Áfengissértæk umritunarvirkni endurþéttingar minnis og bakslags Hluti 4

Auk Arc komumst við að því að mRNA-magn Egr1, en ekki Bdnf, jókst í DH og mPFC með endurheimt áfengisminni.

Eftir því sem tíminn líður öðlast fólk smám saman nýjan skilning á leyndardómi gleymskunnar. Í þessu ferli hefur ný tækni minni endurheimt smám saman orðið að heitum rannsóknarreitur.

Svo er samband á milli endurheimt áfengis og minnisframmistöðu? Komdu og skoðaðu núna! Í fyrsta lagi þurfum við að hafa það á hreinu: Minnisleit á áfengi er ekki sérstök tækni. Það er tækni sem hefur áhrif á taugafrumur í heila í gegnum áfengi. Þetta ferli getur virkjað sumar "sofandi" minningar í heilanum, sem gerir okkur kleift að hressa upp á þessar minningar.

Í öðru lagi þurfum við að vita að það að bæta minni gerir okkur ekki einfaldlega kleift að „muna“ fleiri hluti heldur er það ferli að sækja og endurbyggja minningar á mismunandi hátt. Þetta ferli getur hjálpað okkur að treysta betur og skilja þá þekkingu sem við höfum lært og þar með bætt minni okkar.

Þess vegna getum við ályktað að það sé samband á milli endurheimtar áfengis og minnisframmistöðu. Þegar við notum þessa tækni til að draga fram fyrri minningar aftur eftir áfengisdrykkju, þá erum við að ganga í gegnum ferli til að þétta þessar minningar aftur og bæta þar með minnið að vissu marki.

Auðvitað verðum við líka að hafa í huga að endurheimt áfengisminni er ekki langvarandi og áreiðanleg tækni til að bæta minni. Ef við viljum hafa frábært minni í langan tíma þurfum við stöðugt að treysta og bæta minnið með daglegu námi og lífi, ásamt annarri minnisþjálfunartækni.

Í þessu ferli þurfum við að halda bjartsýnu viðhorfi á hverjum tíma, til að örva betur námshvatningu okkar og minnimöguleika. Þess vegna skulum við horfast í augu við minnisþjálfun á virkan hátt, vera við sjálf án afláts og halda áfram hugrökk á leiðinni til að bæta minnið stöðugt! Það má sjá að við þurfum að bæta minnið og Cistanche deserticola getur bætt minnið verulega því Cistanche deserticola getur líka stjórnað jafnvægi taugaboðefna eins og aukið magn asetýlkólíns og vaxtarþætti. Þessi efni eru mjög mikilvæg fyrir minni og nám. Að auki getur Kjöt einnig bætt blóðflæði og stuðlað að súrefnisgjöf, sem getur tryggt að heilinn fái nægileg næringarefni og orku og þar með bætt heilaþrótt og úthald.

Smelltu núna til að bæta skammtímaminni

Aukin Egr1 mRNA tjáning hefur áður verið tengd við endurþéttingu ótta og lyfjaminninga[19, 21, 48, 61], sem eykur möguleikann á að þessi umritunarþáttur gegni einnig hlutverki í endurþéttingu áfengisminninga.

Þar sem hlutverk Bdnf í endurþéttingu minnis er enn umdeilt [19, 49], er vitað að Bdnf framleiðsla er afgerandi formi öflun og útrýmingarnám [19, 62]. Þannig gæti skortur á breytingu á Bdnf tjáningu í rannsókn okkar bent til þess að aðferðin til að endurheimta minni hafi ekki hafið útrýmingarnám samhliða minnisheimsókn.

Þar að auki greindum við nýlega frá því að þrátt fyrir að mRNA-gildi Bdnf í DH séu ekki aukin með endurheimt áfengisminni í sjálfu sér, þá hafi tjáning vaxtarþáttarins verið hækkuð þegar endurheimtunni er fylgt eftir af andstæðri mótvægi sem kom í veg fyrir bakslag [44], sem bendir til flókins hlutverks Bdnf. í áfengisminni gangverki.

Niðurstöður okkar benda til þess að aukningin á IEG tjáningu sé ekki einstök fyrir endurþéttingu áfengistengdra minninga.

