Blöðrur í ytri himnu baktería valda umritunarbreytingu í Arabidopsis í átt að virkjun ónæmiskerfis sem leiðir til bælingar á vexti sýkla í Planta

Ágrip

Gram-neikvæðar bakteríur mynda kúlulaga blöðrur á jaðri frumu sinna, sem losna síðar frá bakteríufrumuveggnum og mynda utanfrumublöðrur. Sýnt hefur verið fram á að þessar nanó-mælikvarða, þekktar sem ytri himnublöðrur (OMV), stuðla að sýkingu og sjúkdómum og geta framkallað dæmigerða ónæmisútgang í bæði spendýrum og plöntuhýslum. Til að skilja betur þær víðtæku umritunarbreytingar sem plöntur verða fyrir eftir útsetningu fyrir OMVs, meðhöndluðum við Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) plöntur með OMVs hreinsuðum úr Gram-neikvæðu plöntusjúkdómsvaldandi bakteríunni Xanthomonas campestris pv. campestris og framkvæmdi RNA-seq greiningu á OMV og sýndarmeðhöndluðum plöntum 2, 6 og 24 klst. eftir áskorun. Mest áberandi umritunarbreytingin átti sér stað á fyrstu tveimur tímapunktunum sem prófaðir voru, eins og endurspeglast af fjölda gena sem tjáð eru á mismunandi hátt og meðalfallsbreytingu. OMVs framkalla meiriháttar umritunarbreytingu í átt að virkjun ónæmiskerfisins, sem hækkar fjölda ónæmistengdra ferla þar á meðal margs konar ónæmisviðtaka. Samanburður á svörun Arabidopsis við OMVs og hreinsuðum elicitors, leiddi í ljós að OMVs framkalla svipaða svítu af genum og ferlum og stakir elicitors, hins vegar fundust leiðir sem virkjaðar voru af OMVs en ekki af öðrum elicitors. Formeðhöndlun Arabidopsis plöntur með OMVs og sýking í kjölfarið með bakteríusýkingu leiddi til verulegrar minnkunar á vexti sjúkdómsvalda. Stökkbreytingar í plöntulengingarþáttarviðtakanum (EFR), flagellinviðtakanum (FLS2) eða brassinosteroid-ónæmum 1- tengdum kínasa (BAK1) samviðtakanum, höfðu ekki marktæk áhrif á ónæmisfrumnunaráhrif OMVs. Saman sýna þessar niðurstöður að OMVs framkalla víðtæka umritunarbreytingu í Arabidopsis sem leiðir til uppstjórnunar margra ónæmisferla og að þessi umritunarbreyting getur auðveldað viðnám gegn bakteríusýkingu.

LYKILORÐ

Arabidopsis thaliana, bakteríusýking, utanfrumublöðrur, OMV, ytri himnublöðrur, plöntuónæmi, RNA-seq, Xanthomonas campestris pv. campestris

cistanche ávinningur fyrir karla styrkir ónæmiskerfið

1. INNGANGUR

Plöntur standa stöðugt frammi fyrir skaðlegum örverum sem þrífast á vefjum þeirra og hindra eðlilegan vöxt. Skilvirk varnarviðbrögð eru mjög háð skjótri og nákvæmri uppgötvun og auðkenningu innrásar örverunnar. Í þessu skyni nota plöntur víðtæk eftirlitskerfi til að fylgjast með innrás sýkla (Cook o.fl., 2015). Getgátur eru um að fyrsta línan í eftirlitskerfi plöntunnar, eða fyrsta frumuviðmótið þar sem plöntur og örverur hafa samskipti, sé millifrumurýmið, apoplast. Þar er þekking á innrásar örverum miðlað af himnubundnum, utanfrumu útsettum mynsturþekkingarviðtökum (PRR) (Boutrot & Zipfel, 2017; Couto & Zipfel, 2016). PRRs þekkja örveruákvarðanir sem eru víða til staðar og varðveittir meðal margra örvera og eru þekktir sem örveru- eða sýklatengd sameindamynstur (MAMPs) (Ranf o.fl., 2016). Þar sem örverur gangast undir stökkbreytingu á miklum hraða, eru þróunarfræðilegir gagnlegir ónæmisviðtakar aðlagaðir til að greina mjög varðveitt svæði mikilvægra örveruþátta sem ekki er auðvelt að farga eða stökkbreyta vegna alvarlegs líkamsræktarkostnaðar. Til dæmis er bakteríuflagellín afgerandi þáttur í lífeðlisfræði margra örvera, þar á meðal sýkla, og er eins og er eitt best rannsakaða MAMP-efnið (Felix o.fl., 1999; Zipfel o.fl., 2004). Skynjun flagellins, eða tilbúnu epitopunnar flg22 (sem samanstendur af mjög varðveittum 22 amínósýrum á N-enda flagellum byggingareiningarinnar, flagellin), af skyldum ónæmisviðtaka plantna flagellin sensing 2 (FLS2), leiðir til meiriháttar umritunarbreytingar , fylgt eftir með áhrifaríkri ónæmissvörun sem stöðvar sýkingu (Chinchilla o.fl., 2007; Gómez-Gómez & Boller, 2000). Mörg þekkt MAMP eru tengd frumuvegg örverunnar. Til dæmis sveppakítín (Fesel & Zuccaro, 2016), bakteríupeptidoglýkan (PG) (Erbs o.fl., 2008; Gust o.fl., 2007), lípópólýsykrur úr bakteríum (LPS) (Dow o.fl., 2000; Silipo o.fl. ., 2005), flagellin (Boutrot & Zipfel, 2017; Felix o.fl., 1999) og fleira. Engu að síður er ekki alveg ljóst hvernig þessir frumuveggstengdu þættir hafa samskipti við tengda ónæmisviðtaka þeirra í planta. Hvort þetta á sér stað vegna frumudauða og/eða niðurbrots frumuveggsins, eða með virkri losun á íhlutum eins og flagellum, er efni sem þarfnast frekari rannsóknar (Bahar, 2020).

Dæmi um virka losun á frumuveggbrotum frá Gram-neikvæðum bakteríum er losun utanfrumublaðra (EVs) sem blása og klípa af ytri himnunni inn í umhverfið í kring (Kulp & Kuehn 2010; Théry o.fl., 2018 ). Þessar EV-gerlar eru almennt nefndar ytri himnublöðrur (OMVs) og við munum héðan í frá fylgja þessu nafnakerfi (Schwechheimer & Kuehn, 2015). Ferlið við losun OMV á sér stað stöðugt og við ýmsar umhverfisaðstæður, þar á meðal við landnám hýsils (Gurung o.fl., 2011; Ionescu o.fl., 2014; Jin o.fl., 2011). Auk óaðskiljanlegra ytri himnusameinda eins og ytri himnu (OM) próteina, LPS og lípíða, hylja OMVs umflæðisvökva, sem samanstendur af fjölbreyttu úrvali sameinda eins og próteina, frumuveggbrjótandi ensím, fjölsykrur og kjarnsýrur (Kuehn & Kesty, 2005). Þar sem OMVs losna við landnám hýsils, og þar sem farmur þeirra samanstendur af MAMPs, er freistandi að geta sér til um að þau virki sem burðarefni ónæmisvalda sem skila framkallandi sameindunum í nálægð við tengda ónæmisviðtaka þeirra (Bahar, 2020; Katsir & Bahar, 2017). Reyndar hefur verið sýnt fram á að OMVs örva bæði spendýra- og plöntuónæmiskerfin þegar þau eru kynnt fyrir hýslum þeirra (Bahar o.fl., 2016; Ellis & Kuehn, 2010; Janda o.fl., 2021; McMillan o.fl., 2021). Þó að í spendýrafrumum virki bæði LPS og próteinhlutar OMVs sem ónæmisvaldar (Ellis o.fl., 2010), í plöntum er ekki enn ljóst hvaða OMV sameindir eru aðal ónæmisvaldar.

