Kalpastatín kemur í veg fyrir angíótensín II-miðlaðan kjarnafrumuskaða með viðhaldi sjálfsáts

fyrir frekari upplýsingar:ali.ma@wecistanche.com

Imane Bensaada^1,3, Blaise Robin^1,3, Joe¨lle Perez², Yann Salemkour¹, Anna Chipont¹, Marine Camus¹, Mathilde Lemoine¹, Lea Guyonnet¹, He´le`ne Lazareth¹, Emmanuel Letavernier², Carole He'nique¹,Pierre-Louis Tharaux¹og Olivia Lenoir¹

¹Université de Paris, PARCC, Inserm, París, Frakklandi; og²Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, París, Frakklandi

Sterkt forspárgildi próteinmigu í langvinnum gauklasjúkdómum er staðfastlega staðfest sem og sjúkdómsvaldandi hlutverk angíótensíns II sem stuðlar að framgangi gauklasjúkdóms með breyttri gauklasíunarhindrun, skaða á kjarnafrumum og örmyndun á gaukla. Hér komumst við að því að langvarandi háþrýstingur af völdum angíótensíns II hamlaðisjálfsáhrifútstreymi í músahnoðra. Eyðing á Atg5 (geni sem kóðar prótein sem tekur þátt í sjálfsát) sérstaklega í fræfrumunni leiddi til hraðari dangio tensín II-framkallaðrar frumukvilla, aukinni albúmínmigu og glomerulosclerosis. Þetta gefur til kynna að sjálfsát sé lykilvörn í frumufrumu í þessu ástandi. Angiotensin-II framkallað calpain virkni í fræfrumum hamlarsjálfsáhrifútstreymi. Frumfrumur úr músum með erfðabreyta tjáningu á innræna calpain hemlinumkalpastatínsýndi hærri podocytesjálfsáhrifí upphafi sem var ónæmur fyrir angíótensín II háðri hömlun. Einnig viðvarandi sjálfsát meðkalpastatíntakmarkaðar skemmdir á fræfrumum og albúmínmigu. Þessar niðurstöður benda til þess að háþrýstingur hafi sjúkdómsvaldandi áhrif á gauklabyggingu og virkni, að hluta til með því að virkja calpains sem leiðir til blokkunar á sjálfsát kjarnafrumna. Þessar niðurstöður afhjúpa upphaflegan aðferð þar sem angíótensín II miðlaður háþrýstingur hamlar sjálfsát með kalsíumvöldum nýliðun calpains með sjúkdómsvaldandi afleiðingum ef ójafnvægi erkalpastatínstarfsemi. Þannig kemur í veg fyrir calpain-miðlaða lækkun ásjálfsáhrifgæti verið efnileg ný meðferðaraðferð fyrir nýrnakvilla sem tengjast mikilli virkni renín-angíótensínkerfisins.

LYKILORÐ: angíótensín II;sjálfsáhrif; kalpastatín; háþrýstingur; podocyte

Þýðingaryfirlýsing

Í ljósi mikilvægs hlutverks autophagy í þróunnýrusjúkdóma, lyfjafræðileg mótun ásjálfsáhrifgæti verið vænleg stefna til að koma í veg fyrir og meðhöndla nokkranýrusjúkdóma. Samhliða kom í ljós að ofvirkni calpainvirkni í fræfrumum hafði skaðleg áhrif á virkni fræfrumna á meðan skaðleg verkunarháttur þess var ekki auðkenndur. Hér gefum við vísbendingar um að calpain tengir skaðlega verkun angíótensíns II við skaðlega blokkun ásjálfsáhrifí fræfrumum og benda til þess að calpain hömlun gæti verið vænlegt lækningalegt skotmark fyrir fræfrumusjúkdóma að hluta til með því að viðhalda sjálfsát fræfrumna.

Smelltu til aðCistanche deserticola ma fyrir langvinnan nýrnasjúkdóm

Háþrýstingur er næst á eftir sykursýki sem leiðandi orsök versnandi langvarandinýrusjúkdómur 1–3 og jafnvel hófleg hækkun á blóðþrýstingi er sjálfstæður áhættuþáttur nýrnasjúkdóms á lokastigi.4 Sífellt fleiri tilraunarannsóknir hafa sýnt fram á mikilvægi fræfrumna í þróunnýrumeiðsli. Sífellt tap á fræfrumum og smáæðabreytingar koma snemma fram með hnignun á starfsemi nýrna í nýrnakvilla með háþrýstingi.5 Hjá sjúklingum var sýnt fram á að útskilnaður lífvænlegra fræfrumna í þvagi væri viðkvæmt og sértækt merki fyrir meðgöngueitrun,6,7 og sjúklingar með nýrnakölkun höfðu marktækt minni þéttleiki gauklafruma en gerðinýrugjafa.8,9 Ennfremur er sjúkdómsvaldandi hlutverk angíótensíns II (AngII) sem stuðlar að framgangi gauklasjúkdóms vel staðfest, ekki aðeins við háþrýsting heldur einnig við nokkra gauklasjúkdóma.10–21

Glomerular háþrýstingur leiðir til gauklaháræða teygja, æðaþelsskemmda og aukinnar gauklaprótínsíun sem veldur gauklahruni og gauklakölkun. Það hefur einnig bein áhrif á gauklabyggingar, sem veldur boðefnaviðbrögðum sem miða að því að bæta upp. Virkjað almennt og staðbundið renín-angíótensín-aldósterónkerfi (RAAS) stuðlar að ofvöxtum í mesangíum og myndun æðagegndræpisþátta. Samhliða birta fræfrumur kalsíumboð22,23 og breyta lögun sinni við AngII type 1 viðtaka (AT1)-háða örvun.24–28 Þessir aðlögunaraðferðir verða vanaðlögunarhæfar til lengri tíma litið og leiða loks til gauklakölkun. AT1 miðlar áberandi RAAS þátttöku fyrir blóðþrýsting og salt- og vatnsjafnvægi. Angíótensín-umbreytandi ensímhemlar og AT1 blokkar eru klínískt notaðir til meðferðar á háþrýstingi og hjartabilun hjá sjúklingum. Athyglisvert er að báðir blokkarar sýna einnig verndandi áhrif ánýruvirka.

Sýnt var fram á að sjálfsát væri nauðsynlegt til að viðhalda frumujafnvægi, einkum í frumum eftir kímfrumna29,30 og sérstaklega í fræfrumum.31–34Autophagyer leysitengd niðurbrotskerfi fyrir langlífa umfrymisprótein og óvirk frumulíffæri35,36 og felur í sér bindingu próteina og frumulíffæra í sjálfsátfrumum. Myndun autophagosomes er háð örvun nokkurra gena þar á meðal Map1lc3a/b, Beclin 1 og Tags. 37 Það eru vaxandi vísbendingar um að vanstjórnun á sjálfsátsferlinu tengist meingerð nýrnaöldrunar og nokkurranýrusjúkdóma eins og bráðan nýrnaskaða, fjölblöðru nýrnasjúkdóm, öldrun og nýrnakvilla af völdum sykursýki.31,32,38–41

Reglugerð umsjálfsáhrifí fræfrumum, lífeðlisfræðilegum og umfram allt í sjúklegu samhengi, er ekki vel þekkt. Við sýndum nýlega fram á að sjálfsát kjarnafrumna er óháð vélrænu markmiði rapamýsíns (mTOR) stjórnun við lífeðlisfræðilegar aðstæður, sem gerir þessa frumutegund að undantekningu.42 AT1 virkjun örvar próteinmyndun og próteinveltu í frumum. Þannig rökstuddum við að virkjun RAAS gæti einnig haft áhrif á örvun próteinsveltu og próteinstöðugleika.

Í þessari rannsókn einbeittum við okkur að hlutverki AngII-merkja í fræfrumumsjálfsáhrifreglugerð. Við greindum kalsíumvirkjaða próteasana calpains sem miðla langvarandi blokkandi áhrifum AngII á frumufrumursjálfsáhrif. Ennfremur komumst við að því að innræn calpain hemillkalpastatíntókst að koma í veg fyrir AngII-háða sjálfsátahömlun og skaða á fræfrumum við háþrýsting.

Þessar niðurstöður afhjúpa upprunalegan aðferð þar sem AngII-miðlaður háþrýstingur hamlarsjálfsáhrifmeð kalsíumvöldum nýliðun kalpaíns með sjúkdómsvaldandi afleiðingum ef ójafnvægi er af völdum kalpastatínvirkni.

AÐFERÐIR

Dýr

Kalpastatínerfðabreyttum (CSTTg) músum var vinsamlegast útvegað af Dr. E. Letavernier.43 Mýs með fræfrumusértæka truflun á Atg5 geninu (Nphs2.cre Atg5lox/lox) voru búnar til eins og áður hefur verið lýst31 með því að krossa Nphs2.cre mýs44 með Atg5lox/lox mice45 á C57BL6/J bakgrunninum. Nphs2.cre Atg5lox/lox mýs og viðmiðunarkörlum, á aldrinum 10 til 12 vikna, voru notaðar í þessari rannsókn. Háþrýstingslíkanið var framkallað með sc innrennsli AngII (Sigma-Aldrich, A9525) í skammtinum 1 mg/kg/mín í 4 til 6 vikur með osmótískum minipumpum (Alzet Corp, líkan 2006). Dælur voru settar í sc á bakið á milli herðablaða og mjaðma. Mýs fengu saltuppbót (3 prósent NaCl) í mat. Atg5lox/lox (villigerð [WT]) mýs voru notuð sem viðmið í öllum rannsóknum. Fyrir deoxýkortikósterón asetat (DOCA) salt með nýrnaminnkunarlíkaninu fóru fullorðnar karlkyns mýs í einhliða vinstri nýrnabrottnám. Tveimur vikum eftir nýrnabrottnám fengu þeir DOC köggla með 21-dagsútgáfunni (Innovative Research of America) ígrædda sc. Önnur köggla var ígrædd 3 vikum eftir fyrstu ígræðsluna. Allar mýs fengu 0,9 prósent NaCl í drykkjarvatni eftir frjálsum vilja og voru drepnar eftir 6 vikna DOC gjöf.46 Tilraunir voru gerðar samkvæmt frönskum dýralæknareglum og þeim sem Evrópubandalagið hefur sett saman til notkunar á dýrum (L358-86/ 609EEC) og voru samþykktar af franska rannsóknarráðuneytinu og siðanefnd háskólarannsókna á staðnum (APAFIS-7646 og -22373).