Reyndar voru ARC og EGR1 áður tengdir við það að sameina nokkrar tegundir af minningum, þar á meðal óttaminningum [19, 46, 47, 62], viðurkenningarminningum [21], og minningum tengdum mismunandi misnotkunarlyfjum [20, 22, 61].

Hins vegar eru einnig vaxandi vísbendingar um að sumir af þeim aðferðum sem liggja að baki áfengisleit geta verið frábrugðnir þeim sem stjórna náttúrulegri verðlaunaleit [5, 27, 28, 63]. Einnig eru vísbendingar um að minningar fyrir mismunandi umbun (og sérstaklega fyrir mismunandi lyf) séu unnar á mismunandi hátt [29-32]. Niðurstöður RNAseq greiningar okkar leiddu sannarlega í ljós hið einstaka umritamerki sem framkallað er af endurheimt áfengisminni.

Nánar tiltekið fundum við 44 gen í DH og annað sett af 9 genum í þeim PFC, sem sýndu verulegar breytingar eftir endurheimt áfengisminni. Eftir frekari sannprófun gagna, einbeitum við okkur að einu geni í mPFC (Fkbp5) og þremur genum í DH (Adcy8, Scl8a3 og Neto1) og komumst að því að tjáning þeirra var ekki fyrir áhrifum af endurheimt súkrósatengdra minninga.

Þetta bendir til þess að ólíkt Arc og Egr1 gegni þessi 4 sértæku gen líklega ekki almennu hlutverki í vinnslu verðlaunaminninga, en gætu frekar gegnt sértæku hlutverki í vinnslu áfengisminninga.

Athyglisvert er að þessi fjögur gen voru áður tengd röskun á áfengisneyslu og nám og minni. Þannig kóðar Fkbp5 fyrir FK506 bindandi prótein 5, eftirlitsaðila á streitutaugainnkirtlakerfinu [64].

FKBP5 afbrigði móta alvarleika áfengisfráhvarfsheilkennis [65] og spá fyrir um tilhneigingu til mikillar drykkju hjá mönnum [66-68]. Sýnt var að brottfall Fkbp5 eykur alvarleika áfengisfráhvarfs [65] og áfengisdrykkju [67] hjá músum, en lyfjafræðileg hömlun á próteini dró úr hóflegri áfengisneyslu og endurupptöku CPP í músum [69] og minnkaði áfengisdrykkju hjá stressuðum karlrottum [70].

Magn Adcy8 mRNA, sem kóðar adenýlatsýklasa 8 (AC8) sem hvetur cAMP myndun sem svar innstreymi kalsíums og nýlega merkt sem mögulegur stjórnandi áfengisneyslu [28, 71], lækkuðu í blóðfrumum frá langtímabindandi alkóhólistum [72].

Áður hefur verið sýnt fram á að brottfall Adcy8 dregur úr áfengisdrykkju og eykur næmi fyrir vímuefnaáhrifum áfengis í músum [73]. Að auki hækkaði langvarandi áfengisútsetning hjá rottum tjáningu heila burðarfjölskyldu 8 (natríum/kalsíumskiptar), meðlimur 3 (NCX3), próteinið sem er kóðað af Scl8a3 [74, 75].

Áfengisneysla hjá rottum var einnig tengd minni tjáningu í heilastofni á Neto1 [76], sem kóðar neuropilin tolloid-like 1 (NRP1), sem er hluti af NMDA-viðtakakomplexinu [77].

Þetta prótein tekur þátt í endurskipulagningu taugamóta og sendingu í hippocampus [78] og er nauðsynlegt fyrir staðbundið nám og minni [77].

Þannig sýna niðurstöður okkar að það eitt að endurheimta áfengisminningar, jafnvel án lyfjafræðilegra áhrifa áfengis, hefur áhrif á tjáningu þessara gena. Hins vegar á eftir að prófa sérstakt hlutverk þeirra í endurþéttingu áfengisminni og bakslagi.