Auk þess að móta ónæmissvörun hýsilsins var sýnt fram á að OMVs bera meinvirkniþætti og taka þátt í fjölmörgum ferlum. Þetta felur í sér samskipti frumna (Deatheragea & Cooksona, 2012; Mashburn & Whiteley, 2005; Raposo & Stahl, 2019), sending eiturefna til markfrumna (Ellis & Kuehn, 2010; Kadurugamuwa & Beveridge, 1996), myndun líffilmu (skóli). & Beveridge, 2006), slökkun á sýklalyfjum (Manning & Kuehn, 2011), viðbrögð við streitu (MacDonald & Kuehn, 2013), láréttur genaflutningur (Fulsundar o.fl., 2014; Velimirov & Ranftler, 2018) og meinvirkni (Ellis) & Kuehn, 2010; Kunsmann o.fl., 2015). Þó að flest þessara dæma komi frá rannsóknum á sýkla af bakteríum spendýra, þá styðja nýlegar rannsóknir á plöntusjúkdómsvaldandi bakteríum einnig að OMV stuðli að meinvirkni baktería og landnám plantna. Ionescu o.fl. (Ionescu o.fl., 2014) sýndu fram á að OMV framleiðsla plöntusýkilsins Xylella fastidiosa við landnám xylemæða hindrar tengingu baktería við vatnsleiðandi þætti plöntunnar (xýlemið) og hallar jafnvæginu á milli kyrrsetu og hreyfanlegra forma sýkill í átt að hreyfanlegu formi. Þetta form er talið stuðla að frumudreifingu í xyleminu, sem leiðir til hraðari hnignunar plöntunnar (Ionescu o.fl., 2014). Tvær aðrar rannsóknir hafa sýnt að meinvirkniþættir eins og lípasar/esterasar og xylanasar af tegund II og áhrifavaldar af tegund III eru seyttir í tengslum við OMV (Chowdhury & Jagannadham, 2013; Sidhu o.fl., 2008; Solé o.fl. ., 2015) sem bendir til þess að OMV gæti gegnt mikilvægu hlutverki í meinvirkni baktería. Sameindaflækjustig OMVs, ásamt tvíþættum og hugsanlega andstæðum aðgerðum þeirra í hýsilnum (örva ónæmi og stuðla að meinvirkni), hvetur okkur til að rannsaka víðtækari umritunarsvörun Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) plantna við OMV áskorun og prófa hvort þessi umritunarbreyting breytist. myndi valda ónæmi eða næmi fyrir síðari bakteríusýkingu.

2 EFNI OG AÐFERÐIR

2.1 Plöntuefni og vaxtarskilyrði

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) villigerð Col-0 lína sem og eftirfarandi stökkbreyttar línur: bak- (Schlesinger o.fl., 2011) og fellur alltaf (Nekrasov o.fl., 2009) voru notaðar í þessari rannsókn. Arabidopsis fræ voru yfirborðssótthreinsuð og sáð á Murashige og Skoog (MS) agarplötur eins og lýst er (Bahar o.fl., 2016). Plöturnar voru geymdar í myrkri við 4◦C í 2–4 daga og síðan færðar í 22◦C til spírunar í 5–8 daga. Spíraðar plöntur af svipaðri stærð voru fluttar í 24-brunnsplötur (tvær plöntur í hverri brunn) sem innihéldu 1 ml af MS æti með 1% (w:v) af súkrósa (Duchefa Biochemie) og ræktaðar í aðra 8–10 daga kl. sömu skilyrðum áður mótmælt við elicitor eins og lýst er hér að neðan. Fyrir frumgreiningar voru fræ af Arabidopsis villigerð Col-0 línu og stökkbreyttar línur (falls ever og back-) spíruð eins og lýst er hér að ofan og síðan ígrædd í 7 × 7 × 6 cm potta (1 ungplöntu/pott) sem innihélt blöndu jarðvegur Grænn #7611 (Evenari, Ashdod, Ísrael) og ræktaður á 9,5 klst ljóstímabili við 22–24˚C. Plöntur voru

2.2 Hreinsun á ytri himnu blöðru baktería

Glýserólbirgðir af Xanthomonas campestris pv. campestris(Xcc) 33913 var stráið á næringaragar (Difco, NA, Becton, Dickinson og Company) plötur og ræktaðar í 2–5 daga við 28˚C. Stökum þyrpingum var safnað og þeim notað til að sáð er 3-ml YEB (gerseyðisoði) ræsir sem innihélt 10 ug/ml cephalexin hýdrat (Cp, Sigma-Aldrich). Startarar voru ræktaðir yfir nótt við 28◦C með 185–200 snúningum á mínútu og síðan notaðir til að sáð 500 ml af PSB (peptón súkrósasoði) miðli með sýklalyfjum (eins og lýst er hér að ofan) í 2-L flöskum í hlutfallinu ~1:1000 (v:v). Ræktanir voru ræktaðar eins og lýst er hér að ofan í OD600 0,6–0,8 og síðan voru bakteríufrumur spunnnar niður og OMVs dregin út úr flotinu eins og lýst er (Mordukhovich & Bahar, 2017). Hrá OMV undirbúningurinn var síðan látinn fara í Optiprep hallaskilvindu til að fá hreinsað OMV, eins og lýst er (Bahar o.fl., 2016; Mordukhovich & Bahar, 2017). Hver OMV lota var hreinsuð úr 1.5-L bakteríurækt og var að lokum endurleyst í 1 ml af PBS (pH 7,3). Hreinsuð OMV voru notuð strax eða geymd við 4◦C allt að 7 dögum fyrir notkun. Stærðardreifing OMV var mæld með því að nota kraftmikið ljósdreifingartæki (Zetasizer Nano ZS, Malvern Panalytical, Worcestershire, Bretlandi) og hafði meðalþvermál 121,7 ± 55,43 nm (SD). Styrkur agna var mældur á sama hátt og er að finna í hverri tilraunalýsingu hér að neðan.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

2.3 Arabidopsis ungplöntuáskorun með OMV

Til að kanna umritunarsvörun Arabidopsis við OMV áskorun voru Col-0 plöntur ræktaðar í 24-brunnsplötum eins og lýst er hér að ofan notaðar. Daginn fyrir OMV-áskorunina var MS miðillinn tekinn af plötum og skipt út fyrir 250 ul af dauðhreinsuðu dH2O og plöturnar voru látnar liggja á bekknum yfir nótt. Morguninn eftir var 20 ul af hreinsuðum OMV (30 ug á ml sem samsvarar 1,44 × 109 ögnum í hverri holu), eða dauðhreinsuðu dH2O sem spotti, bætt í hvern brunn. Fræplöntum var safnað 2, 6 og 24 klst. eftir áskorun, þurrkaðar á pappír og snöggfrystar með fljótandi köfnunarefni í 2-mL Eppendorf Safe-Lock rör (Hamborg, Þýskalandi). Á hverjum tímapunkti var safnað fjórum OMV-meðhöndluðum og fjórum spottmeðhöndluðum brunnum, sem tákna fjórar líffræðilegar endurtekningar fyrir hverja meðferð á hverjum tímapunkti.

2.4 RNA hreinsun

RNA var dregið úr Arabidopsis plöntum með því að nota TRIzol hvarfefnið (Invitrogen) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. RNA var hreinsað frekar með því að nota Turbo DNA-frítt sett (Ambion, Thermo Fisher Scientific) og RNA hreinsunar- og þéttingarsett (Norgen Biotek) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Hreinsuð RNA sýni voru látin fara í styrkingar- og gæðagreiningu með TapeStation 2200 vél (Agilent Technologies), RNA Screen Tape og RNA Screen

2.5 RNA bókasafnsbygging og raðgreining

Fyrir hvern meðferð og tímapunkt voru tvö sýni sem sýndu mestan hreinleika valin til greiningar. TruSeq mRNA bókasöfn (Illumina) með PolyA fanga voru unnin úr völdum RNA sýnum hjá Crown Institute of Genomics við Weizmann Institute of Science (Rehovot, Ísrael). Hvert sýni var merkt og laug var útbúin úr sýnunum. Þessi laug var síðan hlaðin inn á tvær NGS brautir, og keyrðar í Illumina HiSeq raðgreiningarvél, með háum afköstum hlaupaham, einni lestri (SR) 60 (v4).

