Chrysogenamide A frá innsveppum tengdum Cistanche Deserticola og taugaverndandi áhrif þess á SH-SY5Y frumur

Tengiliður: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Netfang:audrey.hu@wecistanche.com

Kynning

Cistanche deserticola(YC Ma) er sníkjudýr planta upprunnin í norðvesturhluta Kína. Stöngull þessarar plöntu er mikilvæg hefðbundin kínversk læknisfræði og er notuð til að meðhöndla nýrnaskort og taugaveiki ("The Chinese Medicine Dictionary", 1977). Phenylthanoid glýkósíð fráCistanchedeserticolaTilkynnt hefur verið um starfsemi í að koma í veg fyrir og meðhöndla höfuðkúputaugasjúkdóma og hreinsa sindurefna [1, 2]. Byggt á því að innsveppur geta framleitt nýja lyfjaþætti og sömu/svipaða og úr hýsilplöntunum sýnir leit að nýjum virkum efnasamböndum úr innsveppum mikilvægra lyfjaplantna gildi fyrir þróun nýrra lyfjaauðlinda. Í leit okkar að nýjum taugaverndandi efnasamböndum frá endophytic sveppum fráCistanchedeserticolasafnað frá Innri Mongólíu í norðvestur Kína, þrír virkir stofnar voru skimaðir með SH-SY5Y frumum. Meðal þeirra sýndi ræktunarsoð sveppa nr. 005, auðkennt sem Penicillium chrysogenum, umtalsverð taugafrumuvörn gegn frumudauða af völdum oxunarálags í SH-SY5Y frumum. Rannsóknir á virku innihaldsefnum þessa stofns leiddu til einangrunar á krýsógenamíði A (1) (mynd 1) með einangrunaraðferð sem stýrt er af lífgreiningu. Að auki voru fjögur þekkt efnasambönd einangruð og auðkennd sem circumdat í G (2) [3], 2-[(2-hýdroxýprópíónýl) amínó] bensamíð (3) [4], 2- ,3-díhýdrósorbicillín (4) [5] og (9Z,12Z)-2,3-díhýdroxýprópýl oktadeka-9,12-díenóat (5) [6] , með því að bera saman litrófsgögn þeirra við bókmenntagögn. Hér greinum við frá einangrun, auðkenningu og taugaverndandi áhrifum chrysogenamide A.

Cistanche deserticola

Efni og aðferðir

Sveppaefni Sýni af Penicillium chrysogenum nr. 005 var einangrað úr rót C. deserticola sem safnað var frá Innri Mongólíu í norðvestur Kína. Á kartöfludextrósaagar var stórsæja útlitið af útbreiddum, sléttum, flauelsmjúkum, blágrænum þyrpingum, stundum gróin ljósum dúkum; yfirborð nýlendanna sýndi oft marga ljósgula dropa; öfugt gult. GenBank leit með 18S ríbósóma DNA gena röðinni nr. 005 (1676 núkleótíð; Gen-Bank aðildarnúmer EU203859) var framkvæmd. Niðurstöðurnar gefa til kynna að tegund af Penicillium chrysogenum sé næst samsvörun. Á grundvelli stórsæis útlits og 18S rDNA gena röð, er No.005 stofn af Penicillium chrysogenum.

Gerjun og útdráttur

Sveppurinn var ræktaður við kyrrstæðar aðstæður við 24 gráður í 3{{10}} daga í 35 1000-ml keilulaga flöskum sem innihéldu fljótandi miðil (30{{2{{22} }}} ml/flaska) sem samanstendur af glúkósa (10 g/lítra), maltósa (20 g/lítra), mannitóli (20 g/lítra), mónónatríumglútamati (10 g/lítra), KH2PO4 (0,5 g/lítra), MgSO4·7H2O (0,3 g/lítra), maísbrjótavatn (1,0 g/lítra) og gerþykkni (3,0 g/lítra) og sjór eftir að pH hefur verið stillt í 7,0. Gerjaða heila seyðið (10,5 lítrar) var dregið út þrisvar sinnum með EtOAc til að gefa EtOAc leysi, sem var þykkt við lækkaðan þrýsting til að gefa hráan útdrátt (9,5 g).

