Hver er munurinn á villt vaxa Cistanche og tilbúnum ræktuðum Cistanche á ónæmisbætandi virkni

Tengiliður: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Zhao Bing; Yang Xiumei; Wu Daocheng; Ba Xueli; Li Quanxiao; Tan Yachao; Zhang Ailian

Ágrip:

Hlutlæg:Til að bera saman ónæmisbætandi áhrif villt vaxandi cistanche og gervi ræktaðar cistanche fjölsykrur frá cistanche (síðar: WCDPS & CCDPS í sömu röð).

Aðferðir:Mismunandi skammtar (lítill, miðlungs og hár) af WCDPS og CCDPS og eggalbúmíni (OVA) voru bólusettir undir húð með ICR músum, OVA-sértæku mótefni IgG og mótefnaundirgerðir IgGl og IgG2a greindust með ELISA og með MTT aðferð. OVA-sértæk eitilfrumnafjölgunarvirkni, frumuflæðismæling til að greina tjáningarstig CD4 plús T frumna og CD8 plús T frumna.

Niðurstöður:Bæði WCDPS og CCDPS geta verulega aukið tjáningarstig OVA-sértæks mótefna IgG og mótefnagerð IgG1 og IgG2a (P<0.05), and="" there="" is="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" the="" same="" doses="" of="" wcdps="" and="" ccdps="" (f="">0. 05); WCDPS and CCDPS can significantly promote OVA-specific lymphocyte proliferation, and the difference between the same dose is not statistically significant (P>0.05); WCDPS og CCDPS geta einnig aukið verulega hlutfall CD4 plús T og CD8 plús T frumna undirefnis (P<0.05), and="" the="" difference="" between="" the="" same="" dose="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05), WCDPS og CCDPS höfðu engin áhrif á þyngd bólusettu músanna.

Niðurstaða:Bæði WCDSP og CCDPS geta verulega aukið OVA-sértæk húmor og frumu ónæmissvörun og það er enginn tölfræðilega marktækur munur á þessu tvennu og þau hafa gott öryggi.

Lykilorð: cistanche; fjölsykrur úr cistanche; eggalbúmín; hjálparefni

Cistanche (C. deserticola. YC Ma),einnig þekkt sem Cunyun og Dayun, er sníkjudýr jurtplanta af Lydanaceae í mörg ár. Það er sjaldgæft og dýrmætt kínverskt lækningaefni. Helstu innihaldsefni þess eru fjölsykrur úr cistanche, Cistanche phenylethanoid glycoside efnasambönd, Lífrænar sýrur, alkalóíðar o.s.frv.⑷, hafa margar aðgerðir eins og að næra kjarna og blóð, aðstoða yang og styrkja nýrun og létta öldrun⑸. Vegna afar mikils lækningagildis cistanche er ofnýting villtra tegunda á barmi útrýmingar og gerviræktaður cistanche hefur gengið vel. Vísindamenn heima og erlendis hafa gert miklar rannsóknir á efnaþáttum og virkum innihaldsefnum villtvaxandi cistanche og gerviræktaðra cistanche, en fáar skýrslur eru til um samanburð á villtum og ræktuðum cistanche fjölsykrum úr cistanche (WCDPS/CCDPS) hjálparefnisvirkni . Mikill fjöldi rannsókna hefur sýnt að plöntufjölsykrur frá cistanche sem hjálparefni geta stjórnað ónæmissvörun líkamans. Margir vísindamenn hafa notað kínversk jurtalyf sem hjálparefni fyrir bóluefni og hafa náð góðum árangri.

Þessi rannsókn er byggð á fyrri rannsóknum (6) til að bera samanónæmisbætandistarfsemi Xinjiang WCDPS og CCDPS. Aðallega með músabólusetningartilraunum voru mismunandi skammtar af WCDPS og CCDPS bólusettir undir húð með OVA í ICR músum og áhrif þeirra á magn húmorsfriðhelgiog frumuónæmi framkallað af OVA eftir ónæmisaðgerð voru prófuð. Bera samanvillt vaxa cistancheogtilbúið ræktað cistanchefjölsykrur Ónæmisbætandi virkni fjölsykrna í sítrus getur veitt viðmiðun fyrir betri þróun og nýtingu tilbúnar ræktaðra cistanche í Xinjiang.

