Kafli 2: Nýrnapípluperoxisóm eru ómissandi fyrir eðlilega nýrnastarfsemi

Fyrir frekari upplýsingar. sambandtina.xiang@wecistanche.com

Umræða

Mikið magn af peroxisómum í nærpíplum ásamt tilvist nýrnabilunar hjá sjúklingum með ZSD hefur sterklega bent til mikilvægs hlutverks peroxisóma ínýru. Þar að auki hefur nýrnasértæk tjáning nokkurra peroxisomal ensíma stutt þá hugmynd að nýrnaperoxisóm geti haft líffræðilega virkni að hluta til frábrugðin þeim í öðrum vefjum (15). Til að prófa þessar tilgátur skoðuðum viðnýrnastarfsemií músum sem eru lausar við peroxisóm sérstaklega ínýrnapípla. Meðal mismunandi múslíkana sem notuð voru til að rannsaka hlutverk peroxisomes, völdum við mýs sem leyfðu skilyrt erfðafræðilega óvirkjun Pex5 sem kóðar peroxisome biogenesis factor PEX5 nauðsynleg fyrir peroxisome myndun. Þetta líkan var valið vegna þess að (i)Pex5-núll mýs sýna margvíslega lífefnafræðilega og starfræna frávik sem minna á þá sem komu fram hjá sjúklingum með ZSD(11) og (i) mikið litróf múslíkana með vefsértækri brottnám Pex5 hefur verið greind(16) sem gerir okkur kleift að bera saman virknilegar afleiðingar peroxisomal skorts í nýrnapíplum við þær sem sést í öðrum vefjum. Eins og sýnt er af Baes o.fl., sýndu Pex5-null mýs vaxtarskerðingu í legi, vansköpun í heila og alvarlega lágþrýsting og dóu á fyrstu 72 klukkustundum lífsins (11). Lífefnafræðilegar greiningar leiddu í ljós nokkur einkenni ZSD, þar á meðal skert plasmalógen í lifur og heila og mikil aukning á plasmaþéttni VLCFA. Engar nýrnablöðrur í heilaberki fundust í nýrum Pex{{10}}null músa við P0,5, en seinkun á þroska gaukla í legi kom fram. Tilvist kalsíumoxalatútfellinga var ekki rannsökuð.

Smelltu hér til að kynnast ávinningi cistanche jurta

Hjá cKOm músum olli brottnám á peroxisomal biogenesis í nýrnapíplum ekki neinni meiriháttar svipgerð, nema minnkað KW og BW hjá ungbörnum cKOm músum og minnkað KW/BW hlutfall hjá fullorðnum cKOm músum. Hjá cKOf músum benti ófullkomin útskurður á floxed Pex5 samsætu ásamt miklu vægari áhrifum Pex5 eyðingar á nýrnaafrit og umbrotsefni til þess að sumar leifar af peroxisómum gætu verið eftir í nýrnapíplum. Hins vegar,kynlífEinnig er ekki hægt að útiloka sérhæfni peroxisomal starfsemi í nýrum. Við fundum engan marktækan formfræðilegan mun á nýrum cKOm músa sem gæti skýrt lægra KW eða KW/BW hlutfall. Hins vegar gæti tilhneigingin til minnkaðrar nærfrumubreidd verið möguleg orsök þessa munar. Mikilvægt er að hómóstatískri nýrnastarfsemi hélst í cKOm músum þrátt fyrir verulegar breytingar á tjáningarstigi umrita sem kóða prótein sem taka þátt í þekjuflutningi jóna, vatns, amínósýra, lífrænna anjóna og katjóna, fosfats, úrats og í megalínmiðluðu fjöllífi. gand innfrumuleið. Athygli vekur að meirihluti niðurstýrðra umrita kóðaði flutningsefni sem tjáð var í nærpíplum á meðan flest uppstýrðu umrita umrituðu flutningsefni sem komu fram í fjarlægari hlutum nýrungans. Til dæmis benti aukin tjáning á Nkcc2, Clc-Kb, Ncc og ENaC afritum til uppbótaruppbótar í endurupptöku natríums eftir nærliggjandi. Samþætt greining á umriti og umbroti nýrna leiddi í ljós djúpstæðar breytingar á ýmsum frumuferlum sem tengjast umbrotum frumna, samsetningu fituhimnu og afoxunarjafnvægi. Í nýrum cKOm músa sýndu um það bil 8 prósent af transcriptome og um 24 prósent af greindum umbrotsefnum mismunandi magn samanborið við Ctrl mús. Eins og búist var við voru mörg þessara umrita og umbrotsefna tengd peroxisomal virkni. Stórkostleg minnkun sást á magni eter fosfólípíð plasmalógena sem eru mynduð í peroxisómum (~67 prósent í cKOm músum og ~50 prósent í cKOf músum, óvigtuð summa af öllum greindum plasmalogen tegundum). Plasmalógen eru helstu frumuhimnu fosfólípíð með vaxandi fjölda tengdra aðgerða, þar á meðal himnuheilleika, frumuboð og andoxunarvörn. Í nýrum eru plasmalogens um það bil 20 prósent af heildar fosfólípíðum(17), sem bendir til þess að að minnsta kosti 10 prósent af fosfólípíðsamsetningunni hafi verið frábrugðin nýrum cKOm og cKOf músa frá viðkomandi samanburðarhópi. Þurrkun plasmalogens var hugsanlega bætt upp með auknu magni fosfatidýletanólamína (PE) og fosfatidýlkólína (PC), sem sýndu umtalsverða auðgun í nýrum bæði cKOm og cKOf músa. Athygli vekur að svipuð jöfnunaraukning á PE og PCs kom fram í nýrum sjúklinga með ZSD (17).