2.6 Röð les upphafsvinnslu

The raw sequence reads were cleaned with Trimmomatic software v 0.36 (Bolger et al., 2014), removing low-quality reads and remaining adapter sequences. The clean reads were mapped to the reference Arabidopsis TAIR10 reference genome (Lamesch et al., 2012) using bowtie2 (Langmead & Salzberg, 2012) and quantification of gene expression was done using RSEM (Li & Dewey 2011). Principal component analysis and sample correlation matrix were calculated with the function cor() and pre-comp (), respectively, of the R base package version 3.6.1. DEGs were determined using the DESeq2 tool (Love et al., 2014). The FDR (false discovery rate) cutoff chosen was FDR < 0.05. The LogFC (Log of the fold change) cutoff for the up-regulated and the downregulated genes, was > 

2.7 Genaverufræði og genalýsingar 

Gene Ontologies (GO) voru sóttar með því að nota TAIR's GO Annotations (http://www.arabidopsis.org/tools/bulk/go/index.jsp). Genlýsingar, samkvæmt genalíkönunum, voru fengnar með því að nota TAIR erfðalýsingaleit (http://www.arabidopsis. org/tools/bulk/genes/). GO auðgun var reiknuð út með því að nota AgriGO veftólið (http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/index.php) með Arabidopsis erfðamengisstaðnum (TAIR10) sem viðmiðun

2.8 Magn-PCR og RNA-seq staðfesting

Til að sannreyna RNA-seq gögn voru RNA sýni af sýndar- og OMV ögruðum ungplöntum notuð fyrir cDNA myndun, fylgt eftir með magnbundinni PCR (qPCR) með því að nota genasértæka primers (Supp. Tafla S4), eins og lýst er (Bahar et al. , 2016). Á heildina litið voru 17 gráður úr RNA-seq gagnasafninu prófuð, með því að nota fjórar líffræðilegar endurtekningar af RNA af OMV- eða spottameðhöndluðum plöntum. Hlutfallsleg tjáning prófuðu gena var borin saman við ubiquitin tjáningu, með því að nota 7500 Fast rauntíma PCR vél (Applied Biosystems), eins og lýst er (Bahar o.fl., 2016).

2.9 Samanburður á Arabidopsis umritunarsvörun við MAMPs og OMVs 

OMV-framkallað gagnasafn okkar var borið saman við tiltæk umrit af Arabidopsis með flg22, (Denoux o.fl., 2008) elf26 (Zipfel o.fl., 2006), PGN (Willmann o.fl., 2011), OG (Davidsson o.fl. , 2017) og LPS (Livaja o.fl., 2008). Til samanburðar á gögnum var auðgun GO hugtaka framkvæmd og framkölluð GO voru sýnd með Venn skýringarmyndum eins og lýst er hér að ofan.

2.10 Arabidopsis grunntilraunir

Til að prófa frumunaráhrif Xcc OMVs á Arabidopsis sýkt af Pseudomonas syringae pv. tómatur DC3000 (Pst), fylgdum við aðferðinni sem lýst er af Zipfel o.fl. (2004). Í stuttu máli voru blöð af 6–8 vikna gömlum Arabidopsis plöntum, ræktaðar eins og lýst er hér að ofan, síast inn með 50–100 ul af hreinsuðum Xcc OMVs (30 ug/ml, sem samsvarar 3.6-7.2 × 109 ögnum fyrir hvert blað), 1 μM flg22, eða vatni með því að nota nálalausa sprautu. Fyrir hverja meðferð voru notuð 5 lauf/plöntu og þrjár plöntuafrit. Pst sáðefni var útbúið með því að rækta bakteríuna á King's B miðlungs plötum (20 g/L peptón, 1,5 g/L MgSO4 x7H2O, 10 ml/L glýseról og 15 g/L agar) við 28˚C í 2–3 daga, og síðan endurblöndunar þyrpingar með vatni og stilla styrk sáðefnisins í 105 CFU/ml. Pst sáðefni var síast inn í grunnuð blöð 24 klst. eftir grunnun, með því að nota nálalausa sprautu (um það bil 100 ul var síast inn í hvert blað). Bakteríuvöxtur var ákvarðaður 0 (1 klst. eftir sáningu) og 2 dögum eftir sáningu (dpi) með því að safna og vega blöðin sem sáð var, blanda þeim í 1 ml af 10 mM MgCl2 og húða 10-faldar raðþynningar á King's. B agar plötur. Fjöldi CFU á hverri plötu var ákvarðaður 2 dögum síðar og reiknaður út á g blaða.

MYND 1 Arabidopsis umritunarsvörun við OMVs 2, 6 og 24 eftir áskorun. Aðalþáttagreining (A) og sýnisfylgnifylki (B) af umritunarsvörun Arabidopsis ungplantna við OMV, eða spotta, 2, 6 og 24 klst. eftir áskorun

2.11 In vitro vaxtarmælingar á bakteríum 

Til að meta áhrif hreinsaðra Xcc OMVs á Pst vöxt in vitro, voru Pststarters ræktaðir í King's B fljótandi miðli í 24 klst við 28˚C og síðan notaðir til að sána þrjár mismunandi ræktanir sem innihéldu 12 ml af King's B miðli hver, í {{3 }}mL Falcon rör í hlutfallinu 1:100. Bakteríuræktum var breytt með 30 ug/ml OMV (1:50 eða 1:100, sem samsvarar 1,44 × 109 eða 7,2 × 108 ögnum á ml, í sömu röð), eða PBS sem viðmiðunarefni, og ræktaðar í 20 klst við 28°C. Bakteríuvöxtur var mældur með litrófsmæli (Amersham Biosciences) við ljósþéttni (OD) 600 nm á 22 klst.

3 NIÐURSTÖÐUR

3.1 RNA-seq greining leiðir í ljós mikið mengi Arabidopsis gena sem eru mismunandi tjáð sem svar við OMV áskorun

Til að rannsaka umritunarbreytinguna á Arabidopsis í kjölfar OMV áskorunar, meðhöndluðum við Arabidopsis plöntur með OMVs hreinsuðum úr bakteríusjúkdómsvaldinu Xanthomonas campestris pv. campestris 33913 (Xcc) og safnað plöntu-RNA 2, 6 og 24 klst eftir áskorun (hpc). RNA úr OMV- og sýndarmeðhöndluðum sýnum var síðan raðgreint og greint eins og lýst er í Efni og aðferðum. Aðalfylgni (Mynd 1A) og sýnisfylgnifylkisgreining (Mynd 1B) sýna að líffræðilegar endurtekningar í hverjum meðferðarklasa náið saman, vísbending um heildaruppskriftarsvörun líkt milli líffræðilegra endurtekningar. OMV-meðhöndluðu sýnin við 2 og 6 hpc hópuðust saman, sem gefur til kynna að OMV-meðferðin hafi meiri áhrif á afritunarsvörun en sýnatökutíma (Mynd 1B). Á hinn bóginn safnast OMV-meðhöndluð sýni saman ásamt sýndarmeðferð þeirra við 24 hpc, sem gefur til kynna að umritunarbreytingin sem OMVs hafa framkallað á þessum tímapunkti hafi minnkað og var svipuð og hjá spottmeðhöndluðum plöntum.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Á hverjum tímapunkti sem prófuð var voru OMV-meðhöndlaðar plöntur bornar saman við plöntumeðhöndlaðar plöntur sem voru meðhöndlaðar og mismunað tjáð gen (DEG) voru dregin út. Á öllum tímapunktum samanlagt reyndust samtals 984 og 175 gen vera marktækt (Log fold change > 1 eða ← 1, p gildi og FDR < 0.05) upp- eða niður-stýrð, í sömu röð, til að bregðast við OMV áskorun (Mynd 2A; Supp. Tafla S1). Genatjáning Log fold-change (LogFC) var á bilinu að hámarki 9,08 (AT1G26410, 6 hpc), sem samsvarar meira en 500-falt breytingu, til -5.73 (AT3G17520, 24 hpc). Mesti fjöldi DEGs fannst við 2 og 6 hpc, þar sem samtals 647 og 876 DEG, í sömu röð, voru auðkennd (upp- og niður-stýrð saman). Við 24 hp fundust 121 gráður. Meira en 50% af uppstýrðu genum 2 og 6 klst eftir OMV áskorun var deilt á milli þeirra (mynd 2B). Til að kanna breytingu á tímabundinni genatjáningu, drógum við út allar uppstýrðar DEGs sem fundust á öllum tímapunktum (37 gen) og bárum saman faltbreytingu þeirra með tímanum (Mynd 2C). Tjáning þessara gena með breytingabreytingum var marktækt mismunandi milli mismunandi tímapunkta (einstefnu ANOVA; F2,108=8.1633, p=0}.0005). Post hoc samanburður með Tukey Kramer HSD prófinu gaf til kynna að LogFC við bæði 2 (M=3.45, SD=1.72) og 6 hpc (M=3.87, SD=1.98) var marktækt hærra en við 24 hpc (M=2.32, SD=1.31) (p=0.0145 og p=0 .0005, í sömu röð) (Mynd 2D). Þó að meðaltal LogFC tjáning við 6 hpc væri hærri en við 2 hpc, var hún ekki tölfræðilega frábrugðin (p=0.5413). Þess vegna, þegar miðað er við fjölda DEGs og heildargenið LogFC á þeim þremur tímapunktum sem prófaðir voru, getum við ályktað að mikilvægasta umritunarbreytingin hafi átt sér stað 2 og 6 klst eftir OMV áskorun. Til að kanna réttmæti RNA-seq niðurstaðna var tjáning 17 uppstýrðra gena ákvörðuð með því að nota magn PCR (qPCR) með sérstökum primerum. Fjórtán af prófuðu genum sýndu sama mynstur og í RNA-seq greiningu og var marktækt uppstýrt miðað við spotta. Þrjú af prófuðu genum höfðu hærri hlutfallslega tjáningu en voru ekki marktækt frábrugðin spotta með þessari aðferð (Supp. Mynd S1).

