Part 1 Acteoside bælar RANKL-miðlaða beinþynningu með því að hindra C-Fos örvun og NF-kB feril og draga úr ROS framleiðslu

Hluti 1 Hvernig stuðla akteósíð beinvöxt?

Fyrir frekari upplýsingar:ali.ma@wecistanche.com

Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook2, Jeong-Chae Lee2,3* 1 Research Institute of Clinical Medicine Chonbuk National University, Biomedical Research Institute of Chonbuk National University Sjúkrahús, Jeonju, Chonbuk, Suður-Kórea, 2 tannréttingadeild, Institute of Oral Biosciences og School of Dentistry, Chonbuk National University, Jeonju, Chonbuk, Suður-Kóreu, 3 Department of Bioactive Material Sciences, Research Center of Bioactive Materials, Chonbuk National University, Jeonju, Chonbuk, Suður-Kóreu

Ágrip

Fjölmargar rannsóknir hafa greint frá því að bólgueyðandi cýtókín séu mikilvægir miðlarar fyrir beinþynningarmyndun og valda þar með of mikilli beinupptöku og beinþynningu.Akteósíð, aðal virka efnasambandið í Rehmannia glutinosa, sem er mikið notað í hefðbundinni austurlenskri læknisfræði, hefur bólgueyðandi og andoxunarefni. Í þessari rannsókn komumst við að því að CTE hliðin hamlaði verulega aðgreiningu og myndun beinmergs úr beinmergsátfrumum (BMM) og RAW264.7 átfrumum sem örvaðir voru af viðtakavirkjanum kjarnaþáttar-kappaB (NF-kB) bindil (RANKL). Acteoside-meðhöndlun kom einnig í veg fyrir beinuppsog þroskaðra beinþynningar á skammtaháðan hátt. Acteoside (10 mM) veikt RANKL-örvuð virkjun p38 kínasa, utanfrumumerkjastýrðra kínasa og c-Jun N-enda kínasa, og bældi einnig NF-kB virkjun með því að hindra fosfórun á p65 undireiningunni og hemlinum kBa. Að auki, RANKL-miðluð aukning á tjáningu c-Fos og kjarnaþáttar virkjaðra T-frumna, umfrymis 1 (NFATc1), og á framleiðslu æxlisdrepsþáttar-a, interleukin (IL)-1b , og IL-6 voru greinilega hindraðir með akteósíðformeðferð. Ennfremur minnkaði akteósíð til inntöku af völdum eggjastokkauppnáms beinataps og bólgueyðandi cýtókínframleiðslu til að stjórna magni. Gögn okkar benda til þessakteósíðhamlar aðgreiningu og þroska beinþynna frá forverum beinþynningar með því að bæla RANKL-framkallaða virkjun á mítógenvirkjum próteinkínasa og umritunarþáttum eins og NF-kB, c-Fos og NFATc1. Samanlagt benda þessar niðurstöður til þess aðakteósíðgetur virkað sem uppsogslyf til að draga úr beinatapi með því að hindra beinþynningarvirkjun.

