TUNEL próf: Öflugt tæki til að meta nýrnaskaða

Tengiliður:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Ágrip:Endanleg deoxýnukleótídýl transferasa dUTP nick-end merking (TUNEL) próf er gamalgróið próf sem er notað til að greina frumudauða tengda DNA sundrun (3'-OH DNA enda) með endónukleasum. Vegna þess að þessi ensím eru sérstaklega virk í nýrum, er TUNEL mikið notað til að bera kennsl á og mæla DNA sundrun og frumudauða í ræktuðumnýru frumur og nýru dýra og manna sem stafa afeitur- eða súrefnisskaða. Snemma lýsingin á TUNEL sem apoptotic prófun hefur leitt til margra rangtúlkana á aðferðumnýrnafrumu meiðsli.Engu að síður er TUNEL að verða sífellt vinsælli fyrirnýrnaskaðamat vegna þess að það er hægt að nota almennt í ræktuðum frumum og vefjafrumum og fyrir allar leiðir til frumudauða. Ennfremur er það viðkvæmt, nákvæmt, magnbundið, auðvelt að tengja það við sérstakar frumur eða vefjahólf og hægt er að sameina það með ónæmisvefjafræði til að leyfa áreiðanlega auðkenningu á frumugerðum eða líklegum aðferðum frumudauða. Hefð hefur TUNEL greining verið takmörkuð við tilvist eða fjarveru TUNEL merki. Hins vegar er hægt að fá viðbótarupplýsingar um gang frumudauða með greiningu á TUNEL mynstrum.

kynferðisleg örvun nýrnasjúkdóms meðferð með cistanche viðbót dufti

Kynning DNA er eina sameindin í frumunni sem hægt er að gera við, en ekki er hægt að endurmynda hana að fullu eftir skemmdir. Eyðing DNA er eitt af lokastigum fjölþrepa frumudauðaferlis, sem er mögulega afturkræf þar til endanleg DNA sundrun er. Þess vegna er hið síðarnefnda algengur eiginleiki og vélrænni merki um óafturkræfan frumudauða [1,2]. DNA sundrun sem tengist frumudauða er venjulega „sjónsýnd“ með endanlegri deoxýnukleótidýltransferasa dUTP nick-end merkingu (TUNEL) prófun, DNA stiga eða halastjörnuprófi [3]. Púlssviðs rafdrætti [4] og tilviljunarkennd fákjarna frummyndun (ROPS) próf [5] eru tvö önnur sjaldan notuð aukapróf. Notkun halastjörnugreiningar er takmörkuð við in vitro (ræktaðar frumur) eingöngu og magngreining þess er vinnufrek [6]. Það er mögulegt að framkvæma halastjörnumælingar í einangruðum frumukjörnum, en það tengist fleiri truflandi þáttum við einangrun kjarna. Önnur, DNA stigaprófun, er ekki megindleg aðferð og upphaflega vonin um að stigamynstur á móti stroki myndi greina á milli frumudauða og dreps, í sömu röð, var eytt þar sem þessi aðferð reyndist óáreiðanleg [7]. Af þremur helstu aðferðum er TUNEL viðkvæmasta, minnst tímafrekt og algengasta. Það er hægt að nota í ræktuðum frumum og vefjum og fyrir allar frumudauðaaðferðir. Það er nákvæmt, magnbundið, auðvelt að tengja það við sérstakar frumur eða vefjahólf og hægt er að sameina það með ónæmisvefjafræði til að leyfa áreiðanlega auðkenningu á frumugerðum eða aðferðum frumuskaða sem tengjast TUNEL-jákvæðum merkjum [2].

DNA brot sem hægt er að mæla með TUNEL eru aðallega framleidd af apoptotic endonucleases. Virkustu endonucleases í nýrum eru deoxyribonuclease 1 (DNasi I) og endonuclease G (EndoG) [8–10]. DNase I er virkasti og algengasti apoptotic endonuclease í spendýrum [11]. Nýrun, munnvatnskirtlar, bris og þarmar eru líffæri sem vitað er að framleiða mikið magn af DNase I. Þekjufrumur í munnvatnskirtlum, brisi og þörmum seyta DNase I sem meltingarensím í meltingarvegi. Sumir frumu-DNasis I berjast gegn "erlendu" DNA sem ráðast inn í hýsilfrumur [12]. Óútskilinn DNasi I stafar af duldri hættu fyrir DNA hýsilfrumu, en venjulega virka DNasar ekki á hýsilfrumu DNA fyrr en fruman slasast eða deyr. Í nýrum er DNasi I seytt af pípulaga þekjufrumum, væntanlega til að eyða veirum og bakteríum í þvagi. Þessi virkni fer líklega fram í tengslum við próteinasa, einkum meprin, sem er aðalpróteinasinn í þvagi [13]. Þó að það sé verndandi gegn sýkingu, gerir nærvera mjög virks DNasa í nýrum þetta líffæri viðkvæmt fyrir meiðslum, þar sem vitað er að virkni DNase hefur frumudrepandi áhrif á hýsilfrumur. DNasar stuðla að frumudauða af völdum eitraðra eða súrefnisskorts áreiti og eyðileggja allar DNA frumur hýsilnýra sem losna við frumudauða.