Efniviður og aðferð

Tilraunaefni:

Villt vaxa cistanche og ræktað cistanche (í sölu). RPMI 1640 ræktunarmiðill var keyptur frá GIBCO; Fóstursermi frá nautgripum var keypt frá Israel Bioind; Flæðifrumumælingar mótefni: PE rottu-andstæðingur mús CD3, APC rotta-andstæðingur mús CD4, FITC rottu-andstæðingur mús CD8a voru keypt frá American BD fyrirtæki, eggjahvítu Prótein (Ovalbumin, OVA) Sigma vara, piparrótarperoxíð-merkt geita and-mús IgG, IgGl og IgG2a voru keypt frá Southbiotech, Bandaríkjunum. Hin tilraunaefnafræðilegu hvarfefnin eru öll innlend greiningarhvarfefni.

Tilraunadýr:

Hreinar kvenkyns ICR mýs (6-8 vikur, 18-22 g) voru keyptar frá tilraunadýramiðstöð Xinjiang læknaháskólans. Dýrin voru geymd í dýraherberginu á rannsóknarstofu okkar og tilraunin hófst 7 dögum eftir að dýrin voru aðlöguð.

Undirbúningur WCDPS og CCDPS:

Tilvísun [17] notar aðferðina við vatnsútdrátt og áfengisútfellingu. Stuttu skrefin eru sem hér segir: Taktu þurrt Xinjiang ræktað og villt cistanche duft, bættu 10 sinnum rúmmálinu af jarðolíuhlaupi og algeru etanóli í ultrasonic í 1 klst; eftir sogsíun, geymdu lyfjaleifarnar og þurrkaðu, bættu 10-földu rúmmáli eimaðs vatns 37T ómskoðun tvisvar sinnum, skilvindu við 4 000 sn./mín. í 10 mínútur, blandaðu saman vökvanum, gufaðu upp í snúningi og þykkni og botnfellið yfir nótt með áfengi; eftir lofttæmisíun og þurrkun fæst hráefnisþykkniduftið; Savage aðferð ⑻ fjarlægir prótein úr WCDPS og CCDPS. Innihald fjölsykra úr cistanche í WCDPS og CCDPS ákvarðað með lauk-brennisteinssýruaðferðinni var 76,82 prósent og 59,58 prósent, í sömu röð.

Músabólusetning og sermissöfnun:

{{0}} vikna gamlar ICR kvenkyns mýsnar voru notaðar sem tilraunadýralíkön. Tilrauninni var skipt í 9 hópa, 5 í hverjum hópi: 0,9 prósent NaCl, OVA 10 jig, OVA-Alum 200 |jLg, OVA-WCDPS 10 |xg, OVA -WCDPS 50 |xg, OVA- WCDPS 100 net, OVA-CCDPS 10 |jLg, OVA-CCDPS 50 |xg, OVA-CCDPS 100 net. Leysið upp með 0,9 prósent NaCl fyrir bólusetningu og bólusetjið mýsnar tvisvar undir húð með 2 vikna millibili. Blóði er safnað fyrir bólusetningu og sermi-80Y er útbúið og geymt til notkunar síðar.

Áhrif WCDPS og CCDPS á vöxt músa:

Til að fylgjast með áhrifum WCDPS og CCDPS á vöxt músa, var þyngd músa í hverjum hópi vigtuð við 0 d fyrir fyrstu bólusetningu, 14 d og 21 d eftir bólusetninguna.