Fyrir frekari upplýsingar vinsamlega hafðu samband við:ali.ma@wecistanche.com

Smelltu til að Cistanche effects vörur

Kynning

Bein eru stöðugt endurgerð með jafnvægi á beinþynninga- og beinhimnuvirkni [1]. Osteoclastar myndast úr blóðmyndandi forverafrumum af einfrumu/átfrumuætt, en beinfrumur eru af mesenchymal ætterni [2]. Óeðlileg virkjun beinþynningar eða minnkuð beinmyndun getur truflað jafnvægi í beinum og valdið sjúkdómum eins og beinþynningu, liðagigt og beinakrabbameini [3,4]. Beinþynning er algengur beinsjúkdómur sem leiðir til aukinnar hættu á beinbrotum. Algengasta form beinþynningar er af völdum estrógenskorts hjá konum á tíðahvörf. Lyf eins og barksterar og flogaveikilyf geta einnig valdið ójafnvægi milli beinaupptöku og myndunar, sem getur leitt til beinþynningar [5]. Margir and-uppsogshemlar, þar á meðal bisfosfónöt, kalsítónín, estrógen og sértækir estrógenviðtakastýringar, hafa verið notaðir til að meðhöndla beinþynningu. Þessir hemlar viðhalda beinmassa með því að hindra beinþynningarstarfsemi [6]. Uppbótarmeðferð með estrógeni er vinsælasta meðferðin til að koma í veg fyrir og meðhöndla beinþynningu eftir tíðahvörf. Hins vegar getur langtíma estrógenuppbótarmeðferð aukið hættuna á legslímu- og brjóstakrabbameini. Þess vegna hafa margir rannsakendur einbeitt kröftum sínum að því að þróa nýtt uppsogslyf sem hefur ekki aukaverkanir [7-10]. Vegna þess að beinþynningar virka við beinupptöku, hefur sérstaklega hamlandi beinþynningar verið talið aðalmarkmiðið í fjölmörgum rannsóknum. Beinfrumur eru fjölkjarna risafrumur sem myndaðar eru af einkjarna forverum einkjarna/átfrumnafjölskyldunnar með raðfjölgun, aðgreiningu og samruna blóðmyndandi forverafrumna [11]. Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) og viðtakavirkjun kjarnaþáttar (NF)-kB (RANK) bindill (RANKL) eru nauðsynlegir þættir fyrir aðgreining beinþynninga[12]. Að auki stuðla nokkur bólgueyðandi frumudrep, eins og æxlisdrep (TNF) og interleukin (IL)-1b, að beinþynningarmyndun með því að stilla örvun RANKL, osteoprotegerins og M-CSF [7,13]. RANKL binding við frumuyfirborð RANK viðtaka leiðir til RANKL/RANK/TNFR tengdra þátta (TRAF) fléttur sem virkja í röð NF-kB og mítógenvirkjaða próteinkínasa (MAPK), þar á meðal c-Jun N-enda kínasa (JNK), p38 kínasa og utanfrumumerkjatengdur kínasa (ERK) [14]. Þessi virkjun gegnir lykilhlutverki við að miðla aðgreiningu, virkjun og lifun beinþynninga. RANKL virkjar einnig tjáningu umritunarþátta eins og kjarnaþáttar virkjaðra T-frumna, umfrymis 1 (NFATc1) og-Fos, sem eru nauðsynlegir fyrir þróun beinþynningar [ 7,9]. Þess vegna er RANKL merking talin aðalmarkmið uppsogslyfja sem bæla beinþynningarvirkjun og beinatapi.

Akteósíðer aðal virka efnasambandið í Rehmannia glutinosa, sem er mikið notað í hefðbundnum austurlenskum lækningum [15,16]. Acteoside er sterkt andoxunarefni og hefur eiturverkanir á lifur, bólgueyðandi og sýklalyfjavirkni [17-20]. Við fundum það áðurakteósíðdregur úr týrósínasavirkni og melanín-lífmyndun með því að stjórna ERK-boðum [21], verndar gegn hvarfgjörn súrefnistegundum (ROS)-miðluðum tannholdsskemmdum [22] og bælir sveppaeitur-miðluðum frumuskemmdum [23]. Þessi áhrif eru nátengdacteoside'sgetu til að fjarlægja ROS og stjórna MAPK-miðluðum merkjum. Sérstaklega er lagt til að ROS miðli RANKL-framkallaða merkjaleiðir og frumuviðburði í beinþynningum. Formeðferð með andoxunarefnum hindraði RANKL-framkallaða virkjun NF-kB, ERK og IkBa og bæla þannig beinþekjumyndun [24]. Þessar niðurstöður bentu eindregið til þess að auk bólgueyðandi virkni og andoxunarvirkni sé mikilvægt fyrir uppsogsefni, þ.e.akteósíðgetur bælt beinþynningu af völdum RANKL.

Í þessari rannsókn könnuðum við hvortakteósíðhefur lækningaleg áhrif á beinmissi. Við skoðuðum áhrifin afakteósíðum beinþynningaraðgreiningu og beinupptöku og tengda frumuferli með því að nota in vitro og in vivo tilraunakerfi.

Efni og aðferðir

Siðferðisyfirlýsing

Dýraumönnun og notkunarvenjur voru samþykktar af Chonbuk National háskólanefndinni um siðfræði í umönnun og notkun tilraunadýra (leyfisnr. CBU 2010-0007). Allar tilraunir í þessari rannsókn voru gerðar samkvæmt leiðbeiningum dýraverndar- og notkunarnefndar Háskólans.