Hreinsun

Hráa útdrátturinn (9,5 g) var aðskilinn í 15 hluta á kísilgelsúlu með því að nota þrepastigsskolun á jarðolíueter/Me2CO. Hluturinn 2, skolaður með 8 : 2 jarðolíueter/Me2CO, var endurkristallaður úr MeOH, sem gaf 3 sem litlausar nálar (8,{{10}} mg). Hluturinn 3 (19.{{30}} mg), skolaður með 7 : 3 petroleum ether/Me2CO, var aðskilinn frekar með öfugfasa súlu (RP18, 40 6{{38 }} mm, Merck; MeOH - H2O 3:2→4:1→MeOH) til að gefa fr. 3 7 (8.0 mg), sem var hreinsað með víðtækri PHPLC (60 prósent MeOH sem inniheldur {{70}},1 prósent TFA, 4.{{77} } ml/mínútu) til að gefa 4 (2,{{80}} mg). Hluturinn 4 (26,0 mg), skolaður með 6:4 jarðolíueter/Me2CO, var aðskilinn frekar með öfugfasa súlu (RP18, 40 60 mm, Merck; MeOH - H2O 3:2→4:1→MeOH) til að gefa fr. 4-3 (5,4 mg) og fr. 4-9 (7,6 mg). Þá hefur fr. 4-3 var aðskilin með víðtækri PHPLC [YMC-pakkning ODS (A), 10 250 mm, 5 mm, 4,0 ml/mínútu] (60 prósent MeOH, 4,0 ml/mínútu) til að gefa 2 (1,0 mg) og fr. 4-9 var aðskilin með víðtækri PHPLC (80 prósent MeOH, 4,0 ml/mínútu) til að gefa 1 (4,0 mg) og 5 (2,6 mg). 1: fæst sem fölgult fast efni; [a]D25 24,5 gráður (c 0,155, MeOH); UV (MeOH) I max 208, 251 nm; CD (MeOH) (sjá mynd 4); IR (KBr) n max 3433, 3200, 3076, 2928, 2862, 1677, 1440, 1370, 1324, 1188, 1029 cm 1; 1H- og 13C-NMR (sjá töflu 1); HRESI-MS m/z 448,2951 [MH] (reiknað fyrir C28H38N3O2, 448,2964)

DPPH Radical Scavenging Effect

MeOH lausn (160 ml) með mismunandi sýnisstyrk (1,0 mg/ml 0,0001 mg/ml) var bætt við 40 ml DPPH (1,1- dífenýl{{8) }}píkrýlhýdrasýl; Sigma) MeOH lausn (1,5 10 4 M). Eftir að hafa blandað varlega og látið standa í 30 mínútur við stofuhita var ljósþéttleiki mældur við 520 nm með litrófsmæli. Andoxunarvirkni hvers sýnis var gefin upp sem IC50 (mg/ml eða mM sem þarf til að hindra myndun DPPH radicals um 50 prósent) og reiknuð út frá log-skammta hömlunarferlinu.

taugaverndandi cistanche deserticola

Frumurækt og lyfjameðferð

SH-SY5Y frumur úr mönnum taugafrumur voru ræktaðar í DMEM miðli og þeim haldið við 37 gráður í rakaðri andrúmslofti með 5,0 prósentum CO2. Þessar frumusviflausnir (180 ml) með þéttleikanum 5*104 frumu ml-1 voru plötuðar í 96- brunn örtítraplötur og ræktaðar í 24 klst. ofangreind skilyrði. Chrysogenamide A lausn (2,0 ml í DMSO) í mismunandi styrkleika var bætt við hvern brunn fyrir utan viðmiðunar- og líkanhópana og ræktuð áfram í 1 klukkustund við sömu aðstæður. H2O2 (Sigma Chemical Co., MO, USA) var bætt við til að framkalla frumudauða í SH-SY5Y frumum við lokastyrk 200 mM í 24 klukkustundir. Frumulífvænleiki var ákvarðaður með því að nota MTT próf. MTT leyst upp í fosfat-jafnaðri saltvatni var bætt við í lok ræktunar í lokastyrk 5,0 mg/ml (PBS), og síðan ræktað við 37 gráður í 4 klukkustundir. Ef flotinu var fleygt var formazanafurðin sem myndaðist leyst upp.