Frumfrumuræktunartilraun

Aðgreindar frumfrumur voru ræktaðar eins og áður hefur verið lýst.47,48 Í stuttu máli var nýeinangruðum nýrnaberki blandað og melt með kollagenasa I (Gibco, 17100-017) í Roswell Park Memorial Institute 1640 (Life Technologies, 61870-044). Síðan var farið í gegnum 70 mm og 40 mm frumusíum (BD Falcon, 352340 og 352350). Glomeruli, sem festast við 40 mm frumusíuna, voru fjarlægð með fosfat-bufferðri saltlausn (PBS; Life Technologies, 10010023) þ 0,5 prósent nautgripasermi albúmín (Eurobio, HALALB07-65) sprautað undir þrýstingi og síðan þvegin tvisvar í PBS. Nýeinangruð glomeruli voru húðuð í 6-brunnsdiskum í Roswell Park Memorial Institute 1640 (Gibco, 61870036) sem bætt var við 10 prósent fósturkálfasermi og 1 prósent penicillín/streptomycin (Life Technologies, 15140122) til að hleypa út hnoðfrumur og vaxa. Podocyte auðgun var sannreynd með Western blot greiningu eins og áður hefur verið lýst31,48,49 (viðbótarmynd S1). Podocytes voru ræktaðar í fjarveru eða viðveru bafilomycin A1 (100 nmól/l, Sigma-Aldrich, B1793) í 4 klst. Fyrir tilraunir með ónæmisflúrljómun voru frumfrumur húðaðar á 4 diskamerkingar (Dutcher, 055071). Frumfrumur voru síðan festar í paraformaldehýði 4 prósent í 10 mínútur og unnar fyrir ónæmisflúrljómun.

Calpain virkni próf

Innanfrumuvirkni calpain var ákvörðuð í frumfrumufrumum, eins og áður hefur verið lýst.50–52 Alls voru 100,000 frumur ræktaðar í 24-brunn vefjaræktunardiskum í Roswell Park Memorial Institute 1640 með 10% fóstri. kálfasermi og 1 prósent penicillín/streptomycin. Eftir tilgreint ræktunartímabil var efnið skipt út fyrir Krebs-Ringer HEPES bíkarbónat (KRH) lausn (pH 7,4) sem innihélt 4 mM CaCl2, með eða án 10 mM calpain hemla-1 og ræktað í 10 mínútur áður en bætt var við af 50 mM kalpaín hvarfefni N-súkkínýl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amínó-4-metýlkúmarín (Sigma-Aldrich, S6510). Eftir 90-mínútna ræktunartíma var kalpaínvirkni ákvörðuð sem munurinn á FL flúrljómun (mældur við 360 nm örvun og 430 nm losun) með og án calpain hemla-1.

Western blot

Primary podocytes voru rispaðir með 80 ml af geislaónæmisútfellingarprófunarbuffi sem innihélt fosfatasa og próteasahemla. Próteinstyrkur var mældur með BCA Protein Assay Kit (Merck Biochemistry, 71285). Tuttugu míkrógrömm af próteinum voru rafskorin á Criterion XT forsteypt hlaupi (12 prósent Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124). Prótein voru flutt yfir á pólývínýlíden tvíflúoríð himnu (Thermo Fischer Scientific, 88518). Eftir lokun í 5 prósent mjólk í Tris Buffer Saline 0,1 prósent Tween (TBS-T), voru himnur ræktaðar með kanínu fjölstofna and-LC3 (1:1000, Cell Signaling Technology, 2575), kanínu fjölstofna and-ATG5 (1:2000, Cell Signaling Technology, 2630), polyclonal and-Sequestosome 1 (SQSTM1)/P62 (1:10.000, PROGEN, GP62), kanína polyclonal anti-calpain 1 lén IV (1:1039, abcam, ), kanína fjölstofna and-calpain 2 amínóenda enda léns I (1:1000, Abcam, ab39165), mús einstofna IgG1 anti-calpain 4 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, sc-32325), kanína and-podocin (1:1000, Abcam, ab50339), naggrís-anti-nephrin (1:500, PROGEN, GP-N2) og einstofna and-túbúlín frá rottum (1:5000, Abcam,ab6160) mótefni. Eftir þvott voru himnur ræktaðar með piparrótarperoxidasa-tengdu mótefni (1:2000, Cell Signaling Technology, 7074, 7076, 7077). Greining ákveðinna merkja var framkvæmd með því að nota ECL Chemiluminescent Kit (Bio-Rad, 170-5070) á LAS 4000 tæki (Fuji). Þéttmælingagreining með ImageJ hugbúnaði (National Institute of Health) var notuð til magngreiningar.

Blóðþrýstingsmælingar og lífeðlisfræðilegt mat

Slagbilsþrýstingur músa var skráður með tail-cuff aðferð (Visitech Systems Inc., BP-2000). Tíu mælingar voru teknar af hverri mús og síðan var meðalgildi ákvarðað. Slagbilsþrýstingur var mældur í upphafi (12 vikna aldur) og síðan vikulega til loka meðferðartímabilsins. Allar mýsnar voru settar í efnaskiptabúr með frjálsan aðgang að vatni í 6-klukkutíma þvagsöfnun. Styrkur kreatíníns í þvagi og þvagefnis í plasma var greind með litrófsmælingu með litamælingu (Olympus, AU400). Útskilnaður albúmíns í þvagi var mældur með því að nota sérstakt ensímtengd ónæmissogandi prófun til að ákvarða magn albúmíns í músaþvagi (Crystal Chem, 80630).

Vefjafræði

Nýruvoru safnað og fest í 4 prósent PBS-bufferuðu formalíni. Parafín-innfelldir hlutar (3- mm þykkir) voru litaðir með Masson'strichrome til að meta formgerð nýrna. Frávik í nýrum voru flokkuð á grundvelli tilvistar og alvarleika óeðlilegra þátta, þar með talið gauklakölkun, þenslu í skeifu, rýrnun í píplum eða gips og bandvefsmyndun. Hlutfall sclerotic glomeruli var metið með blindri skoðun á að minnsta kosti 50 glomeruli pr.nýrukafla.

Ónæmisflúrljómun litun á nýrnahlutum og frumfrumum

Fastar frumfrumur voru stíflaðar í TBS-T 3 prósenta sermi albúmíni úr nautgripum og ræktaðar yfir nótt við 4 gráður með aðal mótefni naggrísa and-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C) og kanínumótefni -grænt FL flúrljómandi prótein (GFP; 1:500, Abcam, ab290). Eftir TBS-T skolun, FL flúorófór-tengd aukamótefni asna gegn naggrísum IgG AF594-samt mótefni (JacksonImmunoResearch, 706-585-148) og asna gegn kanínu IgG AF488-samt mótefni ( Invitrogen, A21206) var beitt. Myndir voru teknar með Zeiss 2 feta flúrsmásjá, AxioCam HRccamera og Axiovision 4.3 hugbúnaði.

Fyrir formalín-bundið paraffín-innfellt (FFPE)nýru, hlutar (3 mm) voru afparaffínaðir og vökvaðir og mótefnavaka endurheimt var framkvæmd í hitaðri sítratbuffi (pH 6). Hlutar voru síðan gegndræpnir með Triton 0.1 prósent (Euromedex) og lokaðir í TBS-T 3 prósent nautgripasermi albúmíni fyrir mótefnaræktun yfir nótt við 4 C. Við notuðum geita-anti-nephrin (1:100, PROGEN, GP -N2), naggrísa andstæðingur-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C), kanína andstæðingur-GFP(1:1000, Abcam, ab290), geita and-Podocalyxin (PODXL; 1: 1000, Bio-Techne, AF-1556), og kanínumótefni gegn Wilms æxli 1 (WT1;1:100, Abcam, ab192). Auka mótefni voru Alexa488– og Alexa 568–sambönd mótefni frá Invitrogen. Kjarnar voru litaðir í bláum lit með Hoechst. Rennibrautir voru settar upp með því að nota flúrljómandi festingarmiðil (Dako, S3023). Ljósmyndir voru teknar með Zeiss Axiophot smásjá og Axiovision hugbúnaði. Hálfsjálfvirkar magngreiningar á Fiji voru notaðar til að mæla nephrin-jákvæð svæði og PODXLþ svæði á gauklahluta á að minnsta kosti 30 glomeruli á mús. Podocytentala var talin sem fjöldi WT1þ kjarna á hvern gauklahluta á að minnsta kosti 30 gaukla á mús.

Sendingarrafeindasmásjáraðferð

Litlir bitar af nýrnaberki (1 mm3) voru festir í 3 prósent glútaraldehýðgráðu (rafeindasmásjárfræði) í 1 til 3 0 daga og þvegin þrisvar sinnum í PBS. Sýni voru eftirfestuð í 1 prósent osmíumtetroxíði 0.1 M (rafeindasmásjárfræði) í 0,1 M PBS (pH 7,4) og þvegin í vatni. Sýni voru þurrkuð í alkóhólflokkum og 100 prósent própýlenoxíði (rafeindasmásjárfræði). Íferð plastefnis var framkvæmd sem hér segir: Blandið Epikote 812 og própýlenoxíði í hlutfallinu 1:1 í 30 mínútur og síðan blandað Epikote 812 og própýlenoxíði í hlutfallinu 1:2 fyrir stofuhita yfir nótt. Sýni voru felld inn í 4 mm gelatínhylki í 100 prósent Epikote 812 og fjölliðuð í ofni sem var hitaður í 60 C. Ofurþunnir hlutar voru skornir með UFC7 ultramicrotome (Leica MicrosystemsGmbH) og settir á Gilder Grids 200 möskva (Electron Microscopy Science). Þau voru mótlituð með 7% úranýlasetati (LFG Distribution) og Reynold's blýsítrati (LFG). Sýni voru skoðuð í JEM1011 rafeindasmásjá (JEOL) með Orius SC1000 CCD myndavélinni (Gatan), sem stjórnað var með Digital Micrograph hugbúnaði (Gatan) til töku.

Cistanche-nýrnasjúkdómur

Magnbundin pólýmerasa keðjuverkunarfylki

Nýeinangruð glomeruli voru fryst í QIAzol Lysis hvarfefni (Qiagen) við -80 gráðu. Heildar-RNA útdráttur með fenól-undirstaða aðferð var unnin í samræmi við ráðleggingar framleiðanda. cDNA voru mynduð með því að nota RT2 First Strand Kit (Qiagen, 330401), og rauntíma pólýmerasa keðjuverkun (PCR) var framkvæmd með því að nota sérsniðna RT2 Profiler PCR Array (Qiagen, CLAM36771C) með RT2 SYBR Green qPCR Mastermix (Qiagen, 330502) . Magn PCR plöturnar voru keyrðar á Applied Biosystems StepOnePlus hringrás. Hvert fylki inniheldur gæðaeftirlit fyrir skilvirkni öfugumritunar og erfðafræðilegri DNA mengun. Megindleg PCR greining var gerð með 2-DDCT aðferðinni með hjálp GeneGlobe Data Analysis Center (www. Qiagen. com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page) og tjáð sem Log2 falt breyting á genatjáningu.

Í silico proteomic greiningu

Í silico spá um calpain klofningssvæðið var gert með DeepCalpain (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org) og CaMPDB (http:// calpain.org/) verkfæri á netinu. Amínósýruröð músapróteina var fengin frá Uniprot (https://www.uniprot.org). Niðurstöðurnar eru endurteknar í aukatöflum S1 og S2.

