Samsettar erfðafræðilegar aðferðir til að uppgötva hágæða eftirlitssamsetningar og verkfræðilega erfðafræðilega drifkrafta fyrir taugaaðgreiningu

Að kafa í leitina að áhrifaríkum frumuaðgreiningarþáttum

Vísindamenn eru enn að leitast við að finna betri meðferð til að snúa við eða hægja á framgangi taugasjúkdóma eins og Parkinsonsveiki, Alzheimerssjúkdóms og Huntingtonssjúkdóms. Þessar sjúkdómar eru afleiðing af dauða taugafrumna í mismunandi hlutum heilans. Lyf eða meðferðir sem notaðar eru til að draga úr einkennum hjá sjúklingum hafa ekki verið vel staðfestar.

Smelltu til að cistanche tubulosa duft fyrir taugavernd

Þeir endurheimta ekki skemmda taugavefinn og geta valdið óæskilegum aukaverkunum. Þess vegna lítur vaxandi fjöldi rannsókna á stofnfrumur sem efnilega meðferð, vegna sjálfsendurnýjunargetu þeirra og sveigjanleika við aðgreiningu í æskilegar frumuættir til ígræðslu í sjúklinginn til að endurheimta tapaða taugavef.

Hins vegar, áður en hægt er að nota stofnfrumur klínískt til að meðhöndla taugasjúkdóma, eru enn svæði sem krefjast betri skilnings til að opna möguleika þeirra til fulls. Stofnfrumur eru endurnýjanlegar og sveigjanlegar, með tilhneigingu til að verða hvaða frumutegund sem er með rétta samsetningu þátta til að knýja fram aðgreiningu. Hins vegar er dýpt flækjustigs í hinu stóra neti þátta.

Það er mikilvægt að ákvarða samsetningar umritunarþátta (TF), lítilla sameinda og/eða vaxtarþátta til að ná sem bestum samvirkni fyrir aðgreina stofnfrumur, þ. í hreinasta stofni taugafrumnaættar. Hins vegar gæti verið stefnumótandi leið til að skima fyrir þessum þáttum á hagkvæmari og tímahagkvæmari hátt.

Þetta myndi hjálpa til við að hámarka þegar settar samskiptareglur sem eru enn erfiðar eða fyrir frekari lýsingu á taugafrumum eins og miðlungs taugafrumum, skyntaugafrumum og serótónvirkum taugafrumum. Það er enn áskorun að kynna ökumenn örlaga taugafrumna ítarlega og skilgreina hvernig þessir þættir hafa samskipti sín á milli í eftirlitsnetinu.

Nokkrir hópar hafa notað nýjar skimunaraðferðir með mikilli afköstum til að skýra reglubundið net örlaga frumna og veitt upplýsandi innsýn í þætti sem knýja fram taugafrumumbreytingu og lifun. Liu o.fl. (2018) notaði CRISPR virkjun (CRISPRa) til að leita að TF eða DNA-bindandi þáttum sem stuðla að taugafrumuörlögum ESC. Hins vegar einskorðaðist vinnan við að rannsaka staka þætti eða samsetningar í pörum.

Önnur kerfisbundin skimun var gerð af Tsunemoto o.fl. (2018), sem rannsakaði tengsl milli TFs. Flestir valdir stakir TF þeirra sýndu engin áhrif í rannsókninni, hins vegar auðkenndu þeir 76 pörbundnar TF samsetningar til að stuðla að aðgreiningu mústrefjafrumna til framkallaðra taugafrumna.

Sérstaklega skorti niðurstöður þeirra nokkuð samræmi við fyrri rannsóknir, svo sem að greina ekki dópamín virka flutningsefnið Slc6a3 í framkölluðum taugafrumum, hugsanlega vegna þess að missa af viðbótarþáttum. Önnur rannsókn ákvarðaði nauðsynleg gen til að viðhalda eða bæta lifun taugafrumna með því að framkvæma skimun sem byggir á CRISPR truflunum (CRISPRi) (Tian o.fl., 2019). Og aftur, þau voru takmörkuð við skimun á stökum sgRNA.

