Cistanoside A miðlar P38/MAPK leið til að hindra beinþynningarvirkni

Ágrip

BAKGRUNNUR:Cistanoside Ahefuráhrif bólgueyðandi áhrifa, andoxun,draga úr nýrnaskemmdum og gegn beinþynningu, en áhrif þess ábeinþynningaraðgreining, virkni og undirliggjandi sameindakerfi eru enn óljós. MARKMIÐ: Að kanna áhrifCistanoside Aábeinþynningaðgreining ogbeinupptökuframkallað af viðtakavirkjun kjarnaþáttar kappa-B bindils (RANKL) in vitro og verkunarháttur hans.

AÐFERÐIR: Beinmergsátfrumur voru fengnir úr lærlegg og sköflungi 4-6-vikugamla C57BL/6 músa. Frumueyðandi áhrif Cistanoside A (5, 10, 20, 40, 80 og 160 μmól/L) á lífvænleika átfrumna í beinmerg voru könnuð með því að nota frumutalningarsettið-8 greiningarsett. Tartrat-ónæm sýrufosfatasa litun var gerð til að fylgjast með áhrifum mismunandi styrks afCistanoside Aum beinþynningaraðgreiningu og árangursríkur inngripsstyrkur hennar var ákvarðaður. Það var jákvæður samanburðarhópur, Cistanoside A hópar með lágum, meðalstórum og háum skömmtum (40, 80 og 160 μmól/L). Eftir frumutengingu var 50 ng/ml RANKL bætt við til að örva aðgreiningu beinþynninga og samsvarandi skammti af Cistanoside A var bætt við Cistanoside A hópa með lágum, meðalstórum og háum skömmtum, í sömu röð. F-aktín hringur og 2-(4-Amidinophenyl)-6-indólkarbamidín tvíhýdróklóríð litun voru gerðar til að greinaáhrif Cistanoside Aámyndun beinþynningar. Tólúidínblátt litun á beinsneiðum var notuð til að fylgjast með áhrifum Cistanoside A á beinuppsog beinþynningar. Tjáning andstreymis og downstream próteina í JNK/MAPK ferlinum var greind með Western blot. Tjáning gena sem tengjast beinþynningaraðgreiningu og beinuppsogsvirkni eins og tartratónæmum sýrufosfatasa, DC-STAMP, Nfatc-1, Ctsk og c-Fos var greind með RTqPCR. NIÐURSTÖÐUR OG NIÐURSTAÐA: Tartrat-ónæm sýrufosfatasa litun, F-aktín hring litun og uppsogsholapróf sýndu að Cistanoside A marktækthamlaði RANKL-framkallaða beinþynningaraðgreininguogbeinupptökuá skammtaháðan hátt samanborið við jákvæða samanburðarhópinn. Niðurstöður RT-qPCR sýndu að samanborið við jákvæða viðmiðunarhópinn gætu bæði há- og lágskammtahópar af Cistanoside A dregið verulega úr mRNA tjáningu tartratónæmra sýrufosfatasa, DC-STAMP, Nfatc-1, Ctsk og c-Fos á skammtaháðan hátt. Niðurstöður Western blot prófunar sýndu að háskammtahópur Cistanoside A hamlaði marktækt tjáningu p-JNK próteins við 10, 20, 30 og 60 mínútna inngrip; samanborið við jákvæða samanburðarhópinn hamlaði Cistanoside A marktækt tjáningu Nfatc1 og c-Fos próteina á skammtaháðan hátt. Til að álykta, gæti Cistanoside A hindrað myndun og beinupptöku beinþynningar með því að draga úr magni p-JNK próteins, hindra virkjun MAPK ferilsins og tjáningu lykilgena í beinþynningar.

Leitarorð: Sístanósíð A; beinþynning; MAPK; JNK; RANKL; STAÐA;beinþynningu; fenýletanóíð glýkósíð

CISTANCHE AÐ VINNA TIL AÐ HAMMLA BEINHAGSVIRKNI

0 Inngangur Inngangur

Faraldsfræðilegar rannsóknir hafa sýnt að eftir því sem jarðarbúar stækka og eldast mun tíðni beinleysissjúkdóma eins og beinþynningu og slitgigt aukast enn frekar [1]. Núverandi rannsóknir sýna að í meingerð beingreiningarsjúkdóma mun ójafnvægi á beinupptöku og beinauppbyggingu af völdum óhóflegrar virkjunar á beinþynningastarfsemi leiða til verulegrar minnkunar á beinrúmmáli, beinþéttni og örbyggingu beina. Skaðleg hrörnun, leiðir til aukinnar beinbrots og aukinnar hættu á beinbrotum [2-3]. Þess vegna eru beinþynningar helsta frumumarkmið fyrir auðkenningu og þróun áhrifaríkra lyfja til að meðhöndla beinþynningu. Hins vegar hafa lyf sem nú eru notuð sem hamla beinþynningu eins og denosumab (anti-RANKL mótefni), bisfosfónöt o.fl. aukaverkanir eins og eiturverkanir á nýru, beindrep, hættu á legslímukrabbameini og beindrep í kjálka [4-5 ]. Þess vegna hefur það mikla klíníska þýðingu að finna ný lyf sem geta hamlað beinþynningarvirkni.