Nýrueru að sía líffæri sem fjarlægja eitruð efnasambönd úr líkamanum. Mikil DNase I virkni í nýrum gerir nýrnafrumur mjög viðkvæmar fyrir meiðslum frá eitruðum efnasamböndum og efnaskiptaafurðum þeirra. Þetta gerir TUNEL að viðeigandi og viðeigandi aðferð til að mæla áverka á nýrum. Í þessari umfjöllun munum við einblína á TUNEL sem mikið notaða, upplýsandi og nákvæma prófun til að mæla frumudauða og vefjaskaða í nýrum. Við munum ræða þætti TUNEL eins og það á við um nýrnasjúkdóma og meiðsli og auðkenna eiginleika, tækni og vannotaða eiginleika TUNEL til að stuðla að afkastamikilli og viðeigandi notkun þessa öfluga prófunar í rannsóknum, greiningu og meðferð á nýrnasjúkdómum. Við munum einnig ræða ýmis TUNEL myndmynstur sem hægt er að tengja við frumudauðakerfi. Atriði sem sett eru fram í þessari umfjöllun eiga í stórum dráttum við um TUNEL notkun í öðrum líffærum en nýrum.

Leitarorð:TUNEL; frumudauði; nýru; DNasar; endonucleases; vefjaskaða

TUNEL meginreglurTUNEL prófið var þróað árið 1992 af Gorczyca o.fl. [14] og Gavrieli o.fl. [15], með því að nota flúorókróm og avidin-peroxidasa merkingu, í sömu röð. Á þeim tíma var örvæntingarfull þörf fyrir nýjar aðferðir til að meta apoptosis og TUNEL fyllti þetta skarð með góðum árangri. Upphaflega markaðssett sem prófun fyrir brot á DNA strengi meðan á eða í tengslum við frumudauða [14,16], þar sem ekki voru betri mælingar, varð TUNEL fljótt staðlað próf fyrir frumudauða [17,18]. Hins vegar var það viðurkennt nánast samstundis af vísindamönnum að TUNEL mældi ósjálfrátt hvers kyns DNA sundrungu, ekki bara þann sem tengdist apoptosis [19-21]. Engu að síður var þörfin fyrir apoptotic mælingar svo mikil að sjaldgæfar skýrslur um að TUNEL væri ósérhæfður fyrir apoptosis voru almennt hunsaðar. Þetta leiddi til gífurlegs magns fölsk-jákvæðra tilkynninga um frumudauða í nýrum og öðrum líffærum, að því marki að allt að 20 prósent af heildarfrumum var tilkynnt um frumudauða jafnvel án meiðsla [22–25] þegar breytingar sem lítið sem 0,01 prósent gæti verið tölfræðilega marktæk vísbending um vefjaskaða.

TUNEL prófið hefur fengið endurreisn á undanförnum árum frá því að uppsveiflunni í rannsóknum á apoptosis lauk fyrir nokkrum árum. PubMed leit okkar að tímaritsgreinum sem innihalda „nýra“ og „TUNEL“ hugtök skilaði yfir 1500 niðurstöðum frá 1992 til 2020. Árið 2019 voru birtar 170 greinar, mesti fjöldi á einu ári undanfarin 28 ár (Mynd S1) og sem eru meirihluti greina sem skoðaðar voru fyrir þessa umfjöllun. Fjölmargar rannsóknir notuðu TUNEL-jákvæðni sem alhliða mælikvarða á DNA sundrunartengdan frumudauða í öðrum gerðum frumudauða fyrir utan frumudauða. Til dæmis er hægt að greina ferroptosis, nýuppgötvað form forritaðs frumudauða sem ekki er apoptotic, af völdum oxunarskemmda sem á sér stað við nýrnablóðþurrð (IR) í músum, með TUNEL [26]. Pyroptosis, sem er bólgueyðandi form forritaðs frumudauða sem er aðgreint frá frumudauða og drepi, er sýnt fram á að tengjast TUNEL-jákvæðum merkjum [27,28]. TUNEL-jákvæðni kom fram meðan á drepi stóð sem stuðlaði að versnandi eyðingu nýrnapíplafrumna hjá rottum sem fóru í nýranám [29]. Í nýrum og öðrum vefjum hafa jákvæð TUNEL merki fundist í drepi [30,31], óreglulegri sjálfsáhrifum [32-35], anoikis [36,37], mítóskum hörmungum [35,38], sjálfslysi [39], sjálfsofnæmi. [39], proptosis [40] og aponeurosis [30], sem sýnir að TUNEL er sannarlega alhliða prófun fyrir óafturkræfan frumudauða.

TUNEL prófið byggist á merkingu 3'OH enda með 3'OH-enda sértæku DNA ensími, enda deoxýnukleótidýl transferasa (TdT) (mynd). Notkun DNA-pólýmerasa eða Klenow-fragment DNA-pólýmerasa í stað TdT getur hjálpað til við að ákvarða gerð 3'OH-enda (högg, eyður eða yfirhangandi oligos) vegna þess að DNA-pólýmerasar þurfa sniðmát (andstæða DNA-strenginn) og munu því ekki merkja hangandi eða útstæð DNA endar. Mikilvægt er að muna að framleiðsla 3ZOH DNA-enda er ekki einstök fyrir apoptotic (DNA-niðurbrotandi) endonucleasa. 3'OH DNA endar eru aðal "samskipta" merki, samnefnari meirihluta DNA ensíma. Þau eru framleidd og notuð af næstum öllum DNA ensímum í heilkjörnungum, þar á meðal DNA viðgerðar (apurinic/apyrimidinic, AP) endónukleasa, exonucleasa, DNA pólýmerasa, DNA ligasa, DNA transferasa og tópóísómerasa. Að auki er hægt að breyta 3'Id 3z-sykri eða 3z-próteinsamböndum í 3'OH enda með fosfatasa, glýkósýlasa og próteinasa, í sömu röð. Þess vegna er nákvæmur skilningur á því sem verið er að mæla nauðsynlegur fyrir árangursríka beitingu TUNEL og túlkun á niðurstöðum þess.

