CAR-daufkyrningamiðlaða sending æxlismíkróumhverfis móttækilegra nanlyfja við glioblastoma krabbameinslyfja-ónæmismeðferð

Glioblastoma (GBM) er eitt af árásargjarnustu og banvænustu föstum æxlum í mönnum. Þó að áhrifarík lækningalyf, svo sem nýjar kímerískar mótefnavakaviðtaka (CAR)-T frumur og lyfjameðferð, hafi verið þróuð til að meðhöndla ýmis krabbamein, hefur árangur þeirra í GBM meðferð að mestu verið hindraður af blóð-heilaþröskuldi og blóð-heilaæxlishindrunum. Daufkyrningar úr mönnum fara í raun yfir lífeðlisfræðilegar hindranir og sýna áhrifaónæmi gegn sýkla en stuttur líftími og þol gegn erfðamengibreytingum frumdaufkyrninga hefur takmarkað víðtæka notkun þeirra í ónæmismeðferð. Hér erfðabreyttum við fjölhæfar stofnfrumur úr mönnum með CRISPR/Cas9-miðlaðri gen-knock-in til að tjá ýmsar and-GBM CAR smíðar með T-sértækum CD3ζ eða daufkyrninga-sértækum merkjasviðum. CAR-daufkyrningar með bestu æxlishemjandi virkni eru framleidd til að skila og gefa út og gefa út æxlisörumhverfissvörun nanólyf til að miða á GBM án þess að þurfa að framkalla frekari bólgu á æxlisstöðum. Þessi samsetta krabbameinslyfja-ónæmismeðferð sýnir yfirburða og sértæka and-GBM virkni, dregur úr lyfjagjöf utan markhóps og lengir líftíma kvenkyns æxlisberandi músa. Saman er þetta lífhermifræðilega CAR-daufkyrningalyfjagjafakerfi öruggur, öflugur og fjölhæfur vettvangur til að meðhöndla GBM og hugsanlega aðra hrikalega sjúkdóma.

Kostir cistanche tubulosa-antitumor

Glioblastoma (GBM) einkennist af hárri dánartíðni, stuttum líftíma og slæmum horfum með mikilli tilhneigingu til endurkomu1,2. Meðferðarárangur bæði skurðaðgerða og krabbameinslyfja er fyrst og fremst hindruð af fíngerðri heilabyggingu og lífeðlisfræðilegri blóð-heilaþröskuld (BBB) ​​eða blóð-heila-æxlisþröskuld (BBTB)3-5. Sérstaklega er lyfjagjöf til miðtaugakerfisins (CNS) til að meðhöndla heilaæxli mjög krefjandi:<1% of administered nanoparticle dose is found to be delivered to a solid tumor based on 376 published datasets6, and 0.8% delivered to brain cancer7. Due to their native capacity to migrate towards inflamed sites, traverse BBB/BBTB, and infiltrate solid tumors, mouse neutrophil-mediated delivery of nanoparticulated chemo drugs has been investigated to enhance targeted drug delivery to the brain tumors for improved therapeutic efficacy8–10. However, an invasive surgical resection of the tumor or tumor microenvironment priming is needed to induce additional inflammation for neutrophil recruitment before neutrophil/chemotherapeutic administration, leading to limited neutrophil recruitment in tumor sites beyond the inflamed surgical margin11. Furthermore, neutrophil-delivered chemotherapeutics were primarily enriched in the spleen, but not in the targeted brain of tumor-bearing mice. While necrosis was not observed in the major organs of experimental mice, there are still concerns regarding off-target tissue toxicity or even systemic toxicity in patients12. Previous studies also focused on mouse neutrophils. The feasibility and safety of using human neutrophils in drug delivery remain elusive since neutrophils have a short lifespan and are prone to apoptosis ex vivo. In addition, massive neutrophil extraction from pre-surgical patients for drug loading may lead to neutropenia or other risks. Thus, a safe and effective human neutrophil-mediated biomimetic drug delivery system that utilizes the natural chemo-attractive GBM microenvironment is urgently needed.

Meðfædd ónæmi og mýkt daufkyrninga gegn ýmsum krabbameinum12–16, þar á meðal GBM, voru minna könnuð en notkun þeirra sem frumuberar við lyfjagjöf8–10. Hringrás daufkyrninga í blóði heim til súrefnisæxlis örumhverfis (TME), þar sem þeir verða að ólíkum æxlistengdum daufkyrningum (TAN), ómissandi þáttur ónæmisbælandi TME sem stuðlar að framgangi krabbameins og meðferðarþols12,17. Svipað og átfrumum fundust N1- og N2-æxlishemjandi svipgerðir TAN innan súrefnissúrefnis TME18-21. Ýmsar meðferðaraðferðir hafa verið þróaðar til að miða beint á daufkyrninga með áherslu á eyðingu daufkyrninga eða hömlun12,22, sem leiðir til nokkurra klínískra rannsókna (td CCR5 hemill Maraviroc í NCT03274804). Þannig getur bein notkun ómeðhöndlaðra daufkyrninga sem nanóbera valdið viðbótaráhættu fyrir krabbameinssjúklinga þar sem daufkyrninga sem selja eiturlyf geta verið endurforrituð í ónæmisbælandi N2 svipgerð fyrir æxli innan TME eftir að hafa farið á æxlissvæði13,23. Að auki ætti að kanna og efla innri æxlishemjandi virkni barnalausra daufkyrninga til að ná hámarksmeðferðarvirkni þegar þau eru notuð sem lyfjaberi ásamt krabbameinslyfjum.

Kostir cistanche tubulosa-styrkja ónæmiskerfið

Breyting á kímvirkum mótefnavakaviðtaka (CAR) hefur verulega aukið æxlishemjandi virkni ónæmis T eða náttúrulegra drápsfrumna (NK)24–27. Hins vegar er virkni þeirra í föstum æxlum enn takmörkuð, að hluta til vegna tiltölulega lítillar sölu þeirra og getu til að komast í gegnum æxli. Tilvist lífeðlisfræðilegra BBB og BBTB hindrar enn frekar virkni þessara lyfja sem koma fram gegn GBM í heilanum. Við veltum því fyrir okkur að samsetning CAR verkfræði og mjög hreyfanlegra daufkyrninga gæti viðhaldið N1 svipgerð þeirra gegn æxli og skilað framúrskarandi lækningalegri verkun við meðhöndlun GBM. Frumdaufkyrningar eru skammlífar og ónæmar fyrir erfðamengibreytingum28, sem takmarkar notkun þeirra í CAR-stýrðri ónæmismeðferð. Fjölhæfar stofnfrumur úr mönnum (hPSCs), sem eru aðgengilegri fyrir genabreytingar og færar um að aðgreina sig í daufkyrninga í miklum mæli, gætu veitt ótakmarkaða uppsprettu hágæða CAR-daufkyrninga fyrir markvissa ónæmismeðferð við efnafræðilega skilgreindar, útlendingalausar aðstæður29. Daufkyrningar taka einnig helst til átfrumna örverusjúkdóma með gróft eða langt yfirborð, eins og S. aureus og E. coli30, sem ætti að taka með í reikninginn við hönnun nanóagna við daufkyrningamiðlaða lyfjagjöf. Reyndar, Safari o.fl. greint nýlega frá æskilegri átfrumnaafgangi ílengdra agna sem gefnar eru í bláæð, án flókinna yfirborðsbreytinga, með daufkyrningum30. Svo auðveld og lífræn hönnun í lyfjahlaðnum nanóögnum getur hámarkað lyfjahleðslu í daufkyrningum og leyft lækningalegt magn lyfjagjafar á markhópa.

In this work, we design and screen four anti-GBM chlorotoxin (CLTX)-CAR constructs with T or neutrophil-specific signaling domains by knocking them into the AAVS1 safe harbor locus of hPSCs via CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination and identified an optimized CAR, composed of a 36-amino acid GBM-targeting CLTX peptide27, a CD4 transmembrane domain and a CD3ζ intracellular domain, for neutrophil-mediated tumor-killing. The resulting stable CAR-expressing hPSCs are then differentiated into CAR-neutrophils, which sustain an anti-tumor N1 phenotype and exhibit enhanced anti GBM activities under the hypoxic tumor microenvironment. A biode gradable mesoporous organic silica nanoparticle with a rough surface (R-SiO2) is synthesized and employed to load hypoxia-activated prodrug tirapazamine (TPZ) or clinical chemo-drug temozolomide (TMZ) and JNJ-64619187 (a potent PRMT5 inhibitor under clinical trial NCT03573310) into hPSC-derived CAR-neutrophils, which are unharmed by the nanoparticulated cargo and retain the inherent physiological properties of naïve neutrophils. CAR-neutrophils loaded with drug-containing SiO2 nanoparticles display superior anti-tumor activities against GBM, possibly due to a combination of CAR-enhanced direct cytolysis and chemotherapeutic-mediated tumor killing via cellular uptake and glutathione (GSH)-induced degradation of nanoparticles within the targeted tumor cells. In an in situ GBM xenograft model, hPSC-derived CAR-neutrophils precisely and effectively deliver TPZ-loaded SiO2 nanoparticles to the brain tumors without invasive surgical resection for amplified inflammation, significantly inhibiting tumor growth, and prolonging animal survival, representing a targeted and efficacious combinatory chemoimmunotherapy. Notably, Si content measurement suggests that>20% af nanólyfjum sem gefin eru eru afhent í heilaæxli með CAR daufkyrningum samanborið við 1% af ókeypis nanólyfjum. Í stuttu máli má segja að lífhermikerfi okkar fyrir CAR-daufkyrningalyf er öruggur, öflugur og fjölhæfur vettvangur til að meðhöndla GBM og aðra hrikalega sjúkdóma.