Mýs, efni og varningur til rannsóknarstofu

Fjögurra vikna gamlar kvenkyns ICR mýs voru keyptar frá OrientBio Inc. (Seoul, Kóreu) og geymdar við 2261uC og 5565 prósent raka á 12 klst ljós/myrkri hringrás með ókeypis aðgangi að mat og vatni. Akteósíð (3,4-díhýdroxý-b-fenetýl-Oa-ramnópýranósa-Sýl-(1R3)-4-O-kaffóýl-bD-glúkópýranósíð; C29H36O15) (mynd S1) var einangrað úr laufum á Rehmannia glutinosa. Acteoside var leyst upp í fosfat-bufferðri saltvatni (PBS) fyrir notkun. RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 og M-CSF voru keypt frá rannsóknar- og þróunarkerfum (Minneapolis, MN, Bandaríkjunum). Mótefni sem eru sértæk fyrir c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa og b-actin voru fengin frá Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, Bandaríkjunum ). Mótefni fyrir p-p38 og p38 voru keypt frá Cell Signaling Technology (Danvers, MA, Bandaríkjunum). CalciumAssay og Osteocalcin (OC) EIA Kit var keypt frá BioAssay Systems (Hayward, CA, Bandaríkjunum) og Biomedical Technologies (Stoughton, MA, Bandaríkjunum), í sömu röð, til að ákvarða lífefnafræðilegar breytur í sermi. Músartrat-ónæmur sýrufosfatasa (TRAP) prófunarbúnaður (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, USA) var einnig notað til að mæla TRAP5b þéttni í sermi. Nema annað sé tekið fram, voru viðbótarefni fengin frá Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, Bandaríkjunum), og varningur á rannsóknarstofu var frá SPL Life Sciences (Pochun, Suður-Kóreu).

Frumumenning

Beinmergsfrumur voru fengnar úr sköflungum og lærlegg 6 vikna gamalla kvenkyns ICR músa samkvæmt aðferðum sem lýst var áður [25]. Beinmergssviflausnin var ræktuð í 100-mm ræktunarskál í viðurvist 50 ng/ml M-CSF. Eftir 3 daga voru viðloðandi frumur notaðar sem beinmergsmakrófagar (BMM) til að framkalla beinþynningaraðgreiningu. Sumar beinmergsfrumur voru einnig ræktaðar í 48 klst án M-CSF og viðloðandi frumur voru ræktaðar í beinmergsaðgreiningarmiðli, eins og lýst er annars staðar [25]. RAW264.7 átfrumnafrumur voru ræktaðar í Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) sem bætt var við 10 prósent nautgripafóstursermi (FBS), 2 mM L-glútamíni og sýklalyfjum. Þessar frumur voru notaðar sem hliðstæða frumulínu fyrir BMM til að kanna áhrif akteósíðs á beinþynningarmyndun.

Osteoclastic aðgreining og TRAP litun

BMM var formeðhöndluð með ýmsum styrkjum (0–50 mM) af akteósíði í 2 klst. áður en þau voru örvuð með 100 ng/ml RANKL. Ræktunarmiðlum var skipt út fyrir ferskt miðil á dögum 2 og 5. Eftir 7 daga ræktun voru ræktunin fest í 4 prósent PBS-bufferuðu paraformaldehýði og lituð með TRAP með Sigma Aldrich setti samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. TRAP-jákvæðar frumur voru taldar með ljóssmásjá og frumur sem innihéldu 3 eða fleiri kjarna voru taldar vera beinfrumur.RAW 264.7 frumur voru einnig útsettar fyrir 100 ng/ml RANKL eftir formeðferð með acteoside í 2 klst, og eftir 7 daga ræktun, frumurnar voru unnar fyrir TRAP litun.

Mæling á lífvænleika frumna

Lífvænleiki frumna var ákvarðaður með því að nota vatnsleysanlegt tetrasólíumsalt (WST)-8 hvarfefni. Í stuttu máli, BMM eða RAW264.7 frumur sem ræktaðar voru í vaxtaræti sem innihélt 10 prósent FBS og sýklalyf voru meðhöndluð með 10 mM akteósíði eða fenólsambandi eins og quercetin, lúteólín, apigenin eða epigallocatechin-3-gallate (EGCG). WST-8 hvarfefni var bætt við ræktunina eftir 48 klst. Eftir ræktun í 4 klst til viðbótar var WST -8-sértæk gleypni mæld við 450 nm með því að nota örplötulesara (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, Bandaríkjunum).

Beinupptökupróf

BMM (16105 frumur/ml) voru stöðvaðar í a-MEM sem innihélt 50 ng/ml M-CSF og 100 ng/ml RANKL, síðan skipt yfir 24-brunn plötu sem var húðuð með kalsíumfosfat nanókristöllum (OAAS{{6} }; Osteoclast Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, Suður-Kóreu) með þéttleika 26104 frumur/cm2 með og án akteósíðs. Eftir ræktun í 7 daga voru frumurnar fjarlægðar af plötunum með 5% natríumhýpóklóríti og upplýsingarnar voru skoðaðar í ljóssmásjá. Uppsogað svæði var einnig mælt með myndgreiningartæki og gefið upp sem hundraðshluti af viðmiðunargildi.

