Gagnleg áhrif heildarhlutans fenýletanóíð glýkósíðs einangruð úr Cistanche Deserticola á smábyggingu beina í rottum með eggjastokkum.

Lingling Yang, Shuqin Ding, Bo Zhang, Jingjing Liu, Yanhong Dong, Qiwen Tang, Pingping Yang og Xueqin Ma

1 Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Ningxia Medical University, 1160 Shenli Street, Yinchuan 750004, Kína

2 School of Clinical Medicine, Ningxia Medical University, 692 Shenli Street, Yinchuan 750004, Kína

3 Key Laboratory of Hui Ethnic Medicine Modernization, Menntamálaráðuneytið, Ningxia Medical University, 1160 Shenli Street, Yinchuan 750004, Kína

Þetta er grein með opnum aðgangi sem dreift er undir Creative Commons Attribution License, sem leyfir ótakmarkaða notkun, dreifingu og fjölföldun á hvaða miðli sem er að því tilskildu að rétt sé vitnað í upprunalega verkið.

Tengiliður:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Ágrip

Þessi rannsókn var hönnuð til að áætla andbeinþynningarvirkni heildar phenylethanoid glýkósíðhluta einangraðs úrCistanchedeserticola(CDP) á rottum af völdum eggjastokkanáms (OVX) sem og skyldum aðferðum. Eftir 3 mánaða gjöf til inntöku var minnkuð beinþéttni, Ca og P í sermi í OVX rottum endurheimt og versnandi örbyggingu beinbeina var að hluta til bætt með inngripi Cistanche deserticola (60, 120 og 240 mg/kg), virknin. beinuppsogsmerkja var lækkuð og lífvirk beinmyndunarvísitala var stjórnað upp; á meðan minnkaði innihald MDA og GSH var aukið með CDP meðferð. Í samsetningu voru 8 fenýletanóíð glýkósíð efnasambönd auðkennd íCistanchedeserticola(CDP), þar sem heildarinnihaldið er mælt sem 50,3 prósent með því að nota HPLC aðferðina. Vélrænt,Cistanchedeserticola(CDP)lækkaði magn TRAF6, RANKL og RANK og bældi þannig RANKL/RANK/TRAF6-framkallaða virkjun á NF-KB og PI3K/AKT merkjaleiðum aftan við streymi og kom að lokum í veg fyrir virkni helstu beinþynningarpróteina NFAT2 og c -Fos. Öll ofangreind gögn gefa til kynna að CDP hafi jákvæð áhrif á beinsmábyggingu hjá rottum sem hafa verið gerðar með eggjastokkum og þessi áhrif geta tengst NF-KB og PI3K/AKT boðleiðum sem komu af stað með bindingu RANKL, RANK og TRAF6.

Cistanche tubulosahefur mörg áhrif, smelltu hér til að vita meira

1. Inngangur

Beinþynning eftir tíðahvörf, þar sem 1 af hverjum 3 konum eldri en 50 ára þjáist, er að verða helsta heilsufarsáhættan sem hrjáir meira en 200 milljónir kvenna um allan heim [1]. Við tíðahvörf leiðir mikil lækkun estrógenmagns venjulega til aukinnar beinupptöku af völdum aukinnar beinþynningar; þá raskaðist jafnvægið milli beinmyndunar af völdum beinþynningar og beinuppsogs af völdum beinþynninga, og hraðari beinupptökur olli að lokum beinþynningu og jafnvel mjaðma- eða hryggbrotum [2]. Talið var að aðgreining beinþynnunnar hafi komið af stað þegar viðtakavirki kjarnaþáttar kappa B (RANK) var bundinn við RANKL, bindil RANK. Samt sem áður er ekki hægt að virkja samsetningu RANK og RANKL nema próteinæxlisdrepsþáttur viðtaka-tengdur þáttur 6 (TRAF6) hafi verið tengdur í það [3], fylgt eftir með örvun niðurstreymis boðleiða þar á meðal PI3K/AKT og NF-KB. Og að lokum var tjáning kjarnaþáttar virkjaðra T frumna c2 (NFAT2) og c-Fos stjórnað [4] til að stilla aðgreiningu beinþynninga sem og beinupptöku. Þannig var talið að þættirnir og eftirlitsaðilarnir sem tengjast beint eða óbeint virkjun og aðgreiningu beinþynningar séu mikilvæg markmið til að koma í veg fyrir beinmissi.

Það eru örugglega nokkur klínísk og tilbúin hormónalyf eins og estradíólvalerat sem eru áhrifarík við meðferð á beinþynningu eftir tíðahvörf. Því miður jók sum þeirra hættuna á alvarlegum krabbameinum þar á meðal brjósta- og legslímukrabbameini [5], sem takmarkaði klíníska notkun þeirra. Þess vegna er nauðsynlegt að velja aðra valkosti með bæði virkni og lágmarks aukaverkunum. Hefðbundin kínversk lyf (TCM), sem og einangruðu lífvirku efnasamböndin og brotin [6-9], reyndust árangursrík við ýmsum kvillum, þar með talið beinþynningu eftir tíðahvörf. Meðal þessara lífvirku efnisþátta og hluta var talið að fenýletanóíð glýkósíð (PhG) efnasambönd með hugsanlega virkni væru efnileg lyf til meðferðar á beinþynningu [10-12]. Uppbygging PhGs samanstendur af kanilsýruaglýkóni, hýdroxýlfenýletýlhópi sem er sameinað -glúkópýranósa, apiósa, galaktósa, ramnósa eða xýlósa með glýkósíðtengi. Þeir eru víða til í lækningategundum af ættkvíslinniCistanche[13]. CistanchedeserticolaYC Ma er opinber TCM sem er skráð í kínverska lyfjaskrá og fyrir utan að vera mikilvæg TCM [14], er C deserticola einnig öldrunarlyf jurt með fáum aukaverkunum sem hefur verið þróuð í lyfjavín og næringarvökva samþykkt af matvælum ríkisins. og Lyfjastofnun. Byggt á skráningu kínverskrar lyfjaskrár, hafði C. deserticola verið notað af innfæddum til að meðhöndla nýrnavandamál eins og vöðvaskort og mjóhrygg, og fenýletanóíð glýkósíð efnasambönd þar á meðal echinacoside og acteoside eru helstu lífvirku innihaldsefnin í þessari jurt. Samkvæmt TCM kenningunni um „nýra-stjórna-bein“ er beinkerfið stjórnað af nýrnakjarna [15], og beinatengd vandamál eins og beinþynning gætu verið endurheimt með jurtum eða efnasamböndum sem hafa þá virkni að næra nýrnakjarna. Þess vegna settum við fram tilgátu um að heildarhlutfall fenýletanóíð glýkósíðs sem einangrað var frá C. deserticola, að minnsta kosti að hluta, væri gagnlegt við meðhöndlun á beinþynningu. Núverandi tilraun var því hugsuð til að sannreyna tilgátu okkar með því að nota rottalíkan með eggjastokkum (OVX); fyrir utan beinuppsogs- og myndun merkjanna sem þarf að áætla, voru andoxunarstuðullinn sem og RANKL/RANK/TRAF6- framkallaðir PI3K/AKT og NF-KB merkjaleiðir einnig notaðar til að kanna helstu aðferðir af lífvirkni gegn beinþynningar. .