Takmörkun þessarar rannsóknar er að RNA-seq prófið var framkvæmt á lausu mPFC og DH vefjum, frekar en á einstökum frumum sem virkjaðar voru með endurheimt minni. Sérstaklega hafa nýlegar rannsóknir bent til þess að minningar almennt [79, 80], og sérstaklega áfengistengdar minningar [32, 81, 82], séu kóðaðar með virkjun taugafrumna sem samanstanda af litlum fjölda taugafrumna, sem hægt er að greina með taugavirkjunarmerkjum ( td cFOS) [80].

Reyndar fundust svipað IEG (cFOS) virkjunarmynstur með því að endurheimta virkt skilyrt áfengi og sætar verðlaunaminningar á mPFC og viðbótarmesolimbískum svæðum í rottuheilanum [32, 81]. Þannig er mögulegt að það að framkvæma RNA-seq prófið sértækt á taugafrumusameindinni sem virkjað er með minnisheimsókn hefði skilað nákvæmari niðurstöðum.

Í stuttu máli benda niðurstöður okkar til þess að endurheimt áfengisminni framkalli tvö samhliða umritunaráætlanir. Eitt forrit, sem er miðlað með sameiginlegum sameindaaðferðum náms og minnis, þar á meðal IEG Arc og Egr1, tekur þátt í því að styrkja minningar almennt.

Hitt umritunarforritið, hleypt af stokkunum með endurheimt áfengisminni, er stjórnað af genum sem sérstaklega stuðla að áfengistengdri hegðun. Þetta tvöfalda vinnslu líkan fyrir áfengisminningar vekur möguleika á því að endurþétting minni fyrir mismunandi minningar geti haft svipaða tvívinnslu sameindakerfi, með sumum íhlutum sem margar minningar deila og aðrir einstakir fyrir hverja minnistegund.

Þetta tilgáta líkan á eftir að meta með því að prófa hvort að meðhöndla þessi gena hafi mismunandi áhrif á endurþéttingu áfengis og súkrósa-minni. Ef svo er myndi það benda til þess að það gæti verið mögulegt að stefna að verðlaunasértæk sameindamarkmið til að meðhöndla sjúkdóma sem tengjast sjúkdómsvaldandi minningum, svo sem fíkn, frekar en að trufla helstu sameindakerfi sem eru nauðsynlegir fyrir margar aðgerðir umfram endurþéttingu áfengisminni.

EFNI OG AÐFERÐIR

Sjá viðbótarupplýsingar til að fá upplýsingar um tækið, lyf og efni, hönnun og undirbúning oligodeoxynucleotide (ODN), westernblot og qRT-PCR greiningar og undirbúning RNA-seq bókasafns.

Dýr

Karlkyns og kvenkyns C57BL/JRccHsd mýs (25–30 g), hýst 3–4/búr voru ræktaðar í Tel-Aviv háskólans dýraaðstöðu (Ísrael), og haldnar undir 12 klst ljós-myrkri hringrás (ljósin kveikt klukkan 7), með mat og vatni tiltækt adlibitum.

Í tilraunum sem fólu í sér staðhæfingu fyrir súkrósa var aðgangur að mat takmarkaður í 6 klukkustundir fyrir æfingar til að efla hvata músanna til að safna súkrósaköglum. Þessi stutti tími matarskorts er byggður á niðurstöðum þess að á daginn hefur 2-6 klst fasta ekki áhrif á fæðuhegðun [83] og kallar ekki á marktæka breytingu á efnaskiptamerkjum [84] og lágmarkar þannig áhrif matartakmarkana í sjálfu sér. .

Mýs voru vigtaðar tvisvar í viku til að stjórna þyngdartapi. Allra tilraunasamskiptareglur voru samþykktar af og voru í samræmi við viðmiðunarreglur dýraverndar- og notkunarnefndar stofnana við háskólann í Tel Aviv og viðmiðunarreglur NIH (dýraverndarnúmer A5010-01). Allt var reynt til að lágmarka fjölda dýra sem notuð voru.

Atferlisaðferðir

Staðskæling

Áfengisskilyrði (CPP): Allar mýs voru vanar daglegum ip saltvatnssprautum í 3 daga.

Grunnpróf (dagur 1): Á fyrsta degi var rennihurðin dregin til baka og músum var leyft að skoða allt tækið að vild í 30 mínútur. Áfengisskilyrði (dagar 2–9): Þjálfun hófst 24 klukkustundum eftir grunnprófið með einni lotu gefið á dag í 8 daga, með rennihurðina lokaða. Á dögum 3, 5, 7 og 9 fengu mýsnar áfengi (1,8 g/kg, 20% v/v; ip) og voru samstundis bundnar við parað hólf í 5 mín.