Í samanburði við tvær aðrar aðalaðferðir við DNA sundurgreiningarmælingar, DNA stiga og halastjörnugreiningu, hefur TUNEL þann kost að byggja á auðkenningu DNA enda frekar en brota (Mynd 2). Fræðilega séð ætti TUNEL að vera næmari og línulegra til að bera kennsl á upphaflega (lítið) DNA sundrun en DNA stigi eða halastjörnu, sem báðir hafa töf við uppsöfnun lítilla brota með mikla hreyfanleika. Í öllum tilvikum, rannsóknir sem sameina TUNEL við annaðhvort halastjörnu )41,42] eða DNA stiga [43,44] hafa einhvern kost á því að ná snemma DNA sundrun með hámarks næmi.

TUNEL umsóknirTUNEL er notað til að bera kennsl á og mæla nýrnaskaða í klínískum og grunn eiturefnafræðilegum rannsóknum í margvíslegum notkunum, þar á meðal læknisfræðilegum meðferðum [45], umhverfis [46], landbúnaði [41] og iðnaðar [47] váhrifum og dýra [48] ] og matvælafræði [49]. TUNEL á við um allar frumugerðir, líffæri og tegundir sem hafa DNA og DNasa, sem inniheldur nánast allar tegundir. TUNEL hefur verið notað til að bera kennsl á og mæla nýrnaskaða í fjölmörgum dýrum, þar á meðal sebrafiskum [50], japanskum hrísgrjónafiskum [51], kjúklingum [48], gerbils [52], músum [41], rottum [45], rabb þess [53], smásvín [54] og menn [55]. Mikilvægur kostur við TUNEL er að það er hægt að nota í föstum ræktuðum frumum sem og föstum vefjum. Þetta veitir aðferðafræðilega samkvæmni til samanburðar á in vitro og in vivo niðurstöðum í rannsóknum þar sem hægt er að kanna gangverk í ræktuðum nýrnafrumum, en áhrif in vivo eru metin í nýrum dýra. Allt sem er á milli heilra frumna og vefja er líka hægt að nota, þar á meðal ræktaðar frumukúlur [56] og ex vivo nýrnasneiðar [57,58].

Styrkur TUNEL hvað varðar merkisstyrk eða fjölda TUNEL-jákvæðra frumna getur verið mismunandi eftir tegundum eftir virkni DNasa. Reynsla okkar er að rotta nýra hefur virkara DNase I en músarnýru og TUNEL-jákvæður merkistyrkur tengist þessu. Þegar nýrað er borið saman við önnur líffæri er TUNEL-jákvætt merki þess mjög sterkt og svipað og önnur líffæri með mikla DNase I virkni, eins og þarma og munnvatnskirtlar. Á hinum enda litrófsins sést lægsti TUNEL-jákvæði boðstyrkurinn í heila og æxlis-/krabbameinsfrumum, þar sem DNase I tjáning er líklegast óvirkjuð með annarri splæsingu á kóðunarsvæðinu [59]. TUNEL-jákvætt merki sést í öllum frumugerðum í nýrum. Að meðaltali skemmist pípulaga þekjuvef oftar en gaukla, sérstaklega við bráða meiðsli (Mynd 3A). Þetta tengist vel DNase I virkni sem er ríkjandi í þessum tegundum frumna. Miðað við kyn- og aldursmun sem sést í tilraunum okkar er DNasi I algengara og virkari hjá körlum en kvendýrum og miðaldra dýrum samanborið við gömul dýr eða nýburadýr. Hins vegar er enginn greinilegur munur á TUNEL-jákvæðni áberandi í tengslum við kyn eða aldur, líklega vegna þess að áberandi eða er ríkjandi af öðrum þáttum. Í sumum nýrnalíkönum (eins og blóðþurrð-endurflæði) er DNasi I framkallað [9]; en í öðrum er það ekki og gæti jafnvel verið bælt (til dæmis í cisplatín eiturverkunum) [10]. Sýnt hefur verið fram á að virkjun innkirtla, ef þau eru til staðar, eigi sér stað innan fyrsta 24 klst. eftir nýrnaskaða [9,60,61]. Þess vegna kom það ekki á óvart að að minnsta kosti helmingur TUNEL umsóknanna í nýrnarannsóknum í þessari endurskoðun var notaður fyrir bráðan nýrnaskaða (AKI) þar sem mat á AKI er oft gert innan 24 til 72 klst. eftir áverka þegar innkirtlaefni eru virkast . Listinn yfir AKI rannsóknir er langur og inniheldur eituráverka, rotþró, ígræðslu og súrefnisskaða. Í þessari vinnu könnuðum við líkön, váhrifagerðir, meðferðir, tímalínur mats og frumugerðir sem hafa áhrif á þessar rannsóknir. Rannsóknirnar sem voru könnuð náðu yfir bráða og blönduð bráð-krónískan nýrnaskaða og langvinnan nýrnasjúkdóm.

