Adenóveirubóluefni sem inniheldur stytt SARS-CoV-2 Spike Protein S1 undireiningu leiðir til sérstakrar ónæmissvörunar í músum

ÁgripCT% 3aÞróun skilvirks og öruggs kransæðaveirusjúkdóms 2019 (COVID-19) bóluefnis er afgerandi nálgun til að meðhöndla alvarlegan bráðan öndunarfærasjúkdóm coronavirus 2 (SARS-CoV-2) heimsfaraldur í ljósi núverandi aðstæðna. Í þessari rannsókn framleiddum við styttan hluta af fínstilltu SARS-CoV-2 toppgeninu (2043 bp, kallað S1) sem gat umritað stytt S1 prótein. Próteinið var prófað til að ákvarða hvort það gæti framkallað skilvirka bólusetningu í músum gegn SARS-CoV-2. Tilvist S1 próteinsins var staðfest með ónæmisflúrljómun og Western blotting. Eitlaveirubóluefni sem ber S1 genabrotið (Ad-S1) var gefið í vöðva fjórum sinnum á 4 vikum. Sýnt var fram á SARS-CoV-2 S1 prótein húmorónæmi hjá öllum bólusettum músum. Sermi frá bólusettum músum sýndi framúrskarandi sýkingarvirkni in vitro. Öflugt ónæmissvörun gegn SARS-CoV-2 sást í músunum eftir bólusetningu með Ad-S1, sem bendir til þess að bóluefni gegn æðanveiru geti hjálpað til við þróun bóluefna gegn SARS-CoV-2 og öðrum erfðafræðilega aðgreindum vírusa.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Leitarorð: SARS-CoV-2; bóluefni; adenoviral vektor; S1 gen; friðhelgi

1. Inngangur

Kórónuveirusjúkdómur 2019 (COVID-19) er oft tengdur fjöllíffærabilun og háum dánartíðni [1] og er mikil ógn við almannaöryggi um allan heim. Frá og með 15. júlí 2022 hefur COVID-19 faraldurinn verið viðvarandi á heimsvísu, með 557.917.904 staðfest tilfelli, þar á meðal 6.358.899 dauðsföll, tilkynnt til Alþjóðaheilbrigðismálastofnunarinnar (WHO). Ennfremur hafa samtals 12.130.881.147 bóluefnisskammtar verið gefnir frá og með 11. júlí 2022. Þess vegna er hönnun og þróun ný kórónavírus (nCoV) bóluefni afar mikilvæg og eitt af forgangsverkefnum á heimsvísu í heilbrigðismálum. S próteinið er lykilþáttur í innkomu SARS-CoV-2 alvarlega bráða öndunarfærasjúkdómsins coronavirus 2 (SARS-CoV-2) inn í hýsilfrumur [2,3]. Próteinið binst hýsilviðtakanum og gerir vírusnum kleift að komast snurðulaust inn í hýsilfrumu [4]. N-tengd glýkan skaga út úr trimer yfirborðinu og skreyta S próteinið mikið, sem hefur áhrif á S próteinbrot, húmorsónæmi og hýsilfrumu próteasavinnslu [5]. SARS-CoV-2 S próteinið hefur lægri N-tengd glýkanþéttleika en önnur S-prótein af völdum kórónaveirunnar sem sjúkdómsvaldandi í mönnum [6]. Þess vegna getur S próteinið verið mjög ónæmisvaldandi og er aðalmarkmið hlutleysandi mótefna. S próteinið hefur þrjú uppbyggingarsvið, þar á meðal er S1 lénið mikilvægasta S prótein yfirborðsmótefnavakinn [4]. Vegna erfiðleika við að framleiða stór raðbrigða prótein (utanfrumusvæði prótein S er um 1300 amínósýrur) og hættu á mótefnaháðri aukningu (ADE) á sýkingu, S1 (um 700 amínósýrur) og viðtakabindandi svæði þess (RBD, um 200 amínósýrur) eru almennt álitnar aðlaðandi mögulegu skotmörk fyrir kransæðaveirubóluefni [7,8]. Sermigerð 5(HAdV-C5) af kirtilveiru manna er mikið notuð í grunnveirufræði sem genameðferð og bóluefnisferjur [9]. HAdV-C5 hefur náttúrulegan fjölbreytileika og getur sníkjudýrt flesta hýsils, sem er grunnur að þróun dýratilrauna. Raðbrigða kirtilveiruferjur með fjölgunar- og afritunargalla sem eru smíðaðar úr HAdV-C5 hafa verið mikið notaðar í bólusetningargjöf og genameðferð [9,10]. Eins og er hafa kirtilveirur verið samþykktar sem bóluefni gegn bráðum öndunarfærasýkingum og margar tilraunir hafa verið gerðar á slíkum bóluefnum, svo sem fyrir malaríu og HIV-1 [9]. Í þessari grein lýsum við SARS-CoV-2 bóluefni gegn kirtilveiru sem skortir eftirmyndun í mönnum og undirbúningi og notkun þess. Í þessari rannsókn var kirtilveirubóluefnið smíðað sem hér segir: ferjan var afritunargölluð adenoveira HAdV-C5 með E1 og E3 eyðingu, beinagrind plasmíðið var raðbrigða adenoveira með pBHGlox∆E1,3Cre, pakkningsfrumulínan var HEK293 frumur, og markgenið var stytta S1 próteingenið af SARS-CoV-2. S1 próteintjáning í bóluefninu var auðkennd með Western blot og ónæmisflúrljómunarprófum. Til að ákvarða gæði ónæmissvörunar sem framkallaðir eru af bóluefnisframbjóðendum sem byggjast á toppi var mótefnasvörun eftir bólusetningu skoðuð í smáatriðum. Ónæmisávinningur bóluefnisins var metinn með bindandi mótefnaprófi (ensímtengd ónæmissogandi prófun [ELISA]) og hlutleysandi mótefnaprófi. Niðurstöður okkar leggja grunninn að þróun og mati á COVID-19 bóluefnum og meðferðum sem byggjast á S1 próteini.