MYND 2 Arabidopsis tjáðu gen á mismunandi hátt sem svar við OMV áskorun. (A) Heildarfjöldi gena með mismunandi tjáningu (DEG) (upp- eða niðurstýrð, LogFC > 1 eða ← 1, p-gildi og FDR < 0.05) við 2, 6 og 24 klst eftir áskorun. (B) Skörun milli DEGs á mismunandi tímapunktum (vinstri, uppstillt; hægri, niðurstýrt). (C) Uppstýrð gen sem fundust í öllum þremur tímapunktum voru teiknuð á LogFC tjáningargraf, sem sýnir genatjáningu með tímanum. (D) LogFC meðaltal allra DEGs á mismunandi tímapunktum. Mismunandi stafir gefa til kynna tölfræðilegan mun við p < 0,05 með Tukey-Kramer HSD prófinu

3.2 Arabidopsis bregst við OMVs með umritunarbreytingu í átt að virkjun ónæmiskerfisins

Til að bera kennsl á Arabidopsis-ferlar sem OMV-áskorunin hefur verulega áhrif á, notuðum við AgriGO veftólið (Du o.fl., 2010; Tian o.fl., 2017). Við greindum 333 og 55 marktækt (FDR <0,05) upp- og niðurstýrða genaverufræði (GO) hugtök, í sömu röð, á öllum tímapunktum sameinuð sem svar við OMV áskoruninni. Næstum 25% af uppstýrðum GOs tengdust viðbrögðum plantna við áreiti (Mynd 3A). Innan 'svörunar við áreiti' flokki voru ríkustu GO hugtökin tengd streituviðbrögðum, líffræðilegu áreiti, efnum og innrænu áreiti (Mynd 3B; Supp. Tafla S2). AgriGO tólið benti einnig á 103 sameindavirkni sem var verulega uppstillt, þar á meðal „transferasavirkni“, kínasavirkni“, „umritunarþáttavirkni“, „jóna- og málmjónabinding“, „kolvetnabinding“, „próteinbinding“, „hvatavirkni“ , 'Adenyl nucleotide binding', 'transmembrane receptor activity' og fleiri bindiaðgerðir (Supp. Tafla S2). Staðsetning frumu mikilvægu hugtakanna var í mismunandi hólfum frumunnar, þar með talið kjarna, lofttæmi og innhimnukerfi, en var einkum tengd við jaðar frumunnar og innihélt 'plasmahimnu', 'utanfrumusvæði', 'frumuvegg' og 'apoplast' verufræði (Supp. Tafla S2). Hin verulega niður-stýrðu GOs, á hinn bóginn, innihélt hugtökin 'eiturefna- og efnaskiptaferli', 'viðbrögð við vatns- og vatnsskorti', 'lípíðflutningur og staðsetning' og fleira (Supp. Tafla S2). GOs sem tengjast svörun við líffræðilegu áreiti voru ekki auðguð á niðurstýrðu genum. Verulega niðurstýrð sameindastarfsemi innihélt mörg redoxhugtök eins og 'oxídoredúktasavirkni', 'hembinding', 'járnjónabinding', 'lípíðbinding', 'súrefnisbinding' og fleiri súrefnistengdar aðgerðir (Supp. Tafla S2) . Niðurstýrðir hugtök voru einnig staðsett á utanfrumusvæðinu. Til að ákvarða hvaða GO hugtök DEGs með hæstu tjáningu tilheyra, síuðum við upprunalega DEGs listann með því að velja gen sem voru með LogFC hærra en 4, eða minna en -4 (sem samsvarar 16-földum mun) . Við greindum 117 gen sem uppfylltu þessi skilyrði, þar af voru 115 uppstýrð og 2 niðurstýrð á öllum tímapunktum samanlagt. Vegna fárra niðurstýrðra gena með LogFC minna en -4 fundust engin marktækt bæld GO. Á hinn bóginn fundust 72 marktækt uppstýrðar GOs, þar af mikilvægustu tengdar „viðbrögð við ytri líffræðilegu áreiti“, „viðbrögð við öðrum lífverum“, „svörun frumna við súrefnisgildi“, „varnarviðbrögð“ , 'viðbrögð við streitu' og fleiri ónæmistengdar GOs (Mynd 3C).

MYND 3 Arabidopsis gena verufræði (GO) hugtök auðguð sem svar við Xcc OMV áskorun. Bökuritsframsetning á flokkadreifingu í uppstýrðu líffræðilegu ferli (A) og svörun við áreiti (B) GO hugtökum. (C) Listi yfir Arabidopsis gen með LogFC > 4 sem svar við OMV áskorun. Gen voru síuð úr öllu gagnasafni DEGs og notuð til að auðkenna auðgað GO hugtök með því að nota AgriGo veftólið. FDR cutoff < 0.05

3.2 OMV áskorun leiddi til uppstjórnunar ónæmisviðtaka

MAMP skynjun og viðbrögð plantna við MAMP eru að miklu leyti miðlað af himnubundnum PRR sem miðla skynjun sýkla og skilvirkri mildun sýkingar. PRR eru almennt flokkuð í tvo hópa viðtakakínasa (RK) og viðtakalík prótein (RLP) (Boutrot & Zipfel, 2017). Til að bera kennsl á PRR sem komu fram á mismunandi hátt sem svar við OMVs, bárum við DEG sett okkar saman við áður staðfesta lista yfir Arabidopsis RKs (Kemmerling o.fl., 2011; Mott o.fl., 2016) og RLPs (Wang o.fl., 2008). Við höfum greint í gagnasafninu okkar 33 og 10 uppstýrða RK og RLP, í sömu röð, á öllum tímapunktum samanlagt (tafla 1). Engin RK eða RLP fundust á listanum okkar yfir 175 niðurstýrða gena. Kemmerling o.fl. (2011) skilgreindi lista yfir 49 RK, þar sem tjáning þeirra var marktækt framkölluð af MAMP eins og flg22 og NLP (drep og etýlen-framkallandi peptíð 1-líkt prótein), eða meðferð með sýkla. Við bárum þennan lista saman við uppstýrða RLK frá tilraun okkar og komumst að því að 45% af RKs skilgreindum af Kemmerling o.fl. (2011) voru einnig framkölluð sem svar við OMV. Þar á meðal eru athyglisverð FRK1, SOBIR1, SERK4, RLK/IKU2, PSKR1, HAESA, EFR, BIR og IOS1 (tafla 1). Meðal RK hópsins var FRK1 með hæstu tjáninguna bæði við 2 og 6 hp með LogFC 7,11 og 5,2, í sömu röð, en meðaltal LogFC allra RK var 2,11 og 2,13 við 2 og 6 hp, í sömu röð. Þó himnubundin RK og RLP miðli að mestu utanfrumuskynjun á innrásar örverum, eru núkleótíðbindingsstaður-leucínríkur endurtekinn (LRR) viðtakar (NLR) innanfrumu ónæmisviðtakar. Við fundum 7 mismunandi NLR gen uppstýrt sem svar við OMV-áskorun við 2 og 6 hpc, engin fannst við 24 hpc (NLR listi var dreginn út úr TAIR, 102 genum) (tafla 1).