Kostir cistanche tubulosa-antitumor

Niðurstöður

Skimun fyrir daufkyrningasértækum CAR mannvirkjum fyrir aukna æxlisvirkni

To engineer CAR-neutrophils for targeted drug delivery to brain tumors (Fig. 1a–b), we first designed and tested 4 different CAR structures optimized for anti-tumor activities of hPSC-neutrophils. All CAR structures shared the same extracellular granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor (GM-CSFR) signal peptide (SP), glioblastoma-targeting domain CLTX27, and IgG4 hinge29 (Fig. 2a). CAR #1 is a first-generation T cell-specific CAR that uses the CD4 transmembrane (TM) domain and CD3ζ intracellular signaling domain. CAR #2, CAR #3, and CAR #4 differ from CAR #1 in using a transmembrane domain from neutrophil-specific CD32a (or FcγRIIA), a single-chain transmembrane receptor that is highly expressed in neutrophils (30,000 to 60,000 molecules/cell31) and critical for neutrophil activation31–34. CAR #3 and CAR #4 also include an Fc domain γ-chain of CD32a, which relies on a highly conserved immunoreceptor tyrosine based activation motif (ITAM) to express and signal in neutrophils. Notably, CAR #3 contains a combo signaling domain by fusing CD32aITAM to the CD3ζ intracellular domain. Since primary neutrophils are short-lived and resistant to genome editing, we engineered human pluripotent stem cells (hPSCs) with these different CARs to achieve stable and universal immune receptor expression on differentiated neutrophils by knocking CAR constructs into the AAVS1 safe harbor locus via CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair (Fig. 2b). After nucleofection, single cell-derived hPSC clones were isolated and screened with puromycin for about two weeks. Genotyping identified successfully targeted hPSCs with an average CAR knock-in efficiency of >90%, og meirihluti miðaðra klóna eru arfblendnir (viðbótarmynd 1a-d). CAR tjáning á verkfræðilegum hPSCs var enn frekar staðfest með RT-PCR og frumuflæðisgreiningu á CLTX-IgG4 (viðbótarmynd 1e-g). Eins og búist var við, héldu CAR-tjáandi hPSCs háu tjáningarstigi fjölhæfra merkja, þar á meðal OCT4, SSEA4 og SOX2 (viðbótarmynd 1f).

Til að framleiða de novo CAR-daufkyrninga, voru CAR-tjáandi hPSCs fyrst aðgreindar í fjölvirka blóðmyndandi og síðan mergfrumufrumur með stigssértækri frumumeðferð35 (mynd 2c). Síðari notkun G-CSF og retínósýruörva AM580 stuðlaði að öflugri framleiðslu daufkyrninga36. Svipað og hliðstæða þeirra í útæðablóði (PB), sýndu hPSC-afleidd CLTX-CAR daufkyrninga dæmigerða daufkyrninga formgerð og yfirborðsmerki CD16, CD11b, MPO, CD15, CD66b og CD18 (aukamynd. 2). Næst ákváðum við áhrif CAR tjáningar á frumueiturhrif gegn æxli hPSC-afleiddra daufkyrninga með því að rækta þá með glioblastoma (GBM) U87MG frumum in vitro. Eins og búist var við sýndu hPSC-afleiddir CLTX-CAR daufkyrninga betri æxlisdrepandi getu samanborið við PB daufkyrninga (mynd 2d), í samræmi við fyrri athuganir í CLTX CAR-T frumum27. Meðal þessara mismunandi CARs miðlaði CAR #1 yfirburða æxlisdrepandi virkni í hPSC-daufkyrningum. Athyglisvert er að CAR #4 sem byggir á -keðju er minnst árangursríkur við að koma af stað daufkyrningamiðluðu æxlisdrápi, sem gæti stafað af lægri afriti af ITAM í en ζ-undireiningu og minni tjáningu á -berandi CAR á frumuyfirborði28. Daufkyrningar losa frumudrepandi hvarfefni súrefnistegunda (ROS) og æxlisdrepsþáttar (TNF-) til að drepa markfrumur. Framleiðsla á ROS og TNF- (mynd 2e, f) úr mismunandi daufkyrningum féll vel saman við aukna frumusundrun þeirra. Eins og búist var við var framleiðsla á ROS og TNF- úr mismunandi daufkyrningum eftir samræktun með venjulegum SVG p12 glial frumum áfram eins lítil og neikvæði samanburðarhópurinn (viðbótarmynd 3a, b). Að auki sáust aukin frumueiturhrif gegn æxli CAR-daufkyrninga aðeins við samhliða ræktun með GBM frumum, þar á meðal U87MG, frumum fullorðinna GBM43 og SJ-GBM2 frumur fyrir börn (aukamynd 3c), sem sýnir mikla sérhæfni CLTX okkar. -BÍLL. Sérstaklega sýndu CAR daufkyrninga mikla lífsamrýmanleika við venjulegar SVG p12 glial frumur, hPSCs og hPSC-afleiddar frumur (viðbótarmynd 3d), í samræmi við fyrri athugun að óvirkjuð frumdaufkyrningur drepi ekki heilbrigðar frumur16. Sameiginlega sýndu hPSC-afleiddir CAR daufkyrninga, einkum CD3ζ-berandi CAR-daufkyrninga, aukna frumueiturhrif gegn æxli og framleiddu meira ROS og TNF- in vitro, sem undirstrikar möguleika þeirra í markvissri ónæmismeðferð.

Mynd 1|Skýringarmynd af aukinni verkun gegn glioblastoma með því að nota samsetta ónæmismeðferð á CAR-daufkyrningum og æxlisörumhverfissvörunum nanólyfjum. Fjölhæfar stofnfrumur úr mönnum voru hannaðar með CAR og aðgreindar í CAR-daufkyrninga sem eru hlaðnar grófum kísil nanóögnum (SiO2 NPs) sem innihalda súrefnisskortsmiðað tírapazamín (TPZ) eða önnur lyf, sem tvíþætt ónæmislyfjameðferð. b Kerfisbundið CAR-neutrophil@R-SiO2- TPZ NPs ráðast fyrst á ytri normoxískar æxlisfrumur með því að mynda ónæmisfræðilegar taugamót og drepa æxlisfrumur með átfrumum. Eftir frumudreifingu gætu CAR-daufkyrningar losað R-SiO2-TPZ NPs, sem æxlisfrumur ná yfir. Eftir það bregðast nanóforlyf við súrefnisæxlis örumhverfinu og drepa æxlisfrumur á áhrifaríkan hátt. TEOS tetraetýl ortósílíkat, BTES bis[3-(tríetoxýsilýl) própýl] tetrasúlfíð, TPZ tírapazamín, BTZ bensótríasínýl.

CAR-daufkyrningar héldu áfram yfirburða virkni gegn æxli í ónæmisbælandi æxlisörumhverfi

Svipað og átfrumum fundust N1- og N2-æxlishemjandi svipgerðir æxlistengdra daufkyrninga innan ónæmisbælandi æxlis örumhverfis17. Pro-æxlis N2 daufkyrninga gegna mikilvægu hlutverki í æxlisæðamyndun, meinvörpum og ónæmisbælingu, en meðferðarmiðun þessarar frumutegundar hefur verið krefjandi.

Frekar en kerfisbundin eyðingaráætlun22, metum við möguleika CAR-verkfræði til að viðhalda æxlissvipgerð daufkyrninga. CAR hPSC-afleiddir og PB daufkyrninga voru meðhöndlaðir með súrefnisskorti (3% O2) og TGF , sem stuðla að ónæmisbælingu æxlismíkróumhverfis37,38, til að meta viðvarandi æxlisdrepandi virkni þeirra. Þó PB daufkyrningar sýndu marktækt minnkað frumudrif gegn GBM frumum við ónæmisbælandi aðstæður, héldu CAR-daufkyrningar mikla æxlisdrepandi virkni (viðbótarmynd 4a). Svipaðar athuganir voru einnig gerðar í TNF losun og ROS kynslóð (viðbótarmynd. 4b, c) frá PB eða CAR-daufkyrningum við ónæmisbælandi og eðlilegar aðstæður. Til að staðfesta enn frekar svipgerð daufkyrninga við súrefnisskort og TGF aðstæður, mældum við tjáningu á N1-sértækum iNOS og N2- N2-sértækum arginasa á einangruðum daufkyrningum með frumuflæðisgreiningu (aukamynd. 4d–f). Samanborið við normoxia, ónæmisbælandi súrefnisskortur og TGF lækkuðu marktækt tjáningarstig iNOS og aukið magn arginasa í PB daufkyrningum, en CAR daufkyrningar héldu háu tjáningarstigi iNOS. Fyrri rannsóknir benda til þess að virkjun Syk-Erk merkjaleiðarinnar leiði til ROS framleiðslu39–42. Þess vegna fundum við og bárum saman Syk-Erk virkjun í óbreyttum daufkyrningum og CAR-daufkyrningum, og niðurstöður okkar gáfu til kynna marktækt meiri virkjun á Syk-Erk ferlinum í CAR-daufkyrningum undir súrefnisskorti (viðbótarmynd 5a–d), sem gæti viðhaldið óbreytt ROS framleiðsla CAR-daufkyrninga við súrefnisskort. Samanlagt héldu CAR-daufkyrninga upp svipgerð gegn æxli og héldu mikilli virkni gegn æxli við æxlisörumhverfi sem líkja eftir aðstæðum in vitro, sem undirstrikar möguleika þeirra í markvissri ónæmismeðferð.