Hvort nýrnaskaða með TUNEL-jákvætt merki sést í píplum eða gaukla fer eftir tegund skaðlegs efnis eða sjúkdóms. Til dæmis var nýrnabólga í úlfa í mönnum og skemmdum á nikkel nanóagna lýst þannig að þau hefðu stranglega gaukla TUNEL-jákvæð merki [62,63]. Á hinn bóginn framleiddu blóðþurrð-endurflæði og streptósótósín af völdum nýrnakvilla af völdum sykursýki í rottum aðeins TUNEL-jákvæðar frumur í píplunum [64,65]. Nærpíplar, Henle's lykkja, fjarpíplar og sameiginlegar rásir eru oft TUNEL-jákvæðar í blóðþurrðar-endurflæðislíkönum. TUNEL-jákvæðum frumum í bæði gaukla og píplum var lýst í rottum sem voru útsettar fyrir lyfjum eins og cyclosporine A [66] og doxorubicin [67] eða neysluvöru eins og sinkoxíð nanóögnum [68] og í rottulíkani af sykursýki [68] 69]. AKI af völdum rotsóttarlosts í mönnum var einnig tengt bæði gaukla- og pípulaga TUNEL-jákvæðum frumum [70]. kyrkt lokaðri lykkju í smáþörmum olli TUNEL-jákvæðni í nýrum á 3 klst. [87].

AKI getur komið fram eftir ígræðslu og súrefnisskaða. Höfnun ósamgena ígræðslu hjá mönnum er almennt tengd hækkun á TUNEL-jákvæðum frumum [88,89]. Eftir kalt blóðþurrð sáust TUNEL-jákvæðar frumur venjulega innan 2-24 klst. við endurflæði [90], eða þröngt, á milli 14 og 17 klst. eftir blóðþurrð [91], og stundum sjást við enn eins seint og 7 dögum í höfnun ígræðslu [92]. Á sama hátt, í blóðþurrðar-endurflæðislíkönum, sáust TUNEL-jákvæðar frumur oftast 24 klst. eftir endurflæði [44,93,94], eða á bilinu á milli 4 [95,96] og 72 klst. [97]. Í bæði ígræðslu og blóðþurrðarrannsóknum á AKI voru TUNEL-jákvæðar frumur staðbundnar í fjarlægar og nærliggjandi pípulaga þekjufrumur [44,93]. Í músnýrueftir blóðþurrðar-endurflæðisskaða var TUNEL-jákvæðum frumum lýst sem einbeittar í corticomedullary junction, venjulegu skotmark blóðþurrðarskaða [98].

Blönduð bráð og langvinn meiðsli, þar sem eituráhrif, sjúkdómsástand og/eða mat voru bæði bráð (þ.e. klukkustundir, dagar) og langvinnir (þ.e. vikur, mánuðir, ár) í sömu rannsókn, komu fram í ígræðslu manna höfnun (vefsýni 1 viku til 3 árum eftir ígræðslu) [88], lifrarbólgu E veirusýkingu í svína (7 og 14 dögum eftir sáningu) [52], streita af völdum CO2 pneumoperitoneum í vatnsnýrnasjúkdómumnýru(2 vikur vatnsrýrnun, 2 dögum eftir pneumoperitoneum) [53], mesangial fjölgun glomerulonephritis af völdum snákaeiturs (1 til 14 dögum eftir inndælingu) [99], einhliða þvagrásarstífla (1 til 14 dagar af hindrun) [100], útsetning fyrir úranýl asetati (1 til 28 daga útsetning) [101], aristókólsýru nýrnakvilli (5 og 30-daga dagleg útsetning) [102], og ofoxí hjá nýburum (prófað 1 til 60 daga eftir fæðingu, útsett fyrir ofoxíu fyrstu 14 dagar) [103]. Fjórtán dögum eftir áhrif er mjög algengur matstími fyrir svonanýrnaskaða[52,53,99,101,103]. Í flestum tilfellum voru TUNEL-jákvæðar frumur staðbundnar í píplum og sameiginlegum rásum. Eina undantekningin var eituráhrif á snákaeitur, sem skaðaði fyrst og fremst hnoðrana [99].