Umbrot nærpíplanna byggjast aðallega á fitusýruoxun, sem einkennist af mikilli kynslóð ROS sem framleitt er bæði í hvatberum og peroxisómum. Hjá cKO músum voru leiðir tengdar niðurbroti/lífmyndun fitusýra verulega uppstýrðar, sem gæti bent til jöfnunarauka á orkuframleiðslu hvatbera frá þessum hvarfefnum. Þar sem eitt af meginhlutverkum peroxisóma er afeitrun á ROS, gerðum við tilgátu um að brottnám peroxisóms myndi valdaoxunarálagí nýrum cKO músa. Samt sem áður leiddu sameindagreiningar ekki í ljós breytingar á andoxunargetu og lífmerkjum oxunarálags. Áskorun með HFD olli ekki breytingum á virkri svipgerð, nema væg aukning á þvagrúmmáli og þvagútskilnaði kalsíums og úrats í cKOm músum. Samþætt umrita- og umbrotsgreining gerði kleift að bera kennsl á glútaþíon-ferilinn sem mögulegan uppbótarbúnað til að viðhalda heildar andoxunargetu í nærliggjandi píplufrumum nýrna sem skortir peroxisóm.

Skilyrt brottfall Pex5 í fósturlifri(12), í brisfrumum(18) og í mismunandi frumugerðum miðtaugakerfis (skoðað í tilvísun 16) veldur breytilegri en að mestu alvarlegri líffærasértækri virkni rýrnunar. Þetta var ekki tilfellið í nýrum. Í þessari rannsókn greindum við nokkra innri nýrnakerfi sem mögulega gerir kleift að takast á við skort á peroxisómum. Þar sem nýrað er líffærið sem sýnir háan blóðflæðishraða, er annar möguleiki fólginn í uppruna að minnsta kosti hluta umbrotsefna utan nýrna sem nýrun framleiðir ekki í fjarveru peroxisóma en eru nauðsynleg fyrir eðlilega nýrnastarfsemi. Samanlagt benda gögn okkar til þess að nýrnapípluperoxisóm séu ómissandi fyrir eðlilega nýrnastarfsemi og að lífeðlisfræðilegar breytingar á nýrum sjúklinga með ZSD séu utan nýrnauppruna.