Tölfræðilegar greiningar

Öll línurit tákna einstök gildi og meðaltal±SEM. Tölfræðilegar greiningar voru gerðar með GraphPad Prism hugbúnaði, útgáfu 9. Samanburður á milli hópanna 2 var gerður með því að nota parametric Student t-próf ​​þegar sýni stóðust Anderson-Darling og D'Agostino eðlilegleikaprófin og F próf fyrir dreifnijafnrétti. Annars var notað Mann-Whitney próf sem ekki var parametrískt. Samanburður á milli margra hópa var gerður með því að nota 1-leið eða 2-vega greiningu á dreifni og fylgt eftir með margþættu samanburðarprófi með leiðréttingu Simaks. Gildi P < 0.05="" voru="" talin="" marktæk.*p="">< 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>

Mynd 1|Angíótensín II (AngII) D hásaltfæði (HSD) framkallaður háþrýstingur hamlar gauklasjálfsáhrif. (a–c) Ónæmisflúrljómun Podocalyxin (PODXL; rautt) og P62 (grænt) í glomeruli (a,a0) frá villigerð (WT) músum, (b,b0) frá WT mýs eftir 6 vikna AngII þ HSD, og ​​(c,c0) frá Nphs2.cre Atg5lox/lox músum sem sýna uppsöfnun P62 í fræfrumum við háþrýsting og í fræfrumusértæku ATG{{1{{12 }}}}snauður mýs. Örvahausarnir gefa til kynna P62þ punkta í WT í (a0 ). Kjarnar voru mótlitaðir með Hoechst (bláum). Myndundirhlutar með prime benda til meiri stækkunar. Barir=50 mm. (d) Tengd magngreining á P62þ svæðinu gefið upp sem hundraðshluti gauklasvæðisins. n=4 WT mýs og n=5 WT með AngII þ HSD, og ​​Nphs2.cre Atg5lox/lox mýs. Gildi eru sett fram sem einstök reiti og meðaltal±SEM. Mann-Whitney próf: *P=0.0159. Til að hámarka áhorf á þessa mynd, vinsamlegast skoðaðu netútgáfu þessarar greinar á www.nýru-international.org.

NIÐURSTÖÐUR

Háþrýstingur af völdum AngII D mataræðis með háum salti hamlaði sjálfsát fræfrumna

Podocytes sýna mikið magn afsjálfsáhrifin vivo, eins og sýnt er af sterkri GFP tjáningu í erfðabreyttum músum með GFP samruna við LC3 (GFP-LC3 mýs), lykilmerki sjálfsáts (viðbótarmynd S2A). Autophagy er kraftmikið ferli með stöðugri myndun autophagosomes og niðurbroti autophagolysosomes. Hindrun sjálfsáts niðurbrots með klórókíni leiddi til uppsöfnunar GFPþ punkta, sem gefur til kynna mikið sjálfsátflæði í fræfrumum (viðbótarmyndir S2A og B). Staðfesting á því að GFPþ punktar væru sjálfsátsflögur kom fram með tvöföldu ónæmis- FL flúrljómun fyrir GFP og SQSTM1/P62, fylgjendaprótein sem er brotið niður afsjálfsáhrif(Viðbótarmynd S2C og D). Aftur olli klórókínmeðferð uppsöfnun GFPþ P62þ punkta, sem sýnir mikilvægt sjálfsátflæði í fræfrumum. Að lokum var mikið sjálfsátflæði varðveitt in vitro eins og sýnt er með tjáningu GFP og P62 í frumfrumum einangruðum úr GFP-LC3 músum og sterkri uppsöfnun GFPþ og P62þ punkta við meðferð með bafilomycin A1, annar blokkari sjálfsáts niðurbrots (viðbótarmynd S2E–H) .

Geta háþrýstings til að móta sjálfsátssvörun fræfrumna var síðan metin hjá músum sem fengu AngII með innrennsli með saltríku fæði (HSD) í 6 vikur og í samanburðarhópum sem ekki höfðu háþrýsting. Eins og sést á mynd 1, olli AngII þ HSD uppsöfnun P62 í gaukla með sterkri uppsöfnun í fræfrumum, sem bendir til þess að AngII þ HSD hafi verið ábyrgur fyrir fræfrumumsjálfsáhrifblokkun (mynd 1a–d). Athyglisvert er að P62 uppsöfnun í fræfrumum var svipuð þeirri sem sást í músum sem skorti á sjálfsát fræfrumna (Nphs2.cre Atg5lox/lox músum). Í öðru líkani af háþrýstingi, DOC-salt líkaninu, sáum við einnig stigvaxandi P62 uppsöfnun í fræfrumum á meðan sjúkdómurinn stóð yfir (viðbótarmynd S3).

Eyðing á Atg5 sérstaklega í fræfrumum veldur aukinni albúmínmigu, fræfrumatapi og gauklaskaða í AngII D HSD líkaninu

Við skoðuðum síðan hvortsjálfsáhrifblokkun aðeins í fræfrumum (Nphs2.cre Atg5lox/lox músum) hefur áhrif á gauklaskaða í AngII þ HSD líkaninu. Við staðfestum fyrst að Nphs2. cre Atg5lox/lox mýs voru með eðlilegan blóðþrýsting, eðlilegannýruvirkni, og engar gauklavefjaskemmdir fyrr en 10 mánaða aldur, eins og áður hefur verið greint frá (viðbótarmynd S4).32 Síðan, Atg5lox/lox (WT) og Nphs2. cre Atg5lox/lox músum var gefið AngII með HSD í 6 vikur. Mikilvægt er að slagbilsþrýstingur var svipaður í hópunum 2 eftir AngII innrennsli meðan á rannsókninni stóð (Mynd 2a), þó að hala-manssaðferðin sem notuð var til að mæla blóðþrýsting gæti ekki haft getu til að leysa lítinn blóðþrýstingsmun. AngII innrennsli með HSD jók verulega hlutfall albúmíns og kreatíníns í þvagi í WT músum og þessi áhrif jukust enn frekar í Nphs2.cre Atg5lox/lox músum (Mynd 2b). Nphs2.cre Atg5lox/lox mýs með háþrýstingi sýndu einnig marktækt aukna gauklaslit í samanburði við WT gotfélaga (mynd 2c–e). Í samræmi við mælda próteinmigu voru próteinkennd steypur og pípuútvíkkun marktækt algengari hjá músum með skort á fræfrumum í ATG5 (mynd 2f–h).

Mynd 2|Eyðing Atg5 sérstaklega í fræfrumum leiðir til marktækrar aukningar á albúmínmigu,nýrumeiðslum og tapfrumum eftir 6 vikna angíótensín II (AngII) innrennsli D saltfæði (HSD). (a) Slagbilsþrýstingur í Atg5lox/lox og Nphs2.cre Atg5lox/lox músum í 36 daga AngII þ HSD. n=9 mýs á hverja arfgerð. Gildi eru sett fram sem meðaltal±SEM. Tvíhliða dreifnigreining (ANOVA): ns. Í (b–m), n=10 músum á hverja arfgerð. Í (b,g,h,k) eru gildi sett fram sem einstök reiti og meðaltal±SEM. (b) AngII þ HSD (framhald)

Mynd 2|(framhald) leiddi til stórkostlegrar aukningar á albúmínmigu í Nphs2. cre Atg5lox/lox mýs samanborið við Atg5lox/lox viðmiðunarmýs. Tvíhliða ANOVA: arfgerð, P=0.013; tími, P=0.0018. (c–f) Fulltrúarmyndir af Masson's trichrome-lituðum hlutum af glomeruli frá Atg5lox/lox stjórn og Nphs2.cre Atg5lox/lox músum eftir 6 vikna AngII þ HSD. Barir=50 mm í (c,d). Barir=100 mm í (e,f). (g,h) Samanburður (g) á hlutfalli sclerotic glomeruli og (h) á fjölda pípulaga kasta á smásjásviði. Mann-Whitney próf: **P=0.0026 tommur (h), ***P=0.0003 tommur (g). (i,j) Fulltrúar ónæmisflúrljómunarmyndir af tjáningu Wilmʼs Tumor 1 (WT1; rauður) og Podocalyxin (PODXL; grænn) í glomeruli frá Atg5lox/lox stjórn og Nphs2.cre Atg5lox/lox músum eftir AngII þ HSD í 6 vikur. Kjarnar voru litaðir með Hoechst (bláum). Barir=50 mm. (k) Magngreining á fjölda WT1þ frumna á hvern gauklahluta. Mann-Whitney próf: **P=0.0029 tommur (l,m). Fulltrúar ónæmisflúrljómunarmyndir af tjáningu CD44 (grænt) í glomeruli frá Atg5lox/lox stjórn og Nphs2.cre Atg5lox/lox músum eftir AngII þ HSD í 6 vikur. Kjarnar voru litaðir með Hoechst (bláum). Barir=50 mm. (n,o) Fulltrúar rafeindasmásjárljósmyndir af sneiðum af gaukla úr Atg5lox/lox stjórn og Nphs2.cre Atg5lox/lox músum eftir AngII þ HSD í 6 vikur, sem sýnir útrýmingu á fótfrumnafótum (örvahausa) í háþrýstingi Nphs2. cre Atg5lox/lox mýs. Barir=1 mm. n=3 mýs á hverja arfgerð. Til að hámarka áhorf á þessa mynd skaltu skoða netútgáfu þessarar greinar á www.kidney-international.org.

Mynd 3|Calpain tjáning og virkni í fræfrumum. (a) Western blot greining á tjáningu calpain-1, calpain-2 og calpain-4 í frumfrumum. Tjáning túbúlíns þjónar sem eðlileg staðhæfing. (b) Calpain virkni var mæld á frumfrumufrumum sem voru meðhöndluð eða ekki meðhöndluð með angíótensíni II (AngII; 100 nM) í 24 klukkustundir með eða án kalpeptíns (10 mM). n=5 óháðar tilraunir. Gildi eru sett fram sem einstök reiti og meðaltal±SEM. Einhliða dreifnigreining (ANOVA): meðferð, P=0.0035. Margfalt samanburðarpróf Sidak: *P=0.0128 fyrir AngII á móti grunnlínu, ##P=0.0056 fyrir AngII þ calpeptin á móti AngII. (c) Calpain virkni var mæld á frumfrumufrumum úr villigerð (WT) eðakalpastatínerfðabreyttar (CSTTg) mýs meðhöndlaðar eða ekki meðhöndlaðar með AngII (100 nM) í 24 klst. n=7 óháðar tilraunir. Gildi eru sett fram sem einstök reiti og meðaltal±SEM. Tvíhliða ANOVA pöruð til meðferðar: arfgerð, P=0.0483. Margfalt samanburðarpróf Sidak: ***P=0.0009 fyrir WT AngII á móti grunnlínu, *P=0.0420 fyrir CSTTg AngII á móti grunnlínu, #P=0.0424 fyrir WT á móti CSTTg AngII. Til að hámarka áhorf á þessa mynd, vinsamlegast skoðaðu netútgáfu þessarar greinar á www.nýru-international.org.

Frumfrumnafjöldi á hverja glomerulus minnkaði marktækt í Nphs2. cre Atg5lox/lox mýs meðhöndlaðar með AngII þ HSD (Mynd 2i–k). Podocyte skaði í Nphs2.cre Atg5lox/lox músum með AngII innrennsli þ HSD þróaðist jafnvel í focal og segmental glomerulosclerosis eins og sýnt er með tjáningu á parietal epithelial cell (PEC) virkjunarmerkinu CD44 í gaukla (Mynd 2l og m). Greining með rafeindasmásjá benti á verulegar breytingar sem tengdust ATG5-skorti við langvarandi AngII-innrennsli með HSD, þar með talið fótferlaeyðingu í háþrýstingi Nphs2. cre Atg5lox/lox mýs. Aftur á móti fundust fáir útbyggingargallar í fræfrumum frá WT músum, jafnvel eftir 10 vikna AngII innrennsli með HSD (Mynd 2n og o), sem gefur til kynna að sjálfsátsvirkni fræfrumna sé nauðsynleg fyrir mótstöðu þeirra gegn skaða af völdum AngII þ HSD. Alls gáfu niðurstöður okkar til kynna að í AngII þ HSD líkaninu,sjálfsáhrifhömlun eykur áverka og tap á fræfrumum og veldur síðari brennisteins- og hlutagaklakölkun.