Frekari rannsókna er krafist fyrir óhlutdræga skimun fyrir öðrum erfðaþáttum og til að fjölga þáttasamsetningum, þar sem sýnt hefur verið fram á að kokteill með fleiri en tveimur þáttum gæti þurft í mismunandi samhengi til að knýja fram aðgreiningu og endurforritun á skilvirkan hátt.

Gott dæmi er samsetningin af Oct4, Sox2, Klf4 og c-Myc sem er nauðsynleg til að stjórna þróunarmerkjanetinu fyrir fjölhæfni ESCs (Takahashi og Yamanaka, 2006). Í slíkum flóknum kerfum er þörf á að skilgreina ítarlega virkni hágæða erfðafræðilegra samsetninga með miklum afköstum, og Combinatorial Genetics En Masse (CombiGEM) aðferð gæti bara gert það.

CombiGEM aðferð fyrir mikla afköst, háskipan og kerfisbundinn skjá þáttasamsetninga

CombiGEM býður ekki aðeins upp á kerfisbundna leið til að framkvæma stórfellda sameinaða skjái heldur hefur einnig getu til að stilla saman hágæða samsetta erfðafræðilega bókasöfn (Wong o.fl., 2015, 2016; Zhou o.fl., 2020). Ferlið með einum potti gerir notandanum kleift að skima fyrir fjölda erfðafræðilegra samsetninga; 1-leið, 2-leið, 3-leið, og í orði, n-vegur bókasöfn.

Þetta veitir skjótan valkost við hefðbundið ferli að byggja og prófa einstaka samsetningar umsækjenda af áhuga. Þó að nokkrar aðrar samsettar CRISPR skimunaraðferðir hafi einnig verið þróaðar til að rannsaka pörbundnar erfðafræðilegar samsetningar (Han o.fl., 2017; Shen o.fl., 2017; Najm o.fl., 2018; Truong o.fl., 2019; DeWeirdt o.fl., 2020 ), CombiGEM býður upp á einstakt tækifæri til að meta samskipti milli þriggja eða fleiri erfðasamsetninga.

Til dæmis, ef notandinn stefnir að því að nota CRISPRa eða CRISPRi til að oftjá eða bæla, hvort um sig, lista yfir TF-samsetningar, gæti maður skimað strikamerkjasafn af TF-miða sgRNA samsetningum með því að nota CombiGEM-CRISPR v2.0 ( Wong o.fl., 2016; Zhou o.fl., 2020) eins og sýnt er á mynd 1.

Með því að nota bindingarþrep með einum potti er safn sgRNAs og viðkomandi strikamerkja þeirra fellt inn í lentiveiru-áfangarferju sem greinir frá tjáningu flúrljómandi próteins við virkjun á taugafrumugerð-sértækum hvata, svo sem tubulin 1. Safnið af sgRNA og aðskildum lentiveiruferju sem hýsir ensímalega skortinn Cas9 annaðhvort samruna við umritunarvirkja eða bæli er hægt að skila inn í upphafsfrumur sem óskað er eftir.

Með tímanum, þegar frumur byrja að aðgreina sig, munu aðeins framkallaðar taugafrumulíkar frumur tjá flúrljómun og hægt er að einangra þessar frumur með því að nota flúrljómunarvirkjaða frumuflokkun til að ná í TF samsetningar þeirra með strikamerkjaröðun.

Til að öðlast betri skilning á samsetningum sem knýja fram tilteknar frumuættir, er einnig hægt að rannsaka þessar frumur fyrir þekkta frumuættarfréttamenn eða merkja, byggt á vali á aðgreiningarstigum sem notandinn velur að rannsaka. Hægt væri að nota segulvirkjaða frumuflokkun til að aðgreina frumur sem áhugaverðar eru eftir tjáningu frumuyfirborðsmerkja.