Western Blot greining

Heil próteinlýsöt voru útbúin í lýsisbuffi eins og lýst er annars staðar [26]. Cytosolic og kjarnaprótein voru útbúin eins og áður hefur verið lýst [25]. Jafnt magn af próteinþykkni var aðskilið með 12-15 prósent SDS-PAGE og þeytt á pólývínýldíflúoríð himnur. Blettirnir voru rannsakaðir með frummótefnum yfir nótt við 4uC fyrir ræktun með öðru mótefni í blokkunarbuffi í 1 klst. Blettirnir voru framkallaðir með aukinni efnaljómun (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, Bretlandi) og útsett fyrir röntgenfilmu (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, Bandaríkjunum).

MAPK virknigreining

Frumur voru formeðhöndlaðar með akteósíði í 2 klst og síðan örvaðar með RANKL í -30 mín. MAPK virkni var ákvörðuð með því að nota ónæmismælingarsett, eins og p-p38kinase prófunarbúnaðinn (Assay Designs, Inc., MI, USA), p-ERK ensímprófunarbúnaðinn (Assay Designs) og p-SAPK/JNK samloku ELISA Kit ( Cell Signaling Technology, MA, Bandaríkjunum). Allar aðferðir fóru eftir leiðbeiningum framleiðanda og gleypni var mæld með örplötulesara.

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

DNA-próteinbindingahvörf voru framkvæmd í 30 mínútur við stofuhita, með 10–15 mg próteini í 20 ml jafnalausn sem innihélt 1 mg/ml BSA, 0,5 mg/ml pólý (dI-dC), 5 prósent glýseróls ,1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mm NaCl, 30,000 CPM af [a-32P] dCTP-merktum fákjörnum og Klenow brotið af DNA pólýmerasa. Sýnin voru aðskilin á 6 prósent pólýakrýlamíð hlaupum, sem voru þurrkuð og útsett fyrir röntgenfilmu (Eastman Kodak Co.) í 12–24 klst við 270uC. Fákjarna frumur raðir sértækar fyrir NF-var 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTGGCC TGG A-39 og 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGGACC GGA CCT GGA A{{30 }}.

NF-kB Luciferasa próf

RAW264.7 átfrumur í 24-brunnsplötum voru umbreyttir með 0,8 mg kB-luciferasa reporter vektor með því að nota 2 ml af Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, Bandaríkjunum) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. 24 klst. eftir transfæðingu voru frumurnar örvaðar með RANKL í nærveru og fjarveru akteósíðs í 24 klst. Frumur voru endursviflausnar í 100 ml skýrslulýsubuffi (Promega, Madison, WI, USA). Jafnt magn af próteinsýnum var sett í 96-brunn örplötur og blandað við lúsiferasa hvarfefni. Lýsun var mæld með því að nota örplötuljósamæli (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Þýskalandi). Í þessari tilraun var gegndræpi NF-B hemla peptíð (BIOMOL, Butler Pike, PA, USA) notað sem jákvæður kB hemill.

Mæling á cýtókínum

BMM eða RAW264.7 frumur voru örvaðar með RANKL í viðurvistakteósíðí 24-brunnsræktunarplötum. Eftir 48 klst. ræktun var ræktunarfrumvökva safnað og metið með ELISA með TNF-a-, IL-1b- og IL-6-sértækum OptEIATM settum samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.

Rauntíma öfug umritun-pólýmerasa keðjuverkun (RT-PCR)

MRNA tjáning beinþynningarmerkja, eins og c-Fos, NFATc1 og TNF-a, var ákvörðuð með rauntíma RT-PCR. Í stuttu máli var heildar-RNA dregið úr átfrumum með Trizolreagent samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda (Invitrogen). cDNA var búið til með 1 mg af heildar-RNA með því að nota SuperScriptReverse Transcripatase II og primers (Invitrogen). Power SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) var notað til að greina uppsöfnun PCR vöru meðan á hjólreiðum stóð með ABI 7500 raðgreiningarkerfinu (Applied framkvæmt með því að nota fjörutíu 3- þrepa afeitrun við 95uC í 15 sekúndur, glæðing við 60uC í 1 sek og framlenging við 72uC í 30 sek. Öll PCR viðbrögð voru framkvæmd að minnsta kosti í þríriti og tjáningarmagnið var staðlað við heimilisgeniðHPRT í sama hvarfi. Þessi rannsókn notaði sömu grunnröðina sem lýst er annars staðar [7].