Greining á IgG mótefni í sermi músa og vélritun eftir WCDPS og CCDPS bólusetningu:

Óbein ELISA aðferð var notuð til að ákvarða sermismótefni. Húðaði ELISA plötuna með 2,5 jig/ml OVA, 4Y yfir nótt; þvegið með PBST 3 sinnum og síðan bætt við 5 prósent fitulaust mjólkurduft 37L til að loka í 1 klst; þvegið þrisvar sinnum með PBST og aðalmótefninu bætt við mýsnar eftir bólusetningu í hverjum hópsermi, aðal mótefnaþynningarhlutfallið er 1: 100, 100 pilla í hverri brunn, 37Tl klst; eftir þvott 3 sinnum með PBST, bætið við aukamótefnum: geitamótmúsum IgG, IgGl, IgG2a (l: 5 000) merkt með HRP 37 Ræktaðu drekann í 1 klst; eftir þvott 4 sinnum með PBST, bætið við tetrametýlbensidín (TMB) hvarfefnislausn til að forðast ljós í 15 mínútur. Bætið 50 í hvern brunn til að stöðva hvarfið með 2 mól/L H2SO4 og mælið A45O/655 gildið. Berðu saman magn mótefna í hverjum hópi.

Greining á fjölgun músa milta eitilfrumna eftir WCDPS og CCDPS ónæmisaðgerð:

MTT aðferð var notuð til að greina fjölgun eitilfrumna í milta músa sem voru bólusettar með CCDPS og WCDPS. Milta músanna var einangruð við smitgát 21 dögum eftir fyrstu bólusetningu og miltafrumurnar voru þynntar með 10 prósent FBS-innihaldandi RPMI 1640 miðli til að búa til stakar frumur. frumur/ml dreift í 96-brunn frumuræktunarplötu, bætið við 20 OVA (lokastyrkur 10 |xg/ml) og ConA (endastyrkur 5 grís/ml) í sömu röð. Örva, stilltu tóma frumustjórnun og tómt sermi stjórna á sama tíma, setja það í 37Y frumu útungunarvél í 48 klukkustundir, bæta 20 MTT við hvern brunn, 37^ og halda áfram að rækta í 4 klukkustundir, bæta 100|±1 DMSO í hvern brunn til að leysa upp og prófa hjartað 0 /63. Gildi, reiknaðu örvunarstuðul (SI) hvers hóps músa.

Tjáning CD4 og CD8 á CD3 plús T frumum eftir WCDPS og CCDPS ónæmisaðgerð:

Flæðifrumumæling var notuð til að greina tjáningu CD4 plús T og CD8*T frumna á yfirborði CD3 plús T frumna. Músarmiltan var einangruð við smitgát 21 dögum eftir frumbólusetninguna og miltan var meðhöndluð með RPMI 1640 miðli sem innihélt 10 prósent FBS. Undirbúið einfrumusviflausn, teljið og stillið frumufjöldann að 1x106 frumum/sýni, framkvæmið CD4 og CD8 litun á yfirborði CD3 plús T frumna, verjið gegn ljósi við stofuhita í 25 mínútur og notið 10 ml af fosfat-bufferða lausn sem inniheldur 0,5 prósent FBS (fosfat-bufferða lausn). saltvatn, PBS) 1 200 s/mín. 7 mín þvo einu sinni, bæta við 250 |jil PBS, fara í 200 möskva koparmöskva, frumuflæðismælingu til að greina tjáningu CD4 og CD8 á yfirborði CD3*T frumna.

Tölfræðilegar aðferðir:

Flowjo 7.6 hugbúnaður vinnur úr niðurstöðum flæðifrumumælinga; GraphPad Prism 5.0 er notað fyrir gagnagreiningu og gögnin eru öll byggð á meðaltali ± staðalfráviki. Notaðu Nemandi og próf til að bera saman gögnin milli tilraunahópanna. P<0.05 means="" that="" there="" is="" a="" difference.="" statistical="">

Niðurstaða

1. The effect of WCDPS and CCDPS on the growth of mice: After co-immunization with WCDPS and CCDPS and OVA, weigh the weight of the mice (Table 1). There was no statistically significant difference in the bodyweight of mice in each group during the same growth period ( P>0.05).