Langvarandinýrusjúkdómur (CKD), skilgreindur sem tilvistnýruskemmdir eða minnkuð gauklasíunarhraði (GFR) hjá mönnum í lengri tíma en 3 mánuði, er einnig algengt viðfangsefni fyrir TUNEL mat, sem getur ákvarðað hvort nýrnasjúkdómur tengist versnandinýrnaskemmdir.Algengasta nýrnasjúkdómurinn sem er rannsakaður þar sem TUNEL er notaður er nýrnakvilli af völdum sykursýki. Skaðinn sem greindur var með TUNEL-jákvæðni átti sér stað í píplum og fræfrumum [69] hjá sykursýkissjúklingum með upphaf sykursýki fyrir TUNEL próf á bilinu 7 til 30 árum [104.105] og 2 til 16 vikum eftir streptósótósínmeðferð hjá nagdýrum [106.107]. Tilkynnt var um svipaða TUNEL-jákvæða vefjameinafræði við immúnóglóbúlín A nýrnakvilla [22]. Í nýrnabólga í úlfa og himnufjölgunarheklabólgu sást TUNEL-jákvæðni fyrst og fremst í glomeruli [62,108,109]. Á hinn bóginn sáu lyfjaöryggisrannsóknir á cisplatíni [110], klórókíni [45], doxórúbicíni [67], finasteríði [23], takrólímus [111] og levetiracetami [24] aðallega pípluskemmdum. Sömuleiðis var áframhaldandi bráðum meiðslum sem greindust af pípulaga TUNEL-jákvæðum frumum lýst í rannsóknum á þvagsýrunýrnakvilla [112], metíónínskorti [48], útsetningu fyrir umhverfiseiturefnum microcystin-LR [50] og kadmíum [113] og í tengsl við kalsíumoxalat af völdumnýrusteinar [114] og kölkandi nanóagnir [115]. Þó að auðkenning á versnandi nýrnaskemmdum meðan á nýrnasjúkdómi stendur með því að nota TUNEL prófið sé gagnlegt greiningartæki, væri að sameina TUNEL prófið með ónæmisvefjafræði (IHC) ef til vill enn upplýsandi við að ákvarða meiðsli.

TUNEL magngreiningar- og samstaðatækni

Aðferðir við TUNEL magngreiningu eru mismunandi. Í meirihluta skýrslna eru TUNEL-jákvæðar frumur/kjarna magngreindar sem hundraðshluti heildar frumna/kjarna [83,116,117]. Þetta virðist vera rétt að gera, þó að fjöldi TUNEL-jákvæðra frumna samsvari líklega ekki nákvæmlega fjölda dauða frumna. Sumar frumur hafa ef til vill ekki náð auðkennanlegum stigum DNA sundrungar, en aðrar gætu þegar hafa verið útrýmt með átfrumum. Einnig er notuð magngreining á fjölda TUNEL-jákvæðra frumna á hverja fermetraeiningu (mm2) [118], en þessi aðferð virðist ónákvæmari vegna þess að hún fer eftir staðsetningu og frumutegundarinnihaldi svæðanna. Barkarhlutar innihalda að mestu gaukla, píplur, æðar og merggeisla, en merghlutar innihalda fyrst og fremst lykkjur af Henle, safnrásum og æðum. Magngreining „á hvern hluta“ fer vissulega eftir því hvert reiturinn er [72.119] og magngreining „á hvern hluta“ er, jafnvel meira, óskilgreind [61.120]. Illa auðgreindar mælingar, svo sem "vefjafræðilegt stig" [121], "apoptotic index" [113], "apoptosis hlutfall" [92], "prósentu af apoptosis" [122], eða hlutfall ómeðhöndlaðrar samanburðar [123,124], virðast vera vera enn síður viðeigandi og gera túlkun erfiða og ekki sambærilega við flestar rannsóknir.

Frumudauði í nálægum frumum byrjar ójafnt vegna þess að það fer eftir æðamyndun, frumuhring og öðrum breytum. Þetta leiðir oft til ójafnrar TUNEL-litunar á frumum í vefnum [45,96,125]. Það kemur á óvart að almennur styrkur TUNEL-jákvæða merkjanna er ekki notaður fyrir TUNEL mælingar, þrátt fyrir að það fari beint eftir hversu DNA sundrunin er. Þetta er kannski vegna þess að frumur eru taldar dauðar óháðar styrk TUNEL merkisins, þar sem fruma getur ekki verið "dauðari" ef TUNEL litunin er sterkari. Þrátt fyrir að erfitt sé að bera saman rannsóknir sem nota margvíslegar aðferðir til að mæla TUNEL niðurstöður, er magn TUNEL-jákvæðra frumna í samanburðardýrum venjulega undir 2 prósentum [75,99,100,116,126]. Bráð meiðsli tengist ~5-40× aukningu á TUNEL-jákvæðni [79,126,127]. Við langvarandi meiðsli er aukningin á TUNEL-jákvæðum frumum örlítið minni, ~2–20-föld, [29,43,65] samanborið við ómeðhöndlaða viðmiðunarhóp.

Upphaflega TUNEL prófið sem byggir á díamínóbensidín (DAB) litun var hannað fyrir ljóssmásjárskoðun [14,15]. Þessi hefðbundna aðferð var enn notuð í tveimur þriðju hluta þeirra rannsókna sem könnuð voru í þessari yfirferð og í yfirgnæfandi meirihluta rannsókna á vefjasýni úr mönnum. Magngreiningin er gerð með handvirkri frumutalningu og þó hún sé nákvæm er hún tímafrekt. Oft er magngreining alls ekki notuð og niðurstöðurnar eru settar fram með myndum af meðhöndluðum og lituðum sýnum sem einföld sönnun þess að frumudauði hafi átt sér stað. Sjálfvirkni getur flýtt fyrir magngreiningarferlinu [128,129]. Hins vegar er ekki hægt að sameina DAB við neina aðra litun í sama sýninu og því getur DAB-undirstaða TUNEL aðeins gefið upp fjölda dauðra frumna, án nokkurrar auðkenningar á frumugerð (nema sjóngreiningu) eða frumudauðakerfi.