2. Efni og aðferð

2.1. Plöntuefni og undirbúningur.

Alls 30 kg stafar afCistanchedeserticolaY.C. Mum var safnað frá Yongning-sýslu í september 2015 með hnitunum 106.026597 og 38.262816, Ningxia héraði, Kína. Jurtin var auðkennd af Dr. Lin Dong (Department of Pharmacognosy, Ningxia Medical University) og samsvarandi sýni (#201509{{40}}1) var varðveitt í lyfjagreiningardeild. Í fyrsta lagi voru 30,0 kg af duftformi C. deserticola dregin út með því að nota bakflæðisaðferðina með 70 prósent etanóli sem leysi; hlutfall efnis og leysis var stillt sem 1:10 og bakflæðistíminn var 2 klst í 3 skipti. Síðan voru allar síuvökvar sameinaðar og þéttar undir lægri þrýstingi við 60 gráður C. Í öðru lagi voru AB-8 stórgjúpar trjákvoðasúlur notaðar fyrir bráðabirgðaaðskilnaðinn og mismunandi hlutföll etanóls í vatni (0 prósent , 20 prósent , 30 prósent, 40 prósent, 50 prósent og 60 prósent, hver 60 L) voru notuð til að skola. Í þriðja lagi voru 40 prósent og 50 prósent elúerin sameinuð og frekar hreinsuð með því að nota endurteknar AB-8 stórgjúpar trjákvoða súlur með elúerunum 0 prósent, 20 prósent, 30 prósent, 40 prósent og 50 prósent etanól í vatni, og hvert skolefni var 12 L. Að lokum var 40 prósenta hlutanum safnað saman og þéttað við lækkaðan þrýsting til að fá 150 g fölgult set af fenýletanóíð glýkósíðhluta C. deserticola (CDP, afraksturinn var 0,5 prósent). Fyrir in vivo tilraunir var 0,5 prósent CMC-Na leysir notaður til að leysa upp CDP; gjöf til inntöku til dýra var stillt sem 1 ml/100 g af líkamsþyngd; fyrir in vitro Western blot greiningu var CDP leyst upp með DMSO og síðan þynnt með DMEM til að fá lokastyrkinn 0,1 mg/ml, 0,01 mg/ml og 0,001 mg/ml.

2.2. Efni og leysiefni.

Estradiol valerate (EV) var frá Delpharm Lille SAS, Frakklandi; basísk fosfatasa (ALP), bein gla-prótein (BGP), tartrat ónæm sýrufosfatasa (TRAP) og deoxýpýridínólín (DPD) krosstengja ELISA sett frá Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Shanghai, Kína, 201605; malondialdehýð (MDA, 20181221), ofuroxíð dismutasi (SOD, 20121218) og glútaþíon (GSH, 20181221) hvarfefnasett frá Institute of Nanjing Jiancheng Biological Engineering, Nanjing, Kína; Lntact parathormón (l-PTH, NEWASHE7UZ), kalsítónín (2L9ISN7AIU) og estrógen-tengd viðtaka alfa (ERR , Y3AY8QEWB3) krosstengja ELISA sett frá Elabscience Biotechnology Co. Ltd., Wuhan, Kína; cathepsin K ELISA hvarfefnissett frá BioVision, Ameríku, 1l300141; aðal mótefni af RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κB p65 (AH04138226), PI31 kínasi p6902 alfa1 (692) , AKT 1 (AF05173234), -aktín (17AV0411), og afleidd mótefni gegn piparrótarperoxídasa-tengdum geita-anti-kanínu IgG frá ZSGB-BIO, Kína, 136080; heildar BCA próteinprófunarsett og viðskiptasettið til að greina oste oclast myndun og fóstursermi og Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) frá HyClone, Logan, UT, Bandaríkjunum; polyvinylidene flfluoride (PVDF) himna frá Millipore Life Sciences, Billerica, MA, Bandaríkjunum; penicillín og streptómýsín frá Gibco, Rockville, MD, Bandaríkjunum. Öll önnur efnafræðileg efni sem notuð voru voru af AR-gráðu.

2.3. HPLC magngreining á Cistanche Deserticola P.

Agilent 1220 HPLC tæki var notað til að bera kennsl á og mæla samsetningu CDP. Skiljunarskilyrði voru sem hér segir: C18 súla (TSK-GEL, 4 6 I d × 250 mm, 5 μm); hallaskolun innihélt leysiefni A (asetónítríl) og B (vatn sem inniheldur 0,5 prósent ediksýru) (0-10 mín: 17-20 prósent A; 10-30 mín: 20-25 prósent A; og 30-40 mín.: 25-30 prósent A); greiningarbylgjulengdin var 333 nm; umhverfishiti; flæðishraðinn var 1,0 ml/mín; inndælingarrúmmál sýnis var 5 μL. Átta PhG efnasambönd, þ.e. cistanosíð F, echinacoside, 6'-asetýlakteósíð, cistanosíð C, cistanosíð A, acteosíð, 2'-asetýlakteósíð og ísóakteósíð, voru auðkennd; með því að nota samsvarandi viðmiðunarefni og ytri staðlaða aðferð var innihald ofangreindra 8 PhGs magnmælt með HPLC greiningu (Mynd 1).