2. Efni og aðferð

2.1. Frumur og dýr

HEK293 og Vero E6 apa nýrnafrumulínur voru notaðar í þessari rannsókn. Báðar frumulínurnar voru ræktaðar í Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) ásamt 2% fóstursermi (FBS) og 1% penicillíni og streptómýsíni við 37 ◦C með 5% CO2 og mettaðri raka. Tuttugu kvenkyns C57BL/6 mýs (6-8 vikur) voru keyptar frá Zhejiang Animal Experimental Center, Zhejiang héraði. Músunum var skipt af handahófi í tvo hópa með 10 músum í hverjum hópi. Annar hópurinn var bólusettur (100 µL inndæling í kviðarhol) með Ad5 vektor sem tjáir SARS-CoV-2 topppróteinið (Ad5-S) og hinn með PBS (100 µL inndælingu í kviðarhol) sem viðmiðunarhóp. Heildarmagn veirunnar var 5 × 109 VP Allar mýsnar voru bólusettar með D0/D14 inndælingu í vöðva [11,12]. Við D14 var 100 µL útlægt blóð tekið, sermi var aðskilið og seinni inndælingin gefin tveimur klukkustundum eftir blóðsöfnun. Við D28 var blóði safnað með aftur-svigrúmstungu og sermi aðskilið. Bindandi mótefni greindust 3 dögum eftir hverja blóðsöfnun, hlutleysandi mótefni greindust 7 dögum eftir hverja blóðsöfnun og cýtókín greindust 7 dögum eftir seinni blóðsöfnunina. Allar mýs voru aflífaðar; allar prófanir voru gerðar í ströngu samræmi við "Leiðbeiningar um umönnun og notkun tilraunadýra í Alþýðulýðveldinu Kína" og samþykktar af siðfræðiráði Zhejiang Shuren háskólans.

2.2. Bóluefni

Öllum SARS-CoV-2 stofnum sem notaðir voru í þessari rannsókn var safnað frá COVID-19 sjúklingum með samþykki. Lyklarannsóknarstofa ríkisins fyrir greiningu og meðferð smitsjúkdóma þróaði bóluefni gegn kirtilveiru (Vero fruma, WuHan stofn, GISAID númer: EPI_ISL_415711) gegn SARS-CoV-2 og síðan bóluefnið var framleitt í líföryggisstigi (BSL) samhæfðum stillingum. Bóluefnislýsingin er 0,5 ml/skammtur og inniheldur Tris, NaCl, reyrsykur, MgCl2.6H2O, C6H9N3O2, algert etanól og SARS-CoV-2 S1 próteinið.

2.3. Uppbygging raðbrigða adenoveiru

SARS-CoV-2 S1 próteinröðin (nr. QRU91950.1) var fengin frá PubMed. Samkvæmt genahrörnuninni var bjartsýni kóðunarkirnisröð sem hentaði fyrir tjáningu spendýrafrumna hönnuð út frá þeirri forsendu að amínósýruröð afurðaprótínsins sem er kóðað af SARS-CoV-2 S1 próteininu hélst óbreytt. Heildarlengdin var 2043 bp. 50 forveraröðin var mynduð með vefjaplasmínógenvirkja (tPA) og röðin sem kóðar SARS-CoV-2 S1 amínósýru 2–688 og tPA forveraröðin voru tengd. Kozak röð og Spel takmörkunarstað var bætt fyrir framan upphafskódoninn og XbaI takmörkunarstaðnum var bætt við á eftir lokunarkódonnum. Núkleótíðraðir ofangreindra gena voru smíðaðar og klónaðar inn í pUC18 af Sangon Biotech til að fá klónaða plasmíð tilbúna gensins. Tilbúna S1 gena röðin og vektor pDC316 voru melt með takmörkunarendonucleasum Spel og Xbal. Markbrotið og ferjan voru tekin úr hlaupinu og tengd til að mynda shuttle plasmíð. SARS-CoV-2 skutlaplasmíðinu var pakkað með AdMax adenóveirukerfis beinagrindplasmíði pBHGloxd∆E1 og 3Cre með samflutningi HEK293 frumna. Aðal veirulausnin var fengin eftir endurtekna frostþíðingu og skilvindu og veiran var mögnuð upp og ræktuð eftir skelluhreinsun.

cistanche ávinningur fyrir karla styrkir ónæmiskerfið

Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur

【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.4. Ákvörðun á adenovirus titli

HEK293 frumur við góða heilsu voru valdar og endursviflausnar til að búa til 5.0 × 105 frumur/mL frumusviflausn, sem var sáð í 24-brunnsplötu (1 ml/brunn) ) og ræktað við 37 ◦C í 5% CO2 umhverfi. Sýnið var raðþynnt tífalt og þynnt sýni (0,1 mL) af 10-5 til 10-8 frumum var sáð á 24-brunnsplötu . Síðan voru plöturnar útsettar fyrir sýkingu við 37 ◦C með 5% CO2 í 48 klst. Í kjölfarið var ræktunarmiðillinn fjarlægður, forkældu metanóli (0,5 ml) bætt við og sýnin fest við -20 ◦C í 20 mín. Eftir festingu voru sýnin þvegin með fosfat-bufferðri saltlausn (PBS) og lokuð með 1% nautgripasermi albúmíni (BSA, 0,2 mL) við 37 ◦C í 1 klst. Næst var aðal (Mouse Anti-Adenovirus Hexon, AbD Serotec 04000079, 1:2000) og auka (geit pAb til MS IgG2a(HRP), Abcam ab97245, 1:1000) mótefni bætt við og ræktað í 1 klst., þar sem PBS var notað til þvotta. Eftir ræktun var nýgerðri vinnulausn (0,2 ml) bætt við og hún ræktuð í 5-10 mínútur við stofuhita. Síðan var vinnulausninni hent, sýnin þvegin með PBS og PBS (1 ml) var bætt við aftur. Reiknaður var meðalfjöldi jákvæðra frumna í smásjásviðinu (cat. CKX53, OLYMPUS Research Inverted System Microscope) þar sem halli með 5–50 jákvæðum frumum í sjónsviðinu var valinn og að minnsta kosti fimm svæði valin af handahófi til talningar . Reiknaður var út fjöldi sjónsviða í hverjum brunni 24-brunnsplötunnar. Síðan var veirutíterinn reiknaður út samkvæmt eftirfarandi formúlu (1):

2.5. Rauntíma PCR

Til að greina HEK293 frumu mRNA tjáningu í kjölfar veirusýkingar, drógum við út millistigs-RNA samkvæmt TRIzol notkunarleiðbeiningunum (Invitrogen, Waltham, MA, USA). Heildar-RNA var dregið út með því að nota TRIzol og unnið með RQ1 RNase-frjáls DNase I (Promega, Madison, WI, USA) til að eyða DNA leifum. Viðbótar-DNA (cDNA) var fengið með öfugri umritun á útdregnu RNA með því að nota PrimerScript™ RT hvarfefnissett með gDNA strokleðursetti (Takara, Kusatsu, Japan). DNA bútar voru myndaðir með sérstökum frumurum P1 (50 -GGTGATTCTCTTCAGGTTGGA-30) og P2 (50 - GTTTCTGAGAGAGGGTCAAGTG-30) ​​markgensins (S1). Genið var magnað upp með frumurum P3 (50 -GTCTTCACCACCATGGAGAA-30) og P4 (50 -TAAGCAGTTGGTGGTGCAG-30) sem innra eftirlit (GAPHD).