Niðurstöður og umræður

1 fékkst sem fölgult fast efni. Sameindaformúlan var ákvörðuð sem C28H37N3O2 með HRESI-MS (séð [MH] við m/z 448.2951, kallað [MH] C28H38N3O2, 448.2964). IR litrófið gaf til kynna að NH (3433 og 3200 cm 1 ) og karbónýlhópar (1677 cm-1) væru til staðar. 1H-NMR (tafla 1) litrófið skráð í DMSO-d6 sýndi þrjá metýlhópa (d H 0.62, 0.87, 0.98) og tvö skiptanleg róteindamerki (d H 10.36 og 8.29). Þar að auki gáfu þrjú orthos-tengd arómatísk merki (d H 6,90 dd, J 7,3, 7,3 Hz, 6,94 d, J 7,3 Hz og 7,18 J 7,3 Hz) til kynna 1,2,3- þrísetinn bensenhring. Metýlen róteindirnar (d H 3,23) ásamt olefinískri róteind (d H 5,27), ásamt tveimur vínýlmetýlum (d H 1,67 og 1,70), bentu til nærveru 3-metýl-2-bútenýlhóps í 1. Eintengitengingar þessara róteinda og annarra 14 metín- og/eða metýlenróteinda voru staðfestar með HMQC tilraun. 13C-NMR og DEPT (tafla 1) litrófið, sem birtu 28 merki, staðfestu einnig tilvist þessara tveggja brota [þrísetna bensenhring (dC 123,6 CH, 120,8 CH, 127,7 CH, 122,1 QC og 140,4 QC) og a {79}}metýl-2-bútenýl (dC 28 CH2, 121,9 CH, 132,3 QC, 25,5 CH3 og 17,7 CH3)]; að auki tvö karbónýl (dC 183.1 og 172.3), fjögur sp3 fjórðungskolefni (dC 46.5, 58.7, 60.4 og 62.3), tvö sp3 metín (dC 46.1 og 58.7) og sex sp3 metýlen (7, 331.8, 3310. 35,2, 39,9 og 64,9) komu einnig fram. Þar sem greint var frá 6 af 12 ómettunarefnum var ályktað að 1 innihaldi sex hringi. Frekari mat á þessum litrófsgögnum, ásamt 1 H-1 H COZY og HMBC niðurstöðum, leiddi í ljós að 1 er nátengt marcfortine hópnum umbrotsefna sveppa [7]. Túlkun á HMBC fylgni (mynd 2) gaf til kynna tilvist hlutabyggingar A (HMBC fylgni 1-NH til C-8 og C-9; H-6 til C{{ 136}}; H-5 til C-7 og C-9; H-26 til C-28 og C-8 og H{{143 }} til C-29 og C-30) og B (HMBC fylgni H-10 til C-3, C-22, C-21, C-11, C-12; H-20 til C-13, C-18, C-22, C-11 og { {157}}NH til C-13, C-10), og C, sex hluta G hringur [8] með metýleruðu kolefni við C-17 (HMBC fylgni H{{ 163}} til C-17, C-16). Tenging undirbyggingar A til B í gegnum C-3 var studd af lykil HMBC fylgni frá H-4 og 1-NH til C-3; H-10 til C-2 og C-9. Tengingin milli byggingar B og C við köfnunarefnisatóm var ályktuð með lykil HMBC fylgni frá H-12 til C-17 og C-13 og samanburði á samsvarandi efnabreytingum þeirra á C{{176 }} og C-17 (dC 64,9 og 58,7). Greiningin hér að ofan gaf til kynna að 1 hefði svipaða byggingu og marcfortín A fyrir utan muninn á hliðarkeðjunni við bensenhringinn og metýl við C-17 í sexliða G hringnum. Þannig að heildaruppbygging 1 var úthlutað eins og sýnt er á mynd 1

Hlutfallsleg staðalíefnafræði 1 var útskýrð á grundvelli NOESY gagna (mynd 3). Fyrri rannsóknir hafa leitt í ljós að 2-oxindól alkalóíða efnasamböndin tóku upp sköpulag þar sem miðlægi fimm hluta hringurinn er hornréttur á plan oxindól undireiningarinnar [9].