Mynd 2|Skimun fyrir daufkyrninga-sértækum chimeric antigen receptor (CAR) byggingum með aukinni daufkyrningamiðluðum andæxlisvirkni. Skýringarmynd af ýmsum CAR mannvirkjum. b Skýringarmynd af CAR #1 smíði og markvissa högg-inn stefnu á AAVS1 örugga höfn staðsetning fjölhæfra stofnfrumna úr mönnum (hPSCs). Lóðrétta örin gefur til kynna AAVS1 miðunar sgRNA. Rauðar og bláar láréttar örvar gefa til kynna primera til að mæla markvirkni og arfhreinni, í sömu röð. HDR: einsleit endurröðunarviðgerð. c Skýringarmynd af bjartsýni daufkyrningaaðgreiningar frá hPSCs við efnafræðilega skilgreindar aðstæður. d Frumueiturhrifapróf gegn U87MG glioblastoma frumum voru gerðar í mismunandi hlutföllum daufkyrninga og æxlismarkmiðs með því að nota tilgreinda daufkyrninga. Gögn eru sýnd sem meðaltal ± SD af fimm óháðum líffræðilegum endurteknum, tvíhliða t-prófi nemenda. Myndun hvarfefna súrefnistegunda (ROS) (e) og ELISA greining á TNF losun (f) frá mismunandi daufkyrningum eftir samræktun með U87MG frumum voru ákvörðuð. n=5 líffræðilega óháð sýni. Gögnin eru sýnd sem meðaltal ± SD, tvíhliða t-próf ​​nemenda. Upprunagögn eru veitt sem frumgagnaskrá.

Undirbúningur og lýsing á hPSC CAR-daufkyrningum hlaðnum tírapazamíni (TPZ)-innihaldandi SiO2 nanóögnum

PB daufkyrninga hafa verið notuð sem frumuberar til að gefa myndgreiningar- og lækningalyf í heilaæxli8–10, þó að markvissa daufkyrningaíferð krefst skurðaðgerðar- eða ljósvakaðri bólgu og lyfjagjöf utan markmiðs gæti verið áhyggjuefni11. Til að bæta enn frekar æxlishemjandi virkni CAR-daufkyrninga, útbjuggum við kísil nanóagnir (SiO2-NP) með grófu eða sléttu yfirborði til að hlaða krabbameinslyfjum eða geislalyfjum í daufkyrninga. Sendingar rafeindasmásjár (TEM) myndir sýndu að báðar SiO2 nanóagnirnar voru vel dreifðar og sýndu kúlulaga formgerð með samræmdri stærð (mynd 3a, viðbótarmynd 6a). Greining á samsetningu dreifingar með skönnun TEM (STEM) með orkudreifðri röntgengreiningu (EDS) sýndi að brennisteinsþátturinn (S) var jafndreifður innan allra grófu SiO2 nanóagnanna (R-SiO2) (mynd 3b). Með því að nota köfnunarefnis (N2) aðsogs-afsogsjafnhita og samsvarandi holastærðardreifingargreiningu voru holastærðir R- og SSiO2 NPs mældar sem 25 nm og 35 nm (mynd 3c, viðbótarmynd 6b), í sömu röð. Í ljósi mikils yfirborðsflatarmáls og stórrar svitaholastærðar, væri hægt að hlaða lækningalyfjum í bæði R- og S-SiO2 NPs, eins og dæmi um súrefnisskorts-svörun pro-lyf tirapazamín (TPZ) (mynd 3d, viðbótarmynd 6c) . Eftir hleðslu TPZ sáust ekki marktækar breytingar á dreifingu, formgerð og stærð R-SiO2-TPZ með því að nota TEM og kraftmikla ljósdreifingargreiningu (aukamynd 6d, e). Tetra-súlfíðtengin sem eru felld inn í R-SiO2 NP eru viðkvæm fyrir afoxandi umhverfi og geta brotnað hratt niður vegna mikils magns glútaþíons (GSH) sem er til staðar í æxlisfrumunum43. Næst ákváðum við GSH móttækilegt niðurbrot R-SiO2–TPZ NPs í viðurvist 10 mM, 1 mM og 10 μM GSH, sem voru þau sömu og innanfrumuskilyrði krabbameinsfrumna, eðlilegra frumna og utanfrumuumhverfis43, í sömu röð. Við 10 mM GSH meðferð var upphaflega kúlulaga uppbygging R-SiO2-TPZ NPs mjög eyðilögð eftir 24 klst (viðbótarmynd. 6f, g). Nanóagnirnar voru algjörlega sundraðar í lítið rusl eftir 48 klst, sem leiddi til losunar TPZ á GSH-móttækilegan hátt (mynd 3e). Rusl af R-SiO2 NPs olli ekki neinum marktækum frumudrepandi áhrifum á frumurnar sem prófaðar voru in vitro (viðbótarmynd. 6h), sem gefur til kynna hlutfallslegt öryggi R-SiO2 NPs.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur

【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Við metum næst hagkvæmni þess að nota SiO2-TPZ NPs til að hlaða lækningalyfjum í CAR-daufkyrninga sem samsetta krabbameinslyfjameðferð til að ná aukinni lækningalegri verkun. Eftir skilvindu mældum við frumuupptöku SiO2–TPZ NPs af daufkyrningum með því að nota flúrljómunarsmásjá og flæðifrumugreiningu (mynd 3f, g), og greindum marktækari frumuupptöku R-SiO2–TPZ NPs en S-SiO2– TPZ NPs með daufkyrningum. Frum Si innihald í daufkyrningum var mælt sem 11,3 og 19,1 ng Si/ug prótein fyrir slétt og gróft SiO2 NPs @ TPZ (Mynd 3h), í sömu röð, með inductive coupled plasma massagreiningu (ICP-MS). Í ljósi mikillar hleðslugetu þeirra í daufkyrningum voru R-SiO2-TPZ NPs notaðir fyrir síðari tilraunir. Við leituðumst síðan við að prófa lífeðlisfræðilega virkni CAR daufkyrninga eftir hleðslu R-SiO2–TPZ NPs. Engar breytingar sáust á lífvænleika frumna (mynd 3i, viðbótarmynd 6i), flutningsgetu í gegnum brunna (mynd 3j), krabbameinslyfjavirkni og samsvarandi hraða (mynd 3k, l) CAR-daufkyrninga fyrir eða eftir hleðslu R-SiO2 –TPZ NP, sem sýnir mikla lífsamhæfni þeirra. Tímaháð nanólyfjahleðslugreining var einnig gerð og hámarkshleðsluinnihaldi var náð 1 klst. eftir frumu-NP ræktun (aukamynd. 7a). Meira en 95% CAR-daufkyrninga tókst að hlaða R-SiO2-TPZ NPs (viðbótarmynd 7b). Tjáningarstig CD11b, yfirborðspróteins daufkyrninga sem miðlar viðloðun og flutningsvirkni við örvun bólgusameinda, var ekki breytt á CAR-daufkyrningum með eða án R-SiO2-TPZ hleðslu (viðbótarmynd 7c, d). Ofuroxíð eða hvarfefna súrefnistegundir (ROS) losna úr virkum daufkyrningum til að drepa örverur og æxlisfrumur44. Eins og búist var við jókst ROS-myndun af CAR-daufkyrningum marktækt eftir meðferð með N-Formýlmetíónín-leucýl-fenýlalaníni (fMLP) og marktækur munur sást ekki á ROS-framleiðslu með CAR-daufkyrningum fyrir og eftir hleðslu R-SiO2- TPZ (mynd 3m). Samanlagt sýndu gögnin okkar fram á að R-SiO2-TPZ hlaðnir CAR-daufkyrningum viðheldur lífeðlisfræðilegri virkni villigerðar daufkyrninga og gætu flutt virkan í átt að bólguáreiti, sem undirstrikar möguleika þeirra í markvissri krabbameinslyfjaónæmismeðferð.

CAR-daufkyrninga hlaðin R-SiO2-TPZ nanóögnum drepa á áhrifaríkan hátt glioblastoma frumur

Næst metum við áhrif R-SiO2-TPZ á æxlisdrepandi getu CAR-daufkyrninga. Náin milliverkun áhrifavalda og markhóps var forsenda daufkyrningamiðlaðrar frumugreiningar. Eins og við var að búast myndaði CAR-neutrophils@R-SiO2-TPZ ónæmis taugamót með æxlisfrumum innan 2 klst. og sýndu svipaða fjölda áhrifa-markmiða milliverkana og lyfjalausir CAR-daufkyrningar (mynd 4a, aukamynd 8) . Sérstaklega fundust engar sjáanlegar milliverkanir á milli CAR-neutrophils@RSiO2-TPZ og líkamsfruma sem ekki eru krabbamein (aukamynd 8), sem undirstrikar sérhæfni CLTX-CAR gegn heilaæxlum. Ennfremur voru R-SiO2-TPZ NPs losaðar úr daufkyrningum í ræktunarmiðilinn (viðbótarmynd. 9a, b) 12 klst. eftir samræktun og fóru inn í æxlisfrumurnar sem eftir voru (mynd 4a). Tuttugu og fjórum klukkustundum eftir samræktun á SiO2–TPZ NP-hlaðnum CAR-daufkyrningum með æxlisfrumum, innihéldu allt að 95% æxlisfrumna R-SiO2–TPZ NPs (mynd 4a, viðbótarmynd 9c), sem gefur til kynna árangursríka flutningsfall sem felur í sér burðardaufkyrninga sem sinna verkunarfrumuvirkni sinni og gangast undir frumudauða og losa þannig R-SiO2-TPZ NPs á óvirkan hátt til markæxlisfrumna45. Við staðfestum einnig súrefnissvörun og frumueiturhrif forlyfja TPZ innan æxlisfrumna með rafeindaparasegulómun (EPR) litrófsgreiningu á róteindamyndun úr TPZ (viðbótarmynd 9d) og flæðifrumugreiningu á TOPRO-3 á æxli frumur (aukamynd. 9e) undir súrefnisskorti og normoxíu. Til að ákvarða frumudrif R-SiO2-TPZ NP-hlaðinn CAR daufkyrninga, útfærðum við in vitro normoxia-súrefnisskorts æxli enduráskorun líkan (mynd 4b). Tuttugu og fjórum tímum eftir normoxic coculture, CAR-daufkyrninga hlaðin R-SiO2-TPZ NPs eða ekki sýndu svipaða frumueitrun gegn æxli (mynd 4c), og báðir voru hærri en PB-daufkyrninga hlaðnir R -SiO2-TPZ NPs eða ekki og R-SiO2- TPZ NPs eingöngu. Aukin frumueiturhrif eru aðallega vegna aukinnar æxlismiðunargetu daufkyrninga eftir CAR verkfræði. Eftir 12 og 24- klst. súrefnissýkingarsamrækt til viðbótar með æxlisfrumum sýndu R-SiO2-TPZ NP-hlaðnir CAR-daufkyrningar yfirburða getu gegn æxli samanborið við aðra hópa (mynd 4d, e). Að auki sýndu CAR daufkyrninga hlaðnir R-SiO2-TPZ NPs frábæra frumugreiningu gegn endursáðum ferskum æxlisfrumum (mynd 4f), sem gefur til kynna æxlishemjandi getu losaðs R-SiO2-TPZ nanóagnir eftir frumudreifingu daufkyrninga.