2.6. Western Blot

Frumulýsinn og flotið voru aðskilin með natríumdódecýlsúlfat-pólýakrýlamíð hlaup rafdrætti (SDS-PAGE) og síðan flutt yfir á pólývínýlídenflúoríð (PVDF) himnur. Blettirnir voru sýndir með Western blot myndgreiningarbúnaði (Bio-Rad, Hercules, CA, Bandaríkjunum). Í stuttu máli voru himnurnar fluttar yfir í TBST (50 mL Tris-HCl, pH 7,5, 8 g NaCl [0,5 mL], 0,2 g KCl, 0,5 mL Tween -20) með 5% fitulaust þurrmjólkurdufti og hrist í aflitunarhristara við stofuhita í 1 klst. Himnur tilrauna- og samanburðarhópanna voru fjarlægðar úr þéttingarlausninni og ræktaðar með aðalmótefninu: [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:5000, cat. #40591- T62, Sino Biological, Peking, Kína)] við stofuhita. Aðal mótefnin voru hrist og ræktuð yfir nótt á aflitunarhristara við 4 ◦C. Bletturinn var skolaður með TBST lausn og ræktaður í 2 klst með aukamótefninu [geita and-kanínu immúnóglóbúlíni G (IgG) H&L (HRP) (1:10.000, cat. #ab6721, Abcam, Cambridge, Bretlandi)]. Eftir skolun voru blettirnir ræktaðir í 1 mín. með LumiBest ECL Substrate lausnarsetti (cat. #4AW011-100, 4A Biotech), og síðan skoðað í myndavél.

2.7. Ónæmisflúrljómunargreining

HEK293 frumum (3 × 106/brunn) var sáð í 12-brunnsplötur. Eftir 48 klst. voru frumurnar sýktar af adenóveiru sem innihélt S1 genið (Ad-S1). Eftir 48 klst var efnið sogað og frumurnar voru þvegnar einu sinni með PBS sem innihélt 2% BSA og festar í 15 mínútur með metanóli sem hafði verið forkælt í 15 mínútur við -20 ◦C. Eftir þrjá þvotta með 2% BSA í PBS voru frumurnar gegndræpnar með 0,5% Triton X-100 í 10 mín. Síðan var frumunum stíflað í 1 klst með 2 mL 2% BSA, blokkunarlausninni var hent og frumurnar þvegnar þrisvar sinnum með PBS. Í kjölfarið var 2 mL aðalmótefni [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, cat. #40591-T62, Sino Biological)] bætt í hvern brunn og ræktað við stofuhita í 1 klst eða 4 ◦C yfir nótt. Síðan var sýnið skolað þrisvar sinnum með 2% BSA í 5 mínútur í hverri skolun. Því næst var 2 mL aukamótefni [geit-anti-kanínu IgG H&L (Alexa Fluor 488) (1:1000, cat. #550037, ZenBio)] bætt við hvern brunn og ræktað við stofuhita í 1 klst. Í kjölfarið voru sýnin skoluð þrisvar sinnum með 2% BSA í 5 mínútur í hverri skolun. 40,6-diamidino-2-fenýlindól (DAPI) lausn (2 ml, 1 mg/ml) (1:400, cat. #S0001, Bioss, Woburn, MA, USA) var bætt í hvern brunn og hvarf í 10 mín í myrkri. Greiningin var skoðuð með EVOS™ M7000 myndgreiningarkerfi (cat. #AMF7000, Invitrogen).

2.8. ELISA

SARS-CoV-2 S prótein (1 µg/mL) var húðað yfir nótt í 96-brunnsplötum (100 µL/brunn) með 0. 05 M bíkarbónatbuffi. Eftir þvott með PBST (0,2 g KH2PO4, 2,9 g Na2HPO4·12H2O, 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 0,5 mL Tween-20, bætið vatni í 1000 mL) fimm sinnum var blokkunarlausn bætt við og ræktuð við 37 ◦C í 1 klst. Sermissýnin var þynnt og bætt við hverja brunn (100 µL/brunn). Eftir 1 klst. ræktun við 37 ◦C voru sýnin þvegin með PBST fimm sinnum. Aðalmótefninu [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, cat. #40591-T62, Sino Biological)] var bætt við og ræktað í 1 klst. sýnin voru þvegin fimm sinnum með PBST, fylgt eftir með 1 klst. ræktun við 37 ◦C með piparrótarperoxídasa-tengdu aukamótefni [geitur gegn kanínu IgG H&L (HRP) (1:10.000, cat. #ab6721, abcam)] og fimm þvo með PBST. Eftir að 3, 30, 5 og 50-tetrametýlbífenýlanhýdríði var bætt við í 5 mínútur var hvarfið stöðvað með 2 M brennisteinssýru. Ljósþéttleiki var mældur við 450 nm og 630 nm með ensímmerkingartæki (Molecular Devices, SpectraMax 190) og síðan settur á staðlaðan feril.

Kostir cistanche tubulosa-styrkja ónæmiskerfið

2.9. Cýtókínákvörðun 

Platan (cat. #T-k15048D-1, MSD) var þvegin þrisvar sinnum með 150 µL/holu þvottajafna og 50 µL tilbúnu sýni var bætt í hvern brunn. Síðan var platan innsigluð með límplötuþéttingu og ræktuð við stofuhita með hristingu í 2 klst. Því næst var platan þvegin þrisvar sinnum með 150 µL/holu þvottabuffi og 25 µL greiningarmótefnalausn var bætt við hvern brunn. Platan var lokuð aftur og ræktuð við stofuhita með hristingu í 2 klst. Því næst var platan þvegin þrisvar sinnum með að minnsta kosti 150 µL/brunn þvottajafna; 150 µL 2× Read Buffer T (MSD) var bætt við hvern brunn og platan var greind á MSD tæki.

