Nýtt netrín-1-afleitt peptíð eykur vernd gegn taugadauða og dregur úr heilablæðingu í músum 1. hluti

Ágrip:

Greint hefur verið frá því að Netrin-1 taki þátt í taugavörn í kjölfar áverka á miðtaugakerfinu. Hins vegar er lágmarks starfhæft lén Netrin-1 sem getur varðveitt taugavörnina en forðast helstu aukaverkanir Netrin enn óviðráðanlegt.

Miðtaugakerfið er eitt mikilvægasta taugakerfi mannslíkamans sem stjórnar hugsun, tilfinningum og gjörðum fólks. Þegar miðtaugakerfið skemmist verður minni fólks einnig fyrir áhrifum. En ekki hafa áhyggjur, við getum notað nokkrar jákvæðar leiðir til að hjálpa til við að endurheimta minnið.

Fyrst þarftu að skilja áhrif minnisskemmda. Skemmdir á miðtaugakerfinu geta haft áhrif á vitræna getu fólks, hugsunarferli og athygli, sem allt hefur bein áhrif á minni fólks. Auk þess geta skemmdir á miðtaugakerfinu einnig valdið tilfinningalegum óstöðugleika, sem gerir fólk hættara við læti, kvíða og þunglyndi og hefur þar með áhrif á endurheimt minni.

Hins vegar, þó að skemmdir á miðtaugakerfinu geti haft neikvæð áhrif, getum við gert nokkrar jákvæðar ráðstafanir til að stuðla að endurheimt minni. Í fyrsta lagi getum við prófað einhverja vitræna þjálfun, eins og að lesa, skrifa og leysa þrautir. Þessi starfsemi getur örvað heilann til að framleiða nýjar taugafrumur og hjálpað heilanum að byggja upp nýjar minningar og hugsanahætti.

Í öðru lagi getum við einnig stuðlað að endurheimt minni með líkamsrækt. Rannsóknir hafa sýnt að rétt hreyfing getur örvað heilann til að framleiða nýjar taugafrumur og taugatengingar og stuðlað að úrvinnslu heilans á nýjum upplýsingum. Þetta er ástæðan fyrir því að sumir fá skyndilega góða hugmynd eða leysa erfið vandamál á meðan þeir eru að hlaupa eða ganga.

Að lokum þurfum við að huga að hlutverki réttrar næringarinntöku á minni. Eðlileg starfsemi heilans krefst nokkurra nauðsynlegra næringarefna, svo sem próteina, vítamína og snefilefna. Ef maturinn okkar skortir þessi næringarefni mun það hafa áhrif á minni okkar og hugsunargetu. Þess vegna ættum við að velja matvæli sem eru rík af þessum næringarefnum í mataræði okkar, svo sem fisk, magurt kjöt, grænmeti og ávexti.

Skemmdir á miðtaugakerfinu munu í stuttu máli hafa ákveðin áhrif á minni fólks, en við getum stuðlað að endurheimt minni með réttri vitrænni þjálfun, líkamsrækt og stjórn á mataræði. Ég vona að allir geti tekist á við áskoranir lífsins á jákvæðan hátt, viðhaldið bjartsýni og kappkostað að endurheimta heilbrigt miðtaugakerfi og gott minni. Það má sjá að við þurfum að bæta minnið og Cistanche getur bætt minnið verulega því Cistanche er hefðbundið kínverskt lyf með mörg einstök áhrif, ein þeirra er að bæta minni. Virkni Cistanche kemur frá hinum ýmsu virku innihaldsefnum sem það inniheldur, þar á meðal tannínsýru, fjölsykrur, flavonoid glýkósíð o.fl., sem geta stuðlað að heilsu heilans á margan hátt.

Smelltu á Vita til að bæta skammtímaminni

Hér könnuðum við taugaverndandi áhrif peptíðs E1 sem er unnið úr EGF3 léni Netrins (leifar 407–422). Við komumst að því að það hefur samskipti við eytt ristilkrabbameini (DCC) til að virkja focal adhesion kínasa fosfórýleringu sem sýnir taugavernd.