NOESY fylgni milli H{{0}} og H-10a, H-25 og milli 19-NH og H-10a bentu til þess að þau væru bæði á andliti sýklópentanónhringsins sem beinir þeim í átt að H-4, og festir hlutfallslegt steríóefnafræði við C-3 eins og sýnt er. NOESY víxlverkun milli H-21, H-12a, H-10b, H-23 og H-24 settu samsvarandi skiptihópa saman á framhliðinni á sýklópentanónhringurinn. Hlutfallsleg staðalíefnafræði sem lögð er til fyrir 1 er í samræmi við viðeigandi eiginleika hlutfallslegrar staðalíefnafræði marcfortíns A [7]. Bómullaráhrifin við 200-250 nm myndast vegna np* umbreytinga á díketópíperasínamíðtengjunum, sem er greiningarkennd fyrir bicyclo-[2.2.2] diazaoctane díketópíperasín kjarna [10, 11]. CD litróf 1 (mynd 4) tengdist viðeigandi svæðum í -brevianamíð A [11]. Þannig að alger staðalefnafræði 1 ætti að vera 3S, 11S, 13S, 17S, 21R og var gefið nafnið chrysogenamide A. Bráðabirgðamat á verndandi áhrifum chrysogenamide A á taugafrumur var metið með því að nota oxunarálag af völdum frumudauða í SH-SY5Y frumur með MTT prófi. Virkni krýsógenamíðs A til að hreinsa sindurefna var fyrst skoðuð með því að nota DPPH sem sindurefnagjafa. Öfugt við C-vítamín (IC50: 29,0 mM), sýndi krýsógenamíð A enga getu (IC50 Stærri en eða jafnt og 100 mM) til að hreinsa DPPH sindurefna í styrk upp að 100 mM. Á sama tíma prófuðum við hvort chrysogenamid A verndaði frumur gegn oxunarálagi af völdum frumudauða í SH-SY5Y taugafrumukrabbameini í mönnum

frumur. Oxunarálagið af völdum vetnisperoxíðs leiddi til lækkunar á lífvænleika frumunnar um 43 prósent samanborið við samanburðarhópinn. Chrysogenamide A hindraði frumudauða af völdum vetnisperoxíðs með því að bæta lífvænleika frumna um 59,6 prósent í styrkleikanum 1*10-4 mM. Þessar upplýsingar bentu til þess að krýsógenamíð A sýndi taugafrumuvörn gegn frumudauða af völdum oxunarálags, ekki með andoxunarvirkni þess. Indólalkalóíðar sem búa yfir óvenjulegu bísýkló [2.2.2] díasóktan hringkerfi hafa verið einangruð frá mismunandi ættkvíslum sveppa eins og Aspergillus [12, 9, 13], Penicillium [14 16] og Malbranchea [17]. 1 var nýr meðlimur í þessum hópi efnasambanda, hann hafði beinagrind sem búist er við að verði milliefni í lífmyndun sítrínadmina A og B sem greint var frá sem nýjum flokki pentasýklískra spíróín dólínón alkalóíða árið 2005 [18]. Frá byggingarsjónarmiði er mikilvægt að benda á að 1 er einstök uppbygging með metýleringu í stöðu C-17 og 2- oxindólhluta sem hefur ísópreneiningu í C-7. Sum þessara indólalkalóíða sem hafa verið einangruð hingað til sýna öfluga sníkjudýravirkni [19], hömlun á æxlisfrumum úr mönnum [13] og frumueiturhrif [10]. Eftir því sem við best vitum er það fyrsta skýrslan um taugavernd með þessari tegund alkalóíða.

ViðurkenningÞetta verk var styrkt fjárhagslega af kínverska náttúruvísindasjóðnum (nr. 30472136).

taugavörn við cistanche deserticola: gegn Alzheimerssjúkdómi

Cistanche deserticola hefur mörg áhrif, smelltu hér til að vita meira

Heimildir

1. Li LL, Wang XW, Wang XF. Andlípíð peroxun og geislunarverkun glýkósíða íherba Cistanches. China J Chin Mater Med 22: 364–367 (1997)

2. Xie JH, Wu CF. Áhrif etanólútdráttar afCistanche deserticolaum innihald mónóamín taugaboðefna í rottuheila. Chin Trad Herb Drugs 24: 417–419 (1993)

3. Dai JR, Carte BK, Sidebottom PJ, Yew ALS, Ng SB, Huang Y, Butler MS. Circumdatin G, nýr alkalóíð úr sveppnum Aspergillus ochraceus. J Nat Prod 64: 125–126 84 Mynd 2 Lykill HMBC og 1 H-1 H COSY fylgni af 1. Mynd 3 NOESYs af 1. Mynd 4 CD litróf af 1.(2001)