2.10. Hlutleysandi mótefni

2.10.1. Gerviveiruhlutleysingarprófun

Hlutleysandi virkni músa í sermi var prófuð með blöðrumunnbólguveiru gerviveirukerfi (VSV). Serumið var óvirkt í vatnsbaði í {{0}},5 klst. við 56 ◦C, og síðan raðþynnt að tilskildu bili. HEK293 frumur voru húðaðar í 96-brunnsplötu. Þynnta sermi var blandað saman við 200 CCID50 (veiruskammtinn sem getur sýkt 50% af frumuræktinni)/100 µL af veirusviflausninni í hlutfallinu 1:1 og sett í CO2 útungunarvél (37 ± 1 ◦C) fyrir 2 klst. Næst var 100 µL af veiruviðhaldslausn sem innihélt 0,5% penicillín-streptomycin tvöfalt mótefni bætt við hvern brunn og hlutlausa blandan var sáð í 96-brunnsplötu sem innihélt frumur með 100 µL í hverri brunn, með tveimur endurteknum brunnum fyrir hverja þynningu. Á sama tíma var venjuleg frumustýring stillt og frumurnar ræktaðar í CO2 útungunarvél (37 ± 1 ◦C) í 96 klst. Síðan voru 200 CCID50/100 µL af veirulausn þynnt í 10-1~10-3. Frumuræktunarmiðlinum í 96-brunnsplötunni var hent, 150 µL af veiruviðhaldslausninni var bætt í hvern brunn og þynning veirulausnarinnar var sáð í styrkleikanum 10-1~{{33} } í brunna á 96-brunnsplötunni (50 µL í hverri brunn). Hver þynning var endurtekin í 8 holum; eðlileg frumustýring var stillt á sama tíma og fylgt eftir með ræktun í 96 klst. Breytingarnar á CPE frumu sáust undir öfugum smásjá. Hið eðlilega frumueftirlit ætti ekki að hafa frumubreytingar og jákvæða eftirlitið ætti að hafa CPE breytingar. Hlutleysisendapunktar (sermisþynningar umreiknaðar í logarithma) voru reiknaðir út með því að fylgjast með CPE. Seronekvæt/jákvæða viðmiðið var 1:12 sem jákvætt/neikvætt viðmið,<1:12 was negative, and ≥1:12 was positive. 

2.10.2. Lifandi hlutleysisgreining

Hlutleysandi virkni músa í sermi var metin með lifandi hlutleysingarprófi. Þynnta sermi var blandað saman við SARS-CoV-2 og ræktað við 37 ◦C í 1 klst. Blöndunni var bætt við 96-brunnsplötu til að smita Vero E6 frumurnar. Eftir 72- klst. ræktun við 37 ◦C, sáust frumudrepandi áhrif veirunnar (CPE) við ×40 stækkun og hlutleysingartítrinn (gagnkvæm 50% sermisþynningar sem þarf til að hlutleysa veirusýkingu) var reiknaður út. Ofangreindar aðgerðir voru allar framkvæmdar í líföryggisstigi 3 umhverfi.

2.11. Tölfræðigreining

Tölfræðilegar greiningar voru framkvæmdar með t-prófi með tveimur sýnum með SPSS 26. p-gildi Minna en eða jafnt og 0.05 voru talin marktæk. Miðlæg tilhneiging var mæld með geometrískum meðaltítra (GMT).

3. Úrslit

3.1. Uppbygging raðbrigða adenoveiru

Raðbrigða adenovirus shuttle plasmíðið pAdeno-CMV-S1 með réttri innsetningu var fengið; Uppbyggingarskýringarmynd hennar er sýnd á mynd 1. Raðbrigða adenoveiran innihélt HAdV-C5 erfðamengið sem vantaði E1/E3 svæðið. Skýringarmynd af raðbrigða adenóveiruferjunni sem fæst með skutluplasmíði og frumubeinagrindplasmíði í HEK293 frumum er sýnd á mynd 1.

3.2. Einkenni raðbrigða adenoveiru

Raðbrigðaplasmíðið sem innihélt markgenið var auðkennt með PCR (sjá mynd 2A til að fá niðurstöður úr hlauprafdrætti). Þetta var endurtekin tilraun. Grunnraðirnar voru MCMV-F ggtataagaggcgcgaccag og S1-R acaataagtagggactgggtc og raðgreining staðfesti að röðin var í samræmi við hönnunina. SARS-CoV-2 S1 tjáning í frumunum greindist með Western blotting (Mynd 2B) og óbeinni ónæmisflúrljómun (Mynd 2C). Hljómbandsliturinn (~75 kDa) var greindur með Western blotting og var í samræmi við væntanlega bandstöðu. Á umritunarstigi var in vitro tjáning S1 greind með PT-PCR. Niðurstöðurnar sýndu að tjáning S1 mRNA í HEK-293 frumum var marktækt meiri en í samanburðarhópnum.

Mynd 1. Smíði raðbrigða adenovirus bóluefnis og tilraunaáætlun. (A) pAdeno-CMV-S1 er raðbrigða adenovirus shuttle plasmíð sem inniheldur markgenið S1. pBHGlox∆E1,3Cre er adenovirus beinagrind plasmíð. pBHGlox∆E1,3Cre og pAdeno-CMV-S1 voru dregin út með QIAGEN plasmíð útdráttarbúnaði (Beijing North Yitao Trading Co., LTD., Peking, Kína). Einum degi fyrir transfæðingu voru HEK293 frumur settar í 25 cm2 frumuræktarflösku. Ræktunarmiðillinn var DMEM sem innihélt 5% FBS án sýklalyfja. Á öðrum degi voru 60–80% af frumunum valin og transfection lausnin bætt við frumurnar. Eftir 7 daga flutning voru frumurnar skafnar af, skilið í skilvindu, flotinu hent og frumurnar endurlífgaðar með PBS. Frumurnar voru frystar-þíðaðar ítrekað við -80 ◦C og 37 ◦C. Eftir skilvindu innihélt flotið aðal veirulausnina. Raðbrigða adenoveirustofninn var hreinsaður, magnaður og fengin eftir frekari vinnslu og nefndur Ad-S1. Bóluefnið var sprautað í vöðva í mýsnar til eftirfylgnirannsókna. (B) Tímakvarðinn á bólusetningu og blóðtöku.