Gjöf peptíðsins E1 tókst að bæta hagnýtan bata með minni frumudauða í tilraunalíkani af músum af innanheilablæðingu (ICH).

Í stuttu máli afhjúpum við virka röð af Netrin-1 sem tekur þátt í endurheimtarferlinu eftir ICH og auðkennum frambjóðanda peptíð til að meðhöndla ICH.

Lykilorð: innanheilablæðing; hemin; taugavörn; Netrin-1; peptíð.

1. Inngangur

Heilablæðing (ICH) er hrikaleg heilablóðfall undirtegund með háa dánartíðni og dánartíðni [1-3] sem felur í sér óeðlilegt rof á heilaæðum í heila [4,5].

Æskilegt er að fjarlægja blóðæxla með skurðaðgerð til að ná blæðingum og létta innankúpuþrýsting [6]. Hins vegar geta leifar af blóðvökva og blóðniðurbrotsafurðum samt stuðlað að afleiddum heilaskaða í kjölfar ICH, framkallað taugaskemmdir og seinkað starfrænum bata [7-9].

Þróun árangursríkra aðferða sem miða að afleiddum heilaskaða af völdum taugaskemmda væri því gagnleg til meðferðar á heilablóðfalli. Netrín-1 er eitt af vel rannsökuðu próteinum sem stjórnar axonal leiðbeiningum og taugamyndun [10–12] með samskiptum við viðtaka þess. eytt í krabbameini í ristli og endaþarmi (DCC) og UNC5H (ósamræmd-5 homolog) til að virkja frumulifun, sérhæfingu og útbreiðslu [13-15].

Viðtakarnir framkalla dauðamerki til að miðla frumudauða þegar Netrin-1 er fjarverandi [16]. Það er vitað að binding Netríns-1 við DCC leiðir til dimerization DCC og kemur af stað týrósíni 861 fosfórýleringu á focal adhesionkinase (FAK) til að örva útvöxt taugafruma og axonal leiðbeiningar [17,18].

Binding Netrin-1 við DCC felur í sér EGF3 lén Netrin-1 og FN5 lén DCC í virkjun Netrin-1 merkjaferilsins [19,20]. Nýlega var sýnt fram á að Netrin-1 hefur taugaverndandi áhrif á blóðþurrðarsvæðum [21].

Tjáningarstig Netríns-1 í sermi, sem hamlar frumudapósu og stuðlar að endurnýjun taugafrumna, er í jákvæðri fylgni við bata sjúklings eftir heilablóðþurrð [22,23].

Athyglisvert er að ígræðsla á mesenchymal stofnfrumum í beinmerg sem seyta Netríni-1 inn í skemmdu rottutaugun kemur af stað endurnýjun axona [24] og dregur úr dauða hreyfitaugafrumna [25]. Stereotaxísk inndæling á Netrin-1 próteini í slegla dregur úr dauða taugafrumna eftir blæðingar undir æðahnúta með virkjun DCC/APPL1/AKT merkja [26].

Fjölpeptíð sem er dregið af EGF3 léni Netrin-1 (amínósýrur 423-433) virkjar verulega ERK fosfórun og stuðlar að framleiðslu NO, sem hefur hjartaverndandi áhrif [27,28]. Hins vegar hefur Netrin-1 verið auðkennt sem hugsanlegt lífmerki fyrir æxlismyndun [29-31] vegna þess að stjórnun á Netrin-1 stöðunni sem finnast í mörgum krabbameinum af völdum vefja [32].

Þegar Netrin-1 er bundið við DCC eða Unc5H viðtaka þess, senda viðtakarnir jákvætt merki sem leiðir til lifunar, bólgu, æðamyndunar og frumudauða, sem aftur stjórnar æxlismyndun [31].

Þess vegna er mjög mikilvægt að bera kennsl á lágmarks starfrænt lén Netrin-1 sem getur varðveitt taugavörnina og forðast helstu aukaverkanir Netrins-1. Hér komumst við að því að peptíð E1 (leifar 407–422), sem er dregið af EGF3 léni Netrin-1, hefur samskipti við DCC til að vernda taugafrumur gegn eiturverkunum af völdum hemíns.