Einfrumu RNA raðgreiningu gæti verið tengt samsettri CRISPR skimun sem útlestur til að kynna tegund og stig gena upp- eða niðurstýringar og hægt er að ákvarða samsetningu markvissa TFs með strikamerkjalestrinum (Replogle o.fl., 2020). Hægt væri að nota efnismikla myndgreiningu til að fylgjast með breytingum á formgerð frumna frá upphafi til síðari stigs taugafrumnaþroska.

Lífeðlisfræðilegt mikilvægi eða virkni framkallaðra taugafrumulíkra frumna er hægt að ákvarða með ónæmisfrumuefnafræðilegum merkingum sem eru sértækar fyrir þroska taugafrumna, svo sem NeuN, TUJ1 og MAP2, og raflífeðlisfræðilegum ráðstöfunum. Eins og fyrr segir hafa rannsóknir sameinað TF og litlar sameindir til að stjórna örlögum frumna.

CombiGEM er einnig hægt að nota til að bera kennsl á smærri sameindasamsetningar sem geta viðhaldið sjálfsendurnýjun stofnfrumna, framkallað aðgreiningu frumna eða auðveldað endurforritun með því að auka skilvirkni og hugsanlega skipt út fyrir erfðafræðilega þætti. CombiGEM er einnig hægt að nota með því að ákvarða fyrst lítil sameindarmarkmið merkjaleiða, epigenetic eða frumuferlisþátta.

Síðan með því að hanna safn af sgRNA til að virkja eða óvirkja lyf sem hægt er að nota, er hægt að bera kennsl á árangursríkar samsetningar lítilla sameinda til að auka aðgreiningu eða endurforritun. Þetta hugtak endurspeglast vel í þeim rannsóknum sem við höfum áður gert til að uppgötva samsetningar lyfja gegn krabbameini og Parkinsonsveiki (Zhou o.fl., 2020).

Notkun CombiGEM er ekki aðeins takmörkuð við truflanir sem byggjast á CRISPR heldur gæti einnig verið beitt á aðra DNA- eða RNA-stýrða þætti til að rannsaka skjámyndir með tap á virkni með RNA-truflunum, sem og virkni-ábata með tjáningu af míkróRNA (Wong o.fl., 2015) og raðstaðfestum opnum lesrömmum úr mönnum eins og þeim sem greint er frá í TFome bókasafni manna (Ng o.fl., 2020).

CombiSEAL aðferð fyrir mikla afköst verkfræði umritunarþátta

Að finna hina fullkomnu samsetningu náttúrulegra erfðaþátta getur samt valdið áskorunum, svo sem að vera takmörkuð við einkennandi TFs í erfðamenginu með fyrri þekkingu um tjáningu þeirra og hlutverk í aðgreiningu. Rannsóknir hafa sýnt fram á að verkfræði TFs eða að búa til gervi umritunarþætti opna nýja möguleika til að flýta fyrir aðgreiningarhraða með öðrum leiðum, fara fram úr háð forsenda tjáningar annarra innrænna meðþátta innan genastjórnunarnetsins, eða að öllu leyti skipta út. náttúruleg TF með skilvirkari (Jauch, 2018).

Þetta gerir vísindamönnum kleift að sníða nauðsynlega þætti í samræmi við tilraunaþarfir þeirra. Við leggjum til að ef maður stefnir að stökkbreytingu með mikilli afköstum á mörgum stöðum til TF sem samanstendur af mismunandi lénum gæti CombiSEAL reynst gagnlegur vettvangur (Choi o.fl., 2019). CombiSEAL aðferðin setur saman amínósýrukóða DNA brot sem eru samsett með strikamerkjum (Mynd 1).