2.4. Dýratilraunabókun.

Alls voru 60 fullorðnar Sprague-Dawley kvenkyns rottur á aldrinum 3 mánaða ætlaðar frá dýraprófunarmiðstöð Ningxia Medical University, með upphafsþyngd að meðaltali um 234 ± 25 g. Rotturnar voru geymdar í venjulegu, sérstöku sjúkdómsvalda umhverfi til að aðlagast í 1 viku. Síðan voru allar rotturnar aðeins svæfðar (klóralhýdrat, 100 mg/kg, ip) eða sýndar eggjastokkar fjarlægðar (SHAM), eða tveir eggjastokkar voru báðir fjarlægðir og síðan skipt af handahófi í 5 undirhópa: meðhöndlaðar til inntöku með burðarefni (0,5 prósent CMC- Na) var stillt sem fyrirmyndarhópur (OVX), estradíólvalerat (1 mg/kg/dag) sem jákvæði hópurinn (EV), og 60, 120 og 240 mg/kg/dag af CDP sem lágt (CDPL), miðlungs (CDPM), og hár (CDPH) skammtahópar, í sömu röð. Allar rotturnar voru gefnar til inntöku daglega og stóðu í 3 mánuði með skammtinum aðlagað á 2 vikna fresti sem var háð breytingu á líkamsþyngd. Á síðasta degi dýratilraunarinnar var 24-klst. þvag fengið með því að nota efnaskiptabúr; sermi var safnað úr lærleggsæð svæfðra rotta; hægri lærlegg, sköflung og öll líffæri voru krufin og geymd við -80 gráðu C til frekari greiningar. Dýratilraunirnar sem við gerðum voru samþykktar af dýraumönnunar- og notkunarnefnd Ningxia læknaháskólans.

2.5. Ákvörðun beinþéttni og ör-CT greining.

Í fyrsta lagi var tvíorku röntgengleypnimæla (Lunar, USA) notuð til að áætla heildarbeinþéttni hægra lærleggs hverrar rottu; Í öðru lagi var sama lærlegg notað til að áætla þrívíddarmynd af örbyggingu beinbeina með því að nota ör-CT skannatæki (GE, Ameríku). Ísótrópíska upplausnin var stillt sem 14 μm til að fá ákjósanlega þrívíddarmynd; áhugasvæðið (ROI) var valið með því að setja sömu hnit í vaxtarplötu lærleggs hvers sýnis; og beinformunarbreytur, þar á meðal trabecular aðskilnaður (Tb. Sp), trabecular tala (Tb. N), trabecular þykkt (Tb. Th), bein steinefnainnihald (BMC), vefja steinefnaþéttleiki (TMD) og vefja steinefnainnihald (TMC) ) voru fengnar með því að greina arðsemi.

2.6. Lífefnafræðileg prófun í sermi og þvagi.

Virkni cathepsin K, TRAP, SOD og GSH í sermi, svo og innihald PTH, kalsítóníns, ERR , MDA, BGP og þvags DPD í sermi, voru ákvörðuð með því að nota samsvarandi hvarfefnasett í samræmi við leiðbeiningar framleiðanda, og magn basísks fosfatasa (ALP) og innihald kalsíums í sermi og þvagi (Ca) og fosfór (P) var metið með því að nota sjálfvirka vél (Ciba-Corning 550 Diagnostics Corp., Oberlin, OH, Bandaríkjunum).

2.7. Western Blot greining.

Osteoclastar voru framkallaðir með því að nota RAW 264.7 frumur sem bætt var við macrophage colony-stimulating factor (MCSF) og RANKL. Í stuttu máli voru 1 × 107 RAW 264.7 frumur ræktaðar í 6-brunnsplötu í viðurvist 30 ng/mL af MCSF og 25 ng/mL af RANKL. Eftir 6 daga örvun voru þroskuðu beinþynningarfrumurnar auðkenndar með því að nota TRAP-litaða aðferðina með samsvarandi setti, síðan meðhöndlaðir með CDP (0.1, 0.01 og 0.001 mg/ml , í sömu röð) í 24 klst; síðan voru frumurnar lýsaðar með lýsisbuffi sem innihélt 0,5 mmól fenýlmetýlsúlfónýlflúoríð, próteasa og fosfatasahemla. Lysatið var síðan aðskilið með því að nota 10 prósent SDS-PAGE og flutt yfir á PVDF himnu, sem var rannsakað með AKT1, NF-KB-p65, RANKL, PI3K-p85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos og -actin (1: 400) eftir blokkun með 5 prósent fitulausri mjólk í 2 klst. Sömu himnur voru fjarlægðar og rannsakaðar aftur með ofangreindum 9 samsvarandi mótefnum, í sömu röð, og voru síðan greindar af Image Lab hugbúnaðinum í lokin. Tilraunirnar voru endurteknar þrisvar sinnum.

2.8. Tölfræðigreining.

Öll gögn sem fengust úr in vivo og in vitro tilraunum, lýst sem meðaltali ± SD, voru greind með því að nota einstefnu ANOVA og síðan Dunnett's próf (SPSS 22.0 hugbúnaður, SPSS, USA); p < 0="" 05="" var="" tölfræðilega="">

Niðurstöður

3.1. Efnafræðileg samsetning Cistanche Deserticola P.

Með því að nota HPLC aðferðina, áttafenýletanóíð glýkósíðefnasambönd fundust í þessu broti, eins og mynd 1 sýnir. Með því að nota staðlaðar tilvísanir og ytri staðlaða aðferð voru efnasamböndin og innihald þeirra auðkennd og magngreind sem hér segir: (1) akteósíð F (3,6 prósent), (2) echinakósíð (8,8 prósent), (3) cistanosíð A (5.{ {9}} prósent), (4) akteósíð (13,3 prósent), (5) ísóakteósíð (3,3 prósent), (6) akteósíð C (3,6 prósent), (7) 2'-asetýlakteósíð (9,9 prósent) og (8 ) 6'-asetýlakteósíð (3,2 prósent). Heildarinnihald þessara átta íhluta var metið sem 50,7 prósent.

3.2. Áhrif Cistanche Deserticola P á beinþéttni og örarkitektúr Trabecula.