Aðferðir

Dýr. Aðferðunum sem notaðar voru til að búa til Pex5a/la/Pax8-ntTA/LC-1 Cre músin var lýst áður (13). Músalínurnar þrjár sem notaðar eru í þessari rannsókn eru innræktaðir stofnar, ræktaðir á erfðafræðilegum bakgrunni C57BL/6J músarinnar (The Jackson Laboratory). Fyrir allar tilraunir voru mýs aðlagaðar að 12-klukkutíma ljós/12-klst. myrkri hringrás. Allar tilraunir voru gerðar á sólarhringstíma ZT3(ZT0er tíminn þegar kveikt er á ljósinu og ZT12 er tíminn þegar slökkt er á ljósinu).

Notaðar voru Pex5bxlo/Pax8-rtTA/LC1 þrefaldar erfðabreyttar karl- eða kvenmýs (sem vísað er til sem cKOm og cKOf) og Pex5l/a mýs (vísað til sem Ctrl eða Ctrl). Pex5 endurröðun hjá nýburum var framkvæmd með því að bæta 0,2 prósent DOX og 2 prósent súkrósa í drykkjarvatn þungaðra kvenmúsa í 2 vikur, frá 14. meðgöngudegi. Fyrir Pex5 endurröðun í fullorðnum músum var DOX og súkrósa bætt við drykkjarvatn 8-vikugamla músa. Uppbygging og virkni nýrna voru metin 4 vikum eftir lok DOX meðferðar hjá 4-vikukömlum ungbarnamúsum eða 14-vikukömlum fullorðnum músum. Eftir frávenningu þeirra eftir 3 vikur voru mýs gefnar með venjulegu samanburðarfæði sem innihélt 4,2 prósent af fitu (Sniff lágfitu stjórnfæði) eða þegar það er nefnt, í 4 vikur með samsvarandi HFD sem innihélt 20,7 prósent af fitu (aðallega LCFA).

Efnaskiptabúr og blóð- og þvagefnafræði. Mýs voru geymdar í einstökum efnaskiptabúrum (Tecniplast). Þvagsöfnun var framkvæmd eftir 3-daga aðlögunartíma. Efnafræði þvags og blóðs var greind eins og áður hefur verið lýst (19). Plasma- og þvagsamsetning var mæld í Laboratoire Central de Chimie Clinique, Centre Hospitalier Universitaire Vaudoise háskólasjúkrahúsinu (Lausanne, Sviss).

Rafeindasmásjá. Nýrnasýni voru skorin í bita um 1 mm³ og fest í glútaraldehýðlausn (EMS) 2,5 prósent í fosfatbuffi (PB, 0,1 M pH7,4) (MilliporeSigma) í 2 klukkustundir við stofuhita (RT). Síðan voru þau skoluð þrisvar sinnum, 5 mínútur hver, í PB jafnalausn og síðan fest með ferskri blöndu af osmíumtetroxíði 1 prósent (EMS) með 1,5 prósent af kalíumferrósýaníði (MilliporeSigma) í PB í 2 klukkustundir við RT. Sýnin voru síðan þvegin þrisvar sinnum í eimuðu vatni og þurrkuð í asetónlausn (MilliporeSigma) í stiguðum styrk (30 prósent 90 mínútur; 70 prósent 90 mínútur; 100 prósent 120 mínútur; 100 prósent 240 mínútur). Þessu fylgdi íferð í Epon plastefni (MilliporeSigma) í stiguðum styrk (Epon/aceton [1/3; v/v] 4 klst; Epon/aceton [3/1;v/v] 4 klst., Epon/aceton [1] /1;v/v] 8 klst; Epón/asetón [1/1; v/v] 24 klst.) og að lokum fjölliðun í 48 klst við 60 gráður í ofni. Ofurþunnir hlutar af 50 nm voru skornir á Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH) og teknir upp á koparraufgrind, 2×1 mm (EMS), húðuð með pólýstýrenfilmu (MilliporeSigma). Hlutar voru eftirlitaðir með úranýlasetati (MilliporeSigma)2 prósent í H, O í 10 mínútur, skolaðir nokkrum sinnum með H, O og síðan Reynolds blýsítrati í 10 mínútur og skolaðir nokkrum sinnum með H, O.