Við gerðum síðan RNA raðgreiningu (RNA-seq) greiningu á æxlisfrumum til að skýra hugsanlegan sameindakerfi sem liggur að baki aukinni frumueyðandi frumufrumu daufkyrninga með CAR tjáningu og R-SiO2-TPZ NPs. Genatjáningargreining sýndi fram á að samanborið við viðmiðunar- og R-SiO2-TPZ NPs, CAR-daufkyrninga hlaðnir með eða án R-SiO2-TPZ NPs minnkuðu marktækt tjáningu umfrymis- og himnugena í æxlisfrumum ( Viðbótarmynd 10a, mynd 4g), sem styður enn frekar átfrumumyndun þeirra á æxlisfrumum við samræktun. Þó að allir tilraunahópar hafi aukið oxunarálag á frumum í æxlisfrumum, stóðu R-SiO2-TPZ-hlaðnir CAR-daufkyrningar fram úr öðrum hópum við að kveikja á oxunarálagsboðum. Að auki ýttu R-SiO2-TPZ-hlaðnir CAR-daufkyrninga verulega undir frumudauða og minnkuðu fjölgun æxlisfrumna. Til að skilja frekar aukna æxlishemjandi virkni R-SiO2-TPZ-hlaðinna CAR-daufkyrninga, notuðum við átfrumnahemla cýtókalasín D og hvarfefna súrefnistegund (ROS) hreinsiefni N-asetýlsýsteins (NAC) og ROS hemill GSK2795039 í samræktun æxlisdaufkyrninga. Frumgreining æxlisfrumna með CAR-daufkyrningum minnkaði marktækt með 5 μM cýtókalasíni D, 5 mM NAC og 100 nM GSK2795039 (viðbótarmynd 10b, c), sem gefur til kynna áberandi hlutverk átfrumna og ROS í CAR daufkyrningamiðluðu æxli. dráp. Eftirstöðvar 40%-50% æxlisfrumugreiningar í nærveru daufkyrninga og NAC eða GSK2795039 benda til þátttöku ROS-óháðs kerfis í daufkyrningamiðluðu æxlisdrápi sem er þess virði að rannsaka frekar.

Mynd 3|Undirbúningur og lýsing á hPSC CAR-daufkyrningum hlaðnum tírapazamíni (TPZ) sem inniheldur SiO2 nanóagnir. a–e Transmission rafeindasmásjá (TEM) (a) og orkudreifingarrófsgreiningu (EDS) frumefnakortlagningarmyndir (b) af grófum SiO2 nanóögnum eru sýndar. c Köfnunarefnisaðsog-afsogsjafnhiti grófra SiO2 nanóagna ásamt Barrett-JoynerHalenda (BJH) svitaholastærðardreifingarlóð er sýnd. Líffræðilegar þrítekningar voru gerðar sjálfstætt. TPZ hleðsluinnihald í SiO2 nanóögnum (d) og glútaþíon (GSH)--svarandi TPZ losun (e) var mæld á tilgreindum tíma. n=3 líffræðilega óháð sýni. Einhliða dreifnigreining (ANOVA) fyrir (e). Flúrljómunarmyndir (f) og frumuflæðisgreining (g) af daufkyrningum hlaðnum sléttu og grófu SiO2-TPZ. Líffræðilegar þrítekningar voru gerðar sjálfstætt. h Innihald SiO2 í frumum í hPSC-afleiddum CAR-daufkyrningum var mælt. n=5 líffræðilega óháð sýni, tvíhliða t-próf ​​nemenda. Frumulífvænleiki (i), n=3 líffræðilega óháð sýni, flutningur (j), n=5 líffræðilega óháð sýni, efnafræðilega togkraft (k, l), n=20 líffræðilega óháð sýni og ROS myndunargeta (m) hPSC-afleiddra CAR-daufkyrninga hlaðnir með eða án grófs SiO2-TPZ var sýnd, n=5 líffræðilega óháð sýni, tvíhliða t-próf ​​nemenda. PMA: phorbol myristat asetat. Öll gögn á þessari mynd eru sýnd sem meðaltal ± SD. Upprunagögn eru veitt sem frumgagnaskrá.

Virknilegt mat á CAR-daufkyrningum hlaðnum nanólyfjum með því að nota lífhermandi glioblastoma líkan in vitro

Til að meta frekar virkni R-SiO2-TPZ NP-hlaðinna CAR-daufkyrninga, innleiddum við transwell-based blood-brain barrier (BBB) ​​æxlislíkan með því að nota öræðaæðaþelsfrumur úr mönnum (mynd 5a, aukamynd . 11a). Eins og búist var við sýndu R-SiO2-TPZ NP-hlaðinn CAR-daufkyrningur framúrskarandi flutningsgetu í in vitro BBB líkani (mynd 5b), sem drap í raun markæxlisfrumur eftir flutning við bæði normoxic og súrefnisskort (mynd 5c) , d), og losa fleiri bólgusýtókín (mynd 5e) sem geta laðað að sér aðrar verkunarfrumur til að drepa æxlisfrumurnar. Að auki höfðu CAR daufkyrningar ekki marktæk áhrif á lífvænleika æðaþelsfrumna eftir flutning (viðbótarmynd 11b). R-SiO2-TPZ NP-hlaðnir CAR-daufkyrningar héldu framúrskarandi flutningsgetu í seinni flutningstilrauninni (mynd 5f) og yfirburða getu gegn æxli samanborið við aðra hópa (mynd 5g). Þrívítt (3D) æxliskúlulíkan var síðan notað til að meta æxlisgengnisgetu R-SiO2-TPZ NP-hlaðna CAR-daufkyrninga (mynd 5h). CAR-daufkyrningar fluttu smám saman í átt að miðju æxlishvolfsins og dreifðust jafnt í kúluhúðinni eftir 8 klst. ræktun (mynd 5i). Mikil samstaðsetning milli CAR daufkyrninga og R-SiO2-TPZ NPs sást (aukamynd. 12a–c), sem sýnir að R-SiO2-TPZ NPs voru hjúpuð stöðugt í CAR -daufkyrninga við æxlisíferð fyrir frumusundrun þeirra. Án daufkyrningamiðlaðrar sendingar fundust R-SiO2-TPZ NP aðeins á ytra lagi æxliskúlulaga. Samanborið við R-SiO2-TPZ NPs og CAR-daufkyrninga, sýndu R-SiO2-TPZ NP-hlaðnir CAR daufkyrninga yfirburði gegn æxlisfrumu í þrívíddaræxlislíkaninu (mynd 5j). Einnig er hægt að nota CAR-neutrophils@R-SiO2 NPs til að afhenda önnur lyf, þar á meðal klínískt temozolomide (TMZ) og JNJ- 64619187, í 3D æxlislíkön og drepa GBM frumur á skilvirkan hátt (aukamynd 12d–f). Samanlagt sýndu samsettu CAR daufkyrningarnir og nanólyf framúrskarandi æxlishemjandi virkni í lífhermandi æxlisörumhverfi sem líkja eftir aðstæðum in vitro, sem varpar ljósi á meðferðarmöguleika samsettrar daufkyrningabundinnar krabbameinslyfjameðferðar.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

In vivo dreifing á R-SiO2-TPZ nanóögnum sem fá CAR daufkyrninga

In addition to improving the direct tumor-killing ability, we hypothesize that CAR engineering of hPSC-neutrophils will significantly enhance their targeted delivery of therapeutic drugs without additional surgery- or light-induced inflammation11. To test this hypothesis, we employed a mouse xenograft model of glioblastoma and an in vivo imaging system to determine the trafficking and biodistribution of R-SiO2-TPZ NP-loaded CAR-neutrophils. We fluorescently labeled SiO2 NPs with a near-infrared dye Cyanine 5 (Cy5) and then performed fluorescence imaging 3 h and 24 h after systemic administration (Fig. 6a). Three hours after intravenous injection, R-SiO2-TPZ NPs traveled to the whole body of tumor-bearing mice and emitted strong fluorescence with or without neutrophil-mediated delivery (Fig. 6b). CAR-neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs accumulated in the brain tumor site within 24 h, whereas free R-SiO2-TPZ NPs were still evenly distributed across the whole body (Fig. 6b). To further quantify the biodistribution of R-SiO2-TPZ NPs in various organs, inductively coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) analysis of Si content was performed on the harvested organs 24 h post-injection. CAR neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs were significantly enriched in the mouse brain (Fig. 6c), although a low-level delivery to the liver and spleen was observed. Si content measurement also demonstrated that >20% af gefnum nanólyfjum voru afhent í heilaæxli með CAR-daufkyrningum samanborið við 1% af óbundnum nanólyfjum sem er í samræmi við fyrri skýrslur6. Markviss sending R-SiO2-TPZ NPs til hýsilheilans yfir BBB með CAR-daufkyrningum var einnig staðfest með vefjafræðigreiningu (mynd 6d). Þvert á móti söfnuðust R-SiO2-TPZ NP ein og sér aðallega upp í lifur og milta. Samanlagt sýndu gögn okkar fram á aukna markvissa afhendingu R-SiO2-TPZ NPs með CAR daufkyrningum án þess að þurfa að framkalla viðbótarbólgu á æxlisstaðnum, sem undirstrikar hagkvæmni og öryggi krabbameinslyfjameðferðar sem byggir á daufkyrningum við krabbameinsmeðferð.