Í tilraunalíkani af ICH músum bætti notkun peptíðs E1 virkni bata, eins og ákvarðað var með atferlismælingum. Ennfremur getur peptíð E1 komið í veg fyrir að taugafrumur hrörni eftir ICH.

Byggt á þessum niðurstöðum greindum við virkniröð Netrin-1 sem tekur þátt í bata eftir ICH og ákváðum að nota mætti ​​þetta peptíð til að meðhöndla ICH.

2. Úrslit

2.1. EGF3 lén er mikilvægt fyrir Netrin-DCC samskipti

Netrin-1 samanstendur af VI léni, þremur EGF endurtekningum og C-enda léni [33]. Kristalbygging mannlegs Netrin-1/DCC flókins sýnir að Netrin-1 EGF3 lénið skiptir sköpum fyrir Netrin-1/DCC víxlverkunina, en ekki EGF1 og EGF2 lénin [34].

Stökkbreyting á lykilamínósýruleifum (His407, Gln442 eða Gln443) á EGF3 léninu truflaði Netrin-1/DCC bindingu algjörlega [19]. EGF1/2 lén eru nauðsynleg til að skipta aðlaðandi merki í fráhrindandi merki þegar Unc5 er samhliða DCC [20].

Þannig mynduðum við fyrst í fullri lengd og EGF3-eydd (Netrin-1 ∆407–443) Netrin-1 smíðar (Mynd 1A) og tjáðum þessar smíðar tímabundið í ræktuðum HEK293T frumum fyrir GSTpulldown .

Binding kom fram fyrir smíðarnar sem tjáðu Netrín-1 en ekki Netrín-1(∆407–443) (Mynd 1C). Þessar niðurstöður benda til þess að lén EGF3 sem inniheldur amínósýrur 407–443 sé ábyrgt fyrir samspili Netrin-1 við DCC. Til að rannsaka hlutverk EGF3 lénsins í Netrin-DCC hreinsuðum við fyrst myc-merkt Netrín{{12 }} eða stytt Netrin-1 (∆407–443) (Mynd 1B).

Næst voru HEK293T frumur transsmitaðar með plasmíði sem bar DCC cDNA og ræktaðar með Netrín-1 próteini, og síðan var Netrín-1 binding metin með ónæmislitun.

Við komumst að því að Netrín-1 í fullri lengd, en ekki stytt Netrín-1, gat tengst DCC við plasmahimnuna (mynd 1D). Til að ákvarða hvort EGF3 lénið geti haft samskipti við DCC, bjuggum við til GST-EGF3 byggingu til að draga niður lýsaðar frumur sem oftjáa DCC. Við sáum sérstaka bindingu DCC við GST-EGF3 (Mynd 1E).

Ennfremur mynduðum við FITC-merkta peptíðiðEGF3 og staðfestum að, eins og Netrín í fullri lengd -1, gat það tengst DCC við plasmahimnuna (Mynd 1F). Samanlagt benda gögn okkar til þess að EGF3 lénið sé ábyrgt fyrir samskiptum Netrin-1 við DCC.

2.2. EGF3 lénið veldur fosfórun á niðurstreymisleiðum Netríns-1

Samspil Netrin-1 og DCC virkjar margar merkjaleiðir, þar á meðalFAK, SFK og ERK [16,35]. Focal adhesion kínasi (FAK) er ein helsta týrósínfosfórunaraðgerðin sem tengist Netrin-1/DCC merkingum.

Netrín-1 virkjar FAK-fosfórun og Src fjölskyldu prótein tyrosínkínasa (SFK) fosfórun [17]. BæðiFAK og SFK merkjaleiðir gegna lykilhlutverki í þroskastigi taugakerfisins og viðgerð á meiðslum [36,37]. Þar að auki getur Netrin-1 virkjað utanfrumumerkjastýrða kínasa-1/2 (ERK1/2), sem miðlar virkni Mítógen-virkjaðs próteinkínasa (MAPK) ferilsins [38–40].