2. Áhrif WCDPS og CCDPS á OVA-sértæk mótefni IgG: WCDPS og CCDPS voru bólusett undir húð með OVA til að greina tjáningu OVA-sérhæfðs mótefna IgG í sermi eftir 14 daga og 21 daga ónæmisaðgerð. Niðurstöðurnar eru sýndar á mynd 1, WCDPS og CCDPS ýttu undir tjáningu mótefna IgG í sermi á skammtaháðan hátt; OVA plús WCDPS 50 p,g samanborið við OVA plús CCDPS 50 |xg getur verulega stuðlað að OVA-sértækum mótefnum samanborið við OVA plús CCDPS 50 |xg. Tjáning IgG (F<0.05), but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" compared="" with="" the="" aluminum="" adjuvant="" group="" (p="">0.05); the difference between WCDPS and CCDPS at the same dose was not statistically significant (P>0.05).

3. Áhrif WCDPS og CCDPS á OVA-sértæka mótefnagerð: 21 dögum eftir ónæmisaðgerð greindist tjáning OVA-sérhæfðs mótefnaflokkunar IgG1 og IgG2a í sermi. Niðurstöðurnar eru sýndar á mynd 2. OVA-WCDPS 50 jig og OVA-WCDPS 100 |xg Mumu ýttu verulega undir tjáningu mótefnis IgG2a í sermi en OVA hópurinn einn (P<0.05); both="" ova-wcdps="" 50="" and="" ova-ccdps="" 50="" pigs="" could="" significantly="" promote="" the="" expression="" of="" ova-specific="" antibody="" iggl=""><0. 001);="" compared="" with="" ova-wcdps="" 50="" p,g,="" and="" ova-wcdps="" 100="" jig,="" the="" aluminum="" adjuvant="" group="" can="" significantly="" promote="" the="" expression="" of="" antibody="" igg2a=""><0.05); the="" expression="" of="" antibody="" typing="" is="" different="" between="" wcdps="" and="" ccdps="" at="" the="" same="" dose="" no="" statistical="" significance="" (p="">0.05).

4. Áhrif WCDPS og CCDPS á fjölgun músa OVA-sértækra eitilfrumna: Til að greina áhrif WCDPS og CCDPS á milta eitilfrumur voru fjölsykrur frá cistanche bólusettar undir húð með OVA og miltafrumur aðskildar 21 dögum eftir bólusetningu. , og MTT aðferðin var notuð til að greina þær. Stuðla að OVA-sértækri eitilfrumufjölgun. Niðurstöðurnar eru sýndar á mynd 3. WCDPS og CCDPS auka OVA-sértæka eitilfrumnafjölgun á skammtaháðan hátt. Samsetning WCDPS og CCDPS með OVA hópnum getur verulega stuðlað að OVA-sértækri eitilfrumufjölgun samanborið við OVA hópinn einn. Eitilfrumufjölgun (P<0.05); ova-wcdps="" 50="" jig="" and="" ova-ccdps="" 50="" |xg="" compared="" with="" an="" aluminum="" adjuvant="" group="" can="" significantly="" promote="" ova-specific="" lymphocyte="" proliferation=""><0.05); the="" same="" dose="" of="" wcdps="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" ccdps="" and="" ccdps="" (p="">0.05).

5. Áhrif WCDPS og CCDPS á CD3 plús CD4 plús T og CD3 plús CD8 plús T frumur: 21 dögum eftir að WCDPS og CCDPS voru bólusett undir húð með OVA, var tjáning CD4 og CD8 í CD3 plús T frumum greind með frumuflæðisgreiningu. , eins og sýnt er á mynd 4A Sýnt er að OVA-WCDPS 50, OVA-CCDPS 50 jig og OVA-WCDPS 100 geta verulega stuðlað að útbreiðslu CD3 plús CD4 plús T frumna (P<0.05); as="" shown="" in="" figure="" 4b,="" ova-wcdps="" 10="" a,="" ova-wcdps="" 50="" zhao="" significantly="" promotes="" the="" proliferation="" of="" cd3+cd8+="" t="" cells=""><0.05), ova-wcdps="" 100="" |xg,="" ova-ccdps="" 100="" significantly="" promotes="" the="" proliferation="" of="" cd3+cd8+="" t="" cells=""><0.01); but="" the="" same="" dose="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" wcdps="" and="" ccdps="" (p="">0.05); there was no significant difference between WCDPS and CCDPS and OVA compared with an aluminum adjuvant group (P>0.05).