Þó að rannsóknir á mönnum byggi yfirgnæfandi á DAB-undirstaða TUNEL með ljóssmásjá, þá notar um það bil helmingur dýrarannsókna FL flúrsmásjá (Mynd 3). Flúrljómandi TUNEL er sjónrænt aðlaðandi, auðvelt að túlka og hefur nokkra helstu kosti. Til viðbótar við nákvæma magngreiningu með því að auðkenna TUNEL-jákvæða kjarna eða meðalstyrk litarins, getur FL flúrljómandi TUNEL merki verið samsett með öðrum litum fyrir vefjafræði (td DAPI) (Mynd 3A) eða IHC (Mynd 3B). Í því síðarnefnda getur notkun próteinmerkja hjálpað til við að bera kennsl á TUNEL-jákvæð merki sem tengjast mismunandinýruhólf eða gefa upplýsingar um tegund frumudauða. Við gátum ekki fundið nein dæmi um TUNEL ásamt tvöföldum IHC mótefnalitun. Þó að slík samsetning væri mjög upplýsandi, til dæmis til að bera kennsl á frumudauðakerfi í ákveðnum frumugerðum, geta tæknilegir erfiðleikar í tengslum við slíka litun vegið þyngra en ávinningurinn.

Auðkenning ánýrufrumugerð er vissulega ekki vandamál fyrir reyndannýrumeinafræðingur [104]. Vegna þessa er notkun viðbótarmerkja til að bera kennsl á frumugerð, til dæmis með því að nota CD31 til að bera kennsl á æðaþelsfrumur [130], sjaldgæf. Hins vegar er oft notuð notkun IHC próteinmerkja til að lýsa vefskaða. Flestar rannsóknir nota TUNEL-jákvæðni sem eina vísbendingu um frumudauða. Í öðrum rannsóknum hefur viðurkenning á því að TUNEL-jákvæðni er ekki sértæk fyrir frumudauða leitt til þess að mörg formfræðileg (td hematoxýlín og eósín eða periodic acid-Schiff litun), lífefnafræðileg og IHC merki eru sameinuð með TUNEL litun til að staðfesta frumudauða. Algengasta merkið fyrir kaspasaháða apoptosis er klofið (virkt) kaspasi-3 með því að nota mótefni sem þekkir ekki kaspasa í fullri stærð-3 [131,132]. Bæði TUNEL og klofnar kaspasa-3 greiningar sýndu eingöngu pípulaga litun en ekki gauklalitun í blóðþurrð-endurflæði rotta [64]. Aðrar kaspasarannsóknir notuðu kaspasa-1 [27], -9 [53], -11 [28] og -12 [75]. Aðrir apoptotic merki voru B-frumu eitilfrumukrabbamein 2 (Bcl2) fjölskyldu próteina Bcl-2 [27], Bcl2L1 [43], Bcl-xl [71], Bax [99], Bak [49] og Bad [43]; apoptotic receptor Fas [52] og apoptotic receptor-bindand FasL [66]; forkhead box (FOX) prótein umritunarþættir Fox01 [133] og Fox03 [27]; og cýtókróm c [53]. Bólga var auðkennd með IHC af æxlisdrep-alfa (TNF) [134]; æxlisvaxtarþættir TGF [66] og TGF- 1 [135]; serín/þreónín kínasi 1 (SGK1) [135]; rafeindaflutningsflavóprótein, beta-undireining (ETF) [136]; Janus kínasi-2 (JAK2) [137]; merkjabreytir og virkja umritunar 3 (STAT3) [137]; kjarnaþættir kappa-léttkeðjuaukandi virkjaðar B frumur (NF-κB) [137] og hemill prótein þess IκB [137]. Fyrirnýruáverkamat, nýrnaskaðasameind-1 (KIM-1) [24], aquaporin-1 rás (AQP-1) [45], súrefnisskortur-framkallandi þáttur {{7} }alfa umritunarþáttur (HIF-1) ​​[103], Asc-gerð amínósýruflutnings-1 (Asc-1) [121], spendýramarkmið rapamýsíns (mTOR) [131] kínasa , og transglútamínasi II [89] voru notaðir. Oxandi nýrnaskaðar voru rannsakaðir með því að nota merki eins og 8-hýdroxýgúanósín (8OHdG) [102], daufkyrninga gelatínasa-tengt lípocalin (NGAL) [102], NAD-háð deacetylase sirtuin-1 (SIRT1) [138] , og hem súrefnisasa 1 (HO-1) [90]. Kínasar voru rannsakaðir ítarlega, þar á meðal c-Jun N-terminal kínasa (JNK) ferillinn [101], fosfóínósítíð 3-kínasa/prótein kínasa B/kjarnaþáttur rauðkorna 2-tengdur þáttur 2 umritunarþáttur (PI3K/ Akt/Nrf2) ferill [46], pannexín-1 (PANX1) plasmahimnu gap junction prótein [26] og mítógenvirkjaður próteinkínasa/utanfrumu merkjastýrður kínasi (MAPK/ERK) [26]. Rannsóknir á apoptótískum endonucleasum tóku þátt í kaspasavirkjaðri DNase (CAD) [139], DNase I [108] og EndoG [139], og DNA skemmdamerki innihéldu æxlisprótein p53 (p53) [99] og dínamín-tengt prótein 1 (PARP1) ) [66]. Sumar rannsóknir fundu einnig mat á endoplasmic reticulum streitumiðlaða frumudauða og vefjaskaða gagnlegt [75].