Til að kanna hvort EGF3 lénið sé mikilvægt fyrir virkjun niðurstreymis boðleiða með bindingu Netrin-1 við DCC, skoðuðum við fyrst áhrif EGF3 lénsins á týrósín 861 fosfórun FAK (Mynd 2A) . Við komumst að því að eyðing á EGF3 hamlaði FAK fosfórun í taugafrumum í ræktuðum heilaberki (Mynd 2B, C), og staðfestir þannig mikilvægt hlutverk EGF3 í Netrin-1 merkjaleiðinni.

Næst voru ræktaðar taugafrumur í heilaberki örvaðar með GST-EGF3samrunapróteininu í 20 mínútur og vestræn blotting staðfesti enn frekar að meðferð með GST-EGF3 samrunaprótíninu olli FAK, ERK og SFK fosfórun (Mynd 2D-G).

Þessar niðurstöður benda til þess að EGF3 lén Netrin-1 virki sem öflugur örvandi til að virkja niðurstreymis boðleiðir.

Mynd 1. EGF3 lén Netrin-1 er mikilvæga svæðið fyrir Netrin-1/DCC samskipti. (A) Teikningar af Netrin-1byggingum. Netrin-1 smíðin eru Netrin-1 í fullri lengd, Netrin-1-(∆407–443) og GST-EGF3. (B) Hreinsað netrín-1-(∆407–443)-Myc/His voru magngreind með samanburði við BSA staðalferilinn. (C) Ónæmisbletting á niðurdráttarhlutanum með GST-DCC FN5 lénssamrunapróteini og GST einu sér. (D) Ónæmisflúrljómunarmyndir af Flag-DCC sem tjá 293T frumur ræktaðar með samanburðarmiðli, Netrin-1-myc/his og Netrin-1-(∆407–443) -Myc/his í 30 mínútur, í sömu röð, og magnið greiningu. Skalastöng, 10 µm. (E) Ónæmisbletting á niðurdráttarhlutanum með GST-EGF3 samrunaprótíninu og GST ásamt. (F) Ónæmisflúrljómunarmyndir af Flag-DCC sem tjá 293T frumur ræktaðar með samanburðarmiðli og FITC merktum Pep EGF3 í 30 mínútur, í sömu röð, og magngreiningin. Skalastöng, 10 µm.

Mynd 2. EGF3 lén virkjar niðurstreymisferli Netrin-1. (A) Tilraunaaðferð. (B) Cortical taugafrumur (E17og DIV3) voru örvaðar með Netrin-1, Netrin-1-(∆407–443) eða stjórnmiðli í 20 mín. Frumulýsi voru ræktuð með and-p-FAK-861 mótefni til að staðfesta Netrin-1 virkni. (C) Magngreining á niðurstöðum Western blot er sýnd í (B). n=3. (D) Cortical taugafrumur (DIV3) voru meðhöndlaðir með 1,5 µM GST (+), 1,5 µM GST-EGF3 samrunapróteini (+), eða 1,5 µMNetrín-1 (+) miðli í 20 mínútur. Frumulýsi voru ræktuð með and-p-FAK-861, and-p-SFK-418 og and-p-ERK-202/204.(E–G) Magngreining á vestrænum blot niðurstöður sýndar í (D). n=3. Gögnin eru sett fram sem meðaltal ± SEM. Einstefnu ANOVA var notuð fyrir allar tölfræðilegar greiningar sem sýndar eru á þessari mynd (* p < 0,05, ** p < 0,01; ns, ekki marktækt). Upplýsingar um gagnagreiningu má sjá í viðbótartöflu S1.

2.3peptíð E1 og E2 hafa samskipti við DCC til að virkja niðurstreymismerkjaleið Netríns-1

Eins og áður hefur verið lýst, örvaði lítið peptíð úr EGF3 léni Netrin-1(amínósýrur 423-433) ERK fosfórun [27]. Við mynduðum peptíð E1 (leifar 407-422) og E2 (leifar 423-433) sem voru unnin úr EGF3 léni Netríns -1 (Mynd 3A).

Við komumst að því að ræktun peptíðs E1 jók magn fosfórýleraðs FAK og SFK (Mynd 3B, D, E) í ræktunarfrumunum á skammtaháðan hátt en breytti ekki magni fosfórýleraðs ERK (Mynd 3B, F).