Áður var sýnt fram á að þessi skammtur og meðferðartími myndu alkóhól-framkallaðan CPP [42, 85]. Á öðrum dögum (þ.e. dagana 2, 4, 6 og 8) fengu mýsnar saltlausn og voru bundnar við óparað hólf í sama tíma og á áfengismeðferðardeginum.

Pöruð hólf voru í mótvægi. Staðsetningarpróf 1 (dagur 10): Staðsetningarprófun var eins og lýst er fyrir grunnprófið og var notað til að mæla alkóhól-CPP [41]. Forgangur var skilgreindur sem aukning á prósentu tíma sem varið er í áfengispöruðu hólfinu í staðvalsprófi 1, samanborið við grunnprófið.

Minnisöflun (dagur 11): Fyrir þetta stig var músunum úthlutað við mismunandi tilraunaaðstæður (samsvörun fyrir CPP stig og kyn). Meðan á minnisleitarlotu stóð voru mýsnar bundnar við alkóhólpöruðu hólfið í 3 mínútur og síðan aftur í búrið sitt. Staðarvalspróf 2 (dagur 12): Mýsnar voru látnar fara í staðsetningarpróf sem var eins og staðsetningarpróf 1.

Súkrósa CPP: Súkrósi forþjálfun (dagar 1–6): Á dögum 1–3 voru mýsnar vanar að safna 5–6 súkrósaköglum (45 mg, Dustless Precision Pellets, Bio-Serv, Frenchtown, NJ, Bandaríkjunum) í búr heima. . Á dögum 4–6 voru mýs þjálfaðar í að safna 3 köglum í tóman plexiglerkassa á 30-mínútum. Mýs sem söfnuðu færri en sex kögglum (af samtals níu kögglum á 3 dögum) við súkrósaþjálfun voru útilokaðar frá tilrauninni (2 mýs af 32).

Grunnpróf (dagur 7): Á sjöunda degi var rennihurðin í CPP-klefa dregin til baka og músunum var leyft að kanna allt tækið í 30 mínútur. Óhlutdræg tæki/hlutlaus úthlutunaraðferð, eins og lýst er í alkóhól-CPP málsmeðferðinni, var einnig tekin upp hér. Súkrósa staðhæfing (dagar 8–15): Þjálfun hófst 24 tímum eftir grunnprófið með einni lotu á dag í 8 daga, með renna hurð lokað. Á dögum 9, 11, 13 og 15 var músum komið fyrir í pöruðu hólfinu og mínútu síðar var þremur súkrósaköglum dreift á gólfið.
Músum var skilað aftur í búrin sín 15 mínútum síðar. Á öðrum dögum (þ.e. dagana 8, 10, 12 og 14) voru mýs settar í óparað hólf í 15 mínútur án truflana.

Pöruð hólf voru í mótvægi. Stöðuvalspróf 1 (dagur 16): Staðsvalsprófun var eins og lýst er fyrir grunnlínuprófið og þjónaði til að mæla súkrósa-CPP. Forgangur var skilgreindur sem aukning á prósentu tíma sem varið er í súkrósa-paraða hólfið á meðan á staðvalsprófi 1 stendur, samanborið við grunnlínuprófið. Minnisöflun (dagar 17): Súkrósaminnisöflunaraðferðin var samhljóða aðferð við endurheimt áfengisminni (sjá hér að ofan). ).

Oligodeoxynucleotide (ODN) staðfesting

Arc antisense ODN (AS-ODN) og spæna ODN (SCR-ODN) (Sigma-Aldrich, Rehovot, Ísrael) hönnun fylgdi leiðbeiningunum sem lýst var áður [56, 86].