Samsett krabbameinslyfjameðferð CAR-daufkyrninga og R-SiO2-TPZ nanóagna sýndi framúrskarandi virkni gegn glioblastoma in vivo

Til að ákvarða lækningalega virkni R-SiO2-TPZ NP-hlaðinna CAR daufkyrninga, var stofnað in situ xenograft líkan af glioblastoma í NOD.Cg-RAG1tm1MomIL2rgtm1Wjl/SzJ (NRG) músunum með því að nota luciferasa frumur sem tjá U87MG. Æxlisberandi mýs voru gefnar í bláæð 5 × 106 daufkyrninga vikulega (Mynd 7a), og æxlisbyrði í hýslum var mæld og magngreind (Mynd 7b, c). Í samanburði við PBS eða PB-daufkyrningameðhöndlaðar mýs, hægði meðferð með CAR-daufkyrningum og CAR neutrophil@R-SiO2–TPZ NPs á áhrifaríkan hátt á æxlisvexti. CAR neutrophils@R-SiO2–TPZ NPs sýndu mun meiri frumueiturhrif gegn æxli en nokkur annar tilraunahópur. Þvert á móti ýttu PB-daufkyrninga verulega undir æxlisvexti í heilanum, sem leiddi til dauða æxlisberandi músa strax á 23. degi (Mynd 7d), sem bendir til þess að óverkfærðir daufkyrningar geti valdið frekari áhættu. Næst mældum við losun cýtókína úr mönnum í plasma mismunandi tilraunamúsahópa (Mynd 7e). Allir tilraunahópar sem ekki voru PBS framleiddu greinanlegt TNF og IL-6 í plasma frá degi 5 til dags 26, sem bendir til virkjunar daufkyrninga úr mönnum við æxlisörvun. Í samræmi við hærri æxlisvöxt sem sést hafa, losuðu óbreyttir daufkyrningar smám saman meira IL-6 og TNF, sem getur leitt til frumulosunarheilkennis hjá sjúklingum og krafist ítarlegri öryggisrannsókna með IL-6 blokkum46,47 . Athyglisvert er að CAR-neutrophils@RSiO2–TPZ NPs sýndu minnkaða cýtókínframleiðslugetu á síðari tímapunktum (dagur 19 og dagur 26), sem bendir til hugsanlegrar lítillar hættu á cýtókínlosunarheilkenni hjá sjúklingum meðhöndlaðir með CAR-daufkyrningabundinni krabbameinslyfjameðferð. Lífsamrýmanleiki samsettra CAR-daufkyrninga og R-SiO2-TPZ NPs var metinn með vikulegum mælingum á líkamsþyngd og eftirliti með meinafræðilegum breytingum í helstu líffærum músa. Enginn munur sást á líkamsþyngd milli CAR daufkyrninga@R-SiO2–TPZ NP-meðhöndlaðra músa og annarra tilraunahópa (mynd 7f), sem gefur til kynna lágmarks altæk eiturhrif og framúrskarandi lífsamrýmanleika CAR-neutrophils@ R-SiO2–TPZ NPs innan 28 daga meðferð. Vefjafræðileg greining á helstu líffærum sem skorin voru úr músum á degi 30 sýndi að CAR-neutrophils@R-SiO2-TPZ NP-meðhöndlaðar mýs ollu ekki áberandi óeðlilegum eða líffæraskemmdum í hjarta, lifur, milta, lungum og nýrum (aukamynd. 13), sem staðfestir enn frekar öryggi samsettra CAR-daufkyrninga og R-SiO2-TPZ NPs.

Mynd 4|CAR-daufkyrninga hlaðin R-SiO2-TPZ nanóögnum drepa í raun glioblastoma frumur. Sýndar voru dæmigerðar myndir af ónæmisfræðilegum taugamótum sem sýndar voru með skautuðum F-aktínsöfnun á snertifleti CAR-daufkyrninga og æxlisfrumna eftir 6, 12 og 24 klst. R-SiO2-TPZ nanóagnir sem losnar úr CAR-daufkyrningum við átfrumumyndun í æxlisfrumum voru teknar upp af æxlisfrumum. Þrennfaldar voru gerðar sjálfstætt. b Skýringarmynd af daufkyrningamiðluðu frumueiturhrifaprófi gegn æxli. Frumueiturhrif gegn U87MG glioblastoma frumum voru gerðar í mismunandi hlutföllum daufkyrninga og æxlismarkmiðs með því að nota tilgreinda daufkyrninga eftir 24 klst (c), 36 klst (d), 48 klst (e) og 72 klst (f). n=3 líffræðilega óháð sýni. Gögn eru sýnd sem meðaltal ± SD, einhliða dreifnigreining (ANOVA). g Bulk RNA raðgreining var gerð á U87MG frumum við ýmsar aðstæður. Hitakort sýnir tjáningarstig valinna umfrymis, himna, oxunarálags, frumudauða og útbreiðslutengdra gena í tilgreindum glioblastoma frumum. n=2 líffræðilega óháð sýni. Upprunagögn eru veitt sem frumgagnaskrá.

Mynd 5|Virknilegt mat á CAR-daufkyrningum hlaðnum R-SiO2-TPZ nanóögnum með því að nota lífhermandi glioblastoma (GBM) líkan in vitro. Skýringarmynd af in vitro æxlislíkani okkar af GBM með blóð-heila-hindrunum (BBB), sem er samsett úr æðaþelsfrumum á frumuinnskotshimnu og æxlisfrumum í botni sama þverbrunns. b Transwell flutningsgreining á daufkyrningum eftir 12 klst. er sýnd. Anti-GBM frumueiturhrif merktra daufkyrninga eftir 24 klst (c) og 36 klst (d) voru mæld og magngreind. e ELISA greining á IL-6 og TNF sem losað var frá merktum daufkyrningum eftir 36 klst. var framkvæmd. f Seinni flutningur mismunandi daufkyrninga eftir 48 klst. er sýndur. g Anti-GBM frumueiturhrif merktra daufkyrninga eftir 60 klst. voru mæld og magngreind. h–j Skýringarmynd af daufkyrninga-íferð í þrívídd (3D) æxlislíkani in vitro var sýnd í (h). Sýndar voru dæmigerðar flúrljómandi myndir af íferðum daufkyrningum í 3D æxlislíkönunum. DAPI var notað til að lita frumukjarnan og CD45 var notað til að lita daufkyrninga. Kvarðastangir, 200 μm. Líffræðilegar þrítekningar voru gerðar sjálfstætt. j Samsvarandi æxlisdrepandi getu tiltekinna daufkyrninga var mæld og magngreind með frumueiturhrifabúnaði. Gögnin eru sýnd sem meðaltal ± SD af fimm óháðum líffræðilegum endurteknum, einhliða dreifigreiningu (ANOVA). Upprunagögn eru veitt sem frumgagnaskrá.

Þó að CAR-neutrophil@R-SiO2–TPZ NPs hafi dregið verulega úr æxlisvexti í xenograft músum, er munurinn á lifun dýra í tilraunahópum CAR-neutrophils, SiO2–TPZ NPs og CAR-neutrophil@R-SiO2-TPZ NPs óverulegur (p > 0.05), sem hugsanlega stafar af dauða skammlífra daufkyrninga við undirbúning frumna og inndælingu. Næst lögðum við áherslu á þessa þrjá hópa og ákváðum hvort styttri frumuundirbúningstími og auknir skammtar af CAR-daufkyrningum og nanólyfjum myndu skipta einhverju um lifun dýra (Mynd 7g). Þegar CAR-neutrophil@R-SiO2-TPZ NPs voru gefin 6 sinnum á kerfisbundinn hátt, stóðust hinir tveir hóparnir betur við að lengja líftíma æxlisberandi músa (Mynd 7h), en munurinn á lifun dýra í hópum CAR-daufkyrninga og SiO2- TPZ NPs héldust óveruleg. Þó að svipaður lifunarferill R-SiO2- TPZ hópsins hafi sést á milli þessara tveggja sjálfstæðu dýrarannsókna, stytti tíma í frumueinangrun og undirbúningi fyrir inndælingu úr samtals ~4 klst. í 1 klst. á fyrstu 4 daufkyrningunum skammtar leiddu til bættrar lifun dýra í CAR-daufkyrningahópum fyrir dag 32. Sameiginlega sýndu gögn okkar mikilvægi undirbúnings daufkyrninga og hagræðingar skammta í framtíðar klínískri notkun daufkyrningalyfja.