Mynd 1 ｜ CombiGEM og CombiSEAL aðferðir til að skima fyrir áhrifaríkum erfðafræðilegum drifkraftum aðgreiningar. Dæmi um CombiGEM aðferðina er samsetning margra sgRNA sem tjáð eru úr sömu smíðinni og sgRNA samsetningarnar eru táknaðar með samtengdum strikamerkjum þeirra. CombiSEAL aðferðin felur í sér stökkbreytingar sem eru kynntar í ýmsum hlutum próteins, svo sem umritunarþætti, táknaðir sem P1, P2, P(n) og P(n plús 1). Og samsetningar stökkbreytinga endurspeglast af samsvarandi samtengdum strikamerkjum þeirra. Notandinn getur notað uppsetningarnar á önnur DNA afhendingarkerfi og í þessari framsetningu eru lentiveiruferjur notaðar. Hægt er að framkvæma skimunaraðferðir með sameinuðu sniði og í þessu dæmi er auðkenning frumuhópa sem aðgreina sig eftir tiltekinni taugafrumnaætt greint með því að virkja hvatamanninn fyrir tjáningu flúrljómandi próteina, merkt sem X-flúrljómun á skýringarmyndinni. Næsta kynslóð raðgreiningar (NGS) strikamerkja úr frumusafninu mun ráða DNA markmiðin eða umritunarafbrigðin. Ströng greining á þáttum sem knýja fram aðgreiningu mismunandi tegunda taugafrumna gæti notað fylkisbundnar aðferðir eins og að rannsaka frumur með frumulínurmerkjum, fylgt eftir með segulvirkjaðri frumuflokkun (MACS) í fjölbrunna plötur, sem hægt er að fylgja eftir með efnismikil myndgreining. Að öðrum kosti gerir einfrumu RNA raðgreining (RNA-Seq) notandanum kleift að gera grein fyrir genatjáningu frumna með æskilegum svipgerðum og myndi geta sótt strikamerkin til að bera kennsl á sgRNA samsetningar eða stökkbreytingasamsetningar lykilafbrigðanna(n). FACS: Flúrljómunarvirkjað frumuflokkun.

CombiSEAL byrjar með fyrstu skurðarhlutum próteins þar sem stökkbreytingar er óskað. Notandinn getur búið til hvaða fjölda afbrigða sem er fyrir hvern hluta, síðan merkt þá með strikamerkjum til að bera kennsl á staðsetningu og samsetningu stökkbreytinga. Hver hópur hluta er síðan settur saman í röð með því að setja þá inn í áfangaferju sem geymir villigerðarpróteinröðina sem er breytt með hliðargerð IIS ensímum á svæðinu þar sem fyrirhuguð stökkbreyting er gerð.

Þetta örlausa samrunakerfi að tengja saman marga hluta próteins er mikilvægt til að forðast að bæta óæskilegum amínósýrum við próteinið. CombiSEAL aðferðin gerir kleift að ákvarða amínósýruröð valins hóps af afbrigðum sem vekja áhuga á skilvirkari og hagkvæmari hátt, og forðast þörfina á langlestri röðun yfir allt próteinið til að bera kennsl á tegundir stökkbreytinga og hvar þær eru staðsettar yfir prótein.

Þessi aðferðafræðilega uppsetning gerir auðveldari greiningu með því að framkvæma afkastamikla raðgreiningu á safni stuttra, samtengdra strikamerkja sem leiða til samsetningar tegunda og staða amínósýrustökkbreytinga, eða aðrar æskilegar breytingar eins og lénsskipti, innsetningu og eyðingu, sem hafði verið upphaflega hannað og sett upp á TF

Niðurstaða

Í samanburði við tilrauna-og-villu aðferðir hafa framfarir orðið í því að beita kerfisbundnari aðferðum til að ákvarða nauðsynlega þætti eða samsetningar sem þarf til að knýja fram umbreytingu einnar frumutegundar í taugafrumuætt. Hins vegar hefur skort á getu til að bera kennsl á hærri röð samsetningar og hér leggjum við til að CombiGEM aðferðin gæti hugsanlega tekið á slíkum takmörkunum.