Aðgreining og beinuppsog beinþynningar er aðallega stjórnað af tveimur merkjasameindum, átfrumna nýlenduörvandi þáttur og viðtakavirkja kjarnaþáttar κB bindil (RANKL) [6]. Nýlenduörvandi þáttur 1 viðtakinn (c-fms) á forvera frumuhimnu osteoclast binst átfrumna nýlenduörvandi þáttur og stuðlar að tjáningu á viðtakavirkja kjarnaþáttar kappa B (RANK). RANKL og RANK binding á frumuyfirborði virkjar umritunarþætti eins og kjarnaþátt κB, JNK, p38 og JNK, sem aftur virkjar umritunarþáttinn c-Fos, kjarnaþátt virkjaðra T frumna c1 (Nfatc1) o.s.frv. kjarna, sem virkjar eyðingu forvera beinfrumna mynda fjölkjarna frumur og aðgreinast að lokum í beinfrumur [7-9].

Cistanche deserticolaer eitt mest notaða kínverska lyfjaefnið í klínískri starfsemi. Það er þurrkaður holdugur stilkur með hreisturblöðum af Cistanche deserticola eða Cistanche tuberosum af Orobanchiaceae plöntunni [10]. Hefðbundin læknisfræði trúir því að Cistanche deserticola sé heitt að eðlisfari, sætt og salt á bragðið og skili sér til nýrna- og þörmanna. Það hefur þau áhrif að næra nýra yang, endurnýja kjarna og blóð, raka þörmum og hægðalyf og er notað til að meðhöndla getuleysi, ófrjósemi, vöðva og bein af völdum ófullnægjandi nýrna yang og kjarna og blóðskorts. Sjúkdómar eins og máttleysi eru í samræmi við lifrar- og nýrnalyftandi meðferðaraðferðir sem notaðar eru í hefðbundinni læknisfræði til að meðhöndla beingreiningarsjúkdóma. Lyfjafræðilegar rannsóknir hafa sýnt að aðal virka innihaldsefnið í Cistanche deserticola er fenýletanóíð glýkósíð, sem hefur gott öryggi og víðtæka lækningavirkni [11]. Cistanoside A (sameindaformúla: C36H48O20) er náttúrulegt fenýletanól glýkósíð efnasamband einangrað og hreinsað úr hefðbundnu kínversku lyfinu Cistanche deserticola. Það hefur bólgueyðandi, andoxunar- og æxliseyðandi áhrif [12-14]. Rannsóknir hafa sýnt að Cistanche deserticola A getur dregið úr c-Fos gildi í frumfrumum músa með bráða lifrarskaða af völdum etanóls [15]. Aðrar rannsóknir hafa sýnt að Cistanche A getur bætt burðarvirki beinskipa í beinþynningu í eggjastokkum með beinþynningarmúsum með RANKL/TNF viðtakatengdum þáttum 6 (TRAF6) ferli [16]. Hins vegar er skortur á frekari rannsóknum á áhrifum Cistancheside A á beinþynningaraðgreiningu og hugsanlega sameindakerfi. Þessi rannsókn miðar að því að kanna áhrif Cistancheside A á beinþynningaraðgreiningu og beinuppsogsvirkni in vitro og hugsanlega sameindaaðferðir, til að finna út ný hugsanleg lyf til að hamla beinþynningaraðgreiningu.

1 Efni og aðferðir Efni og aðferðir

1.1 Hönnun

Fyrir in vitro frumutilraunir voru t-próf ​​og einhliða ANOVA framkvæmd.

1.2 Tími og staður

Lokið frá desember 2022 til desember 2023 í rannsóknarstofu um viðgerðir á beinum og mjúkvefjum á öðru sjúkrahúsi Shanxi Medical University.

1.3 Efni

1.3.1 Tilraunadýr

SPF bekk 4-vikugamlar C57BL/6 mýs, karlkyns eða kvenkyns, voru keyptar frá tilraunadýramiðstöð Shanxi Medical University, framleiðsluleyfisnúmer: SCXK (Jin) 2019-0004. Tilraunamúsum var haldið í venjulegu umhverfi: stofuhita 26 gráður, raki um 55%, ljós útsetning í 12 klukkustundir á dag, frjáls hreyfing og að borða sjálfstætt. Tilraunaskráin var samþykkt af velferðar- og siðanefnd tilraunadýra á öðru sjúkrahúsi Shanxi Medical University (samþykkisnr.: DW2023031).