AngII D HSD virkjar calpain virkni í fræfrumum sem stuðlar að sjálfsátahömlun

Þar sem virkni calpain reyndist (i) vera virkjuð af AngII í nokkrum frumugerðum og (ii) að kljúfa nokkrarsjálfsáhrif-tengd prótein,53 við veltum því fyrir okkur hvort AngII þ HSD- miðlaða sjálfsátahindrun gæti verið rekja til aukinnar AngII-framkallaðrar calpain virkni. Við komumst fyrst að því að frumfrumurnar tjáðu 3 alls staðar nálægar form calpains (mynd 3a). Við sýndum síðan að AngII örvaði calpainvirkni í frumfrumum. Þessi aukning á calpain virkni var lokuð af sértækum calpain hemli (Mynd 3b). Við notuðum innkeyrslu mús með viðbótarkalpastatíntransgenatjáning (sem leiðir til minnkaðrar calpainvirkni)43 til að meta hlutverk calpains í AngII þ HSD-miðluðunýrumeiðsli og blokkun á sjálfsát. Frumfrumur úr CSTTg músum sýndu minnkaða calpain virkni sem svar við AngII samanborið við fræfrumur úr samanburðarmúsum (mynd 3c). Þannig,kalpastatínoftjáning í fræfrumum minnkaði AngII-miðlaða calpain virkjun.

Við metum næstsjálfsáhrifmagn í fræfrumum úr CSTTg músum. Við mynduðum CSTTg mýs með GFP-LC3 transgeninu. LC3-GFP fréttaritari leyfði talningu á sjálfsátfrumum sem GFPþ/P62þ punkta. P62 mun safnast fyrir í söfnum í frumum þegar sjálfsátútflæði er lokað. Við grunnástand töldum við færri GFPþ P62þ punkta (Mynd 4a, b og e) og minni P62 uppsöfnun (Mynd 4c, d og f) í fræfrumum CSTTg GFP-LC3 músa en í fræfrumum venjulegra GFP-LC3 músa , sem bendir til aukins sjálfsáfalls útflæðis í fræfrumum músa með mikið magn kalpastatíns.

Mynd 4|Mat á sjálfsát útflæðis í fræfrumum afkalpastatínerfðabreyttar (CSTTg) mýs. (a,b) Fulltrúar ónæmisflúorljómunarmyndir af tjáningu græns FL flúrljómandi próteins (GFP) (grænt) og P62 (rauður) í glomeruli frá 12-vikukömlum GFP-LC3 og CSTTg GFP-LC3 músum. Örvahausarnir gefa til kynna GFPþ P62þ autophagosomes. (c,d) Fulltrúar ónæmisflúrljómunarmyndir af tjáningu P62 (grænt) og Podocalyxin (PODXL; rautt) í glomeruli frá 12-vikukömlum GFP-LC3 og CSTTg GFP-LC3 músum. Myndundirhlutar með prime benda til meiri stækkunar. Kjarnar voru litaðir með Hoechst (bláum). Barir=50 mm. (e) Magngreining á fjölda LC3þ P62þ punkta á hverja fræfrumu. Mann-Whitney próf: **P= 0.0065. (f) Magngreining á P62þ svæði á hvern gauklahluta. Mann-Whitney próf: *P=0.0420. Í (e,f), n=5 GFP-LC3 músum og n=8 CSTTg GFP-LC3 músum. Gildi eru sett fram sem einstök reiti og meðaltal±SEM. Til að hámarka áhorf á þessa mynd, vinsamlegast skoðaðu netútgáfu þessarar greinar á www.nýru-international.org.

Hægt er að fylgjast með sjálfsátafstreymi með því að mæla umbreytingu umfrymisforms LC3, LC3-I, í sjálfsátaflótta og fosfatidýletanólamín-tengt form LC3, LC3-II, á Western blot . Frumfrumur úr CSTTg músum sýndu aukna umbreytingu LC3-I í LC3-II og minnkaða P62 tjáningu, bæði í nærveru og án bafilomycin A1 (mynd 5a og b), sem bendir til aukins sjálfsátútflæðis í fræfrumur með oftjáningu kalpastatíns. Að lokum var uppsöfnun GFPþ P62þ punkta í fræfrumum eftir gjöf klórókíns mikilvægari í CSTTg GFP-LC3 músum en í GFP-LC3 músum, sem staðfestir því aðkalpastatínoftjáning veldur sjálfsátútflæði í fræfrumum in vivo (mynd 5c-e). Alls benda gögn okkar til þess að AngII örvi calpain virkni í fræfrumum, þaðsjálfsáhrifer hamlað af calpain í fræfrumum og sú hömlun á innrænni calpainvirkni með oftjáningu calpastatins nægir til að örva sjálfsátútflæði í fræfrumum.

CSTTg mýs eru verndaðar gegn AngII D HSD-framkallaðri frumufrumuáverka

CSTTg mýs sýndu engarnýrubreyting til amk 12 mánaða aldurs (viðbótarmynd S5). Við greindum áverka á frumufrumu í CSTTg músum meðan á AngII þ HSD meðferð stóð. Þrátt fyrir að WT mýs hafi þróað með sér væga glomerulosclerosis og podocyte skaða eftir 4 vikna háþrýsting, eins og sést af óeðlilegri tjáningu podocalyxins og nephrins, sýndu CSTTg mýs færri sclerotic gauklaskemmdir (mynd 6a og b) og varðveitt podocalyxin og nephrin tjáningu (Fihgure 6c) . Slíkur munur á svipgerð fræfrumna kom fram á stigi þar sem þéttleiki kjarna kjarna var ekki mismunandi milli WT og háþrýstings CSTTg músa (mynd 6i-k).

Mynd 5|Hindrandi niðurbrot sjálfsátsfrumna staðfesti aukið sjálfsátfrumnaflæði kjarnafrumna íkalpastatínerfðabreyttar (CSTTg) mýs. (a) Western blot greining á tjáningu LC3, Sequestosome 1 (SQSTM1)/P62 og ATG5 í frumfrumufrumum úr villigerð (WT) eða CSTTg músum. Tjáning túbúlíns þjónar sem eðlileg staðhæfing. Frumfrumur voru meðhöndlaðir eða ekki meðhöndlaðir með bafilomycin A1 (BafA1; 100 nM) í 4 klukkustundir fyrir stöðvun ræktunar. (b) Magngreining á hlutföllum LC{{10}}II/túbúlíns og P62/túbúlíns. n=10 WT mýs og n=8 CSTTg mýs. Gildi eru sett fram sem einstök reiti og meðaltal±SEM. Tvíhliða dreifnigreining pöruð fyrir meðferð: fyrir LC3-II/túbúlín: arfgerð, P=0.{{30}}008; meðferð, P < 0,0001;="" fyrir="" p62/túbúlín:="" arfgerð,="" p="0.0884;" meðferð,="" p="">< 0,0001.="" margfalt="" samanburðarpróf="" sidak:="" fyrir="" lc3-ii/túbúlín:="" ***p="">< 0,0001="" fyrir="" wt="" plús="" bafa1="" á="" móti="" wt="" þ="" bafa1,="" ***p="">< 0,0001="" fyrir="" csttg="" plús="" bafa1="" á="" móti="" csttg="" þ="" bafa1,="" ##p{="" {34}}.0028="" fyrir="" wt="" þ="" bafa1="" á="" móti="" csttg="" þ="" bafa1;="" fyrir="" p62/túbúlín:="" ***p="">< 0,0001="" fyrir="" wt="" plús="" bafa1="" á="" móti="" wt="" þ="" bafa1,="" ***p="">< 0,0001="" fyrir="" csttg="" plús="" bafa1="" á="" móti="" csttg="" þ="" bafa1.="" (c,d)="" fulltrúar="" ónæmisflúrljómunarmyndir="" af="" tjáningu="" á="" grænu="" fl="" flúrljómandi="" próteini="" (gfp;="" grænt)="" og="" p62="" (rautt)="" í="" glomeruli="" frá="" 12-="" vikugömlum="" gfp-lc3="" og="" csttg="" gfp-lc3="" músum.="" myndundirhlutar="" með="" prime="" benda="" til="" meiri="" stækkunar.="" kjarnar="" voru="" litaðir="" með="" hoechst="" (bláum).="" barir="50" mm.="" mýsnar="" voru="" meðhöndlaðar="" með="" klórókíni="" (cq;="" 80="" mg/kg)="" 4="" klukkustundum="" fyrir="" aflífun.="" örvahausarnir="" gefa="" til="" kynna="" gfpþ="" p62þ="" autophagosomes.="" (e)="" magngreining="" á="" fjölda="" lc3þ="" p62þ="" punkta="" á="" hverja="" fræfrumu.="" n="5" mýs="" á="" hverja="" arfgerð.="" gildi="" eru="" sett="" fram="" sem="" einstök="" lóð="" og="">±SEM. Óparað t-próf ​​með jöfnum SD: *P=0.0302. Til að hámarka áhorf á þessa mynd, vinsamlegast skoðaðu netútgáfu þessarar greinar á www.nýru-international.org.

Mynd 6 |Kalpastatínoftjáning kemur í veg fyrir angíótensín II (AngII) D hásaltfæði (HSD)-miðlaðan áverka á fræfrumum. (a,b) Fulltrúar myndir af Masson's trichrome-lituðum hlutum af glomeruli frá villigerð (WT) og calpastatin erfðabreyttum (CSTTg) músum eftir 6 vikna AngII þ HSD. Barir=50 mm. (c,d,f,g) Fulltrúar ónæmisflúrljómunarmyndir af tjáningu (c,d) Podocalyxin (PODXL) og (f,g) nephrin (NPHS1) í WT og CSTTg músum eftir 6 vikna AngII þ HSD og (e. ,h) tengdar magntölur. Barir=50 mm. (i,j) Fulltrúar ónæmisflúrljómunarmyndir af tjáningu Wilms æxlis 1 (WT1; grænt) og PODXL (rautt) í gaukla frá WT og CSTTg músum eftir 6 vikna AngII þ HSD og (k) tengda magngreiningu á fjölda WT1þ frumur á gauklahluta. Kjarnar voru litaðir með Hoechst (bláum). Barir=50 mm. Í (e,h,k) eru gildi sett fram sem einstök reiti og meðaltal±SEM. n=9 WT mýs og n=7 CSTTg mýs. Óparað t-próf ​​með jöfnu SD: **P=0.0095 tommur (e), *P=0.0249 tommur (h), P=0.7891 tommur (k). Til að hámarka áhorf á þessa mynd, vinsamlegast skoðaðu netútgáfu þessarar greinar á www.nýru-international.org.