Mæling á innanfrumu ROS

Stofnlausn af 29,79-díklórdíhýdróflúoresceíndíasetati(DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, Þýskalandi) var útbúin í DMSO og geymd við 220uC í myrkri. Í stuttu máli voru BMM (106 frumur/ml í 6-brunnsplötum) ræktaðar með 50 ng/MLM-CSF í 24 klst. ng/mlRANKL. Eftir 1 klst af samræktun voru þessar frumur síðan ræktaðar með 25 mM DCFH-DA í 30 mín. Græna flúrljómun 29,79-díklórflúorljómunar (DCF) var skráð við 515 nm (FL 1) með því að nota FACS VantageH kerfi (Becton-Dickinson, San Jose, CA, Bandaríkin) og 10,000 atburðir voru taldir á hvert sýni

Örvun beinþynningar af völdum eggjastokkanáms

Kvenkyns ICR mýs (6 vikna gamlar) voru notaðar í þessa rannsókn. Mýs fengu sýndaraðgerð (Sham, n=10) eða skurðaðgerð á eggjastokkum (OVX, n=20) í svæfingu. Viku eftir aðgerð var OVX músunum skipt af handahófi í 2 hópa með 10 músum hver: tvíhliða OVX og tvíhliða OVX bætt við 200 ml PBS sem innihélt 1 mM akteósíð til inntöku (AC hópur). Munnlegakteósíðvar gefið einu sinni á 3 daga fresti í 8 vikur eftir aðgerð og sama magn af PBS var gefið Sham og OVX hópunum. Eftir 1 dag frá síðustu gjöf var músum fórnað og síðan voru lífefnafræðilegar breytur í sermi og 3-víddarbeinbygging greind.

Ákvörðun á lífefnafræðilegum breytum í sermi

Blóðsýnum var safnað með hjartastungu og sermi var safnað með skilvindu. Sermissýni voru geymd við 280uC til greiningar á lífefnafræðilegum breytum. Sermisþéttni IL-1b og IL-6 var metið með því að nota ELISA settið eins og lýst er hér að ofan, en virkni alkalísks fosfatasa (ALP) var ákvörðuð með lífefnafræðilegri litamælingu sem mælir magn p -nítrófenól framleitt úr p-nítrófenólfosfat hvarfefni, eins og lýst er annars staðar [27]. Til að áætla lífmerki beinmyndunar og uppsogs voru OC, kalsíum og TRAP5b í sermi einnig ákvarðað samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.

Greining á beinbyggingu og formfræðilegum breytum

Lærlegg músa (Sham, OVX og AC hópar) voru krufin og fyllt með lífeðlisfræðilegu saltvatni fyrir vélrænni prófun. Vélrænni styrkur lærleggsins var mældur eins og lýst er annars staðar [28]. Brotálagið var skráð sem hámarkskraftur í njútonum á þeim stað sem miðskaft hægra lærleggsins brotnaði. Að auki var ljós lærlegg hvers dýrs vefjafræðilega greint með því að nota örtölvusneiðmynda (micro-CT) kerfi (SkyScan 1076 microfocus röntgenkerfi, Kontich, Belgíu). Í stuttu máli voru beinin í 4% formaldehýðgeymslu þurrkuð yfirborðslega á pappírsvef áður en þeim var pakkað inn í plastfilmu eða parafilmu, til að koma í veg fyrir þurrkun við skönnun. Hvert plastvafið bein var sett í plast/pólýstýren froðu rör sem voru fest lóðrétt lárétt í 1076 skanna sýnishólfinu fyrir ör-CT myndgreiningu. Skönnun var framkvæmd með 100 kV spennu og 140 mA straumi með 35 mm upplausn. Þrívíddarlíkön af beinabeinum lærleggsins voru endurgerð með SkyScan CT Analyzer útgáfu 1.11. Byggingarfæribreytur eins og beinþéttni í æðabein (BMD, g/cm3), prósenta beinrúmmál (beinrúmmál (BV)/vefjarrúmmál (TV), prósent ), þykkt (Tb.Th, mm), aðskilnaður (Tb.Sp) , mm), og fjöldi (Tb.N, 1/mm) var síðan mældur.