Heildarbeinþéttleiki rottanna í mismunandi undirhópum er sýndur á mynd 2. Minnkandi tilhneiging í innihald beinþéttni kom fram hjá rottum af OVX líkanhópnum, sem minnkaði um tæp 12,0 prósent eftir 12 vikur af aðgerð samanborið við rottur í SHAM hópnum (p < 0="" 001).="" allar="" rotturnar="" sem="" fengu="" cdp="" sýndu="" marktækt="" aukinn="" beinþéttni="" um="" 11,2="" prósent,="" 12,0="" prósent="" og="" 10,7="" prósent="" (p="">< 0="" 01),="" í="" sömu="" röð,="" samanborið="" við="" rotturnar="" í="" ovx="" líkaninu="" hóp.="" ennfremur,="" í="" samræmi="" við="" gögnin="" um="" heildar="" beinþéttni,="" sýndu="" ör-ct="" enduruppbygging="" auk="" vefjamótunarfræðilegrar="" ákvörðunar="" lærleggsins="" að="" rotturnar="" í="" ovx="" hópnum="" sýndu="" augljósa="" hnignun="" á="" trabecular="" arkitektúr="" sem="" sést="" af="" sérstaklega="" minnkandi="" fjölda="" og="" flatarmáli="" trabecula.="" sem="" verulega="" aukin="" tb.="" sp="" í="" samanburði="" við="" rottur="" sham="" hópsins.="" meðferð="" með="" cdp="" kom="" í="" veg="" fyrir="" versnun="" af="" völdum="" ovx="" í="" trabecular="" arkitektúr;="" eins="" og="" mynd="" 3="" sýnir="" eru="" bmc,="" tmc="" og="" tb.="" n="" gildi="" hækkuðu="" verulega="" og="" flatarmál="" tb.="" sp="" var="" sérstaklega="" lækkað,="" en="" gildi="" tmd="" og="" tb.="" þeir="" virtust="" ekki="" hafa="" veruleg="" áhrif="" á="" ovx="" aðgerðina="" og="" cdp="" inngrip="">

3.3. Áhrif Cistanche Deserticola P á lífefnafræðilegar þættir í þvagi og sermi.

Eins og mynd 4 sýnir greindist marktæk lækkun á þvagþéttni P og sermisinnihald kalsítóníns í rottum af OVX líkanhópnum, sem var næstum 30 prósent og 60 prósent minna en SHAM rotturnar (p < 0="" 001="" ),="" í="" sömu="" röð,="" en="" engin="" augljós="" hækkun="" eða="" minnkandi="" tilhneiging="" í="" þvagþéttni="" ca="" og="" sermi="" ca="" sem="" og="" sermi="" p="" og="" sermi="" pth="" sást="" milli="" ovx="" og="" sham="" hópa.="" meðferð="" með="" cdp="" kom="" marktækt="" í="" veg="" fyrir="" tap="" á="" p="" og="" ca="" í="" sermi="" í="" ovx="" rottum,="" sem="" sést="" af="" því="" að="" magn="" p="" og="" ca="" í="" sermi="" hækkaði="" sérstaklega="" (p="">< 0="" 05)="" samanborið="" við="" rottur="" í="" ovx="" líkanahópnum.="" auk="" þess="" sást="" aukin="" en="" ótölfræðilega="" marktæk="" tilhneiging="" kalsítóníns="" í="" bæði="" lág-="" og="" háskammtahópum="" cdp="" samanborið="" við="" ovx="">

3.4. Áhrif Cistanche Deserticola P á beinmyndun og beinupptökumerki.

Gagnlegum áhrifum CDP á beinmyndunarvísitölu, sem og hamlandi áhrifum á beinuppsogsmerki, var lýst á mynd 5. Varðandi beinmyndunarmerkin var magn BGP í sermi nánast ekki undir áhrifum frá skurðaðgerð á eggjastokkum sem var tekin úr eggjastokkum sem sýndi ekki marktækar breytingar sem komu fram í öllum meðhöndluðum hópum, en tölfræðilega marktækar umbætur á ALP í sermi fengust bæði í litlum (60 mg/kg) og í meðallagi (120 mg/kg) skömmtum af CDP íhlutunarhópum þegar borið saman við rottur SHAM hópsins (p < 0="" 01).="" varðandi="" beinuppsogsstuðulinn="" var="" magn="" cathepsin="" k="" og="" dpd="" í="" sermi="" auk="" trap="" í="" rottum="" af="" ovx="" líkanhópnum="" marktækt="" um="" 75,0="" prósent,="" 41,4="" prósent="" og="" 21,0="" prósent,="" í="" sömu="" röð,="" samanborið="" við="" sham="" rotturnar.="" ,="" og="" þegar="" þeir="" voru="" meðhöndlaðir="" með="" cdp,="" sérstaklega="" lágum="" skömmtum="" 60="" mg/kg,="" voru="" eiginleikar="" cathepsin="" k="" og="" dpd="" sem="" og="" trap="" í="" ovx="" líkanhópnum="" sérstaklega="" hindraðir="" um="" 67,3="" prósent,="" 41,4="" prósent="" og="" 25,9="" prósent,="" í="" sömu="" röð,="" eins="" og="" samanborið="" við="" rotturnar="" í="" ovx="">

3.5. Áhrif Cistanche Deserticola P á leggöngum og legi sem og líkamsþyngd.

Óverulegur munur á upphaflegri líkamsþyngd rotta kom fram fyrir meðferð í sex hópum (mynd 6). Hins vegar leiddi eggjastokkaskurðaðgerðin til marktækrar aukningar á endanlegri líkamsþyngd rotta í OVX líkanahópnum sem er næstum 36,0 prósent, en blautþyngd legs og leggöngum minnkaði verulega um næstum 9{{4 }}.0 prósent og 60,0 prósent , í sömu röð, samanborið við SHAM rotturnar (p < 0="" 001).="" þrátt="" fyrir="" að="" innihald="" err="" sýndi="" engan="" marktækan="" mun="" á="" ovx="" og="" sham="" hópum,="" jók="" allir="" meðferðarhóparnir,="" þar="" á="" meðal="" cdp="" og="" ev,="" marktækt="" magn="" err.="" ennfremur,="" þegar="" það="" var="" meðhöndlað="" með="" ev,="" þyngdist="" ofangreint="" heill="" líkamsþyngd,="" sem="" og="" tap="" á="" leggöngum="" og="" þyngd="" í="" legi="" ovx="" rotta,="" var="" að="" hluta="" til="" snúið="" við="" (p="">< 0="" 001)="" ​​en="" hafði="" ekki="" áhrif="" á="" cdp="">

3.6. Áhrif Cistanche DeserticolaP á magn MDA, SOD og GSH í sermi.