1.3.2 Hvarfefni og lyf

Cistancheside A (hreinleiki 98%, CAS 93236-42-1) var keyptur frá Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.; nautgripasermi og háglúkósa MEM ræktunarmiðill var keyptur frá HyClone Company í Bandaríkjunum; trypsín-EDTA meltingarlausn 0,25%, rauð blóðkornalausn, 1×PBS, penicillin-streptomycin blanda (×100), tólúidínblátt litunarlausn (1/100, bórataðferð), rhodaminmerkt falloidín hringur

Peptíð (cat. No. CA1610) og DAPI litur (tilbúinn til notkunar) voru keyptir frá Beijing Solebao Technology Co., Ltd., og músa raðbrigða átfrumna nýlenduörvandi þáttur og músa raðbrigða æxlisdrepsþáttar bindill yfirfjölskyldunnar RANKL voru keyptir frá Beijing Ze Xiyuan líftækni Co., Ltd.; CCK-8 settið var keypt frá MCE Company í Bandaríkjunum, tartarte resistant acid phosphatase (TRAP) litunarsett var keypt frá Sigma-Aldrich Company í Bandaríkjunum, RNAiso Plus, Premix type reverse transcription Reagents, TB Green® Hröð qPCR blanda,

Prime Script TM RT Master Mix og Trizol voru keypt frá Takara Company í Bandaríkjunum; dendritic cell-specific transmembrane prótein (DC-STAMP), TRAP, CTSK, c-Fos, NFATc-1 sértækur PCR Primers voru keyptir frá Sangon Bioengineering (Shanghai) Co., Ltd.; -aktín mótefni, c-Fos mótefni, Nfatc1 mótefni, JNK mótefni og p-JNK mótefni, m-IgG Fc BP-HRP voru keypt frá Santa Cruz, Bandaríkjunum.

Líftæknifyrirtæki.

1.4.6 Beinuppsogstilraun til að prófa beinuppsogsgetu beinþynningar

Beinmergsátfrumur voru sáð í 96-brunnsplötu með dauðhreinsuðum nautgripabeinsneiðum settar fyrirfram í þéttleikanum 7×103/brunn. 100 μL af ræktunarefni var bætt í hvern brunn og skipt í jákvæðan samanburðarhóp og Cistanche A lágskammta. hópur (40 μmól/L) og Cistancheside Háskammtahópur (160 μmól/L), hver hópur var útbúinn með 5 marggöt, þar af voru 3 marggöt sett með nautgripabeinsneiðum og hinar 2 fjölholar voru notaðar að fylgjast með tjáningu átfrumna beinmergs. Lím og beinþynningarmyndun. Eftir að frumurnar festust, jákvæði viðmiðunarhópurinn og cistanches

RANKL við 50 ng/ml var bætt við alla hópa til að framkalla beinþynningaraðgreiningu. Cistancheside A lág- og háskammtahópum var bætt við 40 μmól/L eða 160 μmól/L Cistancheside A til inngrips, og skipt var um miðil á 48 klst. fresti. Eftir ræktun í 14 daga, taktu nautgripabeinsneiðarnar út, þvoðu beinsneiðarnar tvisvar með PBS, bættu við 70% ísóprópýlalkóhóli og öflugri úthljóðshreinsun í 15 mínútur til að skola burt frumurnar sem eftir eru, bættu við tólúidínbláu (1%, uppleyst) í vatni) litarlausn og lituð við stofuhita í 2 sekúndur. Eftir 1 mín, skolaðu beinbrotin með tvíeimuðu vatni til að fjarlægja leifar af litarefni. Lituðu beinsneiðarnar voru skoðaðar og myndaðar með stereómíkrósjónu og svæði beinuppsogsbilanna var talið með mynd J hugbúnaði.

1.4.7 RT-PCR

Til að greina beinuppsog innanfrumu og tjáningu gena sem tengjast beinmerg, voru beinmergsátfrumur sáð í 6-brunnsplötu með 1,5×105/brunn og 100 μL af ræktunaræti var bætt í hvern brunn, og skipt í jákvæðan samanburðarhóp, Cistanche A lágskammtahóp (40 μmól/L) og Cistancheside A háskammtahóp (160 μmól/L). Bæði jákvæða samanburðarhópnum og Cistancheside A hópnum var bætt við 50 ng/ml RANKL hvata.