Ólíkt peptíðE1, framkallaði peptíð E2 ekki aðeins týrósínfosfórun FAK (Mynd 3C, G) og týrósínfosfórun SFK (Mynd 3C, H) heldur olli einnig týrósínfosfórun ERK (Mynd 3C, I).

Viðmiðunarpeptíðið (Pep Ctrl) hafði engin greinanleg áhrif á týrósín fosfórun FAK, SFK og ERK (Mynd S1). Ennfremur sáum við að fosfórun á íhlutum FAK merkjaferilsins sem framkallað er af peptíð E1 var tímaháð (Mynd S2). Þessar niðurstöður gefa til kynna að E1 og E2 séu lágmarks virknipeptíð Netrins-1.

Mynd 3. Lágmarksraðir EGF3 lénsins virkja niðurstreymisferla Netrin-1. (A) Skýringarmyndir af peptíðunum. (B) Taugafrumur í heilaberki (DIV3) voru örvaðar með hallastyrk peptíðs E1. Frumulýsi voru ræktuð með and-p-FAK-861, and-p-SFK-418 og and-p-ERK-202/204. (C) Ræktaðar taugafrumur í heilaberki voru meðhöndlaðar með stigfallsstyrk peptíðs E2.

Lýsötum var safnað og ræktuð með tilgreindum mótefnum til að mæla fosfórun FAK, SFK og ERK. (D-F) Magngreining á umfangi FAK, SFK og ERK fosfórunar framkallað af peptíð E1 í taugafrumum er sýnd í (B). n=3. (G-I) Magngreining á umfangi FAK, SFK og ERK fosfórunar sem framkallað er af peptíð E2 er sýnd í (C). n=3. (J) Taugafrumur í heilaberki, fengnar úr DCC villigerð og arfblendnum stökkbreyttum fóstri, voru örvaðar með Netrín-1 eða Netrín-1-afleiddum peptíðum og voru leystar.

Lysötin sem mynduðust voru látin fara í ónæmisblettingu. (K) Magngreining á FAK PY{{0}} og DCC stigum í DCC stökkbreyttum taugafrumum er sýnd í (J). n=3. Gögnin eru sett fram sem meðaltal ± SEM. Einhliða ANOVA var notuð fyrir allar tölfræðilegar greiningar sem sýndar eru á þessari mynd (* p < 0,05;ns, ekki marktækt). Upplýsingar um gagnagreiningu má sjá í viðbótartöflu S1.

Til að ákvarða hvort virkjun FAK-boðaleiðarinnar sé DCC-háð, mældum við umfang týrósínfosfórunar FAK framkallað af þessum peptíðum í DCC+/+ og DCC-/- taugafrumum. Við komumst að því að bæði peptíð E1 og E2 tókst ekki að framkalla fosfórýleringu FAK í DCC-/- taugafrumum (Mynd 3J, K).

Við komumst einnig að því að tilbúið N-endalega Flag-merkt peptíð E1 og E2 (Flag-E1 og Flag-E2) bindast beint við DCCFN5 lénið (Mynd S3).

2.4. Peptíð E1 verndar taugafrumur gegn hemín völdum frumudauða in vitro

Til að sýna vernd gegn taugaskemmdum peptíðs E1 notuðum við aHemin framkallanleg eiturhrifaviðbrögð til að líkja eftir afleiddum heilaskaða eftir heilablæðingu [41,42].

Ræktaðar GnRH-tjáandi taugafrumur (NLT) [43-45] voru ræktaðar með hemíni í mismunandi styrk og lengd. Ræktun NLT frumna með hemíni í miðlægum banvænum skammti (60 µM) leiddi til tímaháðrar lækkunar á lifunartíðni frumunnar, sem bendir til þess að hemin hafi verið tekið upp af taugafrumum og umbrotið (Mynd S4).

Til að kanna hvort tjáning Netrin-1 og DCC svaraði taugafrumudauða af völdum hemíns, voru ræktaðar NLT frumur ræktaðar með hemíni í mismunandi lengd. Western blot niðurstöður sýndu fram á að tjáningarmagn Netrin-1 og DCC jókst marktækt 6 klst. eftir hemínræktun og minnkaði síðan smám saman (Mynd 4A, B).