Osteogenic aðgreining og steinefnagreining

Beinmergsfrumur ræktaðar í 6-brunn ræktunarplötum voru meðhöndlaðar með DAG (10 nM dexametasóni, 50 mM askorbínsýru og 20 mM b-glýserófosfati) í viðurvist 10 mMakteósíð. Eftir 2 vikna aðgreiningu voru frumurnar festar með ísköldu 70 prósentum (rúmmál/rúmmál) etanóli í 1 klst og litaðar með 0.2 prósent alizarin red Sin eimuðu vatni í 30 mínútur í herberginu hitastig. Eftir að frumurnar voru aflitaðar og loftþurrkaðar voru frumuræktarplöturnar metnar með ljóssmásjá með því að nota öfuga smásjá (Nikon TS100, Japan). Til að mæla magn rauðs litarefnis var liturinn skolaður út með 10 prósent asetýlpýridíníum klóríði með því að hrista í 20 mínútur og gleypni var mæld við 560 nm. Magn kalsíums sem sett var í frumulögin var einnig mælt með því að nota Calcium Kit (Wako Chemical Inc. Osaka, Japan) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Að auki var tjáning beinsértækra mRNA-merkja, eins og run-tengds umritunarþáttar-2(Runx2), osterix, beinsíalóprótein (BSP) og OC, ákvörðuð með rauntíma RT-PCR. Oligonucleotide primers þessara merkja voru hannaðir með vörustærðum minni en 200 bp með því að nota PrimerExpress Software 3.0 (Applied Biosystems) eins og lýst er annars staðar[27].

Tölfræðigreining

Nema annað sé tekið fram eru öll gögn gefin upp sem meðal6 staðalfrávik (SD) af 3 eða fleiri sjálfstæðum tilraunum. Einstefnu ANOVA var notuð fyrir margvíslegan samanburð með SPSS útgáfu 12.0 hugbúnaði. P-gildi,0.05 var talið tölfræðilega marktækt.

Niðurstöður

Akteósíð hamlar myndun osteoclasts með Macrophagesin á skammtaháðan hátt

Til að sannreyna áhrif akteósíðs á aðgreining BMM í beinfrumur voru frumurnar ræktaðar með ýmsum styrkjum (0–20 mM) af akteósíði í 7 daga í viðurvist 50 ng/ml M-CSF og 100 ng/ml RANKL. Acteósíð minnkaði fjölda beinþynningar á skammtaháðan hátt. Þegar frumurnar voru formeðhöndlaðar með 10 mM akteósíði í 2 klst, minnkaði beinfrumufjöldi um 43 prósent samanborið við frumur sem bættar voru við M-CSF og RANKL (mynd 1A). Mynd 1B sýnir RANKL-miðlaða beinþynningaraðgreiningu og hömlun hennar með samsettri meðferð með akteósíði. Í samræmi við þessa niðurstöðu dró akteósíð formeðferð úr RANKL-örvuðum aðgreiningu RAW264.7 frumna og beinþynningarmyndun (Mynd 1C og D). Þegar and-beinþynningargeta akteósíðs á BMMs var borið saman við and-beinþynningargetu nokkurra fenólefnasambanda við sama styrk (10 mM), sýndi lúteólín hæsta virkni (Mynd 2A). Hins vegar minnkaði lúteólín, quercetin eða apigenin sjálft lífvænleika frumanna (mynd 2B). Öll efnasamböndin hindruðu beinþynningaraðgreiningu með RAW264.7 átfrumum með eftirfarandi hlutfallslega virkni: lúteólín. quercetin=apigenin .EGCG=akteósíð (mynd 2C). Lúteólín, quercetin eða apigenin sjálft sýndu einnig minnkaða lífvænleika frumanna (mynd 2D). Aftur á móti olli quercetin meðferð aðeins marktækri minnkun á lífvænleika í bæði BMM og RAW264.7 frumum, þegar þessar frumur voru útsettar fyrir 10 mM af hverju efnasambandi í 2 daga með 50 ng/ml M-CSF, 100 ng/ml RANKL, eða bæði (gögn ekki sýnd). Þegar styrkur þessara efnasambanda er nauðsynlegur til að hindra 50 prósent af

beinþynningarmyndun í BMM (IC50) var reiknuð út með því að nota þéttni-virkniferil, IC50 afakteósíð, quercetin, luteolin, apigenin og EGCG voru 5,1, 2,3, 2,6, 4,8 og 6,6 mM, í sömu röð (Mynd 2E). Þessi niðurstaða var svipuð og þegar RAW264.7 átfrumur voru skoðaðir. Þessar upplýsingar bentu til þess að lúteólín og quercetin hefðu virkni gegn litningavirkni meiri en akteósíð. Aftur á móti hafði quercetin við IC50 einnig væg eituráhrif á frumurnar (gögn ekki sýnd).