Umræða

Fjölmargar rannsóknir hafa sýnt að kínversk jurtalækning hefur ónæmisbælandi virkni "Da], og það er líka til mikill fjöldi skýrslna sem sanna að hægt er að nota kínverska jurtalyf fjölsykrur frá cistanche sem hjálparefni til að auka ónæmisáhrif bóluefna"3], og Xinjiang eyðimerkurkjötið frá Congrong sem valið var í þessari rannsókn er einstakt lækningaefni í Xinjiang og villtar tegundir eru á barmi útrýmingar, ásamt hærra lækningagildi þeirra, er ræktun ræktaðra tegunda sérstaklega mikilvæg fyrir þróun og nýtingu auðlinda lækningajurta . Ný bóluefni á núverandi markaði hafa góða mótefnavaka sérhæfni, en lélega ónæmingargetu. Plöntufjölsykrur frá cistanche geta bætt upp fyrir þennan skort. land mitt hefur mikla yfirburði í rannsóknum á kínverskum jurtalækningum. Við skimum bóluefni úr náttúrulegum kínverskum náttúrulyfjum. Mikil hagkvæmni. Rannsóknir hafa sýnt að kínverskar jurtafjölsykrur frá cistanche hafa mismikla stjórnun á sértæku ónæmi og ósértæku ónæmi, svo sem Ganoderma fjölsykrur frá cistanche, Radixisatidis fjölsykrur frá cistanche, Poria cocos fjölsykrur frá cistanche kojiaccharide, inulin2 frá o.s.frv. Getur aukið ónæmisáhrif bóluefnisins.

Vegna hraðrar aukningar í eftirspurn eftir cistanche hafa villtar tegundir hans verið útdauðar og eru nú skráðar sem plöntur í útrýmingarhættu og verndaðar í mínu landi. Byggt á velgengni gervigróðursetningar eyðimerkur Caulis Carlsbad, er búist við að ræktaðar tegundir komi í stað villtra tegunda. Í þessari tilraun voru villt ræktaðar cistanche og ræktaðar gervi ræktaðar cistanche fjölsykrur notaðar sem OVA hjálparefni til að framkvæma in vivo ónæmisaðgerðir á músum. Með því að prófa ýmsar vísbendingar voru ónæmisáhrif villtra og ræktaðra cistanche upphaflega metin, sem gaf tilvísun fyrir árangursríka notkun ræktaðs cistanche í Xinjiang.

Til þess að skilja öryggi villt vaxa cistanche og ræktað tilbúið ræktaðcistanche sykrurfrá cistanche, in vivo dýrabólusetningartilraunir hafa athugað útlitseinkenni músa og komist að því að mýsnar eru ekki með niðurgang, upprétt hár eða tár eftir bólusetningu og starfsemi þeirra og öndun eru eðlileg og engin vöðvakippur eru. Ekki var marktækur munur á líkamsþyngd músanna í hverjum hópi vegna röskunarfyrirbærisins, sem bendir til þess að WCDPS og CCDPS bólusetningin hafi ekki áhrif á vöxt músanna og hafi ákveðið öryggi. Mótefna IgG og niðurstöður vélritunarprófa sýna: WCDPS og CCDPS geta verulega aukið tjáningu á OVA-sértæku mótefni IgG eftir samónæmi með OVA, og áhrifin eru jafngild ál hjálparefni; það getur verulega aukið tjáningu á OVA-sértækum mótefnagerð IgG2a og IgGl, Það sýnir að fjölsykrur frá cistanche auka Th1 og Th2 ónæmissvörun á sama tíma og það er enginn marktækur munur á WCDPS og CCDPS. Niðurstöður mótefnagerðar IgG2a komust að því að WCDPS og CCDPS og OVA samónæmishópur getur aukið tjáningu IgG2a verulega samanborið við ál hjálparefni hópsins, ál hjálparefni er veikara í að stuðla að tjáningu T frumna, sem sannar að WCDPS og CCDPS eru notuð sem hjálparefni Getan til að stuðla að frumuónæmi er marktækt meiri en ál hjálparefna.