Til að kanna hvort peptíð E1 og E2 gætu dregið úr taugadauða af völdum hemíns, gerðum við CCK-8 prófun með Netrin-1, PepCtrl, peptíð E1 og peptíð E2.

Við komumst að því að þessi peptíð höfðu engin greinanleg áhrif á lífvænleika frumna (Mynd 4C og Mynd S5). Í samanburði við ræktun með Pep Ctrl og peptíð E2, bætti peptíð E1 og Netrin-1 taugadauða af völdum hemíns (Mynd 4D). Við lituðum einnig með kalsín-AM og PI til að greina lifandi og dauða frumur.

Niðurstöðurnar sýndu að bæði Netrin-1 og peptíð E1 vernduðu gegn hemín-völdum dauða in vitro (Mynd 4E–G). Ennfremur létti 1,5 µM peptíð E1 dauða af völdum hemíns í frumræktuðum taugafrumum (Mynd 4H, I). Alls sýndu þessar niðurstöður að peptíð E1 verndar taugafrumur frá frumudauða af völdum hemíns.

2.5. Netrin-1-Afleitt peptíð E1 stuðlar að virkni bata eftir ICH

Til að kanna hvort peptíð E1 sem er unnið úr Netríni-1 gegnir mikilvægu hlutverki við óvirkan bata eftir blæðingaráfall, stofnuðum við tilrauna ICH líkan inmice með því að sprauta kollagenasa blandað með bleki inn í striatum (Mynd S6A).

Eftir þrjá daga voru myndir af heilasneiðinni sýndar til að fylgjast með inndælingarstöðu og kollagenasarúmmáli með bleki (Mynd S6B, C). Mýs með blæðingu í striatal sýndu máttleysi á hliðarhliðinni vegna heilaskaða (Mynd S7A-C).

Blóðæxli í striatum eftir ICH voru sýnileg samanborið við inndælingu á saltvatni (Mynd S7D). Hlutfallslegt próteinmagn Netríns-1 og DCC í heilaberki jókst í ICH músum samanborið við viðmiðunarmús á 2. degi og Netrín-1 var enn marktækt hærra á 3. degi, sem gefur til kynna að Netrín-1 er mikilvægt fyrir bata heilaskaða (Mynd S7E, F).

Næst var FITC-merkt TAT-peptíð E1 (FITC-Pep TE1), sem bætti við TAT röð af N-enda peptíðs E1, sprautað í ICH mýsnar og sýnt var að FITC-Pep TE1 fór yfir blóð-heila þröskuldinn ( mynd S8).

ICH og viðmiðunarmúsunum var sprautað í kviðarhol með peptíðinu (12 mg/kg) daglega eða jafnmiklu magni af saltvatni (Mynd 5A). Við komumst að því að gjöf með peptíð TE1 bætti lifun og bjargaði göllum í líkamsþyngd eftir ICH (Mynd 5B, C).

Við fundum líka að rúmmál kollagenasa sem var rakið með jöfnu hlutfalli af bleki í hverjum hópi var svipað, sem staðfestir að þetta staðlaða líkan af kollagenasa leiddi til endurskapanlegra blóðrauða innan æða (Mynd 5D). Peptíð TE1 bætti hegðunarskor ICH músanna í límbandsfjarlægingarprófinu (Mynd 5E) ) og strokkprófun (Mynd 5F).

Eins og búist var við, minnkaði peptíð TE1 rúmmálið innfarkt eftir ICH (Mynd 5G, H). Samanlagt benda þessar niðurstöður til þess að peptíð E1 sé hægt að draga úr blóðkornarúmmáli og bæta virkan bata í múslíkani af ICH.