Acteoside hindrar beinupptöku af átfrumum

Acteoside kom einnig í veg fyrir RANKL-miðlaða beinupptöku á skammtaháðan hátt, eins og mælt er með in vitro líkanakerfi (mynd 3A). Beinupptöku var marktækt hindrað þegar BMMswer var ræktað með 1 mM akteósíði (mynd 3B). A 10 mMakteósíðmeðferð dró næstum algjörlega RANKL-framkallaða upplýsingar af BMM. Á sama hátt minnkaði akteósíð beinupptöku í RANKL-örvuðum RAW264.7 frumum (Mynd S2A og B). Hæfni akteósíðs til að hamla beinupptöku var háð tímasetningu meðferðar miðað við RANKL örvun. Acteoside (10 mM) sem bætt var við 4 dögum eftir RANKL örvun dró ekki úr upplýsingum í BMMs, en það bældi fjölda osteoclasts sem myndaðist (mynd 3C). Þessi mismunandi niðurstaða var að hluta til vegna gryfjasvæðisins sem þegar var myndað eftir 4 daga RANKL örvunarmyndun (mynd 3D).

Acteoside lækkar snemma RANKL merkjaleiðir

RANKL framkallar virkjun 3 vel þekktra MAPK og NF-kB í forverum beinþynningar og þessi virkjun er nauðsynleg til að aðgreina beinþynningar snemma. Til að skilja mögulega aðferðir sem akteósíð hamlar beinþekjumyndun, könnuðum við áhrifakteósíðum MAPK og NF-B virkjun í átfrumum. BMM og RAW264.7 frumur voru formeðhöndluð með 10 mM akteósíði í 2 klst og síðan örvuð með 100 ng/ml RANKL í 30 mín. MAPK fosfórun var skoðuð með Western blotting og ónæmisfræðilegri greiningu. RANKL framkallaði fosfórun á p38, ERK og JNK íBMMs (mynd 4A) og RAW264.7 frumum (mynd 4B). Acteoside kom í veg fyrir þessar RANKL-framkallaðar aukningar á p-p38, p-ERK og p-JNK. Þessi niðurstaða var studd af ónæmisfræðilegri greiningu, sem formeðferð með 10 mMakteósíðhamlaði verulega magn fosfórýleraðra MAPKs í þessum átfrumum (mynd 4C). RANKL meðferð jók DNA-bindingu NF-kB, en akteósíð hamlaði RANKL-framkallaða virkjun á NF-kB-DNA bindingu (mynd 5A). Þessi hömlun var meira áberandi í BMM en í RAW264.7 frumum. Acteoside minnkaði einnig RANKL-örvaða p65 og IkBa fosfórun í BMMs og RAW264.7 frumum (myndir 5B og C). Að bæta við 10 mMacteoside hindraði næstum algjörlega bæði niðurbrot og virkjun IkBa í BMMs (mynd 5B). Til að staðfesta enn frekar að NF kB virkjun sé þátt í verkun akteósíðs, voru kB promoter-luciferasa smíðar umbreyttar tímabundið í RAW264.7 frumur. Frumurnar sem ræktaðar voru með 100 ng/ml RANKL höfðu 3-falt meiri kB virkni, sem var verulega veikt af 10 mM akteósíði (mynd 5D).

Acteoside bælar myndun bólgueyðandi frumuefna og tjáningu á TNF-a, c-Fos og NFATc1in RANKL-örvuðum átfrumum

TNF-a, IL-1b og IL-6 eru mikilvæg í myndun og virkni beinþynningar, sem miðlað er af NF-kB merkjum í RANKL-örvuðum átfrumum. RANKL örvaði framleiðslu þessara cýtókína og þessi framleiðsla minnkaði verulega um 10 mMakteósíðformeðferð í BMM (mynd 6A). Á sama hátt dregur akteósíð úr RANKL-framkallaðri framleiðslu cýtókína, nema IL-6, í RAW264.7 átfrumum (mynd S3). Til að skilja sameindahátt verkunar akteósíðs í beinþynningarmyndun, skoðuðum við frekar áhrif akteósíðs á TNF-a, c-Fos og NFATc1 tjáningu. RANKL uppstýrði mRNA tjáningu þessara þátta í BMM og RAW264.7 frumum (myndir 6B og C). Formeðferð með 10 mM akteósíði hamlaði marktækt RANKL-framkallaða tjáningu þessara þátta í báðum

BMM og RAW264.7 frumur. Acteoside formeðferð minnkaði einnig próteinmagn c-Fos og NFATc1 í RANKL-örvuðum BMMs (mynd 6D). Þessar niðurstöður benda til þess að akteósíð lækki RANKL sem framkallar miðlara beinþynningarmyndunar við gena- og próteinstig.