Á sama hátt, eftir 6 vikna háþrýsting, sýndu GFP-LC3 og CSTTg GFP-LC3 mýs áverka á frumufrumu en sár voru meira áberandi í GFP-LC3 músum (Mynd 7). Hlutfall albúmíns og kreatíníns í þvagi var hærra í GFP-LC3 músum eftir 4 vikna AngII þ HSD (Mynd 7a). Fjöldi fræfrumna var ekki frábrugðinn arfgerðunum tveimur, en tjáning nefríns var marktækt minni í GFP-LC3 (viðmiðunar) músum (Mynd 7b–e). Samhengi viðkalpastatín-miðlaða vernd, ofurbyggingargreiningin sýndi væga og brennisteinsfótfótaferilseyðingu í GFP-LC3 músum sem voru meðhöndlaðir með AngII þ HSD með betri varðveislu á fótaferilseyðingu í CSTTg músum, þó að alþjóðleg magngreining á fjölda fótferla á gauklakjallara lengd himna (GBM) var ekki tölfræðilega frábrugðin, líklega vegna þess að áverka á frumufrumu er brennidepli og hlutabundið í líkaninu okkar (Mynd 7f–h). Athygli vekur að átfrumur og íferð T-eitilfrumna innnýruvoru ekki mismunandi á milli hópanna (viðbótarmynd S6). Samanlagt sýndu þessar niðurstöður þaðkalpastatínkom í veg fyrir AngII þ HSD-framkallaðan podocyte skaða.

Oftjáning kalpastatíns endurheimtir sjálfsát útflæðis í fræfrumum úr músum eftir AngII D HSD meðferð

Að lokum veltum við því fyrir okkur hvortkalpastatín-miðluð gauklavörn í AngII þ HSD líkaninu fól í sér viðhald á sjálfsát í fræfrumum. Athyglisvert var að komið var í veg fyrir uppsöfnun P62 af völdum AngII þ HSD í fræfrumum í CSTTg og GFP-LC3 CSTTg músum (mynd 8a–d), sem gefur til kynna að calpastatín hafi komið í veg fyrir blokkun á fræfrumumsjálfsáhrif. Athygli vekur að fjöldi GFPþ P62þ punktamerkinga á sjálfsátfrumum var svipaður í fræfrumum úr háþrýstings GFP-LC3 og GFP-LC3 CSTTg músum, sem bendir því til þess að AngII þ HSD hafi valdið hægagangi á sjálfsátfrumum útflæðis frekar en algjört stopp (Mynd 8e– g).

In silico spá um calpain klofningsstað í podocyte próteinum

Við notuðum nokkur í silico verkfæri til að spá fyrir um hugsanleg calpain markmið í fræfrumum (viðbótartöflur S1 og S2). Þrír gagnagrunnar á netinu voru bornir saman: GPS-CCD,54 CaMPDB,55 og DeepCalpain.56 Í kísilgreiningu greindust nokkur frumufrumuprótein, nefrín og podósín meðal þeirra, sem calpains gætu klofið. Þannig,kalpastatín-miðlaða gauklavörn gæti tengst minnkun á ensímvirkni calpains, sem leiðir til minni niðurbrots sumra fræfrumnapróteina.

Ennfremur að minnsta kosti 3sjálfsáhrif-tengd prótein eru bein markmið calpains. ATG5 er klofið af calpains, sem leiðir til truflunar á ATG12-ATG5 flóknum myndun.57,58 Gjöf calpain hemla in vivo kom einnig í veg fyrir klofningu á sjálfsátaprótíninu Beclin-1.59 Í kísilgreiningu á hugsanlega klofningsstaðurinn á próteinum sem tengist sjálfsát styður þá tilgátu að calpain gæti stjórnað sjálfsát í gegnum ensímklofnun sjálfsátapróteina.

Cistanche-nýrnastarfsemi

mRNA tjáning á endoplasmic reticulum (ER) og oxunarálagsmerkjum í glomeruli frá músum sem fengu AngII plús HSD

Við metum endoplasmic reticulum (ER) streitu og oxunarálag með megindlegri PCR í gaukla við AngII þ HSD meðferð (tafla 1). Í grunnlínu sáum við enga breytingu á mRNA tjáningu greindra gena í glomeruli frá WT og Nphs2.cre Atg5lox/lox músum (viðbótarmynd S7). Eftir 6 vikna háþrýsting, glomeruli frá Nphs2. cre Atg5lox/lox mýs sýndu mismunandi mRNA prófíl gena af ER streitu og oxunarálagsferlum með aukinni tjáningu Sod1, Prdx1, Atf4, Gpx1 og Hsp90b1 samanborið við WT glomeruli, sem bendir til þess aðsjálfsáhrifeyðing í fræfrumum studdi AngII þ HSD-framkallað ER streitu og oxunarálag. Aftur á móti sýndu glomeruli frá CSTTg músum niðurstýringu á nokkrum genum á ER streitu og oxunarálagsferlum sem og minni tjáningu sumra pro-apoptótískra gena (Mynd 9).

Samanlagt benda þessar niðurstöður til þesskalpastatínoftjáning gæti komið í veg fyrir gauklaskaða með því að draga úr AngII þ HSD-völdum ER og oxunarálagi.

UMRÆÐA

Í þessari rannsókn sýndum við fram á að í háþrýstingi af völdum AngII þ HSD, er sjálfsáhrif fræfrumna verulega minnkað. Ennfremur voru mýs með fræfrumnasértæka eyðingu á Atg5 líklegri til að fá AngII þ HSD framkallaða glomerulosclerosis og podocyte tap, sem sýnir þannig aðsjálfsáhrifí podocytes kemur í veg fyrir þróun háþrýstings nýrnakvilla, sem undirstrikar mikilvæga hlutverk sjálfsáts í AngII þ HSD-framkölluðum podocyte skaða. Lítið er vitað um utanfrumuáreiti sem stjórna sjálfsát frumu og þessar niðurstöður varpa ljósi á meinalífeðlisfræðilega stjórnun á sjálfsát fræfrumna af völdum AngII.

Í flestum gauklakvilla hjá mönnum er útrýming á fótfrumnafótum einkenni gauklaskaða sem leiðir til próteinmigu. Líklegt er að sjálfsát gegni mikilvægu hlutverki við að viðhalda starfsemi fræfrumna vegna þess að þessar endanlega aðgreindu frumur sýna hátt hlutfall afsjálfsáhrifjafnvel án streitu. Fyrri rannsókn sýndi að AngII ýtir undir sjálfsát með myndun hvarfgjarnra súrefnistegunda í skilyrt ódauðlegri músfrumufrumufrumulínu.60 Framleiðsla hvarfefna súrefnistegunda er sannarlega almennur örvun á sjálfsát í mörgum frumugerðum og ástæðurnar fyrir slíku misræmi við niðurstöður okkar eru óljóst. Ólíkt þessari síðarnefndu rannsókn, notuðum við frumræktaðar fræfrumur úr músum sem halda í tjáningu pódósíns og nefríns og in vivo nálganir en ekki frumulínur úr músum. Við staðfestum fyrri skýrslur um að frumur eftir kítósu sýni óvenju mikið magn af samsetningusjálfsáhrif. Mæling á auknu magni LC3-II eftir AngII örvun í nærveru eða fjarveru lysosomal inhibitors er nauðsynleg til að ákvarða hvort sjálfsátútflæði sé aukið eða lokað. Fyrri rannsóknir hafa vanrækt þetta fyrirbæri.60

Mynd 7 |Kalpastatínoftjáning kemur í veg fyrir angíótensín II (AngII) D há-salt mataræði (HSD)-miðlaðan fræfrumnaskaða í grænu FL flúrljómandi próteini (GFP)-LC3 músum. (a) AngII þ HSD leiddi til stórkostlegrar aukningar á albúmínmigu í GFP-LC3 músum samanborið við CSTTg (calpastatin erfðabreytt) GFP-LC3 mús. n=8 til 13 mýs á hverja arfgerð. Gildi eru sett fram sem einstök reiti og meðaltal±SEM. Tvíhliða dreifnigreining: arfgerð, P=0.0429; tími, P=0.0165. Margfalt samanburðarpróf Sidak: *P=0.0453 fyrir GFP-LC3 á móti CSTTg GFP-LC3 músum á degi 28. (b,c) Fulltrúar ónæmisflúrljómunarmyndir af tjáningu Wilms æxlis 1 (WT1; grænt) og nefríns (NPHS1) (rautt) í glomeruli frá 18-vikukömlum GFP-LC3 og CSTTg GFP-LC3 músum eftir 6 vikna AngII innrennsli þ HSD. Kjarnar voru litaðir með Hoechst (bláum). Barir=50 mm. Magngreining á (d) NPHS1þ svæði á hvern gauklahluta og (e) fjölda WT1þ frumna á hvern gauklaskurði í 18-vikukömlum GFP-LC3 og CSTTg GFP-LC3 músum eftir 6 vikna AngII innrennsli þ HSD. n=19 GFP-LC3 mýs og n=25 CSTTg GFP-LC3 mýs. Gildi eru sett fram sem einstök reiti og meðaltal±SEM. Óparað t-próf ​​með jöfnum SD: **P=0.0010 í (d), P= 0.1158 í (e). (f,g) Sendingarrafeindasmásjármyndir af glomeruli frá GFP-LC3 og CSTTg GFP-LC3 músum eftir 6 vikna AngII þ HSD. Örvahausarnir gefa til kynna útrýmingu fótaferlisins. Barir=1 mm. (h) Magngreining á fjölda fótferla á hvern míkrómetra af gauklagrunnhimnu (GBM). n=3 mýs á hverja arfgerð. Gildi eru sett fram sem einstök lóð og meðaltal SEM. Hver lóð sýnir meðalfjölda fræfrumna á hvern míkrómetra af GBM á 1 samfelldri lengd GBM. Óparað t-próf ​​með jöfnum SD: P=0.7512. Til að hámarka áhorf á þessa mynd, vinsamlegast skoðaðu netútgáfu þessarar greinar á www.nýru-international.org.

Hér notuðum við háþrýstingslíkan byggt á AngII gegnflæði og HSD. Frumfrumur sýna AT1 viðtaka og eru útsettar fyrir frjálst síuðum peptíðum eins og AngII.13,16,26,61–65 Gert er ráð fyrir að endurvörnandi áhrif RAAS hömlunar gæti stafað - að minnsta kosti að hluta til - vegna blokkunar á þessum fræfrumum- sérstakur RAAS. Sömuleiðis staðfestu in vivo rannsóknir áhrif AngII á frumuskaða og fræfrumusértæka genamiðun á AT1 sýndu fram á að virkjun AT1 viðtaka í gaukla í tilraunalúpus nýrnabólgu er nægjanleg til að flýta fyrirnýruáverka í fjarveru háþrýstings.66,67 Calpain-miðlaðsjálfsáhrifregluleysi í líkaninu okkar gæti tengst beinum AngII-AT1 merkjum á fræfrumum eða að vera afleiðing háþrýstings. Við gætum gefið snemma svar við þessari spurningu. Reyndar, í DOC-salt líkaninu, fundum við einnig P62 uppsöfnun í fræfrumum frá háþrýstingsmúsum (viðbótarmynd S3). Þetta bendir til þess að sjálfsátsblokkun eigi sér stað í fræfrumum í þessu líkani, sem á að vera óháð AngII.68 Frekari rannsóknir sem meta áverka á fótfrumum sem tengjast calpain virkni og sjálfsát útflæðis í músum sem skortir AT1 í fræfrumum þyrfti að afmarka ef slík stjórnun sjálfsáhrif fræfrumna fer eftir beinum eða óbeinum áhrifum AngII.