Enginn tölfræðilega marktækur munur var á eiginleikum SOD og GSH í sermi milli SHAM og OVX líkanahópanna; eins og mynd 7 lýsir, má sjá vaxandi tilhneigingu í GSH milli ofangreindra tveggja hópa. Að auki var magn MDA í sermi hækkað verulega um næstum 50 prósent hjá rottum í OVX líkanhópnum samanborið við SHAM rotturnar. Virkni SOD var ekki fyrir áhrifum af CDP meðferð, en eiginleikar GSH bættust verulega með CDP íhlutun og CDP lækkaði sérstaklega magn MDA um 33,9 prósent og 42,4 prósent í skömmtum 60 og 240 mg/kg, í sömu röð ( p < 0="">

3.7. Áhrif Cistanche deserticola P á próteintjáningu.

Gögnin okkar, sýnd á mynd 8, bentu til þess að CDP meðferð minnkaði marktækt próteinmagn TRAF6, RANK og RANKL samanborið við samanburðarhópinn. Niðurstraumsmerkjaleiðirnar, þar á meðal NF-KB, voru bældar og PI3K/AKT var örvað með CDP inngrip, sem sést af tjáningu á NF-KB-p65 niðurstýringu, en PI3K-p85 og AKT1 voru uppstýrt. Þar af leiðandi minnkaði tjáning NFAT2 marktækt og c-Fos jókst eftir meðferð með CDP í styrkleikanum 0.001-0.1 mg/ml. Leiðbeinandi fyrirkomulagi er lýst á mynd 9, þar sem CDP lækkaði magn RANKL og RANK, sem leiddi til minnkunar á bindimagni þessa bindils við viðtaka hans, og tenging RANKL við RANK minnkaði enn frekar með niðurstýringu á TRAF6, fylgt eftir með bælingu á niðurstreymisferlunum þar með talið NF-KB leiðinni á meðan PI3K/AKT merkjaferillinn var örvaður, sem að lokum leiddi til minnkunar á NFAT2 tjáningu og aukningar á c-Fos stiginu.

4. Umræður

Fenýletanóíð glýkósíð eru náttúrulega vatnsleysanleg efni sem eru víða til í lækningajurtaríkinu [11]. Hingað til hafa efnasambönd fenýletanóíð glýkósíða laðað að fleiri og fleiri vísindamenn vegna augljóss hlutverks þeirra við að meðhöndla ýmsa sjúkdóma og frávik í mönnum [13]. Fjöldi lífvirkra þátta og efnasambanda gegn beinþynningu, þar á meðal pólýfenól og fenýletanóíð glýkósíð, var auðkennd og einangruð úr tugum náttúrulegra lækningajurta [5, 10, 12, 16, 17]. C. deserticola er vel þekkt sem „ginseng eyðimerkurinnar“ sem gefur til kynna öryggissnið þessa æta TCM [18, 19]. Sem almenn tonic jurt og náttúruleg heilsufæði sem hefur lengi verið notuð í Asíulöndum, sýndi C. deserticola jákvæða virkni til að auka nýrnastyrk. Það kom í ljós að TCM, sem venjulega er notað til að endurlífga og viðhalda nýrnakjarna, var venjulega notað til að meðhöndla beinþynningu, bæði in vitro og in vivo birt gögn höfðu sýnt fram á andbeinþynningarvirkni C. deserticola [20-23] og fenýlethanoid glýkósíð innihaldsefna, þ.m.t. echinacoside og acteoside eru helstu lífvirku þættirnir sem eru til í þessari ætu lyfjaplöntu; allt benti til þess að ekki aðeins echinacoside og acteoside sjálft heldur einnig aðrir fenýlethanoid glýkósíð þættir sem eru í C. deserticola voru taldir ábyrgir fyrir mótþynningareyðandi eiginleika þessarar jurtar. Í þessari rannsókn okkar var hagstætt stórgjúpt plastefni notað til að einangra og auðga fenýletanóíð glýkósíð hlutinn úr C. deserticola, og með því að nota HPLC aðferðina, átta helstu fenýletanóíð glýkósíð þættir, þ.e. acteoside F, echinacoside, cistanoside A, acteoside, ísóakteósíð, akteósíð C, 2'-asetýlakteósíð og 6'-asetýlakteósíð, fundust í einangruðu fenýletanóíð glýkósíðhlutanum og innihaldið var 3,6 prósent, 8,8 prósent, 5,0 prósent, 13,3 prósent, 9,3 prósent, 9,3 prósent, 9,3 prósent. og 3,2 prósent, í sömu röð. Echinacoside, eitt helsta virkni efnasambandið sem skráð er í C. deserticola [14], hafði reynst hafa andbeinþynningarvirkni; Hins vegar var skammturinn 270 mg/kg svo hár sem takmarkaði frekari klíníska notkun þess [24]. Í núverandi tilraunum var heildarhlutfall fenýletanóíð glýkósíðs með lægri skammti 60-240 mg/kg líkamsþyngdar/- dag notað á OVX rottum og innihald auðkenndra innihaldsefna var næstum 50 prósent hreint í þessu broti með því að nota HPLC aðferðin.

Það var vel þekkt að OVX getur valdið beinþynningu og OVX rotta var talin vera klassískt og heppilegt líkan til að líkja eftir beinþynningu eftir tíðahvörf manna. Á sama tíma sást marktæk minnkun á steinefnaþéttni beina, örbyggingu beina í beinum, blautþyngd í legi og leggöngum og estrógenmagni, auk augljósrar aukningar á beinupptöku og líkamsþyngd, eftir skurðaðgerð á eggjastokkum, þar af í hluti vegna estrógentaps [25]. Gögn okkar, hingað til, sýndu greinilega að OVX framkallaði beinþynningu eftir tíðahvörf og fylgir alltaf mikilli hnignun í beinum, örbyggingu beina og blautþyngd í legi og leggöngum. Þar sem EV er almennt hormónauppbótarefni sem hefur verið notað í klínískri starfsemi, var það notað sem jákvæð viðmiðun í in vivo tilraun okkar, og aukinn líkamsþyngd og rýrnun legsþyngd, auk versnandi beinþéttni og örbyggingar beins , var væntanlega snúið við með EV viðbót. Ólíkt jákvæðu viðmiðuninni var minnkuð þyngd legganga og legs, svo og heildarþyngd rotta í OVX líkanahópnum, ekki fyrir áhrifum af CDP meðferð, sem gaf í skyn að CDP gæti aukið beinmyndun án þess að valda aukaverkunum á líkamanum og lífrænum vefjum í legi. Þrátt fyrir að magn ERR hafi verið verulega hækkað með CDP meðferð, var það alveg eins og plöntuestrógenáhrif að engar aukaverkanir á lífrænum vefjum í legi og leggöngum komu fram. Að auki styrkti meðferð á CDP verulega gæði beina í OVX rottum sem höfðu versnað við skurðaðgerð á eggjastokkum.