3.3. Adenóveiru titli

Í þessari tilraun voru sex jákvæðar frumur að meðaltali reiknaðar út í fimm smásjársviðum og veiran í brunninum var þynnt 108 sinnum. Byggt á formúlunni sem lýst er í efnis- og aðferðahlutanum var adenoveiru-títrinn 4,74 × 1011 skellumyndandi einingar (pfu)/ml (mynd 2D).

3.4. Frumuónæmi eftir bólusetningu

Á prófunartímabilinu voru tölfræðilega marktækar breytingar á cýtókínum í sermi (p Minna en eða jafnt og 0.05), sem sýndu aðallega að styrkur Keratinocyte chemoattractant/human growth-controlled oncogene (KC/GRO) var lækkaði og styrkur IFN-, IL-10, IL-12p70, IL-1, IL-2, IL-4, IL{{10} } og TNF- hækkuðu en styrkur IL-6 var ekki marktækur breyttur (Mynd 3).

Mynd 2. Auðkenning raðbrigða HAdV-C5–SARS-CoV-2 S1 próteins og ákvörðun adenoveiru titer. (A) PCR uppgötvun raðbrigða plasmíðsins með markgeninu S1. (B) Western blot uppgötvun á SARS-CoV-2. HEK293 frumur með veldisvexti voru sýktar af SARS-CoV-2 í 48 klst, síðan var frumupróteinið dregið út og aðskilið með SDS-PAGE. SARS-CoV-2 tjáning var staðfest með Western blotting með geita-anti-kanínu IgG. (C) Ónæmisflúrljómunarsmásjá á HEK-293 frumum sýktar af Ad-S1 (grænt). Frumur voru mótlitaðar með 40, 6-diamidino- 2-fenýlindóli (DAPI) til að lita kjarnana. Skalastöng 1000 µm. (D) Plaque prófun var notuð til að mæla. Smámyndir sem sýna 10-5, 10-6, 10-7 og 10-8 þynningu (frá vinstri til hægri).

Mynd 3. Ad-S1 framkallaði breytt plasmaþéttni af tegund 1/2 cýtókínum, tegund 1 interferónum og öðrum cýtókínum. Niðurstöðurnar fundust með því að taka blóð úr músunum 7 dögum eftir fyrstu bólusetningu. Gögnin eru sett fram sem dreifingarmyndir fyrir kassa og horn. Hver hringur táknar einn einstakling. p-gildi voru reiknuð út með því að nota tveggja úrtak t-próf.

3.5. Greining á anti-SARS-CoV-2 S1 mótefnum eftir bólusetningu

ELISA leiddi í ljós að SARS-CoV-2-sértæk mótefni voru til staðar í músunum sem voru sprautaðar með fyrsta og öðru Ad-S1, en ekki þeim sem sprautað var með adenoveirukapsíðinu eða PBS lausninni (Ad/PBS) (Mynd 4A). IgG titrar upp á 1:210 og 1:212 greindust í Ad-S1-bólusettum músum tveimur vikum eftir fyrstu og aðra bólusetningu, í sömu röð. Þynningartítrinn 28 dögum eftir bólusetningu (D28, GMT 2297.4) var 6.1-falt hærri en við D14 (GMT 378.9).

Mynd 4. Ad-S1 framkallaði háa títra mótefna (A) og hlutleysingarvirkni (B, C) í músum. (A) ELISA á SARS-CoV-2-sérstakt sermi IgG frá Ad-S1-ónæmissmituðum músum. (B) Greining á gerviveiruvirkni sermi frá Ad-S1-ónæmismúsum. (C) Greining á hlutleysandi virkni sermis frá Ad-S1-ónæmismúsum

3.6. Hlutleysandi mótefnagreining

SARS-CoV-2 áskorun Vero E6 frumna gerði kleift að greina hlutleysandi virkni í bólusettu músasermiinu (Mynd 4B, C). D14 og D28 hlutleysingartítrar Ad-S1-ónæmisbundinna Vero E6 frumna gegn SARS-CoV{{10}} lifandi veiruáskorun in vitro voru 1:24,3 og 1:26,3, í sömu röð. Gerviveiruprófið gaf svipaðar niðurstöður og lifandi veiruprófið, með hlutleysingartítra allt að 1:28,1 og 1:29,6 við D14 og D28, í sömu röð. D28 gerviveiruhlutleysandi titrinn (GMT 769.0) var 2.7-falt hærri en D14 (GMT 283.7).

4. Umræður

We have been working to develop vaccines to stop the COVID-19 pandemic and its rapid spread. The hunt for an effective vaccination against SARS-CoV-2 continues and existing vaccine development strategies include whole virus particle vaccines, live attenuated virus vaccines, purified virus subunit vaccines, and genetic vaccines [13–17]. The epitopes on spike proteins detected in infected serum are highly antigenic, with the ability to induce a strong humoral immune response and neutralize antibodies in individuals infected with SARS-CoV-2 and recovered from COVID-19 [18,19]. The S protein appears to be an ideal target for vaccination against SARS-CoV-2 infection [20]. The S protein S1 subunit induced effective immunity against SARS-CoV-2 and protected against SARS-CoV-2 in animal models [21,22]. The SARS-CoV-2 truncated N protein has a better expression effect than the N protein [23]. Based on this, we selected the truncated S1 protein in this experiment. In other studies, more than 90% of the neutralization activity of the Moderna mRNA vaccine was caused by the RBD antibody, and the neutralization titer directly decreased from >1000 til<25 after the RBD antibody had been eliminated [24]. Higher levels of RBD-specific IgG were associated with increased serum neutralization [25]. Evidently, the S protein demonstrates a greater immune response to the RBD region, and the S1 protein containing RBD can induce neutralizing antibodies with a higher titer than the S protein [26]. Antigens delivered by adenovirus vectors induce strong cellular and humoral immunity after a single immunization, making them useful as an emergency prevention tool in a pandemic [27]. Adenovirus-based vaccine strategies are therefore an important part of the fight against SARS-CoV-2 infection.