4. Kettering M, Sterner O, Anke T. Sýklalyf í efnasamskiptum sveppa. Zeitschrift fuer Naturforschung, C: Journal of Biosciences 59: 816–823 (2004)

5. Trifonov LS, Bieri JH, Prewo R, Dreiding AS, Hoesch L, Rast DM. Einangrun og skýring á uppbyggingu þriggja umbrotsefna frá Verticillium intertextum: sorbicillin, dihydrosorbicillin og bisvertinoquinol. Tetrahedron 39: 4243–4256 (1983)

6. Zhang GL, Xing QY, Zhang MZ. Glýkólípíð frá Mirabilis Himalaya. Phytochemistry 45: 1213-1215 (1997)

7. Polonsky J, Merrien MA, Prange T, Pascard C, Moreau S. Einangrun og uppbygging (röntgengreining) marcfortine A, nýs alkalóíða frá Penicillium roqueforti. JCS Chem Comm 13: 601–602 (1980)

8. Lee BH, Kornis GI, Cialdella JI, Clothier MF, Marshall VP, Martin DG, McNally PL, Mizsak SA, Whaley HA, Wiley VH. Örverufræðileg hýdroxýlering við sex einstök kolefnisatóm marcfortine A. J Nat Prod 60: 1139-1142 (1997)

9. Whyte AC, Gloer JB, Wicklow DT, Dowd PF. Sclerotiamide: Nýr meðlimur paraherquamide flokksins með öfluga skordýraeyðandi virkni frá sclerotia Aspergillus sclerotiorum. J Nat Prod 59: 1093–1095 (1996)

10. Kato H, Yoshida T, Tokue T, Nojiri Y, Hirota H, Ohta T, Williams RM, Tsukamoto S. Notoamides AD: prenýleraðir indólalkalóíðar einangraðir úr sjávarafleiddum sveppum, Aspergillus sp. Angew Chem Int Ed 46: 2254–2256 (2007)

11. Williams RM, Kwast E, Coffman H, Glinka T. Merkileg, andhverf ólík lífmyndun brevianamide A og B. J Am Chem Soc 111: 3064–3065 (1989)

12. Banks RM, Blanchflflower SE, Everett JR, Manger BR, Reading C. Ný ormalyf umbrotsefni frá Aspergillus tegund: aspergillimides. J Antibiot 50: 840-846 (1997)

13. Qian-Cutrone J, Haung S, Shu YZ, Vyas D, Fairchild C, Menendez A, Krampitz K, Dalterio R, Klohr SE, Gao Q. J Am Chem Soc 124: 14556–14557 (2002)

14. Wilson BJ, Yang DTC, Harris TM. Framleiðslu, einangrun og bráðabirgðarannsóknir á eiturverkunum á brevianamíði A úr ræktun Penicillium Viridicatum. Appl Microbiol 26: 633-635 (1973)

15. Birch AJ, Russell RA. Rannsóknir í tengslum við lífmyndun XLIV. Uppbyggingarskýringar á brevianamíðum B, C, D og F. Tetrahedron 28: 2999–3008 (1972)

16. Liesch JM, Wichmann CF. Ný bólgueyðandi og sníkjulyf frá Penicillium Charles. II. Byggingarákvörðun paraherquamides B, C, D, E, F og G. J Antibiot 43: 1380–1386 (1990) 17. Martinez-Luis S, Rodriguez R, Acevedo L, Gonzalez MC, Lira-Rocha A, Mata R Malbrancheamíð, nýr calmodulin hemill frá sveppnum Malbranchea aurantiaca. Tetrahedron 62: 1817–1822 (2006)

17. Mishima T, Tsuda M, Kasa Y, Ishiyama H, Fukushi E, Kawabata J, Watanabe M, Akao K, Kobayashi J. Alger staðalefnafræði sítrínadína A og B frá sjávarafleiddum sveppum. J Org Chem 70: 9430–9435 (2005)

18. Lopez-Greta MP, Gonzalez MC, Ciavatta L, Ayala I, Moya P, Primo J. Skordýraeyðandi virkni paraherquamides, paraherquamides, þar á meðal paraherquamide H og paraherquamide I, tveir nýir alkalóíðar einangraðir frá Penicillium cluniae. J Agric Food Chem 54: 2921–2925 (2006)

taugavörn við cistanche deserticola: gegn Alzheimerssjúkdómi og Parkinsonsveiki