Að auki var magn P og Ca í þvagi og sermi OVX rotta einnig notað til að endurspegla beinþynningaráhrif og styrkur Ca og ólífræns P var venjulega háður magni kalsítóníns og PTH [26]. Í þessari rannsókn, þrátt fyrir að engin marktæk lækkandi eða aukin tilhneiging í þvagútskilnaði Ca, sermi P, sermi Ca og PTH hafi fengist hjá rottum af OVX líkanhópnum, var marktækt þvagmagn P og kalsítóníns (p < {="" {1}})="" sáust.="" í="" samræmi="" við="" birt="" gögn="" um="" að="" estrógenskortur="" af="" völdum="" skurðaðgerðar="" á="" eggjastokkum="" leiddi="" alltaf="" til="" lækkunar="" kalsítóníns="" í="" blóði,="" leiddi="" þetta="" minnkaða="" kalsítónín="" í="" sermi="" að="" lokum="" til="" aukins="" pth-gildis,="" þar="" sem="" ca="" var="" talið="" aðalstjórnandi="" á="" seytingu="" pth.="" vegna="" þess="" að="" styrkur="" pth="" sýndi="" engan="" marktækan="" mun="" á="" ovx="" og="" sham="" hópunum="" í="" þessari="" rannsókn="" sýndi="" magn="" ca="" í="" bæði="" sermi="" og="" þvagi="" engar="" augljósar="" breytingar="" á="" milli="" ofangreindra="" tveggja="" hópa.="" hins="" vegar="" fékkst="" marktækt="" minnkandi="" tilhneiging="" til="" magns="" kalsítóníns="" milli="" ovx="" og="" sham="" hópanna="" og="" þar="" af="" leiðandi="" minnkaði="" innihald="" p="" í="" þvagi="" ovx="" verulega.="" við="" töldum="" að="" ofangreind="" gögn="" gætu="" útskýrt="" hið="" misvísandi="" fyrirbæri="" hvers="" vegna="" útskilnaður="" ca-magns="" í="" þvagi="" í="" ovx="" rottum="" sýndi="" enga="" augljósa="" breytingu="" samanborið="" við="" sham-rottur,="" og="" þetta="" fyrirbæri="" gæti="" einnig="" tengst="" aukinni="" hraða="" beinaskipta="" [27]="" .="" eftir="" meðferð="" með="" cdp="" var="" styrkur="" p="" og="" ca="" í="" sermi="" sérstaklega="" hækkaður="" og="" innihald="" p="" í="" þvagi="" var="" lækkað="" í="" ovx="" rottum,="" sem="" endurspeglaði="" að="" cdp="" gæti="" ekki="" aðeins="" komið="" í="" veg="" fyrir="" útskilnað="" steinefna="" úr="" beinum="" heldur="" einnig="" aukið="" sermisinnihald="" þeirra.="" frumefni,="" þannig="" að="" óbeint="" bæla="" niður="">

Ennfremur voru beinmyndunar- og uppsogsmerkin, sem og andoxunarensímin, þar á meðal SOD og GSH, einnig notuð til að útskýra undirliggjandi mótbeinþynningarferli CDP. Svipað og birt gögn sýndi magn ALP í rottum af OVX líkanahópnum ótölfræðilega marktæka aukningu sem gefur til kynna hraðari beinaveltu í beinþynningu eftir tíðahvörf [10]. Hins vegar, eftir meðferð með CDP (60, 120 og 240 mg/kg/dag), var eiginleiki ALP verulega aukinn. Það var vel þekkt að OVX olli mikilli lækkun á estrógenmagni sem venjulega leiðir til aukinnar beinupptöku og oxunarálags [28], sést af magni TRAP, cathepsin K og DPD sem og MDA sem er sérstaklega uppstýrt hjá rottum OVX módelhópur. Hins vegar var þessi rýrnun að hluta til bætt með inngripi CDP. Að auki sýndi OVX rottameðferð með CDP (60 og 240 mg/kg) marktæka aukningu á virkni GSH (p < 0="" 05).="" ofangreindar="" niðurstöður="" gáfu="" til="" kynna="" að="" cdp="" sýndi="" meðferðaráhrif="" á="" beinþynningu="" af="" völdum="" ovx="" og="" þessi="" áhrif="" voru="" bæði="" með="" því="" að="" auka="" beinmyndun="" og="" bæla="" niðurupptöku="" beina="" auk="" þess="" að="" bæta="" andoxunarkerfi="">

Virkjun RANK með bindil þess RANKL örvaði tjáningu NFAT2 og c-Fos með PI3K / AKT og NF-KB merkjum [29]. NF-KB reyndist nauðsynlegt fyrir beinþynningarmyndun þar sem truflun á NF-KB gæti leitt til skertrar beinþynningaraðgreiningar með beinþynningarsvipgerð, og NF-KB hækkaði c-Fos og lækkaði NFAT2 tjáningu meðan á RANKL/RANK/TRAF-framkallaðri beinmyndun stóð. Til að meta jákvæð áhrif CDP á NFAT2 og c-Fos-miðlaða beinþekjumyndun, voru tjáningarstig RANKL og RANK greind. Væntanlega hamlaði CDP marktækt NFAT2 og örvaði c-Fos stig með því að minnka tjáningu RANKL og RANK. Á sama tíma skorti RANK sjálft innri kínasaeiginleika nema TRAF6 væri sameinuð til að kveikja á niðurstreymismerki [3]. CDP lækkaði einnig tjáningu TRAF6, sem leiddi til þess að bindingarmagn RANKL og RANK minnkaði verulega. Tilgáta mótþynningarkerfi CDP á OVX rottum náði yfir ofangreindar boðleiðir og eftirlitsstýringum var lýst á mynd 9. Hnitmiðað, CDP lækkaði TRAF6, RANKL og RANK stigum, og bældi þannig niðurstreymis boðleiðir þar á meðal PI3K/AKT og NF-KB sem eru kveikt af RANKL/RANK, og að lokum dró úr tjáningu og virkni helstu beinþynningarpróteina NFAT2 og c-Fos. Þess vegna gáfu margar vísbendingar um gögn til kynna jákvæð áhrif CDP á beinefnaskipti OVX rotta, aðallega með RANKL/RANK/TRAF6-miðluðum PI3K/AKT og NF-KB ferlum.