CombiGEM notar strikamerkja, eins potta bindikerfi til að setja saman hærri röð samsetningar DNA bindiþátta til að miða DNA í einu lagi, sniðganga ferli margra lota skimunar til að þrengja fjölda heimsókna í viðráðanlega stærð fyrir sannprófanir síðar. . Ennfremur er hægt að skipta óhagkvæmari náttúrulegum TFs út fyrir gervi eða verkfræðilega TFs til að stjórna betur tjáningu gena. Við lýsum próteinstökkbreytingaraðferð, CombiSEAL, sem gerir notendum kleift að búa til stóra hópa af umritunarþáttaafbrigðum með því að setja saman á einfaldan hátt margar stökkbreytingar á vefnum merktar strikamerkjum innan próteinsins og mismunandi léna þeirra.

Þetta mun flýta fyrir og lækka kostnað við skimunaraðferðir til að ná í upplýsingar um tegundir stökkbreytinga afbrigðanna sem vekur áhuga. Við vonum að fyrirhugaðar aðferðir geti aðstoðað við frekari skilning og víkkað möguleika á að stuðla að endurnýjun tauga og geti átt víða við á öðrum sviðum rannsókna.

Verkunarháttur Cistanche taugaverndaráhrifa

Sýnt hefur verið fram á að Cistanche hefur taugaverndandi áhrif með nokkrum aðferðum:

1. Bólgueyðandi áhrif: Cistanche inniheldur efnasambönd sem sýnt hefur verið fram á að hindra bólgu í ýmsum hlutum heilans, sem getur hjálpað til við að vernda taugafrumur gegn skemmdum.

2. Andoxunaráhrif: Cistanche inniheldur efnasambönd sem hafa sterka andoxunareiginleika. Andoxunarefni hjálpa til við að vernda taugafrumur gegn skemmdum af völdum sindurefna og oxunarálags.

3. Reglugerð taugaboðefna: Sýnt hefur verið fram á að Cistanche stjórnar ákveðnum taugaboðefnum, eins og serótóníni og dópamíni, sem getur hjálpað til við að vernda taugafrumur og bæta vitræna virkni.

4. Örvun taugakerfisþáttar: Sýnt hefur verið fram á að Cistanche örvar framleiðslu taugatruflana, svo sem heilaafleiddra taugakerfisþátta (BDNF), sem getur stuðlað að vexti og lifun taugafrumna.

Á heildina litið vinna þessir aðferðir saman til að vernda taugafrumur gegn skemmdum, stuðla að vexti þeirra og lifun og bæta vitræna virkni.

Heimildir

Choi GCG, Zhou P, Yuen CTL, Chan BKC, Xu F, Bao S, Chu HY, Thean D, Tan K, Wong KH, Zheng Z, Wong ASL (2019) Samsett stökkbreyting í heild hámarkar erfðamengisbreytingarvirkni SpCas9. Aðferðir 16:722-730.

DeWeirdt PC, Sanson KR, Sangree AK, Hegde M, Hanna RE, Feeley MN, Griffith AL, Teng T, Borys SM, Strand C, Joung JK, Kleinstiver BP, Pan X, Huang A, Doench JG (2020) Optimization of AsCas12a fyrir samsetta erfðaskimun í frumum manna. Nat Biotechnol 39:94-104.

Han K, Jeng EE, Hess GT, Morgens DW, Li A, Bassik MC (2017) Samvirkar lyfjasamsetningar fyrir krabbamein sem greint er frá í CRISPR skjá fyrir erfðafræðilegar milliverkanir. Nat Biotechnol 35:463- 474.

Jauch R (2018) Endurforritun fruma örlaga með verkfræði innfæddra umritunarþátta. Curr Opin Genet Dev 52:109-116.