Umræða

Sýnt hefur verið fram á að daufkyrninga í músum sé öflugur burðarefni til að skila nanólyfjum á skilvirkan hátt til bólgna heilaæxla eftir aðgerð8,9. Samt sem áður er hagkvæmni og öryggi þess að nota daufkyrninga úr mönnum við lyfjagjöf enn óljós. Hið mikla magn daufkyrninga úr músum (10 sinnum hærra en heildarfjöldi daufkyrninga í blóði í músum11) sem notað er í þessum rannsóknum til að ná lækningalegum ávinningi getur hindrað klíníska þýðingu þeirra enn frekar þar sem útdráttur á miklum fjölda daufkyrninga úr krabbameinssjúklingum getur leitt til daufkyrningafæð og aðrar áhættur. Til að takast á við þessar áskoranir, beittum við krafti sjálf-endurnýjunar hPSCs til að fá ótakmarkaða de novo daufkyrninga úr mönnum29. Við þróuðum öflugt líffræðilegt innblásið daufkyrningamiðlað lyfjagjafakerfi með CAR-engineering29 og notuðum verkfræðilega CAR-daufkyrninga úr mönnum sem nanóbera með sláandi virkni gegn æxli. Gróf SiO2 NPs virka betur en slétt SiO2 NP í CAR-daufkyrningaberum, í samræmi við fyrri athuganir á því að daufkyrningar átfrumna helst grófa örverusjúkdóma30. Greint var frá daufkyrningum sem stuðla að fjölgun og framgangi glioma frumna48. Við sáum svipuð æxlisáhrif óbreyttra daufkyrninga í dýrarannsókninni okkar, sem undirstrikaði nauðsyn CCAR verkfræði eða annarra breytinga á daufkyrningum til að tryggja öryggi þeirra við lyfjagjöf og önnur lækningaleg notkun. Sérstaklega veltur CAR-daufkyrningamiðluð lyfjagjöf okkar eingöngu á innfæddri efnafræðilegri hæfni GBM, en ekki mögnuðum bólgumerkjum eftir skurðaðgerð, sem bendir til mikillar sérhæfingar og meðferðarmöguleika lyfjagjafakerfis okkar við að uppræta djúpt íferð gliomas. sem ekki er hægt að fjarlægja með skurðaðgerð. Þar sem skurðaðgerð og viðbótar krabbameinslyfjameðferð/geislameðferð eru aðal klíníska inngripin fyrir GBM12, getur samsett meðferð með CAR daufkyrninga nanóberjum og skurðaðgerð/geislameðferð náð ákjósanlegri meðferðarárangri og er þess virði að rannsaka frekar. T- og NK-frumu-sértækar CAR-byggingar hafa verið mikið notaðar til að auka æxlishemjandi virkni T- og NK-frumna, en daufkyrningasértæk CAR sem bæta æxlishemjandi virkni daufkyrninga hefur ekki verið lýst. Áður var greint frá því að CD4ζ og CD4 kímerískir ónæmisviðtakar eykur frumudrufu daufkyrninga gegn HIVenv-smituðum frumum in vitro. Samt sem áður var skilvirkni lýsis aðeins ~10% í hlutfalli áhrifavalds og marks (E:T) 10:128. Fc RIIA (CD32a) er lágsækni einkeðju yfirhimnuviðtaka fyrir einliða IgG sem er mjög tjáður í daufkyrningum (30,000 til 60,000 sameindir/frumu31), og binding hans veldur Fc - háð virkni í daufkyrningum, svo sem losun á innihaldi kyrna, Ca2+ virkjun, frumueiturhrif gegn æxli og átfrumna49. Í ljósi áberandi hlutverks CD32a í virkjun og virkni daufkyrninga, hönnuðum við og prófuðum CD32a byggða CAR smíði. Hins vegar sýndu niðurstöður okkar að CD3ζ miðlar marktækt betri frumusundrun en CD32a þegar það er tjáð í hPSC-afleiddum daufkyrningum, sem gæti verið að hluta til vegna hærri eintaka af ITAMs í CD3ζ en CD32a: þrjú og eitt eintak, í sömu röð, og hærra tjáningarstig af ζ en á frumuyfirborði daufkyrninga28. Eins og CD32a er Fc RIII (CD16b) annar viðtaki með litla sækni fyrir einliða IgG og er tjáður á mun hærra stigi en CD32a á daufkyrningum31. Þó að krosstenging CD16b framkalli aðeins Ca2+ virkjun og kyrningamyndun, en ekki átfrumna og frumudrufu í daufkyrningum28,50, mun það samt vera áhugavert í framtíðarrannsóknum að framkvæma kerfisbundinn samanburð á hæfileikum CD3ζ- og CD16b -CARs í að kveikja og efla æxlishemjandi virkni daufkyrninga.

Mynd 6|In vivo dreifing á R-SiO2-TPZ nanóögnum (NPs) sem fá CAR daufkyrninga. skýringarmynd af Cy5-merktum CAR neutrophil@R-SiO2 NPs og R-SiO2 NPs sem gefin eru í bláæð fyrir frumurannsókn í lífi. 5 × 105 lúsiferasa (Luci)-tjáandi U87MG frumur voru settar inn í hægri framheila NRG músa. Eftir 4 daga voru mýs meðhöndluð í bláæð með PBS, 5 × 106 Cy5-merktum CAR neutrophil@R-SiO2 NPs og R-SiO2 NPs. b Tímaháð lífdreifing Cy5+ daufkyrninga í öllum líkamanum, heila og öðrum líffærum var ákvörðuð og magngreind með flúrljómun á tilgreindum klukkustundum. c Lífdreifing CAR neutrophil@R-SiO2 NPs og R-SiO2 NPs í músum 24 klst. eftir inndælingu var greind með inductive coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) byggð á Si frumefni, og gögn voru gefin upp sem prósenta af inndældum skammti á hvert gramm af vefjum (%ID/g). n=5 líffræðilega óháð sýni. Gögn eru sýnd sem meðaltal ± SD. Upprunagögn eru veitt sem frumgagnaskrá. d Sýndar voru dæmigerðar flúrljómunarmyndir af CD45 og SiO2 í tilgreindum glioblastoma xenografts einangruðum úr æxlisberandi músum. Kvarðastangir, 100 μm. Líffræðilegar þrítekningar voru gerðar sjálfstætt.

Mynd 7|In vivo anti-æxlisvirkni samsettra CAR-daufkyrninga og R-SiO2-TPZ nanóagna (NPs) var metin með inndælingu í bláæð. Skýringarmynd af PBS, PB-daufkyrningum, CAR-daufkyrningum og CAR-neutrophil@ R-SiO2-TPZ NPs sem gefin eru í bláæð fyrir æxlisdrepandi rannsókn in vivo. 5 × 105 lúsiferasa (Luci)-tjáandi U87MG frumur voru settar inn í hægri framheila NRG músa. Eftir 4 daga voru mýs meðhöndluð í bláæð með tilætluðum daufkyrningum vikulega í mánuð. Tímaháð æxlisbyrði var ákvörðuð (b) og magngreind (c) með líflýsandi myndgreiningu (BLI) á tilgreindum dögum. Gögnin eru meðaltal ± SD fyrir mýs í (b) (n=5), einhliða dreifigreiningu (ANOVA). d Kaplan-Meier ferill sem sýnir lifun tilgreindra tilraunahópa (n=5) var sýnd. Losaður æxlisdrep þáttur- (TNF ) og IL-6 í útlægu blóði (e) og líkamsþyngd (f) mismunandi músahópa voru mæld á tilgreindum dögum. Gögn eru meðaltal ± SD, n=5 líffræðilega óháð sýni. g, h Æxlisvirkni aukinnar skammtatíðni CAR-daufkyrninga og RSiO2-TPZ NPs var metin. g Skýringarmynd af CAR-daufkyrningum sem gefin eru í bláæð, R-SiO2-TPZ NPs og CAR-neutrophil@ R-SiO2-TPZ NPs fyrir in vivo æxlisdrápsrannsókn. h Kaplan-Meier ferill sem sýnir lifun tilgreindra tilraunahópa var sýnd (n=5). Kaplan–Meier ferlar voru greindir með log-rank prófinu. Upprunagögn eru veitt sem frumgagnaskrá.

Við kynntum hér einnig mát og fjölhæfan hPSC daufkyrningalyfjasendingarvettvang sem gæti verið endurhannaður og lagaður í framtíðinni til að styðja aðra viðleitni sem byggir á daufkyrningum til að meðhöndla aðra sjúkdóma í mönnum. Í fyrsta lagi er CAR verkfræði aðgengilegri í hPSCs en í frumónæmis T frumum og daufkyrningum. Það þarf aðeins að breyta erfðamengi einu sinni til að ná stöðugri og einsleitri tjáningu ýmissa CARs29. Til viðbótar við CLTX CAR, smíðuðum við einnig stöðugar hPSC línur sem tjá alhliða and-fluorescein (FITC) 51 eða and-PD-L1 CAR52, sem bæði var hægt að virkja til að fá alhliða, föstu æxlismiðaða nanóbera CAR-daufkyrninga. Aðrar erfðabreytingar, eins og bandvefssjúkdómur sem miðar að and-FAP CARs53, er einnig hægt að framkvæma til að beina daufkyrningum nanóberum til að meðhöndla banvæna hrörnunarsjúkdóma, þar með talið heilaáverka og hjartavefsmyndun. Ennfremur væri einnig auðvelt að aðlaga CAR-tjáandi hPSCs til að framleiða CAR-T eða CAR-NK frumur29 og samsetningar þessara ónæmismeðferða með CAR-daufkyrningum nanóberum geta náð ákjósanlegum meðferðarávinningi gegn æxli. Að lokum, lífrænt æxlisglútaþíon (GSH) móttækilegt nanólyfjakerfi okkar er mát og fjölhæfur vettvangur til að hlaða efnilegum krabbameinslyfjum eða geislavirkum lyfjum í CAR-daufkyrninga til markvissrar lyfjagjafar, eins og dæmi eru um af klínískum TMZ, JNJ64619187 og TPZ fyrir lyfjameðferð. Framtíðarrannsóknir á prófun á öðrum nanóögnum geta leitt til hámarks lyfjahleðslu í daufkyrningum og náð hámarks lækningavirkni in vivo.