Miðað við mikinn fjölda vélrænna rannsókna sem kannaðar voru og kosturinn við að sameina TUNEL með IHC merkjum til að bera kennsl á frumudauðaferli, mætti ​​búast við mörgum rannsóknum sem nota sambyggðu milli þeirra tveggja. Greininguna má framkvæma með pixla-fyrir-pixla samsetningu milli TUNEL-jákvæðra frumna og IHC-merkja, IHC-merkja meðalstyrkur á TUNEL-jákvæðum svæðum, eða TUNEL-jákvæð merki þýðir styrkleiki á IHC-merkja-jákvæðum svæðum. Því miður hefur þessi kostur TUNEL aðeins verið notaður í fáum rannsóknum. TUNEL-jákvæðar frumur voru sambyggðar með klofnum kaspasa-3 ínýrupíplur við eituráhrif á acetaminophen hjá rottum [74]. IHC staðsetning með TUNEL-jákvæðu merki leyfði frumudauðagreiningu á mesangial frumum meðan á Habu nýrnabólgu stóð [99]. Í ljóssmásjárskoðun var samstaða með vélrænum eituráhrifamerkjum gerð í raðskurðum, eins og greint var frá af Ott o.fl. [89].

TUNEL vandamál og takmarkanir

Ýmis hugsanleg vandamál geta átt sér stað og ætti að búast við þegar unnið er með TUNEL. Ein er sú að 30OH DNA endar eiga sér stað ekki aðeins við frumudauða vegna endónukleasaverkunar heldur einnig sem eðlilegt milliefni umbrotsefnis í næstum öllum ensímhvörfum við DNA. Aðal frumuvirkni sem framleiðir 30OH enda er DNA nýmyndun, þar sem fjölmörg Okazaki brot geta fræðilega framleitt falskt jákvætt TUNEL merki, sérstaklega í mjög viðkvæmum breytingum á prófuninni. Á meðannýrnaskaða,DNA viðgerð getur einnig stuðlað að fölskum TUNEL-jákvæðum merkjum vegna AP endónukleasaverkunar. Mikill oxandi nýrnaskaði af völdum efna- (vetnisperoxíðs, bleómýsíns) eða eðlisfræðilegs (gammageislunar) skaða getur bætt við fjölda 30OH-enda, aukið falskjákvæðar TUNEL-lestur fyrir utan endónukleasa miðlaða DNA sundrungu.

Oftar og líklegra, rangt stillt tilraunaskilyrði TdT hvarfsins (tími, hitastig, ensímvirkni eða cofactors) geta leitt til tilbúnar hækkaðs TUNEL-jákvæðs merkjabakgrunns. Þrátt fyrir að það sé enn óskilgreint hvað er talið eðlilegt grunngildi fyrir ómeðhöndluð nýrnavefssýni, þá virðist líklegt að um 1 prósent af heildarfrumum væri hæfilegur fjöldi. Vissulega er 10 prósent eða hærri bakgrunnur skýr vísbending um annað hvort óeinkennuð og óhreinsuð prófunarskilyrði eða frávik frá viðeigandi geymsluskilyrðum sýna.

Annað vandamál sem búast má við er lítil DNase I virkni í sumum frumugerðum (td æðaþeli),nýruhólf (td glomeruli), eða meinafræðilegur vefur (td æxli). Búast má við því að þessar frumur sýni litla TUNEL jákvæðni, ekki vegna þess að þær eru ónæmar fyrir meiðslum, heldur vegna þess að það er ekki nægjanleg endónukleasavirkni til að framleiða mælanlegt merki í TUNEL. Reynsla okkar er að jafnvel breytingar á milli {{0}}.01 prósent og 0.1 prósent af TUNEL jákvæðum frumum geta verið tölfræðilega marktækar og notaðar sem traustar vísbendingar um nýrnaskaða (af öðrum vef).

Að lokum kemur upp vandamál við magngreiningu á TUNEL litun þegar magn DNA sundrungar er of mikið, til dæmis á seinni stigum frumudauða eða í miklum áverka, þar sem ekki er hægt að mótlita eftirstandandi DNA með DAPI vegna sundurtöku á tvöfaldur helix (mynd 3D). Í þessum tilfellum eru TUNEL-jákvæð merki "hangandi í loftinu" og virðast ekki tengd kjarna. Það verður á ábyrgð meinafræðings að túlka þessar sem TUNEL-jákvæðar frumur frekar en artifact. Með flúrljómun merktu TUNEL, er hætta á að auðkenna sjálfflúrljómun í bakgrunni í vef sem TUNEL-jákvæðni [140]. Í þessum tilvikum er mælt með því að skipta yfir í rautt litróf TUNEL [51,54].