Najm FJ, Strand C, Donovan KF, Hegde M, Sanson KR, Vaimberg EW, Sullender ME, Hartenian E, Kalani Z, Fusi N, Listgarten J, Younger ST, Bernstein BE, Root DE, Doench JG (2018) Orthologous CRISPR- Cas9 ensím fyrir samsetta erfðaskimun. Nat Biotechnol 36:179-189.

Ng AHM, Khoshakhlagh P, Rojo Arias JE, Pasquini G, Wang K, Swiersy A, Shipman SL, Appleton E, Kiaee K, Kohman RE, Vernet A, Dysart M, Leeper K, Saylor W, Huang JY, Graveline A, Taipale J, Hill DE, Vidal M, Melero-Martin JM, et al. (2020) Alhliða bókasafn um umritunarþætti manna fyrir frumuörlög. Nat Biotechnol doi: 10.1038/s41587-020-0742-6.

Replogle JM, Norman TM, Xu A, Hussmann JA, Chen J, Cogan JZ, Meer EJ, Terry JM, Riordan DP, Srinivas N, Fiddes IT, Arthur JG, Alvarado LJ, Pfeiffer KA, Mikkelsen TS, Weissman JS, Adamson B (2020) Samsett einfrumu CRISPR skimun með beinni RNA handtöku og markvissri raðgreiningu. Nat Biotechnol 38:954- 961.

Shen JP, Zhao D, Sasik R, Luebeck J, Birmingham A, BojorquezGomez A, Licon K, Klepper K, Pekin D, Beckett AN, Sanchez KS, Thomas A, Kuo CC, Du D, Roguev A, Lewis NE, Chang AN , Kreisberg JF, Krogan N, Qi L, et al. (2017) Combinatorial CRISPRCas9 skimun fyrir de novo kortlagningu á erfðafræðilegum samskiptum. Aðferðir 14:573-576.

Takahashi K, Yamanaka S (2006) Framleiðslu fjölhæfra stofnfrumna úr músafósturvísum og fullorðnum trefjafrumuræktum með skilgreindum þáttum. Hólf 126:663-676.

Tian R, Gachechiladze MA, Ludwig CH, Laurie MT, Hong JY, Nathaniel D, Prabhu AV, Fernandopulle MS, Patel R, Abshari M, Ward ME, Kampmann M. -afleiddar taugafrumur. Taugafruma 104:239-255.

Truong VA, Hsu MN, Kieu Nguyen NT, Lin MW, Shen CC, Lin CY, Hu YC (2019) CRISPRai fyrir samtímis genavirkjun og hömlun til að stuðla að frumumyndun stofnfrumna og endurnýjun beina í leglagi. Nucleic Acids Res 47:e74. Wong AS, Choi GC, Cheng AA, Purcell O, Lu TK (2015) Mikið samhliða háflokka samsett erfðafræði í frumum manna. Nat Biotechnol 33:952-961.

Wong AS, Choi GC, Cui CH, Pregernig G, Milani P, Adam M, Perli SD, Kazer SW, Gaillard A, Hermann M, Shalek AK, Fraenkel E, Lu TK (2016) CRISPR-Cas9 skimun með margföldu strikamerki virkjuð af CombiGEM . Proc Natl Acad Sci USA 113:2544-2549.

Zhou P, Chan BKC, Wan YK, Yuen CTL, Choi GCG, Li X, Tong CSW, Zhong SSW, Sun J, Bao Y, Mak SYL, Chow MZY, Khaw JV, Leung SY, Zheng Z, Cheung LWT, Tan K , Wong KH, Chan HYE, Wong ASL (2020) Þriggja-átta samsett CRISPR skjár til að greina samskipti milli lyfja sem hægt er að nota. Cell Rep 32:108020.

Dawn GL Thean, Alan SL Wong*