cistanche ávinningur fyrir karla styrkir ónæmiskerfið

3.3 OMV örva tjáningu margra WRKY umritunarþátta

Í ljós hefur komið að WRKY umritunarþættir (TFs) gegna hlutverki í ónæmissvörun plantna, taka þátt í bæði MAMP-triggered immunity (MTI) og effector-triggered immunity (ETI) svörun (Birkenbihl o.fl., 2018; Rushton o.fl., 2010 ). OMV áskorun leiddi til uppstjórnunar á 20 mismunandi WRKY TFs (listi dreginn úr TAIR, 70 genum) aðeins við 2 og 6 HPC (tafla 1). WRKY TFs voru fjarverandi í niðurstýrðu genasettinu okkar. Önnur fjölskylda TFs sem verða fyrir áhrifum af OMV áskoruninni eru MYB lén sem innihalda prótein (Tsuda & Somssich, 2015), sem vitað er að taka þátt í mörgum ferlum, þar á meðal líffræðilegum og ólífrænum streitu (Ambawat o.fl., 2013). Á heildina litið voru 9 mismunandi MYB TFs (listi dreginn út úr TAIR, 211 genum) tjáð á mismunandi hátt sem svörun við OMV áskorun, 5 upp-stýrt og 4 niður-stýrt (tafla 1). Viðbótarflokkar af mismunandi tjáðum TFs sem greindust eru taldir upp í töflu 1.

3.4 Samanburður á Arabidopsis umritunarsvörun við OMV við svörun við hreinsuðum MAMPs

Til að fræðast um muninn á svörun Arabidopsis við hreinsaðan elicitor samanborið við grófa og sameindalega flókna uppbyggingu - OMVs, bárum við saman RNA-seq gögnin okkar við núverandi umritunargögn um Arabidopsis svörun við þekktum MAMPs, þar á meðal flg22, (Denoux o.fl., 2008) elf26 (Zipfel o.fl., 2006), PGN (Willmann o.fl., 2011), OGs (Davidsson o.fl., 2017) og LPS (Livaja o.fl., 2008). Auðguð GOs voru dregin út úr ofangreindum gagnasöfnum eins og lýst er hér að ofan (Supp. Tafla S3) og borin saman við GOs auðguð í kjölfar OMV áskorunarinnar. Almennt voru Arabidopsis GO hugtök framkölluð af OMV svipuð þeim sem framkölluð voru af stakum, próteinkenndum og próteinkenndum MAMPs, sem deildu 56, 51 og 47% af OMV-örvuðum GOs með GOs framkölluðum af flg22, elf26 og PGN, í sömu röð. Á hinn bóginn sást minni skörun í framkölluðum GOs með LPS og OGs, sem deila 24 og 33%, í sömu röð, með OMV-framkölluðum GOs (mynd 4A). Athyglisvert er að sjúkdómstengda 1 (PR1) genið (At2g14610), einkenni LPS-framkallaðrar ónæmissvörunar (Silipo o.fl., 2005, 2008), var fjarverandi á OMV-framkölluðum genalistanum á öllum þeim tímapunktum sem prófaðir voru. Fjörutíu og einn GO reyndust framkallaður af OMV en ekki af neinum af öðrum MAMPs sem prófuð voru hér (Mynd 4B). Þessi listi innihélt GOs sem tengjast 'apoptosis', 'svörun við lyfi', 'lyfjaflutningur og 'fjöllyfjaflutningur' og 'lípasavirkni' (Supp. Tafla S3, táknuð með stjörnum og feitletrun).

3.5 OMV veldur Arabidopsis ónæmi gegn bakteríusýkingu

Hér og áður (Bahar o.fl., 2016), höfum við lagt fram sönnunargögn sem sýna fram á að Arabidopsis ónæmiskerfið sé framkallað af OMV áreiti. Til að kanna hvort þessi OMV-miðluðu ónæmisörvun sé þýdd í skilvirkt ónæmissvörun, notuðum við planta bakteríuvaxtarpróf (Zipfel o.fl., 2004) þar sem Arabidopsis plöntur eru formeðhöndlaðar með OMVs og fylgt eftir með bakteríubólusetningu. Marktæk minnkun meira en 10-falt á Pseudomonas syringae pv. tómatar DC3000 (Pst) CFU/g blaða sást í bæði OMV- og flg22-formeðhöndluðum plöntum samanborið við sýndarformeðferð, tveimur dögum eftir sáningu (Mynd 5A). In vitro vöxtur Pst var ekki fyrir neikvæðum áhrifum af því að bæta OMVs við miðilinn, sem bendir til þess að minnkaður Pst vöxtur í planta tengist frumunaráhrifum OMV, og er ekki bein áhrif OMVs á bakteríurnar (Supp. Mynd S2). Til að prófa hvort OMV-framkallað ónæmi gegn Pst sé miðlað af FLS2, EFR eða BAK1 endurtókum við þessa tilraun með Col-0, bak- mutant, og tvöfalda stökkbreytta línan fellur efr. Með báðum stökkbreyttum línum leiddi OMV formeðferð til marktækrar minnkunar á Pst CFU/g blaða samanborið við sýndarmeðhöndlaðar plöntur (Mynd 5B-C). Eins og búist var við höfðu fls efr og bak- stökkbreyttar línur meðhöndlaðar með flg22 svipaða Pst titra og ómeðhöndluðu plönturnar þar sem vitað er að þær bregðast ekki við flg22. Til að bera saman hlutfallslega minnkun á sýklatítra í Col-0 samanborið við stökkbreyttar línur ónæmisviðtaka fellur alltaf og bak í grunnuðum plöntum, reiknuðum við muninn á Pst titer í OMV- og spottmeðhöndluðum plöntum í þremur sjálfstæðum tilraunum (Supp Mynd S3). Meðallækkun á Pst titer í OMV-formeðhöndluðum bakplöntum var minni en sást í Col-0 plöntum (0,89 á móti 1,14 Log CFU/gr blaðafækkun fyrir bak og Col-0, í sömu röð, einn- leið ANOVA; F2,4=4.3781, bls=0.0523). Við sáum ekki svipaða lækkun með fls efr stökkbreyttu línunni (1,26 á móti 1,32 Log CFU lækkun fyrir fls efr og Col-0, í sömu röð, einstefnu ANOVA: F1,4=0.0352, bls.=0.5698) (Mynd 5D-E).

Tafla 1 OMV-framkallað RK/RLP og ónæmistengdir umritunarþættir í Arabidopsis plöntum

TAFLA 1 (Framhald)

TAFLA 1 (Framhald)