Arc AS-ODN hagnýtur sannprófun. Arc AS-ODN (2 nmól/µl, 0,5 µl, 0,25 µl/mín) var gefið inn í DH í einu heilahveli og SCR-ODN (2 nmól/µl, { {9}}.5 µl, 0.25 µl/mín.) var gefið inn í hitt heilahvelið (hliðin var mótvægi). Tveimur eða fjórum tímum síðar könnuðu meðhöndlaðar mýs ókunnugt samhengi (CPP hólf, sjá lýsingu á búnaði, hér að ofan) í 5 mínútur til að framkalla nýnæmisháða ARC tjáningu. Mýs voru aflífaðar klukkustund síðar (þ.e. 3 eða 5 klukkustundum eftir ODN innrennsli), heilavefjum var safnað og ARC próteinmagn var metið með Western blotgreiningu (Mynd S4).

Skurðaðgerð og örinnrennsli innan hippocampus Skurðaðgerðir og örinnrennsli voru framkvæmdar eins og áður hefur verið lýst [42, 87].

Skurðaðgerð. Stereotoxic skurðaðgerðir voru gerðar undir isofluran svæfingu. Mýs voru settar í staðalítaxískan ramma (RWD Life Science, Shenzhen, Kína) og tvíhliða leiðarhylki (C235G-2.6, 26G; Plastics One Inc., Roanoke, VA, Bandaríkjunum) var beint að DH kl. eftirfarandi hnit (−2 mm aftan við bregma, ±1,3 mm miðlægt, −1,45 mm í kvið á yfirborði höfuðkúpu). Kanúlur voru festar með tannakrýli. Samsvarandi dummycannulae (Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA) voru settar inn í leiðarcannulae og toppað með rykbollum til að halda inndælingarstaðnum þakinn og hreinu við rusl. Músunum var leyft að jafna sig í 7-10 daga fyrir áfengis-CPP þjálfun.

Innrennsli í hippocampal. Actinomycin D (4 µg/µl, 0,5 µl á hlið,0,25 µl/mín, í DMSO) [19] eða jafngildu rúmmáli burðarefnis var sprautað í DH strax eftir endurheimt minni . Sýnt hefur verið fram á að innrennsli aktínómýsíns D í hippocampus í svipuðum styrk truflar endurþéttingu minnis [19]. Arc AS-ODN eða stjórn SCR-ODN (2nmól/µl, 0,5 µl/hlið, 0,25 µl/mín; í PBS) var örsprautað í DH 4 klukkutíma 2 klst áður en eða 4 klst. eftir minnissókn.

Eftir að rykkápan og brúðarnælurnar voru fjarlægðar var örinnrennsli framkvæmt á 2 mínútum til músa sem voru vakandi og haldnar, með því að nota inndælingarhylki (33 G; Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA) sem náðu 0,5 mm út fyrir leiðarinn. holnálaoddur. Inndælingarhnúður voru látnar standa á sínum stað í 2 mínútur til viðbótar. Eftir innrennsli voru innrennslishylkjur settar í leiðarholurnar, festar með rykbollanum, og dýrin fóru aftur í búr sín. Staðsetningar holna voru sannreyndar í 30 μm þykkum kransæðaköflum af paraformaldehýðföstum vef sem var litaður með kresýlfjólubláu.

Gagnagreining

Place preference was assessed as the percentage of time spent in the alcohol/sucrose-paired compartment, relative to the total test time. Mice that spent >75% tímans í öðru hvoru hólfanna meðan á grunnlínuprófinu stóð voru útilokuð frá rannsókninni (9 af 267). Stofnun CPP var staðfest með því að bera saman CPP stig á milli grunnlínu og CPP prófs 1 og var greind með pöruðu t-prófi. Þar sem tjáning á CPP (þ.e. minnismyndun) er nauðsynleg til að endurheimta minni, voru gögn frá músum sem sýndu ekki CPP (að minnsta kosti 5% aukning á vali milli grunnlínu og prófunar 1) útilokuð frá tilrauninni (48 af 258).

Áfengi-CPP eftir truflun á endurþéttingu minni var greind með ANOVA með blandaðri gerð með meðferðarstuðli á milli einstaklinga (Actinomycin D eða ODN) og innan viðfangsþáttar prófs (CPP próf 1, CPP próf 2). Marktækar milliverkanir voru greindar með aStudent–Newman–Keuls post hoc prófi. Þéttleiki Western blotimmunoreactive ARC próteinmagns var staðlaður í GAPDH og greind með einstefnu ANOVA með milliþáttum meðferðarþáttar, fylgt eftir með Dunnett's post hoc prófi. qRT-PCR mRNA tjáningargögn voru staðlað í Gapdh og gefin upp sem hlutfall af tjáningu samanburðarhóps.