5. Niðurstaða

Í stuttu máli sýndi heildarmagn fenýletanóíð glýkósíða, einangrað úr C. deserticola, marktæk jákvæð áhrif á beinþynningu eftir tíðahvörf hjá OVX rottum, og lækningamöguleikinn til að bæla niður beinmissi var aðallega með því að örva beinmyndun og hindra beinupptöku auk þess að bæta bein andoxunarefni. kerfi; aðferðirnar gætu tengst RANKL/RANK/TRAF6-framkallaðri NF-KB virkjun og PI3K/AKT óvirkjun sem og c-Fos örvun og NFAT2 bælingu, og að lokum var aðgreining beinþynningar hamlað.

Skammstafanir

AKT: Prótein kínasi B

ALP: Alkalískur fosfatasi

BGP: Bein GLA prótein

BMC: Innihald beinsteina

CDP: Phenylethanoid glycoside hluti af C. deserticola

CK: Cathepsin K

CT: Kalsítónín

DPD: Deoxýpýridínólín

ERR: Estrógen-tengdur alfa viðtaka

EV: Estradíólvalerat

GSH: Glútaþíon l-PTH: ósnortið parathormón

MCSF: Macrophage colony-stimulating factor

MDA: Malondialdehýð

NFAT2: Kjarnaþáttur virkjaðra T frumna c2

NF-KB: Kjarnaþáttur-kappa B

OPG: Osteoprotegerin

OVX: Eggjastokkur tekinn

PhGs: Fenýletanóíð glýkósíð

PI3K: Fosfóínósíð 3-kínasa

RANK: Viðtakavirkjari kjarnaþáttar-kappa B

RANKL: Viðtakavirkjun kjarnaþáttar-kappa

B bindill arðsemi: Áhugasvæði

SOD: Superoxide dismutasi

Tb. N: Trabecular tala

Tb.Sp: Trabecular aðskilnaður

Tb.Th: Trabecular þykkt

TCM: Hefðbundin kínversk læknisfræði

TMC: Steinefnainnihald vefja

TMD: Steinefnaþéttleiki vefja

TNF: Æxlisdrep þáttur

TRAF6: Æxlisdrep þáttur viðtaka tengdur þáttur 6

TRAP: Tartrat-ónæmur sýrufosfatasi.

Aðgengi gagna

Gögnin sem notuð eru til að styðja niðurstöður þessarar rannsóknar eru fáanlegar hjá samsvarandi höfundi sé þess óskað.

Hagsmunaárekstrar

Höfundar höfðu enga hagsmunaárekstra.

Framlög höfunda

XM hannaði og hafði umsjón með tilraununum; SD og LY gerðu flestar tilraunirnar og sömdu handritið; BZ og JL gerðu Western blot greiningu og tóku þátt í dýratilraunum; YD greindi gögnin; QT og PY endurskoðuðu handritið. Allir höfundar fóru yfir handritið. Lingling Yang og Shuqin Ding lögðu jafnt sitt af mörkum til handritsins.

Viðurkenningar

Þetta starf var stutt af styrkjum frá Science Technology Foundation of Higher Education of Ningxia (NGY2017090), National Natural Science Foundation of China (nr. 81560684), Key Research and Development Program of Ningxia (2018BHF2001), Ningxia Key Research og Uppfinningaáætlun um vísinda- og tæknisamstarf austurs og vesturs (nr. 2017BY084 og 2017BY079), og West Light Foundation of the Chinese Academy of Sciences-Young Scientists of West 2017.

Heimildir

[1] LJ Melton III, EA Chrischilles, C. Cooper, AW Lane og BL Riggs, "Sjónarhorn. Hversu margar konur eru með beinþynningu?" Journal of Bone and Mineral Research, bindi. 7, nr. 9, bls. 1005–1010, 1992.

[2] S. Schnell, SM Friedman, DA Mendelson, KW Bingham og SL Kates, „1-árs dánartíðni sjúklinga sem eru meðhöndlaðir í mjaðmarbrotaáætlun fyrir öldunga,“ Geriatric Orthopedic Surgery & Rehabilitation, vol. 1, nr. 1, bls. 6–14, 2010.

[3] EM Tan, L. Li, IR Indran, N. Chew og EL Yong, "TRAF6 miðlar bælingu á beinþynningu og kemur í veg fyrir beinatapi af völdum eggjastokka með nýjum prenýlflavonoid," Journal of Bone and Mineral Research, vol. 32, nr. 4, bls. 846–860, 2017.

[4] JH Kim og N. Kim, "Regulation of NFATc1 in osteoclast differentiation," Journal of Bone Metabolism, bindi. 21, nr. 4, bls. 233–241, 2014.

[5] Q. Ye, XQ Ma, CL Hu o.fl., "Vyndingarþynningarvirkni og innihaldsefni Podocarpium podocarpus," Phytomedicine, bindi. 22, nr. 1, bls. 94–102, 2015.

[6] SA Jang, HS Song, JE Kwon, o.fl., "Protocatechuic acid atenuates trabecular bein loss in ovvariectomized mús," Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 2018, greinarnúmer 7280342, 11 síður, 2018.

[7] AB Abdel-Naim, AA Alghamdi, MM Algandaby, o.fl., "Rútín einangrað frá Chrozophora tinctoria eykur útbreiðslu beinfrumna og beinmyndunarmerki," Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 2018, greinarnúmer 5106469, 10 síður, 2018.