Í þessari rannsókn smíðuðum við raðbrigða adenoveiru SARS-CoV-2 bóluefni sem innihélt SARS-CoV-2 S1 undireininguna og nefndum hana Ad-S1. Eins og CanSinoBIO, sem hefur verið samþykkt til markaðssetningar [28], notuðum við HAdV-C5 í þessu bóluefni. Adenóveira er mikið notað í raðbrigða genameðferð og sem bóluefnisferja. Hins vegar er sermisjákvæð hlutfall HAdV-C5 eins hátt og 75-80% í venjulegu þýði [29]. Þetta gefur til kynna að ónæmi fyrir geymslu gegn HAdV-C5 ferjurum dregur verulega úr ónæmi af völdum bóluefnis. ChAdOx1 nCoV-19, þróað við háskólann í Oxford í Bretlandi, notar simpansa adenóveiruferju sem aftur á móti hefur lægri sermisjákvæða tíðni í mönnum og þegar hann er jákvæður sýnir hann venjulega lægri mótefnatítra í sermi [30] . Þess vegna er hægt að kanna adenoveiruferjur sem geta forðast ónæmi sem fyrir er til að auka verndandi virkni adenovirus bóluefnisins. Í þessari rannsókn var sermisstaða músa fyrir og eftir ónæmisaðgerð ákvörðuð með ELISA og hlutleysunarprófum og gaf vísbendingar um ónæmi í húmor fyrir bóluefnisframbjóðendur. Sermi sem framleitt var eftir inndælingu bóluefnisins í vöðva í músum verndaði á áhrifaríkan hátt Vero E6 frumur gegn SARS-CoV-2 sýkingu in vitro (Mynd 4). Við fundum einnig sterkari ónæmissvörun og betri vernd í músunum eftir aðra bólusetningu (Mynd 4). Tilraunaniðurstöður okkar eru svipaðar almennum tilraunaniðurstöðum.

Þegar SARS-CoV-2 rannsóknir halda áfram, hafa nokkrar rannsóknir sýnt fram á að frumustormurinn sem fylgir SARS-CoV-2 sýkingu getur haft áhrif á T-frumuframleiðslu, sem gerir sjúklingum erfitt fyrir að viðhalda langtíma ónæmi gegn SARS-CoV-2 [31]. Þess vegna er nauðsynlegt að ákvarða hvort Ad-S1 geti framkallað T-frumumiðlað ónæmi í músum. Niðurstöður okkar sýndu fram á að IFN- og IL-12 styrkur jókst og IL-4 styrkur lækkaði í Ad-S1 hópnum, sem bendir til þess að bóluefnið hafi valdið lifun og vexti Th1 frumna í músunum. Seyting IL-12, IL-10 og TNF- frá Th1 frumunum jókst lítillega í tilraunahópnum. Þessar niðurstöður gáfu til kynna að Ad-S1 hafi í raun valdið Th1-hlutdrægri T-frumu svörun í músunum [32]. Aukið IL-5 benti til þess að Th2 frumur taka einnig þátt í ónæmissvöruninni og hafa ákveðin áhrif. Styrkur KC/GRO í tilraunahópnum minnkaði marktækt samanborið við PBS samanburðarhópinn, sem gæti hafa verið vegna minnkaðs daufkyrninga krabbameinslyfja sem bældi bólgusvörunina og gerði kleift að stjórna aukaverkunum bóluefnisins lítillega. Þetta væri gagnlegra fyrir ónæmisbælt fólk, eins og aldraða eða sjúklinga sem gangast undir krabbameinslyfjameðferð. Li M., o.fl. [29] þróaði bóluefni gegn kirtilveiru með því að nota Ad68 sem ferju. Niðurstöðurnar sýndu að in vivo hlutleysandi virkni SARS-CoV-2 var hægt að greina innan tveggja vikna eftir bólusetningu í vöðva á BALB/c músum og hélt síðan áfram að aukast og hlutleysandi mótefnatítur (PRNT ID50) náði 957,3 klukkan átta. vikur. Á sama tíma, í rannsókn Liu J., o.fl. [33], bóluefni með AdC6 og AdC68 sem ferjur voru þróuð; bæði bindandi og hlutleysandi mótefnasvörun eftir bólusetningu mynduðust 14 dögum eftir skammtinn, með IgG titli upp á 7108 (geometrísk meðaltítur, GMT; AdC6) og 5489 (GMT, AdC68). Hlutleysingartítrinn 50 (NT50) gerviveiruhlutleysunarprófsins var 125 (GMT, AdC6) og 67 (GMT, AdC68).

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Í þessari rannsókn voru mýs bólusettar með Ad-S1 með IgG títra 1:1010 og 1:122 sem greindust með ELISA tveimur vikum eftir fyrstu og aðra bólusetningu, í sömu röð. Þynningartítri ad-s1 var 378,9 (GMT) 14 dögum eftir sáningu og 2297,4 (GMT) 28 dögum eftir sáningu. Í hlutleysandi mótefnaprófinu sýndu Vero E6 frumur bólusettar með Ad-S1 1:24,3 og 1:26,3 hlutleysingu við D14 og D28 gegn lifandi SARS-CoV-2 veiruáskorun in vitro, í sömu röð. Hlutleysingartítrar gerviveiru við D14 og D28 voru 283,7 (GMT) og 769,0 (GMT), í sömu röð. Þannig var bóluefnið í þessari rannsókn skilvirkara með tilliti til ónæmissvörunar í músamódelinu.

Vegna takmarkaðra tilraunaaðstæðna gerðum við ekki ensímtengda ónæmissogblett (ELISpot) greiningu á milta ónæmisfrumum tilraunamúsanna. Þar að auki var ekki hægt að framkvæma árásarvarnartilraunir með SARS-CoV-2 á músum vegna takmarkana á líkamlegri verndarrannsóknarstofu. Hins vegar komumst við að því að bóluefnið hefði mikla virkni í músalíkönum og gæti verið notað sem kjörinn varabóluefnisstofn. Að auki ætti að kanna ónæmingargetu, öryggi og virkni væntanlegra SARS-CoV-2 bóluefnis umsækjenda í fleiri dýralíkönum (td kanínum, prímötum, þvottabjörnum, hundum), þar sem músalíkön geta ekki endurtekið að fullu ónæmisfræðilega menn. eiginleikar.

cistanche plöntuaukning ónæmiskerfi

5. Ályktanir

Gögnin sem fengust úr forklínískum rannsóknum okkar á bóluefninu gegn kirtilveiru sýndu að bóluefnið hefur nægilegt öryggi og virkni. Þess vegna gæti það verið efnilegt og framkvæmanlegt fyrirbyggjandi bóluefni gegn SARS-CoV-2 sýkingu.