Acteoside dregur úr innanfrumu ROS myndun í BMMs á skammtaháðan hátt Þar sem vitað er að innanfrumu ROS framleiðsla er í tengslum við RANKL-örvaða beinþynningarmyndun, könnuðum við hvort akteósíð hamli ROS framleiðslu meðan á RANKL-miðluðum beinþynningaviðkvæmum aðgreiningu, frumuoxunarnæmri aðgreiningu , DCFH-DA. Flæðifrumugreining sýndi að meðalflúrljómunarmerkið sem er sérstakt fyrir DCF í BMMs var greinilega hliðrað til hægri eftir örvun með RANKL, samanborið við ómeðhöndlaðar samanburðarfrumur (mynd 7A). Þessi breyting var svipuð og þegar RAW264.7 átfrumur sáust eftir RANKL örvun (gögn ekki sýnd). Meðhöndlun BMMs með akteósíði dró úr merkistyrk DCF á skammtaháðan hátt. Formeðferð með 10 mM akteósíði dró næstum algjörlega úr magni innanfrumu ROS sem framleitt var við aðgreining á beinþynningum niður í ómeðhöndlað viðmiðunarstig (mynd 7B).

Inntöku akteósíðs hamlar breytingu á lífefnafræðilegum merkjum fyrir beinþynningu og beinmissi í músum sem hafa verið gerðar með eggjastokkum.

Til að kanna áhrif akteósíðs á beinmissi útbjuggum við beinþynningardýralíkan með eggjastokkatöku. Marktækur munur var á líkamsþyngd á milli OVX og Shammice á tilraunatímabilinu (gögn ekki sýnd). Hópurinn hafði marktækt hærra sermisgildi IL-1b og IL-6 en sýndarhópurinn (mynd 8). Aukning á þessum bólgueyðandi cýtókínum af völdum eggjastokkanáms var dregin úr með gjöf akteósíðs til inntöku (AC hópur). Sermisþéttni beinaskiptamerkja eins og ALP, kalsíums, TRAP5b og OC var marktækt aukið í OVX hópnum. Af þessum beinþynningarmerkjum var aukið magn kalsíums, TRAP5b og OC í OVX músum greinilega hamlað með akteósíðmeðferð, en sermismagn ALP breyttist ekki við meðferðina. Meðalhámarksbrotaálag að miðju hægra lærleggsskafti var marktækt lægra í OVX hópnum en í Sham hópnum (Mynd 9A). Meðferð með akteósíði hækkaði hámarksbrotabrot í Sham hópnum. Þegar barkarbein lærleggsins var krufið og skoðað með sjónsmásjá, voru beinþynningareinkennin sem sýnd voru í OVX hópnum nánast alveg horfin í AC músum (mynd 9B). Til að sannreyna áhrif akteósíðs á beinþynningarlíkanið af völdum OVX, voru beinþéttni og formfræðilegar breytur í beinum í ljósa nærlæga lærleggnum greindar með ör-CT. Eins og sýnt er á mynd. 9C, fannst breyting á lærleggsskekkjubyggingu í OVX músum, en þessi breyting minnkaði með meðferð með akteósíði. Niðurstöður úr ör-CT greiningu leiddu í ljós að BMD, mælikvarði á beinstyrk, minnkaði verulega í OVX músum (mynd 9D). Í samanburði við Sham hópinn sýndu OVX mýs einnig verulegar breytingar á BV/TV, Tb. Sp, og Tb. N, en ekki í Tb.Th. Acteoside meðferð til inntöku á OVX músum kom marktækt í veg fyrir breytingu á beinþéttni sem og BV/TV og Tb.N.

Acteósíð hefur ekki áhrif á beinmergfrumur í beinmergsfrumum

Hlutverk akteósíðs á beinþynnuaðgreiningu var rannsakað frekar með því að nota beinmergsfrumur. Eins og sýnt er á mynd 10A, jók DAG-meðferð fjölda alizarín rauðlitaðra frumna og þessu var ekki breytt með 10 mM akteósíð formeðferð. Magn litarefnisins sem var til staðar benti til þess að sameinað akteósíð og DAG meðferð breytti ekki steinefnamyndun (Mynd 10B). Að sama skapi hafði DAG-framkallaða aukning á kalsíuminnihaldi innanfrumu (mynd 10C) og mRNA-gildum (mynd 10D) beinsértækra merkja, eins og Runx2, osterix, BSP og OC, ekki áhrif af formeðferð meðakteósíð.