Þó að við höfum sýnt fram á meðferðarhugmyndina um að nota CAR-daufkyrninga til að skila krabbameinslyfjum sérstaklega og á skilvirkan hátt til heilaæxla yfir BBB, þá eru nokkrar takmarkanir í þessari rannsókn. Í fyrsta lagi er hugsanlegt að 4-dagar æxlisfrumu sáningu sé ekki nægjanlegt til að finna æxli sem líkja eftir klínískri atburðarás fyrir meðferðarrannsóknir og framtíðarvinna með mismunandi æxlisbótunartímabilum er nauðsynleg til að rifja upp mismunandi stig þróunar glioblastoma og meðferðarsvörun í mismunandi sjúklingar54,55. Í öðru lagi skortir ónæmisgalla mýsnar sem við notuðum hér aðlögunarónæmi og önnur forklínísk líkön með ósnortið ónæmiskerfi, eins og gæludýrahundar með sjálfsprottið glioma56, eru nauðsynlegar til að meta betur öryggi og verkun CAR-daufkyrninga sem framleidd eru in vitro. Sérstaklega er þörf á eituráhrifum utan markhóps CAR-daufkyrninga með eða án hleðslu nanólyfja í dýrum með innrennsli, þar með talið frumulosunarheilkenni, taugaeiturhrif og eiturverkanir utan markhóps sem sjást í CAR-T frumum57, þrátt fyrir stuttan líftíma. af daufkyrningum. Þó að framkvæmanlegar aðferðir, svo sem að þróa ónæmisvaldandi alhliða gjafa hPSCs58–61 og banka-hvítfrumumótefnavaka (HLA)-arfhreina hPSC bókasöfn62, séu tiltækar til að forðast hugsanlega hættu á ígræðslu-versus-host-sjúkdómi (GvHD), eru forklínísk dýralíkön með ósnortið ónæmiskerfi er enn þörf til að meta þýðingarmöguleika daufkyrningameðferða okkar. Að lokum sáust takmarkaðar frumueiturverkanir gegn æxli og lengingu á líftíma dýra CAR-daufkyrninga nanólyfjameðferða. Þess vegna er framtíðarrannsókn á áhrifaríkari krabbameinslyfjum eða geislanæmisefnum og samsettar meðferðir með klassískum CAR-T og skurðaðgerð nauðsynleg til að ná hámarks æxlishemjandi verkun CAR-daufkyrningalyfja. Til dæmis hefur nýleg rannsókn á hönnun sem byggir á vélbúnaði leitt til áhrifaríkara lyfs KL-50 sem sigrar áunnið ónæmi eins og sést í klínísku TMZ lyfi63 og er því hægt að fella inn í CAR-neutrófíl nanólyf vettvang okkar fyrir hugsanlega betri meðferðaráhrif. Að lengja geymsluþol daufkyrninga í 5 daga með CLON-G (caspases-lysosomal membrane permeabilization-oxidant-necroptosis inhibition plus granulocyte colony-stimulating factor64) meðferð og/eða notkun á lengri tíma stýrðu lyfjalosunarkerfi í CAR-daufkyrningum getur einnig ná viðvarandi in vivo æxlishemjandi verkun eftir frumudreifingu daufkyrninga. Sameiginlega sýndu niðurstöður okkar greinilega að R-SiO2-TPZ hlaðnar CAR-daufkyrninga gætu viðhaldið N1 svipgerðinni gegn æxli og drepið æxlisfrumur á skilvirkan hátt við ýmsar æxlislíkar aðstæður in vitro. Einnig væri hægt að framleiða hagnýta CAR-daufkyrninga í miklu magni úr hPSC til að skila nákvæmlega æxlisörumhverfissvörunum nanólyfjum til að miða á GBM in vivo, sem leiðir til samsettrar krabbameinslyfjameðferðar með öflugri og sértækri and-GBM virkni og lágmarks lyfjagjöf utan markmiðs sem lengri líftími hjá æxlisberandi músum.

Heimildir

1. Yang F. o.fl. Samvirk ónæmismeðferð við glioblastoma með tvíþættri miðun á IL-6 og CD40. Nat. Commun. 12, 3424 https://doi.org/ 10.1038/s41467-021-23832-3 (2021).

2. Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C. & Weller, M. Núverandi ástand ónæmismeðferðar við glioblastoma. Nat. Séra Clin. Oncol. 15, 422–442 (2018).

3. Agliardi, G. o.fl. Intratumoral IL-12 sending styrkir CAR-T frumu ónæmismeðferð í forklínísku líkani af glioblastoma. Nat. Commun. https://doi.org/10.1038/s41467-020-20599-x (2021).

4. Németh, T., Sperandio, M. & Mócsai, A. Daufkyrninga sem ný meðferðarmarkmið. Nat. Séra Drug Discoverv. https://doi.org/10.1038/ s41573-019-0054-z (2020).

5. Subhan, MA & Torchilin, VP daufkyrninga sem vaxandi lækningamarkmið og tæki fyrir krabbameinsmeðferð. Lífvísindi. https://doi.org/ 10.1016/j.lfs.2021.119952 (2021).

6. Cheng, YH, He, C., Riviere, JE, Monteiro-Riviere, NA & Lin, Z. Meta-greining á afhendingu nanóagna til æxla með því að nota lífeðlisfræðilega byggða lyfjahvarfalíkan og uppgerð nálgun. ACS Nano 14, 3075–3095 (2020).

7. Wilhelm, S. o.fl. Greining á afhendingu nanóagna til æxla. Nat. Séra Mater. 1, 1–12 (2016).

8. Xue, J. o.fl. Daufkyrningamiðluð krabbameinslyfjagjöf til að bæla endurkomu illkynja glioma eftir aðgerð. Nat. Nanótækni. 12, 692–700 (2017).

9. Wu, M. o.fl. MR myndgreining mælingar á bólguvirkjanlegum verkfræðilegum daufkyrningum fyrir markvissa meðferð á skurðaðgerð meðhöndluðum glioma. Nat. Commun. 9, 1–13 (2018).

10. Chu, D., Dong, X., Zhao, Q., Gu, J. & Wang, Z. Ljósnæmandi frumun æxlis örumhverfis bætir afhendingu nanómeðferðarlyfja með íferð daufkyrninga. Adv. Mater. 29, (2017).

11. Osuka, S. & Van Meir, EG Krabbameinsmeðferð: umferð daufkyrninga í nanólyfjum við krabbamein. Nat. Nanótækni. 12, 616–618 (2017).

12. Lin, YJ, Wei, KC, Chen, PY, Lim, M. & Hwang, TL Hlutverk daufkyrninga í glioma og meinvörpum í heila. Framan. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.701383 (2021).

13. Fridlender, Z. o.fl. Skautun æxlistengdrar daufkyrninga svipgerð með TGF-beta: „N1“ á móti „N2“ TAN. Krabbameinsfruma (2009).

14. Blaisdell, A. o.fl. Daufkyrningar eru á móti krabbameini í legi þekjuvefs með því að eyða súrefnisæxlisfrumum. Krabbameinsfruma 28, 785–799 (2015).

15. Mahiddine, K. o.fl. Dregur úr æxlis súrefnisskorti losar um æxlisdrepandi möguleika daufkyrninga. J. Clin. Invest 130, 389–403 (2020).

16. Yan, J. o.fl. Pólýmorphonuclear daufkyrninga úr mönnum þekkja sérstaklega og drepa krabbameinsfrumur. Oncoimmunology 3, e950163 (2014).

17. Jaillon, S. o.fl. Fjölbreytileiki daufkyrninga og mýkt í æxlisframvindu og meðferð. Nat. Séra Krabbamein 20, 485–503 (2020).

18. Li X. o.fl. Rannsóknarframfarir varðandi glioma stofnfrumur í ónæmisörumhverfi glioma. Framan. Pharmacol. https://doi.org/10. 3389/fphar.2021.750857 (2021).

19. Gieryng A., Pszczolkowska, D., Walentynowicz, KA, Rajan, WD & Kaminska, B. Immune microenvironment of gliomas. Lab. Rannsaka. https://doi.org/10.1038/labinvest.2017.19 (2017).

20. Jung E. o.fl. Mýki, misleitni og viðnám æxlisfrumna í mikilvægum örumhverfisveggjum í glioma. Nat. Commun. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21117-3 (2021).

21. Dunn GP o.fl. Vaxandi ónæmismeðferðir fyrir illkynja glioma: Frá ónæmismyndafræði til frumumeðferðar. Neuro. Oncol. (2020). https://doi.org/10.1093/neuonc/noaa154

22. Yee PP o.fl. Ferroptosis af völdum daufkyrninga stuðlar að æxlisdrepi í framvindu glioblastoma. Nat. Commun. 11, (2020).

23. Sagiv, JY o.fl. Svipgerðarfjölbreytileiki og mýkt í dreifingu daufkyrninga undirhópa í krabbameini. Cell Rep. 10, 562-573 (2015).

24. Li, Y., Hermanson, DL, Moriarity, BS & Kaufman, DS Mannlegar iPSC-afleiddar náttúrulegar drápsfrumur sem eru hannaðar með kímerískum mótefnavakaviðtökum auka æxlisvirkni. Cell Stofnfrumur 23, 181–192.e5 (2018).

25. Kim, GB o.fl. Stökkbreyttar interleukin-13 miðaðar CAR T frumur með mikilli sækni auka sendingu smellanlegra niðurbrjótanlegra flúrljómandi nanóagna til glioblastoma. Bioact. Mater. 5, 624–635 (2020).

26. Nguyen, V. o.fl. Nýtt bindilafhendingarkerfi til að sjá og nýta IL13R 2 æxlistakmarkaða lífmerkið með lækningalegum hætti. Neuro. Oncol. 14, 1239–1253 (2012).