TUNEL mynstur sem uppspretta viðbótarupplýsinga

Hægt er að greina nokkur TUNEL mynstur greinilega og nota til að ákvarða hugsanlegan gang og meiðsli (tafla 1, mynd 3). Venjulega er tegund TUNEL-mynsturs sem eingöngu er fyrir kjarna framleidd með vægum meiðslum, en sterkari áverka (þ.e. aukin útsetning) leiðir til sterkari litunar og sundrunar á kjarna eða frumum. Stranglega apoptotic TUNEL mynstur er kjarna sundrungu vegna myndun apoptotic líkama (Mynd 3E). Lítil brot af TUNEL-jákvæðum kjarna, sem eru líklega apoptotic líkamar, sáust í blóðþurrð-endurflæði rotta eftir 24-72 klst. [97]. Apoptotic líkamar sáust einnig með TUNEL merkingu á kjarna í nýrnapíplum þekjuvef og millivef 14 dögum eftir blóðþurrðar-endurflæðisskaða hjá rottum [141]. Auknir skammtar af lavenderolíu drógu úr TUNEL mynstrum sem eingöngu voru fyrir kjarna og breyttu þeim í drep eins og TUNEL með umfrymisleka [94]. Hið síðarnefnda var afleiðing af eyðingu kjarnahjúps vegna verkunar próteinasa og lípasa í drepi. Umfrymis TUNEL (Mynd 3F) sem sést sem TUNEL-jákvætt umfrymi sást í ljóssmásjá í rákvöðvalýsu líkaninu í rottupíplum [142] og í fræfrumum sem ræktaðar voru í viðurvist hás glúkósa og í nýrnakvilla með sykursýki í músum [135]. Umfrymi TUNEL var einnig lýst í nýrnablóðþurrð-endurflæði í músum sem notuðu FL flúrljómandi TUNEL [98] og í blóðþurrð-endurflæði í rottum með ljóssmásjá [143]. Kvikasilfurklóríð af völdum djúpstæðs og eingöngu pípulaga skaða með sterkri TUNEL litun um umfrymis sem bendir til skemmda á kjarnahimnu [60]. Ef meiðslin halda áfram eða skammtur skaðlegs efnisins eykst, er hægt að breyta umfrymis TUNEL í „sóðalega“ mynd af dreifðri TUNEL (Mynd 3G) sem rekja má til seint stigi frumueyðingar vegna dreps og leka á frumu umfrymi og rusl. Til dæmis sást bæði umfrymi og dreifður TUNEL hjá músum sem fengu cisplatín [71,72] og rottum [144], og í fræfrumum í skaða á streptózótósíni af völdum sykursýkisrottna [145]. Dreifður necrotic TUNEL sást einnig við eiturverkanir á nýru af völdum úranýl asetats í músum [101]. Að lokum, önnur TUNEL merkjabreyta sem þarf að fylgjast með er styrkleiki TUNEL-jákvæðra merkja, sem geta breyst frá frumu til frumu eftir fjölda hléa (meiðslustigs) sem hver fruma upplifir, eins og skjalfest er í sumum rannsóknum [45,96,125 ]. Fyrir líkön þar sem breytileg TUNEL merkjastyrkur sést, er mælt með magni með bæði fjölda TUNEL-jákvæðra hluta og meðalstyrk litunar.

Ályktanir

Vegna mikillar virkni apoptotic endonucleases í nýrum, sérstaklega DNase I og EndoG, er notkun TUNEL fyrirnýrnarannsóknir og greininger mjög fræðandi. Það gæti orðið enn gagnlegra ef TUNEL er notað umfram upphaflega notkun þess sem aðferð til að bera kennsl á apoptosis. Að nota TUNEL eingöngu til rannsókna á apoptosis er gott dæmi um hvernig vísindum getur óvart verið villt með óviðeigandi aðferð. Þrátt fyrir notkun þess sem að mestu bráðaskaðapróf, er hægt að beita TUNEL með góðum árangri til að meta bæði AKI og CKD. Hins vegar, í langvinnum lungnateppum, ætti að búast við að gráðu TUNEL-jákvæðni sé lægri en við bráða meiðsli. Vegna þess að virkni innkirtla (aðallega DNase I) er mun meiri í pípulaga þekjuvef en í öðrum nýrnahólfum, er áverka á nýrnapíplum venjulega talið meira áberandi. Hins vegar er einnig hægt að rannsaka gaukla- eða æðaáverka með TUNEL ef meiðslin eiga sér stað í þessum hólfum. Samstaða FL flúrljómandi TUNEL með IHC merkjum gerir kleift að bera kennsl á og tengja frumugerðir og frumudauðakerfi við TUNEL merki. TUNEL magngreining getur lagt til verðmætar upplýsingar um hversu mikið frumudauða er og notkun myndgreiningarhugbúnaðar getur verið mjög gagnleg í þessu sambandi. Með hliðsjón af fjölbreytileika TUNEL mynstrum er eindregið mælt með dæmigerðum myndum til að koma á fót og sýna fram á

TUNEL merki sem eru talin jákvæð. Að lokum ætti að nota TUNEL mynstur sem uppsprettu viðbótarupplýsinga, svo sem aðferð frumudauða og hversu eiturhrifin eru. Til dæmis, að greina á milli TUNEL-jákvæðra apoptotic líkama, tilvist umfrymis TUNEL merkja eða dreifð TUNEL mynstur getur hjálpað til við að bera kennsl á apoptotic vs necrotic TUNEL-jákvæðar frumur fyrir nákvæmari túlkun á niðurstöðum rannsókna og greiningar.

meðferð með kynferðislegri örvun nýrnasjúkdóms