Heimildir

1. Trougakos, IP; Stamatelopoulos, K.; Terpos, E.; Tsitsilonis, OE; Aivalioti, E.; Paraskevis, D.; Kastritis, E.; Pavlakis, GN; Dimopoulos, MA Innsýn í SARS-CoV-2 lífsferil, meinalífeðlisfræði og hagkvæma meðferð sem miðar að COVID-19 klínískum fylgikvillum. J. Biomed. Sci. 2021, 28, 9. [Krossvísun]

2. Pillay, TS gen mánaðarins: 2019-nCoV/SARS-CoV-2 nýja kransæðapróteinið. J. Clin. Pathol. 2020, 73, 366–369. [Krossvísun]

3. Sheinin, M.; Jeong, B.; Paidi, RK; Pahan, K. Aðhvarf lungnakrabbameins í músum með innri nefgjöf SARS-CoV-2 Spike S1. Krabbamein 2022, 14, 5648. [CrossRef]

4. Kadam, SB; Sukhramani, GS; Bishnoi, P.; Pable, AA; Barvkar, VT SARS-CoV-2, heimsfaraldur kransæðavírus: Sameinda- og byggingarinnsýn. J. Basic Microbiol. 2021, 61, 180–202. [Krossvísun]

5. Sternberg, A.; Naujokat, C. Uppbyggingareiginleikar kransæðavírus SARS-CoV-2 toppprótein: Markmið fyrir bólusetningu. Lífvísindi. 2020, 257, 118056. [CrossRef] [PubMed]

6. Veggir, AC; Tortorici, MA; Frenz, B.; Snijder, J.; Li, W.; Rey, FA; DiMaio, F.; Bosch, BJ; Veesler, D. Glycan skjöldur og þekjuhlíf á kórónavíruspróteini sem sést með kryo-rafeindasmásjá. Nat. Uppbygging. Mol. Biol. 2016, 23, 899–905. [CrossRef] [PubMed]

7. Wang, Y.; Wang, L.; Cao, H.; Liu, C. SARS-CoV-2 S1 er betri en RBD sem COVID-19 undireining bóluefnismótefnavaka. J. Med. Virol. 2021, 93, 892–898. [Krossvísun]

8. Theoharides, TC; Conti, P. Vertu meðvituð um SARS-CoV-2 toppprótein: Það er meira en sýnist. J. Biol. Reglugerð. Homeost. Umboðsmenn 2021, 35, 833–838. [CrossRef] [PubMed]

9. Guo, X.; Deng, Y.; Chen, H.; Lan, J.; Wang, W.; Zou, X.; Hung, T.; Lu, Z.; Tan, W. Kerfis- og slímhúðarónæmi í músum sem framkallað er með einni bólusetningu með bóluefnum sem byggjast á bakteríum úr mönnum af tegund 5 eða 41 með vírberjum sem bera toppprótein af kórónuveirunni í Mið-Austurlöndum öndunarfæraheilkenni. Ónæmisfræði 2015, 145, 476–484. [CrossRef] [PubMed]

10. Gao, J.; Mese, K.; Bunz, O.; Ehrhardt, A. Nýstárleg kirtilveirufræði í mönnum fyrir meðferðaraðferðir. FEBS Lett. 2019, 593, 3609–3622. [Krossvísun]

11. Xing, K.; Tu, XY; Liu, M.; Liang, ZW; Chen, JN; Li, JJ; Jiang, LG; Xing, FQ; Jiang, Y. Virkni og öryggi COVID-19 bóluefna: kerfisbundin úttekt. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi 2021, 23, 221–228. [Krossvísun]

12. Voysey, M.; Clemens, SAC; Madhi, SA; Weckx, LY; Folegatti, forsætisráðherra; Aley, PK; Angus, B.; Baillie, VL; Barnabas, SL; Bhorat, QE; o.fl. Öryggi og verkun ChAdOx1 nCoV-19 bóluefnisins (AZD1222) gegn SARS-CoV-2: Bráðabirgðagreining á fjórum slembuðum samanburðarrannsóknum í Brasilíu, Suður-Afríku og Bretlandi. Lancet 2021, 397, 99–111. [CrossRef] [PubMed]

13. Li, C.; Guo, Y.; Fang, Z.; Zhang, H.; Zhang, Y.; Chen, K. Greining á verndarvirkni samþykktra COVID-19 bóluefna gegn ýmsum stökkbreyttum. Framan. Immunol. 2022, 13, 804945. [CrossRef] [PubMed]

14. Tanriover, læknir; Gerðu ˘ganay, HL; Akova, M.; Güner, HR; Azap, A.; Akhan, S.; Köse, ¸S.; Erdinç, F.; Akalın, EH; Tabak, Ö.F.; o.fl. Verkun og öryggi óvirkjuðs SARS-CoV-2 bóluefnis úr heilum veirum (CoronaVac): Bráðabirgðaniðurstöður tvíblindrar, slembiraðaðrar, 3. stigs samanburðarrannsóknar með lyfleysu í Tyrklandi. Lancet 2021, 398, 213–222. [Krossvísun]

15. Xia, S.; Zhang, Y.; Wang, Y.; Wang, H.; Yang, Y.; Gao, GF; Tan, W.; Wu, G.; Xu, M.; Lou, Z. Öryggi og ónæmingargeta óvirkjuðs SARS-CoV-2 bóluefnis, BBIBP-CorV: Slembiraðað, tvíblind, lyfleysustýrð, 1/2 stigs rannsókn. Lancet Infect. Dis. 2021, 21, 39–51. [CrossRef] [PubMed]

16. Yang, S.; Li, Y.; Dai, L.; Wang, J.; Hann, P.; Li, C.; Fang, X.; Wang, C.; Zhao, X.; Huang, E.; o.fl. Öryggi og ónæmingargeta raðbrigða, endurtekinna tvíliða RBD-undireininga bóluefnis (ZF2001) gegn COVID-19 hjá fullorðnum: Tvær slembiraðaðar, tvíblindar, lyfleysu-stýrðar, 1. og 2. stigs rannsóknir. Lancet Infect. Dis. 2021, 21, 1107–1119. [Krossvísun]

17. Mallapaty, S. Indland DNA COVID bóluefnið er fyrst í heiminum - fleiri eru að koma. Náttúran 2021, 597, 161–162. [Krossvísun]