Sterafræði. Fyrir sterafræðigreiningu voru 3 nýrnaberkisstykki á mús greind, 15 míkrómyndir á sýni með pixlastærð 4,08 nm, með kerfisbundinni samræmdu slembisýni með rafeindasmásjá (Philips CM100, Thermo Fisher Scientific) við 80 hröðunarspennu kV með TVIPS TemCam-F416 stafrænni myndavél (TVIPS GmbH).

Transcriptomic greining. Öll raðgreiningargögn eru aðgengileg almenningi í gegnum NIH Gene Expression Omnibus (aðgangsnúmer GSE179202). RNA-Seq söfn voru útbúin með því að nota 200 ng af heildar nýrna-RNA eins og lýst er í Nikolaeva et al. (19). Notuð voru Illumina TruSeq SR Cluster Kit v4 hvarfefni. Röðunargögn voru unnin með Mus musculus. GRCm38.86 genaskýring, Tölfræðileg greining var gerð í R (útgáfa 3.4.0). Afrit með lágum fjölda voru síuð út samkvæmt reglunni um 1 talningu á milljón (CPM) í að minnsta kosti 1 sýni. Bókasafnsstærðir voru stækkaðar með TMM normalization og log-umbreytt í CPM með voom (20). Aðalhlutagreining sýndi lítinn breytileika milli endurtekinna sýna. Mismunartjáning á milli cKO og Ctrl músa var reiknuð út í 1 F próf með limma (21). P gildi voru leiðrétt eins og lýst er (22) í FDR gildi til að hafa í huga fyrir margvíslegan samanburð, með því að nota niðurstöður allra afrita hjá körlum og konum eða niðurstöður valinna flutningsaðila eða peroxisomal tengdum afritum hjá körlum eingöngu. Afrit með FDR<5% were="" considered="" significant.="" comparisons="" of="" expression="" levels="" were="" done="" using="" the="" mean="" fc="" of="" cpm="" in="" cko="" mice="" as="" compared="" with="" ctrl="" mice.="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" individual="" values="" in="" box-and-whisker="" plots,="" individual="" values="" were="" normalized="" between="" 0="" and="" 1.="" a="" weighted="" gsea="" was="" performed="" using="" the="" unfiltered="" transcript="" list="" ranked="" by="" signed="" p-value="" (product="" of="" p-value="" and="" sign="" of="" the="" fc).="" the="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" gsekegg="" function="" from="" the="" r="" package="" cluster="" profile(version="" 3.16.1)(23).="" kegg="" pathway="" collections="" were="" restricted="" to="" gene="" sets="" with="" minimum="" and="" maximum="" sizes="" of="" 10="" and="" 500,="" respectively.="" the="" enrichment="" scores="" were="" normalized="" by="" gene="" set="" size,="" and="" their="" statistical="" significance="" was="" assessed="" by="" permutation="" tests="" (n="">

Efnaskiptagreining. Umbrotsefni úr frosnum nýrnasýnum voru auðkennd með ofurafkastamikilli vökvaskiljun-tandem massagreiningu og magngreind með AUC (Metabolon Inc). Hrágildi var log-umbreytt og staðlað með tilliti til óunnar svæðisfjölda. Tvíhliða ANOVA skuggaefnispróf voru notuð til að bera kennsl á lífefnafræðileg efni sem voru marktækur munur á milli cKO og Ctrl músa af báðum kynjum. P gildi voru leiðrétt eins og lýst er (22) í FDR gildi til að taka tillit til margvíslegrar samanburðar, og umbrotsefni með FDR<5% were="" considered="" significantly="" modulated.="" for="" log2fc="" calculation,="" missing="" values,="" if="" any,="" were="" replaced="" with="" the="" minimum="" observed="" value="" in="" mice="" of="" the="" same="" sex,="" for="" each="" compound.="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" individual="" values="" in="" box-and-whisker="" plots,="" normalized="" values="" were="" divided="" by="" the="" median="" value="" obtained="" in="" mice="" of="" the="" same="" sex,="" for="" each="">