27. Wang D. o.fl. Klórótoxínstýrðar CAR T frumur fyrir sértæka og árangursríka miðun á glioblastoma. Sci. Þýðing. Med. 12, (2020).

28. Roberts, MR o.fl. Mótefnavaka-sérhæfð frumusundrun af daufkyrningum og NK-frumum sem tjá chimeric ónæmisviðtaka sem bera zeta- eða gamma-merkjasvið. J. Immunol. 161, 375–384 (1998).

29. Chang, Y. o.fl. Verkfræði chimeric mótefnavakaviðtaka daufkyrninga úr mannlegum fjölhæfum stofnfrumum fyrir markvissa krabbameinsónæmismeðferð. Cell Rep. 40, 111128 (2022).

30. Safari H. o.fl. Daufkyrninga átfrumna helst ílengdar agnir tækifæri til sértækrar miðunar við bráða bólgusjúkdóma. Sci. Adv. 6, (2020).

31. Wang, Y. & Jönsson, F. Tjáning, hlutverk og stjórnun daufkyrninga Fc viðtaka. Framan. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu. 2019.01958 (2019).

32. Németh T. o.fl. Mikilvægi fc viðtaka-keðju ITAM týrósína við virkjun daufkyrninga og in vivo sjálfsofnæmisliðagigt. Framan. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.00252 (2019).

33. Hlutverk daufkyrninga Fc RIIa (CD32) og Fc RIIIb (CD16) fjölbreytilegra forma í átfrumumyndun á IgG1- og IgG3-ósonuðum bakteríum og rauðkornum úr mönnum. Blóðgjöf. Med. Rev. https://doi.org/10.1016/ s0887-7963(05)80094-x (1995).

34. Tsuboi, N., Asano, K., Lauterbach, M. & Mayadas, TN Mannlegir daufkyrninga Fc viðtakar hefja og gegna sérhæfðum óþarfa hlutverkum í mótefnamiðluðum bólgusjúkdómum. Ónæmi. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2008.04.013 (2008).

35. Chang, Y. o.fl. Efnafræðilega skilgreind kynslóð blóðmyndandi æðaþels úr mönnum og endanlegar blóðmyndandi frumur. Lífefni 285, 121569 (2022).

36. Brok-Volchanskaya, VS o.fl. Árangursrík og hröð myndun starfhæfra daufkyrninga úr örvuðum fjölhæfum stofnfrumum með því að nota ETV2-breytt mRNA. Stofnfrumufulltrúi 13, 1099–1110 (2019).

37. Emami Nejad A. o.fl. Hlutverk súrefnisskorts í örumhverfi æxlis og þróun krabbameinsstofnfrumna: ný nálgun til að þróa meðferð. Cancer Cell Int. https://doi.org/ 10.1186/s12935-020-01719-5 (2021).

38. Lequeux A. o.fl. Áhrif súrefnisæxlis örumhverfis og mýktar æxlisfrumna á tjáningu ónæmiseftirlitsstaða. Krabbamein Lett. (2019). https://doi.org/10.1016/j.canlet.2019.05.021 39. Takano, T., Sada, K. & Yamamura, H. Hlutverk prótein-týrósín kínasa Syk í oxunarálagsboðum í B frumum. Andoxunarefni Redox Signal. https://doi.org/10.1089/15230860260196335 (2002).

40. Zhang J. o.fl. ROS og ROS-miðluð frumuboð. Oxidat. Med. Cell. Langlífi. https://doi.org/10.1155/2016/4350965 (2016).

41. Kawakami Y. o.fl. Ras virkjunarleið sem er háð Syk fosfórun próteinkínasa C. Proc. Natl. Acad. Sci. BANDARÍKIN. https://doi.org/10.1073/pnas.1633695100 (2003).

42. Mócsai, A., Ruland, J. & Tybulewicz, VLJ The SYK tyrosine kínasi: Mikilvægur leikmaður í fjölbreyttum líffræðilegum aðgerðum. Nat. Séra Immunol. https://doi.org/10.1038/nri2765 (2010). 43. Liu B. o.fl. Æxlis-örumhverfissvörun nanósamsetning fyrir brennisteinsvetnisgas og trimodal-bætt ensím dynamic Therapy. Adv. Mater. https://doi.org/10.1002/adma. 202101223 (2021).

44. Nguyen, GT, Green, ER & Mecsas, J. Neutrophils to the ROScue: Mechanisms of NADPH oxidase activation and bakterial resistance. Framan. Cell. Smitast. Örverur. https://doi.org/10.3389/fcimb.2017. 00373 (2017).

45. Che J. o.fl. Daufkyrningar gera kleift að senda lípósóm á staðnum og ekki ífarandi til bólgu í beinagrindarvöðva og blóðþurrðarhjarta. Adv. Mater. 32, (2020).

46. ​​Le, RQ o.fl. Samþykki FDA: tocilizumab til meðferðar á alvarlegu eða lífshættulegu cýtókínlosunarheilkenni af völdum chimeric mótefnavakaviðtaka T frumu. Krabbameinslæknir 23, 943–947 (2018).

47. Morris, EC, Neelapu, SS, Giavridis, T. & Sadelain, M. Cytokine losunarheilkenni og tengd taugaeiturhrif í ónæmismeðferð með krabbameini. Nat. Séra Immunol. 22, 85–96 (2022).

48. Liang, J. o.fl. Daufkyrningar stuðla að illkynja glioma svipgerð í gegnum S100A4. Clin. Cancer Res. 20, 187–198 (2014).

49. Nagarajan S. o.fl. Frumu-sértæk, virkjunarháð stjórnun á daufkyrningum CD32A bindilsbindandi virkni. Blóð https://doi.org/ 10.1182/blood.v95.3.1069.003k14_1069_1077 (2000).

50. Fanger, MW, Shen, L., Graziano, RF & Guyre, PM Frumueiturhrif miðlað af Fc viðtökum manna fyrir IgG. Immunol. Í dag. https:// doi.org/10.1016/0167-5699(89)90234-X (1989).

51. Lee, YG o.fl. Reglugerð um eiturverkanir sem líkjast CAR T frumu-miðlaðri frumulosunarheilkenni með því að nota millistykki með lágan mólþunga. Nat. Commun. 10, 2681 (2019).

52. Kagoya, Y. o.fl. Nýr chimeric mótefnavakaviðtaki sem inniheldur JAK-STAT merkjasvið miðlar betri æxlisáhrifum. Nat. Med. 24, 352–359 (2018).

53. Aghajanian H. o.fl. Miða á bandvefsmyndun í hjarta með verkuðum T-frumum. Náttúran. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1546-z (2019).

54. Zhang C. o.fl. ErbB2/HER2-sértækar NK frumur fyrir markvissa meðferð á glioblastoma. J. Natl. Cancer Inst. https://doi.org/10.1093/jnci/ djv375 (2016).

55. Akhavan D. o.fl. CAR T frumur fyrir heilaæxli: Lærdómur og leiðin framundan. Immunol. Rev. https://doi.org/10.1111/imr.12773 (2019).

56. Ómar, NB o.fl. Gögn um öryggi og bráðabirgðalifun eftir gjöf innan höfuðkúpu á M032, erfðabreyttu krabbameinslyjandi HSV-1 sem tjáir IL-12, hjá gæludýrahundum með sporadísk glioma. Taugaskurðlæknir. Fókus 50, 1–11 (2021).

57. Larson, RC & Maus, MV Nýlegar framfarir og uppgötvanir í aðferðum og virkni CAR T frumna. Nat. Séra Krabbamein 21, 145–161 (2021).

58. Wang, B. o.fl. Myndun á ónæmisvaldandi T-frumum úr erfðabreyttum ósamgena, fjölhæfum stofnfrumum af mönnum. Nat. Biomed. Eng. 5, 429–440 (2021).

59. Deuse, T. o.fl. Ofnæmisvaldandi afleiður framkallaðra fjölhæfra stofnfrumna forðast ónæmishöfnun hjá fullkomlega ónæmishæfum ósamgena viðtakendum. Nat. Líftækni. 37, 252–258 (2019).

60. Han X. o.fl. Framleiðsla á ónæmisvaldandi fjölhæfum stofnfrumum úr mönnum. https://doi.org/10.1073/pnas.1902566116

61. Kwon YW o.fl. HLA DR Erfðamengi klipping með TALENs í mönnum iPSCs framleiddi ónæmisþolnar dendritic frumur. Stofnfrumur Int. https://doi.org/10.1155/2021/8873383 (2021).

62. Morizane A. o.fl. MHC samsvörun bætir ígræðslu iPSC-afleiddra taugafrumna í prímötum sem ekki eru úr mönnum. Nat. Commun. https://doi. org/10.1038/s41467-017-00926-5 (2017).

63. Lin, K. o.fl. Hönnun efna sem byggir á vélbúnaði sem beinast sértækt á lyfjaónæm glioma. Sci. (80-.) 377, 502–511 (2022).

64. Fan Y. o.fl. Að miða á margar frumudauðaleiðir lengir geymsluþol og varðveitir virkni daufkyrninga úr mönnum og músum fyrir blóðgjöf. Sci. Þýðing. Med. 13, (2021).

65. Chang Y. o.fl. Flúrljómandi vísbendingar fyrir samfellda og ættarsértæka skýrslu um frumuhringsfasa í fjölhæfum stofnfrumum manna. Líftækni. Bioeng. bit.27352. https://doi.org/10.1002/bit. 27352 (2020).

66. Jung, J. o.fl. Efnafræðilega skilgreind kynslóð af endanlegum blóðmyndandi stofn- og forfrumum úr mönnum. STAR Protoc. 4, 101953 (2023).