18. Grifoni, A.; Weiskopf, D.; Ramirez, SI; Mateus, J.; Dan, JM; Moderbacher, CR; Rawlings, SA; Sutherland, A.; Premkumar, L.; Jadi, RS; o.fl. Markmið T-frumuviðbragða við SARS-CoV-2 kórónaveirunni hjá mönnum með COVID-19 sjúkdóma og óútsettum einstaklingum. Cell 2020, 181, 1489–1501.e1415. [Krossvísun]

19. Cao, Y.; Su, B.; Guo, X.; Sun, W.; Deng, Y.; Bao, L.; Zhu, Q.; Zhang, X.; Zheng, Y.; Geng, C.; o.fl. Öflug hlutleysandi mótefni gegn SARS-CoV-2 auðkennd með einfrumu raðgreiningu með mikilli afköstum B-frumna sjúklinga sem eru í bata. Cell 2020, 182, 73–84.e16. [Krossvísun]

20. Amanat, F.; Krammer, F. SARS-CoV-2 bóluefni: stöðuskýrsla. Ónæmi 2020, 52, 583–589. [Krossvísun]

21. Li, Y.; Bi, Y.; Xiao, H.; Yao, Y.; Liu, X.; Hu, Z.; Duan, J.; Yang, Y.; Li, Z.; Li, Y.; o.fl. Ný samsetning DNA og próteina COVID-19 bóluefni veitir fulla vörn gegn SARS-CoV-2 í rhesus macaques. Koma fram. Örverur smitast. 2021, 10, 342–355. [Krossvísun]

22. Du, L.; Hæ.; Zhou, Y.; Liu, S.; Zheng, BJ; Jiang, S. Gaddaprótein SARS-CoV – markmið fyrir bóluefni og meðferðarþróun. Nat. Séra Microbiol. 2009, 7, 226–236. [CrossRef] [PubMed]

23. Yue, L.; Cao, H.; Xie, T.; Long, R.; Li, H.; Yang, T.; Yan, M.; Xie, Z. N-endalega stytt nucleocapsid prótein af SARS-CoV-2 sem betra sermisfræðilegt merki en heilt nucleocapsíð prótein við mat á ónæmingargetu óvirkts SARS-CoV-2. J. Med. Virol. 2021, 93, 1732–1738. [CrossRef] [PubMed]

24. Greaney, AJ; Loes, AN; Gentle, LE; Crawford, KHD; Starr, TN; Malone, KD; Chu, HY; Bloom, JD SARS-CoV-2 mRNA-1273 bóluefnið kallar fram meiri hlutleysingu sem miðar að RBD en með víðtækari mótefnabindingu innan RBD. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Mantus, G.; Nyhoff, LE; Kauffman, RC; Edara, VV; Lai, L.; Floyd, K.; Shi, PY; Menachery, VD; Edupuganti, S.; Scherer, EM; o.fl. Mat á frumu- og sermisviðbrögðum við bráðri SARS-CoV-2 sýkingu sýnir fram á hagnýt mikilvægi viðtakabindandi léns. J. Immunol. 2021, 206, 2605–2613. [Krossvísun]

26. Hann, Y.; Zhou, Y.; Liu, S.; Kou, Z.; Li, W.; Farzan, M.; Jiang, S. Viðtakabindandi svæði SARS-CoV topppróteins framkallar mjög öflug hlutleysandi mótefni: Áhrif á þróun undireiningabóluefnis. Biochem. Lífeðlisfræði. Res. Samfélag. 2004, 324, 773–781. [Krossvísun]

27. Deng, S.; Liang, H.; Chen, P.; Li, Y.; Li, Z.; Fan, S.; Wu, K.; Li, X.; Chen, W.; Qin, Y.; o.fl. Þróun og notkun veirubóluefnis á meðan COVID-19 heimsfaraldurinn stendur yfir. Örverur 2022, 10, 1450. [CrossRef]

28. Zhu, FC; Guan, XH; Li, YH; Huang, JY; Jiang, T.; Hou, LH; Li, JX; Yang, BF; Wang, L.; Wang, WJ; o.fl. Ónæmingargeta og öryggi raðbrigða adenovirus tegundar-5-vectored COVID-19 bóluefnis hjá heilbrigðum fullorðnum 18 ára eða eldri: Slembiraðað, tvíblind, lyfleysu-stýrð, 2. stigs rannsókn. Lancet 2020, 396, 479–488. [Krossvísun]

29. Li, M.; Guo, J.; Lu, S.; Zhou, R.; Shi, H.; Shi, X.; Cheng, L.; Liang, Q.; Liu, H.; Wang, P.; o.fl. Einskammtabólusetning með bóluefni sem byggir á simpansa adenoveiru veldur viðvarandi og verndandi ónæmi gegn SARS-CoV-2 sýkingu. Framan. Immunol. 2021, 12, 697074. [Krossvísun]

30. Guo, J.; Mondal, M.; Zhou, D. Þróun nýrra bóluefnisferja: adenóveiruferjur simpansa. Humm. Bóluefni Immunother. 2018, 14, 1679–1685. [Krossvísun]

31. Kaneko, N.; Kuo, HH; Boucau, J.; Bóndi, JR; Allard-Chamard, H.; Mahajan, VS; Piechocka-Trocha, A.; Lefteri, K.; Osborn, M.; Bals, J.; o.fl. Tap á Bcl-6-Tjáningum T eggbúshjálparfrumna og kímstöðva í COVID-19. Cell 2020, 183, 143–157.e113. [CrossRef] [PubMed]

32. Lexberg, MH; Taubner, A.; Albrecht, I.; Lepenies, I.; Richter, A.; Kamradt, T.; Radbruch, A.; Chang, HD IFN- og IL-12 sameinast til að umbreyta in vivo mynduðu Th17 í Th1/Th17 frumur. Eur. J. Immunol. 2010, 40, 3017–3027. [CrossRef] [PubMed]

33. Liu, J.; Xu, K.; Xing, M.; Zhuo, Y.; Guo, J.; Du, M.; Wang, Q.; Einhver.; Li, J.; Gao, P.; o.fl. Heterologous prime-boost ónæmisaðgerðir með simpansa adenoviral ferjurum kalla fram öflugt og verndandi ónæmi gegn SARS-CoV-2 sýkingu. Cell Discoverv. 2021, 7, 123. [CrossRef] [PubMed]