Mynd 8 |Kalpastatínoftjáning kemur í veg fyrir angíótensín II (AngII) D hásaltfæði (HSD) framkallaðsjálfsáhrifniðurstýring í fræfrumum. (a,b) Fulltrúar ónæmisflúrljómunarmyndir af tjáningu P62 (grænt) og Podocalyxin (PODXL; rautt) í glomeruli frá grænu FL flúrljómandi próteini (GFP)–LC3 og CSTTg (kalpastatínerfðabreyttar) GFP-LC3 mýs eftir 6 vikna AngII þ HSD. Myndundirhlutar með prime benda til meiri stækkunar. Kjarnar voru litaðir með Hoechst (bláum). Barir=50 mm. (c,d) Magngreining á P62þ svæði á hvern gauklahluta. n=9 villigerðir (WT) mýs og n=7 CSTTg mýs í (c), og n=16 GFP-LC3 mýs og n=16 CSTTg GFP-LC3 mýs í (d). Gildi eru sett fram sem einstök reiti og meðaltal±SEM. Mann-Whitney próf: **P=0.0033 in (c), **P=0.0011 in (d). (e,f) Fulltrúar ónæmisflúrljómunarmyndir af tjáningu GFP (grænt) og P62 (rauðra) í glomeruli frá GFP-LC3 og CSTTg GFP-LC3 músum eftir 6 vikna AngII þ HSD. Myndundirhlutar með prime benda til meiri stækkunar. Örvahausarnir gefa til kynna GFPþ P62þ autophagosomes. (g) Magngreining á fjölda LC3þ P62þ punkta á hverja fræfrumu. n=11 GFP-LC3 mýs og n=16 CSTTg GFP-LC3 mýs. Gildi eru sett fram sem einstök reiti og meðaltal±SEM. Óparað t-próf ​​með jöfnum SD: P=0.1014. Til að hámarka áhorf á þessa mynd, vinsamlegast skoðaðu netútgáfu þessarar greinar á www.nýru-international.org.

Tafla 1|Sérsniðið RT2 Profiler PCR fylki

Calpain-1 og calpain-2 eru alls staðar nálægir bólgueyðandi próteasar, en virkni þeirra er stjórnað afkalpastatín, sérstakur hemill þeirra. Reyndar hamlar calpastatín sértækt calpains og enga aðra próteasa hingað til. Calpain virkjun hefur verið tengd nýlega viðnýruskaði í nokkrum meinafræðilegum samhengi.69,70 Kalsíumgangaflutningsgeta tímabundin viðtakarás C6 reyndist virkja calpain-1 í fræfrumum með Ca2þ/calcineurin virkjun. Nýru sjúklinga með focal og segmental glomerulosclerosis höfðu aukna tímabundna tjáningu á hugsanlegri rás C6 viðtaka, aukna virkni calpain og calcineurin og minni tjáningu á calpain target talin-1, sem er mikilvægt fyrir stöðugleika frumufrumunnar í frumu beinagrindarinnar.71 Tímabundin viðtakamöguleg rás C6 binst einnig beint við calpain-1 og calpain-2. Þessi víxlverkun skiptir sköpum fyrir stjórnun talin-1 klofnings og stjórna hreyfigetu fræfrumna.72

Erfðabreyttar mýs oftjáa sigkalpastatíneru varin gegn endurgerð æða og AngII-háðrar bólgu73; gegn bólgu í líkönum af glomerulonephritis,43 blóðsýkingu,74 eða ósamgena höfnun75; og gegn aldurstengdri bólgu.76 Ekki hefur verið kannað áverka á frumufrumu í þessum músum. Peltier o.fl. sýndi að oftjáning ákalpastatínkom í veg fyrir AngII-háða perivascular bólgu í nýrum.43 Þannig gæti nýrnavernd í CSTTg músum verið miðlað, að minnsta kosti að hluta, með bólgueyðandi kerfi. Við metum átfrumur og íferð eitilfrumna í líkaninu okkar og fundum engan marktækan mun ánýrubólga á milli CSTTg og viðmiðunarmúsa við greiningu á hnattrænunýruhvítfrumnaíferð (viðbótarmynd S6).

Calpain tók nýlega þátt í sjálfsátsstjórnun (endurskoðað nýlega í Weber o.fl.53) með áhugaverðum og lífverndandi eiginleikum calpain-hömlunar í sykursýkissamhengi með endurheimtsjálfsáhrif.77 Hér greindum við frá því að calpain hömlun í gegnumkalpastatínoftjáning (i) kom í veg fyrir áverka á fræfrumum við háþrýsting og (ii) endurheimti sjálfsát í fræfrumum, og undirstrikar þannig nýtt skaðlegt hlutverk calpainvirkjunar við háþrýsting með því að hindrasjálfsáhrif.

Sýnt var fram á að næstum öll ATG prótein væru klofin af calpains in vitro. 78 Hér settum við það framsjálfsáhrifviðhald í háþrýstings CSTTg músum var miðlað af calpain hömlun. Til að styðja tilgátu okkar sýndum við fram á að fræfrumur frá CSTTg hafa minnkaða calpain virkni þegar þeir eru ögraðir með AngII in vitro (mynd 3c). Við fundum aukið ATG5 próteinmagn í fræfrumum úr CSTTg músum, sem bendir til þess að oftjáning kalpastatíns hafi komið í veg fyrir calpain-miðlaða ATG5 klofning í þessu samhengi (Mynd 5a). Aftur á móti var sýnt fram á þaðkalpastatín-miðluð calpain hömlun gæti verið óháð hömlun á próteasavirkni þeirra79; þannig gátum við ekki útilokað stjórnun á sjálfsáhrifum með calpastatíni sem er óháð calpain ensímvirkni.

Í stuttu máli leiddu þessar niðurstöður í ljós áður óþekkt hlutverkkalpastatíní stjórnun á fræfrumumsjálfsáhrifog veitti leiðsögn fyrir rannsókn á nýjum lækningaaðferðum til að auka lifun fræfrumna við háþrýstingsnýrnakvilla.

UPPLÝSINGAR

Allir höfundar lýstu ekki yfir hagsmunum í samkeppni.

VIÐTAKNINGAR

Þetta verk var styrkt af Institut National de la Santé Et de la recherche Médicale (Inserm) og Université de Paris. IB var stutt af útskriftarstyrk frá Ministère de l'EducationNationale, de la Recherche et de la Technologie. OL var styrkt í gegnum European Foundation for the Study of Diabetes (EFSD) verðlaun sem styrkt var af EFSD/Novo Nordisk áætluninni um sykursýkisrannsóknir í Evrópu og styrk frá Société Francophone duDiabète (SFD). BR og CH voru styrkt af Starting Grant 107037 frá European Research Council og Evrópusambandinu (P-LT). YS var stutt af útskriftarstyrk frá Fondation de France.

Við þökkum Elizabeth Huc, Nicolas Perez, Corina Suldac og ERIU970 teyminu (Université de Paris, PARCC, Inserm, París, Frakklandi) aðstoð við umönnun og meðhöndlun dýra, Nicolas Sorhaindo fyrir lífefnafræðilegar mælingar (ICB-IFR2, Laboratoire de Biochimie, Hôpital Bichat , París, Frakklandi), og Alain Schmitt og Jean-Marc Masse fyrir rafeindasmásjárskoðun (Institut Cochin, París, Frakklandi). Við þökkum Morgane Le Gall (Cochin proteomic aðstöðu 3P5, París, Frakklandi) fyrir aðstoð við kísilgreiningu. Við tökum undir stjórnsýslustuðning frá Véronique Oberweis, Bruno Pillard og Cyrille Mahieux (Université de Paris, PARCC, Inserm, París, Frakklandi).

VIÐBÓTAEFNI

Viðbótarskrá (PDF)

Mynd S1. Primary podocyte ræktun tjáir podocyte merki. Western blot greining á tjáningu fræfrumnamerkjanna NPHS1 og NPHS2 í frumfrumuræktun frá WT og CSTTg músum. Tubulin (TUBA) þjónar sem hleðslustýring. Fulltrúi n=4 músa fyrir hverja arfgerð.

Mynd S2. Hátt grunngildi podocytesjálfsáhrif. (A, B) Fulltrúar ónæmisflúrljómunarmyndir af tjáningu GFP (grænt) og NPHS1 (rautt) í gaukla frá GFP-LC3 músum sem voru meðhöndlaðar eða ekki með CQ (80mg/kg) 4 klukkustundum fyrir aflífun. Örvar sýna GFPþ autophagosomes. (C, D) Fulltrúar ónæmisflúrljómunarmyndir af tjáningu GFP (grænt) og P62 (rautt) í glomeruli frá GFP-LC3 músum sem voru meðhöndlaðar eða ekki með CQ (80mg/kg) 4 klukkustundum fyrir aflífun. Örvar sýna GFPþ P62þ autophagosomes. (A–D) (0 ) táknar meiri stækkun. Kjarnar voru litaðir með Hoechst (bláum). Bar=50 mm. N=4 mýs í hverju ástandi (E–H) Fulltrúar ónæmisflúrljómunarmyndir af tjáningu GFP (grænt) og P62 (rauðra) í frumfrumufrumum frá GFP-LC3 músum sem fengu meðferð (F, H) eða ekki (E, G) ) með Bafifilomycin A1 (100 nM) í 4 klukkustundir. N=5 mýs í hverju ástandi.

Mynd S3. P62 safnast fyrir í fræfrumum í DOC-salt líkaninu af háþrýstingi. (A – C) Fulltrúar ónæmisflúrljómunarmyndir af tjáningu P62 (grænt) og PODXL (rautt) í glomeruli frá WT músum eftir 2 til 6 vikna DOC-salt líkan. (0 ) táknar meiri stækkun. Kjarnar voru litaðir með Hoechst (bláum). Bar ¼ 50 mm. (D) Magngreining á P62 svæði á hvert fræfrumnasvæði ( ​​prósent ). N=5–6 mýs í hverju ástandi. Einhliða dreifnigreining: tími P=0.0059, margfeldissamanburðarpróf Sidak: D42 á móti D14 **P=0.0055, D28 á móti D14 P=0.8590.

Mynd S4. Podocytesjálfsáhrifer ómissandi fyrir þróun fræfrumna. (A) Slagbilsþrýstingur, (B) hlutfall albúmíns og kreatíníns í þvagi og (C) magn þvagefnis í blóði í Atg5lox/lox og Nphs2.cre Atg5lox/lox músum. N=5–6 mýs á hverja arfgerð. Gildi eru sett fram sem einstakar lóðir og miðar±SEM. Mann-Whitney próf: P=0.7273 (A), P=0.4286 (B) og P=0.6623 (C). (D–E) Fulltrúarmyndir af þríkróm-lituðum hlutum Masson af glomeruli frá Atg5lox/lox og Nphs2.cre Atg5lox/lox músum. (F-G) Fulltrúar ónæmisflúrljómunarmyndir af tjáningu PODXL (grænt) og WT1 (rautt) í Atg5lox/lox og Nphs2.cre Atg5lox/lox músum. Kjarnar voru litaðir með Hoechst (bláum). (D–G) Bar=50 mm. N ¼ 6 mýs á hverja arfgerð. (H–I) Fulltrúar örmyndir af sendingarrafeindasmásjárskurði af gaukla frá Atg5lox/lox og Nphs2.cre Atg5lox/lox músum. Bar=1 mm. N=3 mýs á hverja arfgerð.