4 UMRÆÐA

Bakteríur ytri himnublöðrur (OMV) eru flóknar nanóbyggingar sem eiga uppruna sinn í ytri himnu baktería og eru samsettar úr hundruðum próteina og annarra frumuveggjahluta. Áður var sýnt fram á að Arabidopsis plöntur bregðast við OMV áskorun með því að virkja dæmigerð ónæmissvörun eins og ROS springa, tjáningu ónæmismerkja og miðlungs basamyndun (Bahar o.fl., 2016). Í þessari rannsókn skoðuðum við víðtækari umritunarsvörun Arabidopsis við bakteríum OMVs og áhrif þess á síðari sýkingu. Heildarniðurstaðan úr RNA-seq gagnagreiningum sem gerðar voru í þessari rannsókn er að Arabidopsis ónæmiskerfið er undirbúið eftir útsetningu fyrir Xanthomonas campestris pv.campestris (Xcc) OMVs. Þessi ályktun er studd aðgreindum og ófylltum greiningum. Í fyrsta lagi sýnir genaverufræði (GO) auðgun í plöntum sem verða fyrir Xcc OMVs greinilega að OMVs eru skynjaðar af Arabidopsis sem streituvaldar. Staðsetning frumu plöntusvörunar tengdist fyrst og fremst jaðri frumunnar sem bendir til ytri frumuskynjunar á krefjandi efninu, OMVs. Þetta veitir frekari stuðning við þá hugmynd að OMV og innihaldsefni þeirra skynjist af utanfrumuviðtökum, svipað og margir þekktir MAMPs. Í öðru lagi tókum við eftir stórri föruneyti af RKs og RLPs eru uppsettir til að bregðast við OMV áskoruninni. Margir af þessum viðtökum eru þekktir fyrir að miðla skynjun sjúkdómsvalda eða áður var sýnt fram á að þeir tengdust ónæmissvörun plantna. FLG22-framkallaður viðtakalíkur kínasi 1 (FRK1) var mest framkallaður viðtakinn. Þetta er áhugavert þar sem við gátum ekki greint flagellin í Xcc OMV próteingreiningu okkar (gögn ekki sýnd). Það er vitað að FRK1 er einnig framkallað af öðrum ónæmisvalda, en það er forvitnilegt hvers vegna tjáning þess er svo miklu hærri en restin af RKs sem eru uppstillt hér. Tjáning lengingarþáttaviðtaka (EFR) var aftur á móti aðeins marktækt uppstillt á 2 klst tímapunkti og hafði LogFC upp á 1,12, jafnvel þó að EF-Tu sé að finna í Xcc OMVs (Bahar o.fl., 2016 ). Við fundum einnig nokkur NLR gen sem voru uppstillt sem svörun við OMV áskorun, helmingur þeirra er merktur sem sjúkdómsþolsprótein, en virkni þeirra í ónæmi plantna hefur ekki verið lýst. Þó að við gerum ekki tilgátur um að NLRs eigi beinan þátt í OMV skynjun, gætu þeir verið framkallaðir aftan við RK/RLPs skynjun á OMV sameindum eins og einnig sást sem svar við hreinsuðum MAMP eins og flg22, elf18 og LPS (Denoux o.fl., 2008) ; Livaja o.fl., 2008; Zipfel o.fl., 2006). Í þriðja lagi voru margir ónæmistengdir umritunarþættir, WRKY, MYB og aðrir, marktækt uppstýrðir af OMVs (Bjornson o.fl., 2021). Í rannsókn okkar átti sér stað aðal umritunarbreytingin sem svar við OMV á fyrstu tveimur tímapunktunum (2 og 6 hpc). Þetta sýndi sig bæði með marktækt meiri fjölda mismunandi gena (DEG) og marktækt meiri Log foldchange (LogFC) við 2 og 6 hpc. Engu að síður, af alls 121 gráðu sem fannst við 24 hp, fannst næstum helmingur (52) ekki við 2 eða 6 hp. Þetta bendir til þess að helmingur DEG við 24 hpc séu seint-stýrð gen, þar sem tjáning þeirra var upp- eða niðurstýrð síðar en 6 hpc. Reyndar voru Arabidopsis gen með mismunandi tjáningarvirkni í kjölfar elicitor áskorana áður auðkennd (Bjornson o.fl., 2021).

MYND 4 Samanburður á hugtökum fyrir auðgað genaverufræði (GO) sem svar við OMV og eins hreinsuðum MAMPs. Arabidopsis tjáningargagnasöfn sem svar við MAMP áskoruninni (elf26, flg22, OGs, PGN og LPS; sjá efnis- og aðferðir kafla fyrir tilvísanir) voru notuð til að draga út auðgað GOs með því að nota AgriGo veftólið. Auðguð GO setur hvers MAMP voru borin saman við auðgað GO lista sem svar við OMVs með Venny (A, og Supp. Tafla S3). GO hugtök auðguð aðeins í OMV gagnapakkanum eru sýnd í (B) raðað eftir FDR gildi þeirra.

Í rannsókn okkar átti sér stað aðal umritunarbreytingin sem svar við OMV á fyrstu tveimur tímapunktunum (2 og 6 hpc). Þetta var sýnt með bæði marktækt meiri fjölda mismunandi tjáðra gena (DEG) og marktækt meiri Log fold change (LogFC) við 2 og 6 hpc. Engu að síður, af alls 121 gráðu sem fannst við 24 hp, fannst næstum helmingur (52) ekki við 2 eða 6 hp. Þetta bendir til þess að helmingur DEG við 24 hpc séu seint-stýrð gen, þar sem tjáning þeirra var upp- eða niðurstýrð síðar en 6 hpc. Reyndar voru Arabidopsis gen með mismunandi tjáningarvirkni í kjölfar framkallaðra áskorana áður auðkennd (Bjornson o.fl., 2021). Hraða og að mestu skammvinnt genatjáningarmynstur sem við höfum séð hér er í samræmi við aðrar rannsóknir sem hafa prófað tímabundna svörun Arabidopsis við MAMPs. Til dæmis, Denoux o.fl. (2008) og Björnson o.fl. (2021) hafa sýnt að umritunarbreytingin á Arabidopsis sem svar við ýmsum MAMPs á sér stað innan nokkurra mínútna til klukkustunda, og í flestum tilfellum eru DEGs aftur í grunngildum ~ innan 24 klst. eftir plöntuáskorun. Ólíkt víxlverkunum milli plöntu og sýkla, þar sem víxlverkunin er kraftmikil og viðvarandi þegar reynt er á sýni sem ekki er lifandi, eins og hreinsað MAMP eða OMV-efni, má búast við að plöntusvörunin, að minnsta kosti á umritunarstigi, væri tímabundin og ekki viðvarandi yfir daga. Ákafar rannsóknir á síðustu þremur áratugum hafa leitt í ljós marga ónæmisviðtaka plantna sem bera ábyrgð á örveruþekkingu. Margir þessara viðtaka hafa getu til að greina staka örverueiginleika og er verið að rannsaka þau ítarlega til að skilja betur skynjun sýkla, merki ónæmiskerfisins og svörun líkana og ræktunarplantna. Hins vegar verða plöntur samtímis fyrir mörgum örverueiginleikum frá mismunandi aðilum, sem bæta flókið við ónæmisskynjun og svörun. Við höfðum áhuga á að skoða muninn á umritunarsvörun Arabidopsis við eintölu hreinsuðum MAMPs á móti OMVs, sem tákna náttúrulegri og flóknari örverubyggingu en flækjustig fjarlægt úr örveru sjálfri. OMVs bera meinvirkniþætti, niðurbrotsensím, eiturefni og aðrar lífsameindir sem gætu haft hlutverki að gegna fyrir bakteríuvöxt í planta og því var áhugavert að prófa hvort OMV áskorun framkalli einstök GO sem ekki eru framkölluð af tilbúnum MAMPs.

MYND 5 Formeðferð Arabidopsis laufa með OMV veldur ónæmi fyrir síðari bakteríusýkingu. Col-0 plöntur (A) voru formeðhöndlaðar með OMV, vatni (líki) eða flg22 sem viðmið, og 24 klukkustundum síðar sáð með 105 CFU/ml sviflausn af Pst DC3000 með því að nota nálarlausa sprautuíferð . Pst DC3000 frumutítri í sáðuðu laufunum var ákvarðaður 48 klst. eftir sáningu með raðþynningarplötum. Arabidopsis Col-0 og fls efr (B), eða bak (C) plöntur voru prófaðar í svipaðri tilraun og lýst er í (A). Meðaltal Log Pst DC3000 CFU/gr lækkunar eftir OMV formeðferð (samanborið við ómeðhöndlaðar plöntur) í Col-0 og falls efr (D), og Col-0 og aftur (E), var borið saman. Hver súla táknar meðaltal Log Pst DC3000 CFU/gr minnkun frá þremur sjálfstæðum tilraunum (gögn um óháðu tilraunirnar eru kynntar í Supp. Mynd. S3). Mismunur var ekki tölfræðilega marktækur (Tveggja hala nemenda t-próf. p gildi eru sýnd fyrir ofan línuritssúlurnar). Tilraunir A, B og C voru gerðar að minnsta kosti þrisvar sinnum með svipuðum árangri (3 plöntur/endurtekningar í hverri meðferð í hverri tilraun). Stjörnumerki (**) gefa til kynna marktækan mun miðað við spotta (Dunnet's test p < 0,001)