[8] J. Wattanathorn, C. Thipkaew, W. Thukham-mee, S. Muchimapura, P. Wannanon og T. Tong-un, „Morindacitrifolia L. blaðaþykkni verndar gegn blóðþurrð í heila og beinþynningu í in vivo tilraunalíkani tíðahvörf," Oxidative Medicine and Cellular Longevity, bindi. 2018, greinarnúmer 1039364, 13 síður, 2018.

[9] S. Sungkamanee, J. Wattanathorn, S. Muchimapura, og W. Thukham-mee, "Veisluþynningaráhrif samsetts útdráttar af Morus alba og Polygonum odoratum," Oxidative Medicine and Cellular Longevity, bindi. 2014, greinarnúmer 579305, 9 bls., 2014.

[10] J. Liu, Z. Zhang, Q. Guo, Y. Dong, Q. Zhao og X. Ma, "Syringin kemur í veg fyrir beinmissi í músum sem hafa verið teknar með eggjastokkum með TRAF6 miðlaðri hömlun á NF-KB og örvun á PI3K/AKT "Phytomedicine, bindi. 42, bls. 43–50, 2018.

[11] CW Lu, SK Huang, TY Lin og SJ Wang, "Echinacoside, virkur hluti af Herba Cistanche, bælir flogaveikiformandi virkni í CA3 pýramída taugafrumum hippocampus," The Korean Journal of Physiology & Pharmacology, vol. 22, nr. 3, bls. 249–255, 2018.

[12] X. Xu, Z. Zhang, W. Wang, H. Yao og X. Ma, "Meðferðaráhrif cistanoside A á beinefnaskipti músa sem eggjastokkar hafa verið teknir," Molecules, vol. 22, nr. 2, bls. 197, 2017.

[13] K. Alipieva, L. Korkina, IE Orhan, og MI Georgiev, "Verbascoside - endurskoðun á tilviki þess, (líf)myndun og lyfjafræðilega þýðingu," Biotechnology Advances, vol. 32, nr. 6, bls. 1065–1076, 2014.

[14] Ritnefnd Chinese Pharmacopoeia, Pharmacopeia of the People's Republic of China, China Medical Science and Technology Press, Peking, Kína, 10. útgáfa, 2015.

[15] H. Zhang, WW Xing, YS Li o.fl., "Áhrif hefðbundinnar kínverskrar jurtablöndur á beinþynningar og beinþynningar," Maturitas, bindi. 61, nr. 4, bls. 334–339, 2008.

[16] X. Ma, J. Liu, L. Yang, B. Zhang, Y. Dong og Q. Zhao, „Cynomorium songaricum kemur í veg fyrir beinupptöku í rottum sem hafa verið gerðar með eggjastokkum með RANKL/RANK/TRAF6 miðlaðri bælingu á PI3K/AKT og NF-KB leiðir," Lífvísindi, bindi. 209, bls. 140–148, 2018.

[17] XQ Ma, T. Han, X. Zhang, o.fl., "Kaempferitrín kemur í veg fyrir beinmissi í rottum með eggjastokkum," Phytomedicine, vol. 22, nr. 13, bls. 1159–1162, 2015.

[18] PL Liao, CH Li, LS Tse, JJ Kang og YW Cheng, „Öryggismat á Cistanche tubulosa heilsufæðinu Memoregain®: eituráhrif á erfðaefni og 28-eitrunarpróf eftir endurtekna skammta,“ Food and Chemical Toxicology , bindi. 118, bls. 581– 588, 2018.

[19] CC Wong, HB Li, KW Cheng og F. Chen, "Kerfisbundin könnun á andoxunarvirkni 30 kínverskra lækningajurta með því að nota járnminnkandi andoxunaraflsprófið," Food Chemistry, bindi. 97, nr. 4, bls. 705–711, 2006.

[20] D. Song, Z. Cao, Z. Liu, o.fl., "Cistanche deserticola fjölsykra dregur úr beinþynningu og beinaupptöku með því að hindra RANKL boð og hvarfgjörn súrefnisframleiðslu," Journal of Cellular Physiology, vol. 233, nr. 12, bls. 9674–9684, 2018.

[21] HD Liang, F. Yu, ZH Tong, HQ Zhang og W. Liang, „Cistanches Herba vatnsþykkni sem hefur áhrif á BGP og TRAP í sermi og beinmerg Smad1 mRNA, Smad5 mRNA, TGF- 1 mRNA og TIEG1 mRNA tjáningarstig í beinþynningarsjúkdómi," Molecular Biology Reports, bindi. 40, nr. 2, bls. 757–763, 2013.

[22] TM Li, HC Huang, CM Su o.fl., "Cistanche deserticola þykkni eykur beinmyndun í osteoblasts," Journal of Pharmacy and Pharmacology, vol. 64, nr. 6, bls. 897–907, 2012.

[23] H. Liang, F. Yu, Z. Tong og Z. Huang, "Áhrif Cistanches Herba vatnsþykkni á beinmissi í rottum með eggjastokkum," International Journal of Molecular Sciences, bindi. 12, nr. 8, bls. 5060–5069, 2011.

[24] F. Li, X. Yang, Y. Yang, o.fl., "Vyndingareyðandi virkni echinacosides í rottum með eggjastokkum," Phytomedicine, vol. 20, nr. 6, bls. 549–557, 2013.

[25] H. Nian, MH Ma, SS Nian og LL Xu, "Vyndingareyðandi virkni icariin í rottum með eggjastokkum," Phytomedicine, vol. 16, nr. 4, bls. 320–326, 2009.

[26] SR Fahmy, AM Soliman, AA Sayed, og M. Marzouk, "Mögulegur and-beinþynningarkerfi Cicer arietinum þykkni í rottum með eggjastokkum," International Journal of Clinical and Experimental Pathology, bindi. 8, nr. 4, bls. 3477– 3490, 2015.

[27] R. Swaminathan, "Lífefnafræðileg merki um beinaveltu," Clinica Chimica Acta, bindi. 313, nr. 1-2, bls. 95–105, 2001.

[28] S. Muthusamy, I. Ramachandran, B. Muthusamy, o.fl., "Ovariectomy framkallar oxunarálag og skerðir bein andoxunarkerfi í fullorðnum rottum," Clinica Chimica Acta, vol. 360, nr. 1-2, bls. 81–86, 2005.

[29] WJ Boyle, WS Simonet, og DL Lacey, "Osteoclast aðgreining og virkjun," Nature, bindi. 423, nr. 6937, bls. 337–342, 2003.