Mynd S5.Kalpastatínoftjáning hefur ekki áhrifnýruvirka í grunnlínu. (A) blóðþvagefni köfnunarefnis og (B) magn albúmíns í plasma í 12-vikukömlum GFP-LC3 og CSTTg GFP-LC3 músum. N=5 GFP-LC3 og N=6 CSTTg GFP-LC3. Gildi eru sett fram sem einstakar lóðir og miðar±SEM. Mann-Whitney próf: P=0.6623 (A) og P=0.9307 (B). (C, D) Fulltrúar myndir af Masson's trichrome-lituðum hlutum af glomeruli frá GFP-LC3 og CSTTg GFP-LC3 músum. (E-H) Fulltrúar ónæmisflúrljómunarmyndir af tjáningu PODXL (E, F) og NPHS1 (G, H) í GFP-LC3 og CSTTg GFP-LC3 músum. (C–H) Bar=50 mm. (I, J) Tengd magngreining á PODXL og NPHS1 svæði á hvern gauklahluta. N=5 GFP-LC3 og N=6 CSTTg GFP-LC3. Gildi eru sett fram sem einstakar lóðir og miðar±SEM. Mann-Whitney próf: P=0.1898 (A) og P=0.8413 (B).

Cistanche-nýrnastarfsemi

Mynd S6.Kalpastatínoftjáning hefur ekki áhrif á alþjóðlega nýrnabólgu. Fulltrúi ónæmisvefjaefnafræði á tjáningu F4/80 (A, B) og CD3 (D–E) í GFP-LC3 og CSTTg GFP-LC3 músum eftir 6 vikna angíótensín II þHSD. Bar=200 mm. (C, F) Tengd magngreining á F4/80 og CD3 svæði prnýrukafla. N=7 CSTTg GFP-LC3 og N=8 GFP-LC3 mýs. Gildi eru sett fram sem einstök lóð og þýðir SEM. Mann-Whitney próf: P=0.3969 (C) P= 0.3357 (F).

Mynd S7. Podocytesjálfsáhrifdeficiency does not induce ER stress or oxidative stress in young adults at baseline. qPCR analysis of the mRNA expression of genes of the ER stress, oxidative stress, and apoptosis pathway by Qiagen qPCR array in glomeruli from WT and Nphs2.cre Atg5lox/lox mice (A) and WT and CSTTg mice (B). N=4 mice per genotype. For Nox3, Ct >33.

Tafla S1. In silico forskoðun á calpain klofningsstöðum. Spáð var fyrir um klofningsstaði fyrir Calpain í fræfrumatengdum og sjálfsátatengdum próteinum með GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org), CaMPDB (HTTP:// calpain.org) og DeepCalpain Predict (http://deepcalpain. cancerbio. info/help.php). Viðbótarskrá (Excel)

Viðbótartafla S2. Heildarskráin af in silico forskoðun á calpain klofningsstöðum. Spáð var fyrir Calpain klofningsstaði í fræfrumatengdum ogsjálfsáhrif-tengd prótein með GPS-CCD (http://ccd. biocuckoo.org), CaMPDB (http://calpain.org) og DeepCalpain Predict (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php). Forspá klofningsstaðir eru hafnir aftur fyrir hvert prótein fyrir GPS-CCD og DeepCalpain Predict.

HEIMILDIR

1. Coresh J, Selvin E, Stevens LA, o.fl. Algengi langvinnranýrusjúkdómur í Bandaríkjunum. JAMA. 2007;298:2038–2047.

2. Collins AJ, Vassalotti JA, Wang C, o.fl. Hvern ætti að miða á við skimun fyrir langvinnan nýrnasjúkdóm? Áhrif sykursýki, háþrýstings og hjarta- og æðasjúkdóma. Am J Kidney Dis. 2009;53:S71–S77.

3. Chang TI, Li S, Chen SC, o.fl. Áhættuþættir fyrir ESRD hjá einstaklingum með varðveitt áætlað GFR með og án albúmínmigu: niðurstöður úr nýrnarannsóknaráætluninni (KEEP). Am J Kidney Dis. 2013;61:S4–S11.

4. Hsu CY, McCulloch CE, Darbinian J, o.fl. Hækkaður blóðþrýstingur og hætta á nýrnasjúkdómi á lokastigi hjá einstaklingum án grunnlínu nýrnasjúkdóms. Arch Intern Med. 2005;165:923–928.

5. Nagase M, Shibata S, Yoshida S, o.fl. Podocyte skaði liggur til grundvallar gauklakvilla Dahl salt-háþrýstings rotta og er snúið við með aldósterónblokka. Háþrýstingur. 2006;47:1084–1093.

6. Garovic VD, Wagner SJ, Turner ST, o.fl. Útskilnaður fræfrumna í þvagi sem merki fyrir meðgöngueitrun. Am J Obstet Gynecol. 2007;196, 320.e321–e327.

7. Craici IM, Wagner SJ, Bailey KR, o.fl. Podocyturia er á undan próteinmigu og klínísk einkenni meðgöngueitrun: langvarandi framsýn rannsókn. Háþrýstingur. 2013;61:1289–1296.

8. Wang G, Lai FM, Kwan BC, o.fl. Fótfrumnatap í nýrnakölkun í mönnum með háþrýstingi. Am J Hypertens. 2009;22:300–306.

9. Wang G, Kwan BC, Lai FM, o.fl. Tjáning miRNAs innan nýrna hjá sjúklingum með háþrýstings nýrnakölkun. Am J Hypertens. 2010;23:78–84.

10. Ruggenenti P, Perna A, Gherardi G, et al. Langvinnir nýrnakvilla í próteinþvagi: niðurstöður og svörun við meðferð hjá væntanlegum hópi 352 sjúklinga með mismunandi mynstur nýrnaskaða. Am J Kidney Dis. 2000;35:1155–1165.

11. Fukuda A, Wickman LT, Venkatareddy MP, o.fl. Angíótensín II-háð viðvarandi tapfrumnatap vegna óstöðugleika glomeruli veldur framvindu lokastigsnýrusjúkdómur. Nýra Int. 2012;81:40–55.

12. Tuncdemir M, Ozturk M. Áhrif angíótensín-II viðtakablokka á skaða á fræfrumum og nýrnafrumuhneigð í rottulíkani af tilraunastreptozotocin-völdum nýrnakvilla af völdum sykursýki. Acta Histochem. 2011;113:826–832.

13. Nijenhuis T, Sloan AJ, Hoenderop JG, o.fl. Angíótensín II stuðlar að skaða á fræfrumum með því að auka tjáningu TRPC6 í gegnum NFAT-miðlaða jákvæða endurgjöf. Am J Pathol. 2011;179:1719–1732.

14. EUCLID námshópurinn. Slembiraðað samanburðarrannsókn með lyfleysu á lisinoprili hjá sjúklingum með eðlilega blóðþrýsting með insúlínháða sykursýki og normoalbuminumiu eða microalbuminumiu. Lancet. 1997;349:1787–1792.

15. de Zeeuw D, Remuzzi G, Parving HH, et al. Próteinmigu, markmið fyrir endurvörn hjá sjúklingum með sykursýkisnýrnakvilla af tegund 2: lærdómur frá RENTAL. Nýra Int. 2004;65:2309–2320.

16. Benigni A, Gagliardini E, Remuzzi G. Breytingar á valkvenni gauklaperms af völdum angíótensíns II fela í sér truflun á starfsemi fræfrumna og endurröðun próteins í slitþind. Semin Nephrol. 2004;24:131–140.

17. Wang L, Flannery PJ, Spurney RF. Einkenni angíótensín II viðtaka undirtegunda í fræfrumum. J Lab Clin Med. 2003;142:313–321.

18. Langham RG, Kelly DJ, Cox AJ, o.fl. Próteinmigu og tjáning á þindarpróteini, nefríni, við nýrnakvilla með sykursýki: áhrif hömlunar á angíótensínbreytandi ensímum. Sykursýki. 2002;45:1572–1576.

19. Nakamura T, Ushiyama C, Suzuki S, o.fl. Áhrif angíótensín-umbreytandi ensímhemils, angíótensín II viðtakablokka og kalsíumblokka á frumur í þvagi hjá sjúklingum með IgA nýrnakvilla. Am J Nephrol. 2000;20:373–379.

20. Henger A, Huber T, Fischer KG, o.fl. Angíótensín II eykur kalsíumvirkni frumu í rottum í ræktun. Nýra Int. 1997;52: 687–693.

21. Praga M, Hernandez E, Montoyo C, o.fl. Langtíma jákvæð áhrif hömlunar á angíótensínbreytandi ensímum hjá sjúklingum með nýrnapróteinmigu. Am J Kidney Dis. 1992;20:240–248.

22. Nitschke R, Henger A, Ricken S, o.fl. Angíótensín II eykur kalsíumvirkni innanfrumu í fræfrumum ósnortna glomerulus.NýraAlþj. 2000;57:41–49.

23. Gloy J, Henger A, Fischer KG, o.fl. Angiotensin II stjórnar frumustarfsemi fræfrumna. Nýra Int Suppl. 1998;67:S168–S170.

24. Miceli I, Burt D, Taraba E, o.fl. Teygja dregur úr tjáningu nefríns í gegnum angíótensín II-AT(1) háð kerfi í fræfrumum manna: áhrif rósíglítazóns. Am J Physiol Renal Physiol. 2010;298:F381–F390.

25. Endlich N, Endlich K. Teygja, spenna og viðloðun—aðlögunaraðferðir aktínfrymisbeinagrindarinnar í fræfrumum. Eur J Cell Biol. 2006;85:229–234.

26. Durvasula RV, Petermann AT, Hiromura K, o.fl. Virkjun staðbundins angíótensínkerfis í vefjafrumum með vélrænni stofni. Nýra Int. 2004;65:30–39.

27. Riser BL, Cortes P, Heilig C, et al. Hringlaga teygjukraftur uppstýrir sértækt umbreytandi vaxtarþáttar-beta ísóformum í ræktuðum rottum mesangial frumum. Am J Pathol. 1996;148:1915–1923.

28. Kretzler M, Koeppen-Hagemann I, Kriz W. Podocyte skaði er mikilvægt skref í þróun glomerulosclerosis í uni nephrectomized-desoxycorticosterone háþrýstingsrottum. Virchows skjalasafn. 1994;425:181–193.

29. Jung HS, Chung KW, Won Kim J, o.fl. Tap á sjálfsát dregur úr beta-frumumassa og virkni briskirtils með blóðsykrishækkun í kjölfarið. Cell Metab. 2008;8:318–324.

30. Ebato C, Uchida T, Arakawa M, o.fl.Autophagyer mikilvægt í hólmajafnvægi og jöfnunaraukning á beta-frumumassa sem svar við fituríku mataræði. Cell Metab. 2008;8:325–332.