Mynd 4. Peptíð E1 bætir frumudauða af völdum hemíns in vitro. (A) Western blot af Netrin-1 og DCC í ræktuðum NLT frumum sem verða fyrir Hemin (60 µM). (B) Megindleg greining á niðurstöðum vestrænna bletta er sýnd í (A). n=3. (C) CCK-8 mælingar sýndu að peptíðaröð breyttu ekki frumulífi. n=4. (D) 1,5 µM Pep E1 varðveitti lífvænleika NLT frumna þegar þeim var bætt vel við eftir útsetningu fyrir hemíni (60 µM). n=4. (E) Lifandi (græn)/dauð (rauð) prófun á NLT frumum sem verða fyrir hemíni (60 µM,6 klst.). Stöng, 50 µm. (F, G) Magngreining á lifandi/dauðu greiningu í (E). n=9. (H) CCK-8greiningar sýndu að Pep E1 gæti dregið úr frumudauða af völdum hemíns í frumræktunartaugafrumum. n=8.(I) Myndgreining á lifandi/dauðri greiningu frumræktunartaugafruma (50 µM, 6 klst.). Stöng, 50 µm. Gögnin eru sýnd sem meðaltal ± SEM. Einhliða ANOVA eða tvíhliða ANOVA var notuð fyrir allar tölfræðilegar greiningar sem sýndar eru á þessari mynd (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; ns, ekki marktækt). Upplýsingar um gagnagreiningu má sjá í viðbótartöflu S1.

Mynd 5. Netrin-1-afleitt peptíð E1 stuðlar að bataferlinu eftir ICH. (A) Skýringarmynd af tilraunafyrirmyndinni um inndælingu í kviðarhol (IP) peptíðs TE1 í ICH líkanagerð af músum. (B) Lifunarhlutfall eftir ICH hvers hóps var skráð og Kaplan-Meier aðferðin var notuð. n=10. (C) Líkamsþyngd breytist 5 dögum eftir ICH. n=6.(D) Klippimynd/saltvatnsblanda með jöfnu hlutfalli af bleki (samtals 0,6 µL) sprautað í rák á C57 músum, dæmigerðar myndir sem sýna bleksvæðið var svipað hjá músum sem voru meðhöndlaðar með/ án peptíðs TE1 5 dögum eftir ICH. (E, F) IP innspýting peptíðs TE1 (12 mg/kg) en ekki TAT (12 mg/kg) stjórnun, bætt hegðun eftir því sem fylgst er með verki til að fjarlægja borði (E) eða hornverkefni (F).

Saltvatn,n=10 einstök dýr; ICH, n=6 einstök dýr; ICH + TAT, n=6 einstök dýr; ICH + TE1, n=8 einstök dýr. (G) Fulltrúi hematoxýlíns og eósínlitaðra hluta í músum sem voru meðhöndlaðir með/án peptíðs TE 1 5 dögum eftirICH. Skalastöng, 1 mm. (H) Magngreining á rúmmáli blæðinga í heilahlutum sýnd í (G).

Saltvatn, n {{0}} einstök dýr; ICH, n=6 einstök dýr; ICH + TAT, n=6 einstök dýr; ICH + TE1, n=8 einstök dýr. Gögnin eru sýnd sem meðaltal ± SEM. Einhliða ANOVA eða tvíhliða ANOVA var notuð fyrir allar tölfræðilegar greiningar sem sýndar eru á þessari mynd (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; ns, ekki marktækt). Upplýsingar um gagnagreiningu má sjá í viðbótartöflu S1.

2.6. Netrín-1-Afleitt peptíð E1 dregur úr taugafrumufrumukrabbameini eftir ICH

Að kanna undirliggjandi kerfi peptíðs E1 í því ferli að endurheimta ICH. Við fundum hrörnun taugafrumna á perihematomal svæðinu með flúor-jade C (FJC) litun.

Við komumst að því að gjöf peptíðs TE1 minnkaði verulega fjölda FJC-jákvæðra frumna á perihematoma svæðum, sem gefur til kynna að pep TE1 hamlaði hrörnun taugafrumna eftir ICH (Mynd 6A, B). Við framkvæmdum TUNEL litun og komumst að því að peptíð TE1 minnkaði verulega fjölda TUNEL-jákvæðra taugafrumna (Mynd 6C, D).