Gögn frá öllum genum fyrir hvert heilasvæði voru greind með einstefnu ANOVA með meðferðarstuðli milli viðfangsefna, fylgt eftir með Dunnetts prófi fyrir hvert geni, til samanburðar við gögnin sem fengin voru frá samanburðarhópi (No Retrieval). Fyrir RNA-seq, við sameinuðum vefi frá 3 dýrum fyrir hverja endurtekningu og útbjuggum eftirfarandi fjölda endurtekna: 3 fyrir dorsal hippocampus (DH)-ekki endurheimt, 2 fyrir DH-endurheimt, 3 fyrir prefrontal cortex (PFC)-ekki endurheimt, og 2 fyrir ( PFC)-heimsókn. Eftir heildar RNA einangrun með Trizol voru raðgreiningarsöfn mynduð með aðferðinni sem við þróuðum [88].

Söfnin voru sett í 50 bp einhliða raðgreiningu með IlluminaHiseq 2000. Eftir að hafa staðfest gæði raðgreiningargagna með FastQC, voru lestur kortlagðar á mm9 viðmiðunarerfðamengi með því að nota Bowtie2 [89] og merkt með Tophat2 [90].

Les sem kortlagt var á gena voru magngreind með FeatureCounts [91]. Við útilokuðum Rn45s, Lars2, Rn4.5s, Cdk8, Zc3h7a og hvatbera litninga til að forðast talningu á ofmögnuðum genum sem gætu skekkt eðlilega bókasafn eins og áður hefur verið lýst [92]. DESeq2 [58] var notað til að bera kennsl á mismunað tjáð gen (DEG) í endurheimtunarhópnum, samanborið við viðmiðunarhópinn án endurheimts, með p-gildi (p(adj) < 0.05, aðlöguð marktækni.

gagnaframboð RNA-seq gögn eru fáanleg á NCBI Gene Expression Omnibus á https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi (GSE205586) með gagnrýnandalykil: knyfwwiorbutvuv.

HEIMILDIR

1. Collins PY, Patel V, Joestl SS, March D, Insel TR, Daar AS, o.fl. Stórar áskoranir fyrir geðheilbrigði. Náttúran. 2011;475:27–30.

2. Heilig M, Egli M. Lyfjafræðileg meðferð áfengisfíknar: markeinkenni og markaðferðir. Pharmacol meðferð. 2006;111:855–76.

3. Sinha R. Nýjar niðurstöður um líffræðilega þætti sem spá fyrir um varnarleysi fyrir endurkomu fíknar. Curr Psychiatry Rep. 2011;13:398.

4. Litt MD, Cooney NL, Morse P. Viðbrögð við áfengistengdu áreiti á rannsóknarstofu og á sviði: spár um þrá hjá meðhöndluðum alkóhólistum. Fíkn.2000;95:889–900.

5. Barak S, Liu F, Ben Hamida S, Yowell QV, Neasta J, Kharazia V, o.fl. Truflun á áfengistengdum minningum með mTORC1 hömlun kemur í veg fyrir bakslag. Nat Neurosci.2013;16:1111–7.
6. Milton AL. Drykk, lyf og truflun: minnisstýring til meðferðar á fíkn. Curr Opin Neurobiol. 2013;23:706–12.

7. Nader K, Hardt O. Einn staðall fyrir minni: málið fyrir endurþéttingu. NatRev Neurosci. 2009;10:224–34.

8. Dudai Y. Reconsolidation: kosturinn við að vera endurfókusaður. Curr Opin Neurobiol. 2006;16:174–8.

9. Przybyslawski J, Sara SJ. Endurþétting minnis eftir endurvirkjun þess. Behav.Brain Res. 1997;84:241–6.

10. Nader K, Schafe GE, Le Doux JE. Óttaminningar krefjast próteinmyndunar í theamygdala fyrir endurþéttingu eftir endurheimt. Náttúran. 2000;406:722–6.

For more information:1950477648nn@gmail.com