Til að framkalla beinþynningaraðgreiningu var 40 μmól/L eða 160 μmól/L af Cistancheside A bætt við lágskammta og háskammta hópa af Cistancheside A til inngrips. Skipt var um miðil á 48 klukkustunda fresti. Athugun var framkvæmd undir öfugum smásjá þremur eða fjórum dögum eftir innleiðingu. Það sást í smásjá að átfrumur beinmergs voru nýlega runnnir saman. Bætið TRIzol við ljósfrumur, bætið klóróformi við, setjið á ís í 10 mínútur og sogið blönduna út

Í 1,5 ml EP glösum, bætið 200 μL klóróformi í hvert túpu, hristið í 15 sek., látið standa á ís í 15 mínútur, skilið í skilvindu við 4 gráður, 12 000 s/mín í 10 mín, takið flotið, bætið við jafnt magn af ísóprópýlalkóhóli og sett á ís. Látið standa í 10 mínútur, fargið flotinu, skilið í skilvindu við 4 gráður við 120,000 s/mín., þvoið með 75% etanóllausn með rúmmálshluta af dauðhreinsuðu ensímlausu vatni og þurrkið í loftinu til að fá heildar RNA. Notaðu Prime ScriptTMRT Master mix öfugt umritunarsett til að stilla 20 μL kerfi fyrir öfuga umritun til að búa til cDNA. Stilltu síðan PCR vinnukerfið í samræmi við leiðbeiningar settsins og framkvæmdu uppgötvun í flúrljómandi magnbundnu PCR tæki. PCR hvarfaðstæður voru: forafeitrun við 95 gráður í 5 mínútur; denaturation við 95 gráður í 10 sek., glæðing og framlenging við 60 gráður í 30 sek., samtals 40 lotur. Grunnröðin er sýnd í töflu 1.

Eftir að hafa bætt við einföldum -MEN miðli og sveltur í 3 klst, var Cistancheside A hópnum einnig bætt við með 160 μmól/L Cistancheside A til inngrips. Eftir lok hungursneyðar var 100 ng/mL RANKL bætt við hvern hóp til örvunar. Örvunartímar voru 0, 10, 20, 30 og 60 mín í sömu röð. Eftir að örvunartímanum var lokið var ræktunarmiðlinum hent og þvegið þrisvar sinnum með forkældu 1×PBS. Útdregin prótein voru notuð til að greina tjáningu p-JNK, JNK og -aktín próteina.

Eftir að próteinútdrátturinn er lokið, notaðu gel rafdrætti til að aðskilja próteinið og flytja það yfir á PVDF himnu. Bætið við 5% nautgripasermi albúmíni (BSA) til að blokka við 4 gráður í 1 klukkustund. Fargið lokunarlausninni, þvoið himnuna þrisvar sinnum með TBST jafnalausn og bætið við aðalmótefni. (Nfatc1 mótefni 1: 1000, c-Fos mótefni 1: 1000, p-JNK mótefni 1: 1000, JNK mótefni 1: 1000, -aktín mótefni 1: 1000), ræktið við 4 gráður í 14-16 klst. himnan þrisvar sinnum með TBST jafnalausn, bætið öðru mótefni við (m-IgG Fc BP-HRP, þynningarhlutfall 1:5000), ræktið við stofuhita í 2 klukkustundir, bætið við flúrljómandi lausn eftir þvott og framkallið undir hlaupmyndakerfinu, mynd Rannsóknarstofa Hugbúnaðurinn greinir grágildi böndanna sem fengust og notar -aktín sem innri viðmiðun til að reikna út hlutfallslega tjáningu markpróteins.

1.5 Helstu athugunarvísar

① Niðurstöður RANKL-framkallaðrar beinþynningaraðgreiningar eftir Cistancheside A inngrip; ② Myndun aktínhringa á yfirborði osteoclasts og breytingar á beinuppsogsvirkni beinoklasta eftir Cistancheside A inngrip; ③ Lykillinn að beinþynningu eftir Cistancheside A inngrip Genatjáning; ④ Tjáning á downstream próteinum af JNK/mítógenvirkjaðri prótein kínasa (MAPK) ferli og p-JNK próteini eftir Cistancheside A inngrip.

1.6 Tölfræðigreining

GraphPad Prism 9 hugbúnaður var notaður við tölfræðilega greiningu og teikningu. Öll gögn voru gefin upp sem x-±s. t próf og einhliða dreifnigreining voru valin til samanburðar á milli hópa. P < 0.05 var skilgreint sem marktækur munur. Tölfræðilegar aðferðir þessarar greinar hafa verið þróaðar af tölfræðideild Shanxi Medical University.

Heimilisskoðun.