Fjöldi TUNEL-jákvæðra stjarnfrumna var ekki greinanleg breyting eftir peptíð TE1 meðferð (Mynd 6E, F). Að auki, með því að nota FITC-merkt 4 kDa dextran sem atracer til að gefa til kynna gegndræpi blóð-heilaþröskuldar (BBB), komumst við að því að peptíð TE1 hafði ekki áhrif á endurheimt BBB gegndræpi (Mynd S9A, B).

Styrkur hráefnis flúrljómunareininga í sermi (RFU) var svipuð, sem staðfestir nærveru sprautaðs sporefnis í öllum dýrunum sem voru greind (Mynd S9C). Við notuðum einnig flúrljómunarmerkt lektín til að merkja öræðar en tókst ekki að fylgjast með framförum eftir TE1 meðferð (Mynd S9D, E). Umfram allt benda þessar niðurstöður til þess að peptíð E1 stuðli að endurheimt taugafrumna eftir ICH með því að hindra taugafrumu.

Mynd 6. Netrin-1-peptíð E1 getur verndað gegn taugafrumudauða og hrörnun, en ekki stjarnfrumur eftir ICH.(A) Fulltrúi flúor-jade C-litaða hluta í músum sem voru meðhöndlaðar með/án TE1 5 dögum eftir ICH. Kvarðastöng, 50 µm, og 10 µm, í sömu röð. (B) Magngreining á flúor-jade C jákvæðum frumum á perihematomal svæðinu (n=4). (C) TUNEL-litun sem sýnir áhrif TE1 á afleidd heilaskaða (SBI) 5 dögum eftir að ICH byrjar. Fulltrúar myndir frá Saline, ICH, ICH + TAT og ICH + TE1 hópum.

Hver hópur var undirgefinn ICH nema saltvatnshópurinn. Kvarðastöng, 50 µm og 10 µm í sömu röð. (D) Magngreiningar fyrir hlutfall TUNEL-jákvæðra taugafrumna eru sýndar í (C). n=4. (E) Colocalization TUNEL með GFAP 5 dögum eftir ICH. Fulltrúar myndir frá Saline, ICH, ICH + TAT, og ICH + TE1groups. Kvarðastöng, 50 µm, og 10 µm, í sömu röð. (F) Magngreiningar á hlutfalli TUNEL-jákvæðra stjarnfruma eru sýndar í (E). n=4. Gögn eru sett fram sem meðaltal ± SEM.

Einstefnu ANOVA var notuð fyrir allar tölfræðilegar greiningar sem sýndar eru á þessari mynd (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001; Upplýsingar um gagnagreiningu má sjá í viðbótartöflu S1.

3. Umræður

Rannsóknin okkar benti á kjarnapeptíðröð af Netríni-1 sem skiptir sköpum fyrir virka endurheimt eftir ICH. Með því að hafa samskipti við DCC verndar þetta Netrin-1-afleidda peptíð gegn taugafrumum vegna aukaskemmda eftir ICH og er því vænleg meðferð við ICH.

Meðferðarfræðileg beiting Netrin-1, próteins með mikla mólþunga, krefst auðkenningar á lágmarks starfrænni röð Netríns-1 sem stuðlar að niðurstraumsboðum. Í rannsókn okkar voru peptíð E1 (leifar 407–422) og E2 (leifar 423–433), sem eru unnin úr EGF3 léni Netrin-1, mynduð í sömu röð. Við komumst að því að peptíð E1 (leifar 407–422) verndaði gegn taugafrumum eftir ICH.

Við komumst að því að Netrin-1 og DCC tjáningarstig voru aukin í NLT frumum eftirhemínmeðferð. Hemín losnar úr blóðrauða eftir ICH og veldur aukaskaða á bæði glia og taugafrumum [46-48].

Að auki sáum við einnig aukið próteinmagn Netrin-1 og DCC í kjölfar tilrauna ICH. Að auki sáum við aukið próteinmagn netríns-1 og DCC eftir tilrauna ICH.

Þessar niðurstöður eru í samræmi við fyrri niðurstöður sem sýna að netrín-1 gegnir mikilvægu hlutverki við endurheimt eftir ICH [49].

For more information:1950477648nn@gmail.com