Fyrir umritunarsamanburð okkar tókum við saman gögn úr rannsóknum með svipaðar tilraunaaðstæður, þ.e. í plöntum og á svipuðum tímapunktum. Marktæk skörun í GO auðgun sást í svörun Arabidopsis við OMV og við flg22, elf26 og PGN. Þetta er ekki óvænt þar sem vitað er að margar af varnarleiðunum sem virkjaðar eru við skynjun sjúkdómsvalda eru svipaðar, burtséð frá tilteknum elicitor eða uppruna hans (Bjornson o.fl., 2021; Zipfel o.fl., 2006). Engu að síður reyndust nokkrar einstakar GOs vera uppstýrðar af OMVs en ekki af öðrum MAMPs sem við höfum kannað. Þar á meðal eru GO sem tengjast niðurbroti frumuveggsins eins og 'lípasavirkni' og 'hýdrólasavirkni sem verkar á glýkósýltengi', sem gæti bent til þess að plöntuvarnarkerfið stefni á niðurbrot OMV. Athyglisvert er að þrír GO sem tengjast lyfjaflutningi reyndust einnig vera einstaklega stjórnaðir af OMV áskoruninni. Þetta gæti bent til þess að plöntur standi frammi fyrir því að eitruð efnasambönd berist inn í frumur þeirra, kannski með OMV-miðluðum afhendingu. Ólíkt svörun Arabidopsis við ónæmisvekjandi peptíðum og PGN, sáum við tiltölulega litla skörun milli svörunar Arabidopsis við OMVs OGs og LPS. Þessi litla skörun, sérstaklega við LPS, kemur nokkuð á óvart, miðað við að í spendýrafrumum er LPS vel viðurkennt sem öflugur þátttakandi í ónæmissvörun hýsilsins sem OMVs framkalla (Ellis o.fl., 2010). Ennfremur gæti sú staðreynd að við gátum ekki fundið uppstýringu á LPS ónæmismerkinu PR1 (Silipo o.fl., 2005), bent til þess að LPS sé ekki helsti orsakavaldur ónæmisverkunar plöntunnar við bakteríur OMVs. Þetta á þó eftir að skoða betur. Sýnt hefur verið fram á að OMVs stuðla að landnámi baktería bæði spendýra og plöntuhýsils og í sumum tilfellum til meinvirkni baktería. Á hinn bóginn virkja OMV ónæmiskerfið hýsilsins og virka sem tvíeggjað sverð, stuðla að lifun og meinvirkni baktería annars vegar og fæða eftirlitskerfið hýsilsins og virkja ónæmi hýsilsins hins vegar (McMillan & Kuehn, 2021) ). Bætingarprófanir okkar sýndu að OMV áskorun leiddi til marktækrar hömlunar á Pseudomonas syringae pv. tómatar DC3000 (Pst) vöxtur í planta, svipað og frumunaráhrifin sem sjást með tilbúnum MAMPs (Jung o.fl., 2009). Þess vegna, í þessu tilviki, ýtti forgjöf OMVs í sáðvefinn ekki til landnáms baktería heldur var plönturnar til að framkalla skilvirkt ónæmissvörun sem hamlaði vöxt sjúkdómsvalda. Þessi niðurstaða er í samræmi við umritunargögn okkar og fyrri rannsókn okkar, sem styður þá hugmynd að OMVs framkalli öflugt og áhrifaríkt ónæmissvörun við Arabidopsis. Tvær nýlegar rannsóknir hafa einnig sýnt fram á að Arabidopsis formeðferð með OMVs frá sjúkdómsvaldandi eða commensal Pseudomonas tegund, bældi síðari Pst sýkingu (Janda o.fl., 2021; McMillan o.fl., 2021). Þessar niðurstöður gefa til kynna að við þær aðstæður sem prófuð voru, auðveldar OMV-íferð ekki sýkingu. Í fyrri rannsókn höfum við sýnt að margir ónæmisviðtaka stökkbrigði viðhalda WT svörun við Xcc OMVs. Þessir stökkbrigði innihéldu þekkta PRR, sem þekkja annað hvort próteinkennd (FLS2, EFR, RLPreMAX) eða ekki próteinkennd MAMP (LYM1/LYM3) (Bahar o.fl., 2016). Athyglisvert er að Janda o.fl. (2021) greindi frá því að þegar FLS2 viðtaka stökkbreytt lína Arabidopsis (flensu) var ögrað með OMV frá Pst, var FRK1 tjáning óbreytt og var svipuð spottmeðhöndluðum plöntum, sem bendir til þess að FLS2 miðli svörun við Pst OMVs. Hugsanlegt er að flagellin sé meira í Pst OMV efnablöndur en í Xcc 33913 OMVs og því hafði fjarlæging flagellin viðtaka meiri áhrif á svörun plantna við Pst en Xcc OMVs.

cistanche ávinningur fyrir karla styrkir ónæmiskerfið

Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur

【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Sýnt hefur verið fram á að mismunandi ónæmisprófanir á plöntum geta gefið mismunandi niðurstöður sem leiða til meintra ályktana. Til dæmis höfum við sýnt fram á að í blaða-diskur ROS sprunguprófi var svörun Arabidopsis við OMV háð EFR viðtakanum, en í ónæmismerkjagenatjáningarprófi með Arabidopsis plöntum var stökkbreytt lína eins móttækileg fyrir OMVs og WT. McMillan o.fl. (2021) sýndu að mismunandi líkamleg meðferð sem beitt var við OMVs afnam ákveðna starfsemi eins og vaxtarhömlun ungplöntur. Hins vegar breytti það ekki öðrum ónæmisútgangi eins og grunnun plantna. Þess vegna er mikilvægt að sameina margvíslegar prófanir til að prófa mismunandi ónæmisúttak til að fá eins víðtæka sýn og mögulegt er á ónæmissvörun plantna við tiltekinn framkalla. Til að kanna frekar þátttöku sumra þekktra PRR og samviðtaka, höfum við prófað fallið alltaf og bak stökkbreyttu línurnar með því að nota plöntufrumunarprófið. Niðurstöður okkar sýna að Arabidopsis tvöfalda stökkbreyttu línufallin voru á sama hátt grunnuð af Xcc OMV og WT plöntur, sem styðja þá hugmynd að önnur MAMP en flagellin og EF-Tu séu einnig til staðar í Xcc 33913 OMVs. Byggt á genagreiningum á ónæmismerkjum, lögðum við áður til að BAK1 meðviðtakinn tæki þátt í skynjun og/eða svörun OMV (Bahar o.fl., 2016). Í þessari rannsókn skoðuðum við þessa tillögu aftur með því að nota grunnprófið. Hér var bak stökkbreytta línan grunnuð með OMV formeðferð, en í aðeins minna mæli en WT Col-0 plöntur. Þó að þessi framlegð væri ekki tölfræðilega marktæk var hún meiri en sást með tvöföldu fls-stökkbreyttu línunni. Þessi niðurstaða er einnig í samræmi við nýlega rannsókn sem sýndi að bak stökkbreytta línan var móttækileg fyrir OMV sem WT plöntur í ónæmisfrumunartilraunum (Tran o.fl., 2021). Á heildina litið gæti þetta bent til þess að á meðan BAK1 er þátttakandi í OMV skynjun, þá eru önnur ónæmisskynjun og merkjaleiðir frumstilltar af OMV, sem leiðir til skilvirkrar ónæmissvörunar og bælingar á vexti sýkla. Þátttaka samviðtaka BAK1 og SOBIR1 sem svar við OMVs (Bahar o.fl., 2016) leiddi til þess að við gerðum ráð fyrir að margir ónæmisviðtakar, líklega PRR, taki þátt í OMV skynjun. Hins vegar gaf nýleg rannsókn til kynna að ónæmisvirkjun plantna með OMVs gæti verið MAMP-óháð og stafar af eðlisefnafræðilegum breytingum á plasmahimnu plantna sem orsakast af OMV samþættingu (Tran o.fl., 2021). Þetta er forvitnileg tilgáta sem á eftir að fjalla frekar um. Athyglisvert er að McMillan o.fl. (2021) greindi frá því að OMV sem meðhöndlaðir voru með próteinasa K héldu ónæmisfrumunargetu sinni, sem gefur til kynna að þessi virkni gæti verið óháð OMV próteinkenndum farmi. Þó að þessi niðurstaða geti stutt MAMP-óháða ónæmisvirkjunartilgátu Tran et al. (2021), geta önnur, próteinlaus MAMP sem eru til staðar í OMV eins og LPS og PGN virkjað MTI (Bahar o.fl., 2016; McMillan o.fl., 2021). Að auki héldu próteinasa K-meðhöndlaðir OMVs getu sinni til að örva vaxtarhömlun á ungplöntum, sem gefur til kynna að vaxtarhömlun sé háð próteinkenndum farmi OMVs (McMillan o.fl., 2021). Á heildina litið leggja þessar niðurstöður enn frekar áherslu á flókið svar plantna við OMV og mikilvægi þess að nota margs konar úttak til að prófa þátttöku tiltekins elicitor í tilteknum ferlum.