31. Lenoir O, Jasiek M, Henique C, o.fl. Sjálfsáhrif æðaþelsfrumna og fræfrumna vernda samverkandi gegn glomerulosclerosis af völdum sykursýki. Autophagy. 2015;11:1130–1145.

32. Hartleben B, Godel M, Meyer-Schwesinger C, o.fl. Autophagy hefur áhrif á næmni gauklasjúkdóma og viðheldur frumujafnvægi í öldruðum músum. J Clin Invest. 2010;120:1084–1096.

33. Sato S, Kitamura H, Adachi A, o.fl. Tvær gerðir af sjálfsát í fræfrumum í nýrnasýnum: öfgauppbyggingarrannsókn. J Submicrosc Cytol Pathol. 2006;38:167–174.

34. Asanuma K, Tanida I, Shirato I, o.fl. MAP-LC3, efnilegt sjálfsátsmerki, er unnið við aðgreining og endurheimt fræfrumna frá PAN nýrnasjúkdómi. FASEB J. 2003;17:1165–1167.

35. Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, et al.Autophagyberst gegn sjúkdómum með sjálfmeltingu frumna. Náttúran. 2008;451:1069–1075.

36. Yang L, Li P, Fu S, o.fl. Gallað sjálfsát í lifur í offitu stuðlar að ER streitu og veldur insúlínviðnámi. Cell Metab. 2010;11:467–478.

37. Xie Z, Klionsky DJ. Autophagosome myndun: kjarna vélar og aðlögun. Nat Cell Biol. 2007;9:1102–1109.

38. Kume S, Thomas MC, Koya D. Næringarskynjun, sjálfsáhrif og nýrnakvilli vegna sykursýki. Sykursýki. 2012;61:23–29.

39. Kume S, Uzu T, Maegawa H, o.fl. Autophagy: nýtt meðferðarmarkmið fyrirnýrusjúkdóma. Clin Exp Nephrol. 2012;16:827–832.

40. Huber TB, Edelstein CL, Hartleben B, et al. Nýtt hlutverksjálfsáhrifí nýrnastarfsemi, sjúkdómum og öldrun. Autophagy. 2012;8:1009–1031.

41. Weide T, Huber TB. Afleiðingar sjálfsáts fyrir gauklaöldrun og sjúkdóma. Cell Tissue Res. 2011;343:467–473.

42. Bork T, Liang W, Yamahara K, o.fl. Podocytes viðhalda háu grunngildi autophagy óháð mtor-merkjaboðum. Autophagy. 2020;16:1932– 1948.

43. Peltier J, Bellocq A, Perez J, o.fl. Calpain virkjun og seyting stuðlar að gauklaskaða í tilraunaglomerulonephritis: vísbendingar frákalpastatín-erfðabreyttar mýs. J Am Soc Nephrol. 2006;17:3415–3423.

44. Moeller MJ, Sanden SK, Soofifi A, o.fl. Podocyte-sértæk tjáning Cre recombinase í erfðabreyttum músum. Mósebók. 2003;35:39–42.

45. Hara T, Nakamura K, Matsui M, o.fl. Bæling á basal autophagy í taugafrumum veldur taugahrörnunarsjúkdómi í músum. Náttúran. 2006;441: 885–889.

46. ​​Lazareth H, Henique C, Lenoir O, o.fl. Tetraspanin CD9 stjórnar flæði og fjölgun parietal þekjufrumna og framvindu gauklasjúkdóms. Nat Commun. 2019;10:3303.

47. Bollee G, Flamant M, Schordan S, et al. Vaxtarþáttaviðtaka húðþekju stuðlar að gauklaskaða og nýrnabilun í ört versnandi hálfmánahnaklabólgu. Nat Med. 2011;17:1242–1250.

48. Lenoir O, Milon M, Virsolvy A, o.fl. Bein verkun endóþelíns-1 á fræfrumur stuðlar að gauklakölkun af völdum sykursýki. J Am Soc Nephrol. 2014;25:1050–1062.

49. Henique C, Bollee G, Lenoir O, o.fl. Kjarnaþættir rauðkornaþáttur 2-tengdur þáttur 2 knýr frumufrumnasértæka tjáningu á peroxisome proliferator-virkjaðri viðtaka g sem er nauðsynlegur fyrir mótstöðu gegn hálfmánans GN. J Am Soc Nephrol. 2016;27:172–188.

50. Perez J, Dansou B, Herve R, et al. Calpains losað af T eitilfrumum kljúfa TLR2 til að stjórna IL-17 tjáningu. J Immunol. 2016;196:168–181.

51. Raimbourg Q, Perez J, Vandermeersch S, o.fl. The calpain/kalpastatínkerfið gegnir andstæðum hlutverkum við vöxt og dreifingu sortuæxla með meinvörpum. PLoS One. 2013;8:e60469.

52. Letavernier B, Zafrani L, Nassar D, o.fl. Calpains stuðla að viðgerð á æðum í ört versnandi mynd glomerulonephritis: hugsanlegt hlutverk utanaðkomandi þeirra. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2012;32:335–342.

53. Weber JJ, Pereira Sena P, Singer E, o.fl. Að drepa tvo reiða fugla í einu höggi:sjálfsáhrifvirkjun með því að hindra calpains í taugahrörnunarsjúkdómum og víðar. Biomed Res Int. 2019;2019:4741252.

54. Liu Z, Cao J, Gao X, o.fl. GPS-CCD: nýtt reikniforrit til að spá fyrir um calpain klofningsstaði. PLoS One. 2011;6:e19001.

55. duVerle D, Takigawa I, Ono Y, et al. CaMPDB: úrræði fyrir calpain og mótandi próteingreiningu. Erfðamengi Upplýsa. 2010;22:202–213.

56. Liu ZX, Yu K, Dong J, o.fl. Nákvæm spá um klofningsstaði calpain og frávik þeirra af völdum stökkbreytinga í krabbameini. Framan Genet. 2019; 10: 715.

57. Yousefifi S, Perozzo R, Schmid I, o.fl. Calpain-miðluð klofning á Atg5 breytir sjálfsát yfir í frumudauða. Nat Cell Biol. 2006;8:1124–1132.

58. Xia HG, Zhang L, Chen G, o.fl. Stýring á sjálfsát í grunni með calpain1 miðlaðri klofningu á ATG5.Autophagy. 2010;6:61–66.

59. Russo R, Berliocchi L, Adornetto A, o.fl. Calpain-miðluð klofning Beclin-1 og sjálfsátafræðsla eftir blóðþurrðarskaða í sjónhimnu in vivo. Cell Death Dis. 2011;2:e144.

60. Yadav A, Vallabu S, Arora S, o.fl. ANG II kynnirsjálfsáhrifí fræfrumum. Am J Physiol Cell Physiol. 2010;299:C488–C496.

61. Flannery PJ, Spurney RF. Umvirkjun vaxtarþáttarviðtaka húðþekju með angíótensíni II í gauklafrumur. Nephron Exp Nephrol. 2006;103:e109–e118.

62. Harrison-Bernard LM, Navar LG, Ho MM, o.fl. Ónæmisvefjaefnafræðileg staðsetning ANG II AT1 viðtaka í fullorðnum rottumnýrumeð því að nota einstofna mótefni. Am J Physiol. 1997;273:F170–F177.

63. Liebau MC, Lang D, Bohm J, et al. Virk tjáning renín angíótensínkerfis í fræfrumum manna. Am J Physiol Renal Physiol. 2006;290:F710–F719.

64. Pavenstadt H. Franz Volhard verðlaunin 2000: angíótensín II merki í fræfrumunni. Nýrnablóðþrýstingsres. 2000;23:156–158.

65. Wennmann DO, Hsu HH, Pavenstadt H. Renín-angíótensín aldósterónkerfið í fræfrumum. Semin Nephrol. 2012;32:377–384.

66. Jia J, Ding G, Zhu J, o.fl. Angíótensín II innrennsli veldur breytingum á tjáningu nefríns og frumudauða frumufrumna. Am J Nephrol. 2008;28:500– 507.

67. Crowley SD, Vasievich þingmaður, Ruiz P, o.fl. Glomerular type 1 angíótensín viðtakar auka nýrnaskaða og bólgu í sjálfsofnæmisnýrnabólgu í músum. J Clin Invest. 2009;119:943–953.

68. Song K, Stuart D, Abraham N, o.fl. Söfnun reníns í gangrás miðlar ekki DOCA-salt háþrýstingi eða nýrnaskaða. PLoS One. 2016;11: e0159872.

69. Liu Z, Ji J, Zheng D, o.fl. Verndarhlutverk æðaþels calpain útsláttar í bráðum lípópólýsykrum af völdumnýrumeiðslum vegna dempunar á p38-iNOS brautinni og NO/ROS framleiðslu. Exp Mol Med. 2020;52:702– 712.

70. Seremwe M, Schnellmann RG, Bollag WB. Calpain-10 virkni liggur að baki angíótensín II framkallaða aldósterónframleiðslu í nýrnahettum glome rulosa frumu líkani. Innkirtlafræði. 2015;156:2138–2149.

71. Verheijden KAT, Sonneveld R, Bakker-van Bebber M, et al. Kalsíumháði próteasinn calpain-1 tengir TRPC6 virkni við áverka á fræfrumum. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2099–2109.

72. Farmer LK, Rollason R, Whitcomb DJ, o.fl. TRPC6 binst og virkjar calpain, óháð rásvirkni þess, og stjórnar frumubeinagrind, frumuviðloðun og hreyfigetu. J Am Soc Nephrol. 2019;30: 1910–1924.

73. Letavernier E, Perez J, Bellocq A, o.fl. Miða á calpain/calpastatin kerfið sem nýja stefnu til að koma í veg fyrir endurgerð hjarta- og æðakerfis í háþrýstingi af völdum angíótensíns II. Circ Res. 2008;102:720–728.

74. Zafrani L, Gerotziafas G, Byrnes C, et al.Kalpastatínstjórnar blóðsýkingu fjölörvera með því að takmarka losun procoagulant öragna. Am J Respir Crit Care Med. 2012;185:744–755.

75. Letavernier E, Dansou B, Lochner M, o.fl. Mikilvægt hlutverk calpain/calpastatín jafnvægis í bráðri höfnun ósamsetts ígræðslu. Eur J Immunol. 2011;41: 473–484.

76. Hanouna G, Mesnard L, Vandermeersch S, et al. Sérstök calpain hömlun verndarnýrugegn bólgu. Sci Rep. 2017;7:8016.

77. Ong SB, Lee WH, Shao NY, o.fl. Calpain hömlun kemur aftursjálfsáhrifog kemur í veg fyrir sundrun hvatbera í mönnum iPSC líkani af sykursýki endo the liopathy. Stofnfrumufulltrúi 2019;12:597–610.

78. Norman JM, Cohen GM, Bampton ET. In vitro klofnun hápróteina með frumudauðapróteasum. Autophagy. 2010;6:1042–1056.

79. De Tullio R, Averna M, Pedrazzi M, o.fl. Mismunandi stjórnun á calpain-calpastatin flókinu með L-lénikalpastatín. Biochim Biophys Acta. 2014;1843:2583–2591.