Niðurstöður greiningar á eitilfrumufjölgun með MTT aðferð sýndu að miltafrumur músa í hverjum hópi voru örvaðar með OVA. Örvunarstuðull (SI) eitilfrumnafjölgunar í WCDPS og CCDPS ásamt OVA var marktækt hærri en í OVA einum bólusetningarhópnum. OVA- Örvunarstuðull WCDPS 50 Ah og OVA-CCDPS 50 jig hópsins var marktækt hærri en ál hjálparefnahópsins; það gefur til kynna að WCDPS og CCDPS ásamt OVA hópnum geti aukið verulega fjölgun OVA-sértækra eitilfrumna samanborið við OVA hópinn og ál hjálparefnahópinn.

Það eru mismunandi undirhópar T eitilfrumna. CD3 er yfirborðssameind allra T eitilfrumna. Samkvæmt mismunandi svipgerðum er hægt að skipta þeim í CD8 plús T frumur og CD4 T frumur. CD4 plús sameindir geta myndast undir virkni MHC fl sameinda, sem eru aðallega notaðar sem hjálparfrumur (Th) eftir virkjun. CD8 plús sameindirnar þurfa að myndast undir virkni MHC I sameinda. Eftir virkjun verða þær drápsfrumur (TC eða CTL) sem gegna mikilvægu hlutverki í ónæmi gegn veirusýkingum og æxlisónæmi. 3". Flæðifrumumæling greinir CD3PD4 plús T og CD3 plús CD8 plús T frumu tjáningu, niðurstöðurnar sýna að WCDPS og CCDPS geta verulega stuðlað að fjölgun CD4 plús T og CD8 plús T frumna innan ákveðins skammtabils, og það er engin marktækur munur á WCDPS og CCDPS við sama skammt Samsetning CCDPS og OVA getur örvað tjáningu CD3 plús CD4 plús T og CD3 plús CD8 plús T frumna, og áhrifin tvö eru jafngild.

Í stuttu máli eru WCDPS og CCDPS örugg sem hjálparefni. Eftir að hafa verið bólusett með OVA geta þau samtímis aukið sérstakt húmorsónæmi og frumuónæmi. Í samanburði við ál hjálparefni hafa WCDPS og CCDPS betri áhrif á aukningu á frumuónæmi og það er enginn munur á aukaáhrifum fjölsykranna tveggja frá cistanche. Þessar rannsóknarniðurstöður veita efnislegar tilvísanir fyrir Xinjiang gervi ræktaðar cistanche fjölsykrur úr cistanche sem hjálparefni og veita einnig efnislegan grunn til að skima örugg og skilvirk ónæmisónæmisefni úr Xinjiang eyðimörkinnicistanche.

Heimildir

[1] Zhao X, Sun W, Zhang S, o.fl. Ónæmishjálparsvörun fjölsykra frá Atractylodis macrocephalus Koidz í kjúklingum sem eru bólusettir gegn Newcastle-veiki (ND) [J]. Carbohydr Polym, 2016, 190-196. DOI: 10. 1016/j. kolvetnapopp. 2016. 01.033.

[2]Li J, Wang X, Wang W, o.fl. Pleurotus ferulate vatnsþykkni eykur þroska og virkni músbeinmergsafleiddra dendritic frumna í gegnum TLR4 boðleið [J]. Vaccine, 2015, 33(16): 1923-1933. DOI: 10.1016/j. bóluefni.2015.02. 063.

[3]Zhao H, Luo Y, Lu C, o.fl. Ónæmissvörun í iðraslímhúð gæti komið af stað ónæmisbælandi virkni Ganoderma fjölsykru í músum [J]. Planta Med, 2010, 76(3): 223-227. DOI: 10. 1055/S-0029-1186055.