Árið 2021 greindu fjórar óháðar rannsóknir, þar á meðal þessa (sem líklega hafa átt sér stað samtímis), að OMV-bakteríur stýra ónæmiskerfi plantna og framkalla árangursríka svörun gegn sýkingarsýkingu (Janda o.fl., 2021; McMillan o.fl., 2021; Tran o.fl., 2021). Þessar spennandi niðurstöður staðsetja OMV sem nýjan og mikilvægan aðila í samskiptum plantna og örvera, þar sem enn er margt sem þarf að læra. Í þessari rannsókn gefum við víðtækari sýn á umritunarviðbrögð Arabidopsis við Xcc OMV. Viðbótarrannsóknaraðferðir verða nauðsynlegar til að skilja enn frekar þá þætti og aðferðir sem taka þátt í skynjun plantna á OMV.

HEIMILDIR

Ambawat, S., Sharma, P., Yadav, NR og Yadav, RC (2013). MYB umritunarþættir gen sem eftirlitsaðilar fyrir plöntuviðbrögð: Yfirlit. Lífeðlisfræði og sameindalíffræði plantna, 307–321.

Bahar, O. (2020). Himnublöðrur frá plöntusjúkdómsvaldandi bakteríum og hlutverk þeirra við víxlverkun plantna og sýkla. Í: M. Kaparakis-Liaskos, & TA Kufer ritstj. Blöðrur í bakteríuhimnu - Líffræðileg tilurð, virkni og notkun. Springer International Publishing, Sviss, 119–129.

Bahar, O., Mordukhovich, G., Luu, DD, Schwessinger, B., Daudi, A., Jehle, AK, Felix, G., & Ronald, PC (2016). Blöðrur í ytri himnu baktería framkalla ónæmissvörun plantna. Sameindasamskipti plantna og örveru, 374–384.

Birkenbihl, RP, Kracher, B., Ross, A., Kramer, K., Finkemeier, I., & Somssich, IE (2018). Meginreglur og eiginleikar Arabidopsis WRKY eftirlitsnetsins meðan á ónæmi af völdum MAMP stóð snemma. Plant Journal, , 487–502.

Bjornson, M., Pimprikar, P., Nürnberger, T. og Zipfel, C. (2021). Umritunarlandslag Arabidopsis thaliana mynstur-kveikti á ónæmi. Náttúruplöntur,, 579–586.

Bolger, AM, Lohse, M. og Usadel, B. (2014). Trimmomatic: Sveigjanlegur trimmer fyrir Illumina röð gögn. Lífupplýsingafræði, 2114–2120.

Boutrot, F. og Zipfel, C. (2017). Virkni, uppgötvun og nýting plöntumynsturþekkingarviðtaka fyrir breiðvirkt sjúkdómsþol. Annual Review of Phytopathology, 257–286.

Chinchilla, D., Zipfel, C., Robatzek, S., Kemmerling, B., Nürnberger, T., Jones, JDG, Felix, G., & Boller, T. (2007). Flagellin-framkallað flókið af viðtakanum FLS2 og BAK1 kemur af stað vörn plantna. Náttúra, 497–500.

Chowdhury, C. og Jagannadham, M. v. (2013). Meinvirkniþættir losna í tengslum við ytri himnublöðrur Pseudomonas syringae pv. tómatar T1 við eðlilegan vöxt. Biochimica Et Biophysica Acta-Prótein og próteinfræði,(1), 231-239.

Cook, DE, Mesarich, CH og Thomma, BPHJ (2015). Að skilja ónæmi plantna sem eftirlitskerfi til að greina innrás. Annual Review of Phytopathology, 541–563.

Couto, D. og Zipfel, C. (2016). Reglugerð mynsturþekkingarviðtaka merkja í plöntum. Nature Reviews Immunology, (9), 537-552.

Davidsson, P., Broberg, M., Kariola, T., Sipari, N., Pirhonen, M., & Palva, ET (2017). Stutt oligogalacturonides örva sýklaviðnám tengda genatjáningu í Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology, 1–17.

Deatheragea, BL og Cookson, BT (2012). Losun himnublöðru í bakteríum, heilkjörnungum og forndýrum: varðveittur en vanmetinn þáttur í lífveru lífvera. Sýking og ónæmi, 1948–1957.

Denoux, C., Galletti, R., Mammarella, N., Gopalan, S., Werck, D., De Lorenzo, G., Ferrari, S., Ausubel, FM, & Dewdney, J. (2008). Virkjun á varnarviðbragðsleiðum af OGs og Flg22 elicitors í Arabidopsis plöntum. Sameindaplanta, 423–445.

Dow, M., Newman, M.-A. og von Roepenack, E. (2000). Örvun og mótun á varnarviðbrögðum plantna með lípópólýsykrum baktería. Annual Review of Phytopathology, 241–261.

Du, Z., Zhou, X., Ling, Y., Zhang, Z. og Su, Z. (2010). agriGO: GO greiningartól fyrir landbúnaðarsamfélagið. Kjarnsýrurannsóknir, W64–W70.

Ellis, TN og Kuehn, MJ (2010). Meinvirkni og ónæmisstýrandi hlutverk ytri himnublöðru baktería. Örverufræði og sameindalíffræði, 81–94.

Ellis, TN, Leiman, SA og Kuehn, MJ (2010). Náttúrulega framleiddar ytri himnublöðrur frá Pseudomonas aeruginosa kalla fram öflugt meðfædd ónæmissvörun með samsettri skynjun á bæði lípópólýsykru og próteinþáttum. Sýking og ónæmi, 3822–3831.

Erbs, G., Silipo, A., Aslam, S., de Castro, C., Liparoti, V., Flagiello, A., Pucci, P., Lanzetta, R., Parrilli, M., Molinaro, A. , Newman, M.-A. og Cooper, RM (2008). Peptidoglycan og múrópeptíð frá sýklum Agrobacterium og Xanthomonas kalla fram meðfædd ónæmi plantna: Uppbygging og virkni. Efnafræði og líffræði, 438–448.

Felix, G., Duran, JD, Volko, S. og Boller, T. (1999). Plöntur hafa næmt skynjunarkerfi fyrir mest varðveitta lén bakteríuflagellíns. Plant Journal, 265–276.

Fesel, PH og Zuccaro, A. (2016). -glúkan: Mikilvægur þáttur í frumuvegg sveppa og illskiljanlegt MAMP í plöntum. Sveppaerfðafræði og líffræði, 53–60

Fulsundar, S., Harms, K., Flaten, GE, Johnsen, PJ, Chopade, BA, & Nielsen, KM (2014). Genaflutningsmöguleiki ytri himnublaðra Acinetobacter baylyi og áhrif streitu á blöðrumyndun. Hagnýt og umhverfisleg örverufræði, 3469–3483.

Gómez-Gómez, L. og Boller, T. (2000). FLS2: LRR viðtakalíkur kínasi sem tekur þátt í skynjun bakteríuelicitor flagellins í Arabidopsis. Sameindafruma, 1003–1011.

Gust, AA, Biswas, R., Lenz, HD, Rauhut, T., Ranf, S., Kemmerling, B., Gotz, F., Glawischnig, E., Lee, J., Felix, G., & Nürnberger. , T. (2007). Peptíðóglýkanar sem eru unnin af bakteríum mynda sýklatengd sameindamynstur sem kalla fram meðfædda ónæmi í Arabidopsis. Journal of Biological Chemistry, 32338– 32348.

Ionescu, M., Zaini, PA, Baccari, C., Tran, S., da Silva, AM, & Lindow, SE (2014). Xylella fastidiosa ytri himnublöðrur móta landnám plantna með því að hindra tengingu við yfirborð. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, E3910–E3918.

Janda, M., Ludwig, C., Rybak, K., Meng, C., Stigliano, E., Botzenhardt, L., Szulc, B., Sklenar, J., Menke, FLH, Malone, JG, Brachmann, A., Klingl, A. og Robatzek, S. (2021). Lífeðlisfræðilegar og próteinfræðilegar greiningar benda til virkni Pseudomonas syringae pv tómatar DC3000 utanfrumublöðru í bakteríuvexti við plöntusýkingu. bioRxiv, 2021.02.08.430144.