Sameiginleg transcriptome-metabolome greining. Samþætt greining á efnaskiptaferlum sem sameinar niðurstöður úr genatjáningu og rannsóknum á efnaskiptafræði var gerð með því að nota Joint Pathway Analysis eininguna á MetaboAnalyst 5.0 vefsíðunni(24). Nafn efnasambands umbrotsefna og opinbert genatákn umrita sem er marktækt meira eða minna mikið (FDR<0.05), along="" with="" their="" respective="" fcs="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrl="" mice,="" were="" inputs.="" the="" integration="" was="" performed="" using="" kegg="" metabolic="" pathways="" with="" default="" settings(hypergeometric="" test="" for="" overrepresentation="" analysis,="" degree="" centrality="" for="" pathway="" topology="" analysis,="" and="" tight="" integration="" by="" combining="" queries).="" pathways="" with=""><0.1 were="" considered="" significantly="" affected="" in="" ckom="">

Litningar. Litun á alþjóðlegri nýrnabyggingu, kalsíumoxalatútfellingum eða hlutlausum lípíðútfellingu voru gerðar á þverskipuðum nýrnasneiðum sem voru 5 μm þykkar. Fyrir utan hlutlausa lípíðlitun voru mýs svæfðar og vinstra nýra þeirra var blásið í gegnum ósæð í kviðarholi með 4 prósenta paraformaldehýðlausn fyrir vefjauppskeru. Til greiningar á alþjóðlegri nýrnabyggingu voru nýrnasneiðar innbyggðar í paraffín afparaffínaðar, endurvatnaðar, litaðar með H&E, þurrkaðar og settar í ROTI Histokitt (Carl Roth GmbH). Hlutlaus lípíð voru lituð í nýrnasneiðum sem voru felldar inn í OCT efnasamband (Tissue-Tek) með því að nota Oil Red O lausn. Kalsíumoxalatútfellingar voru litaðar samkvæmt aðferðinni sem Pizzolato lýsti (25). Í stuttu máli voru nýrnasneiðar innbyggðar í paraffín afparaffínaðar og endurvatnaðar, síðan sökktar í 1:1 lausn af silfurnítrati 5 prósent w/v og vetnisperoxíði 30 prósent og settar undir 60 W ljósaperu í 30 mínútur. Glerurnar voru þvegnar vandlega í eimuðu vatni og mótlitaðar með Nuclear Fast Red (MilliporeSigma), síðan þurrkaðar áður en þær voru settar upp íROTI Histokitt. Lengdar nýrnasneiðar úr mús sem var meðhöndluð með kalsíumoxalat nýrnakvilla af völdum mataræði (1,5 prósent kalsíum auk 1,5 prósenta hýdroxýprólíns blandað í venjulegt mat í 3 vikur) virkuðu sem jákvæð stjórn á kalsíumoxalat nýrnaútfellingum. Niðurstöður voru greindar með Zeiss AxioScan.Z1 Slide Scanner við 100× eða 200× upprunalega stækkun.

ELISA og Trolox próf.4-HNE var mælt með því að nota Lipid Peroxidation(4-HNE) prófunarsett frá Abcam (ab238538). Heildargeta andoxunarefna sem ekki er ensím var metin með Trolox prófunarbúnaði frá Abcam (ab65329).

Tölfræði. Öll gögn eru gefin upp sem meðaltal ± SEM. Tölfræðiprófum og marktektarmörkum er lýst í myndsögum eða viðeigandi köflum um aðferðir. Tölfræðileg greining var gerð með því að nota R pakka eða GraphPad Prism hugbúnaðarútgáfu 8.2.1. Öll t-próf ​​voru 2 tailed.

Námssamþykki. Allar dýratilraunir voru gerðar af svissneskum leiðbeiningum um umönnun dýra, sem eru í samræmi við leiðbeiningar National Institute of Health dýraverndar, og samþykktar af svissneska kantónunni (Canton de Vaud) og alríkisdýralæknayfirvöldum (heimild 31827 til DF) (Direction generale) de P'agriculture, de la viticulture et des affairs vetérinaires, Epalinges, Sviss).

Fyrri birting: Hluti þessarar vinnu hefur verið lagður fram sem útdráttur á 2021 ársfund American Society of Nephrology (4. nóvember 2021.https://www.asn-online.org/education/kidney-week/2021) /program-abstract.aspx?controlId=3605774).