Stypt glýkóprótein E af hlaupabóluveiru er tilvalið ónæmisvald fyrir Escherichia coli-undirstaða bóluefnishönnun

Varicella-zoster veira (VZV) er mjög smitandi efni sem ber ábyrgð á bæði hlaupabólu og herpes zoster sjúkdómi. Þrátt fyrir mikla verkun eru enn áhyggjur af öryggi og aðgengi með leyfilegu bóluefnin. Hér var leitast við að framleiða VZV gE ónæmisvaka með því að nota E. coli tjáningarkerfi. Við komumst að því að hægt væri að auka leysanlega tjáningu og afrakstur gE próteins með C-enda styttingum á próteinið og auðvelda þar með öflugt og stigstærð hreinsunarferli fyrir bóluefnisframleiðslu. Blý stytta gE (aa 31–358), hér eftir nefnt tgE, var einsleit einliða í lausn og sýndi framúrskarandi mótefnavaka. Að lokum metum við og bárum saman ónæmingargetu tgE við vodka LAV í atvinnuskyni og Shingrix bóluefni. Við komumst að því að tgE með áli var ónæmisvaldandi samanborið við vodka LAV. Þegar bólusetning með AS01B var notuð sýndi tveggja skammta ónæmisaðgerð af tgE sambærilegan eða betri virkni í mótefnasvörun og frumumiðluðu ónæmi og Shingrix bóluefninu í sömu skömmtum, sérstaklega hvað varðar hlutfall IFN- - sem tjáir CD4+ T frumur. Að lokum, þessi aðferð við E. coli-miðlaða tgE tjáningu býður upp á hagkvæma og stigstærða stefnu til að búa til tilvalið VZV gE ónæmisvaka fyrir þróun bæði hlaupabólu og bóluefna gegn hlaupabólu.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

varicella-zoster veira, glýkóprótein E, Escherichia coli, bóluefni

KYNNING

Varicella-zoster veira (VZV) er sjúkdómsvaldandi alfa-herpesveira í mönnum sem framkallar tvo meginflokka sjúkdóma: aðal sýkingu með hlaupabólu, mjög smitandi sjúkdóm sem einkennist af blöðrulíkum útbrotum á húðinni og vægum almennum einkennum eins og hita og vanlíðan. aðallega hjá börnum; og herpes zoster (HZ), dulda endurvirkjun veirunnar sem svar við veikt frumuónæmiskerfi af völdum öldrunar sem veldur sársaukafullum, staðbundnum blöðruútbrotum (HZ) með eða án nokkurra annarra fylgikvilla (Cohen, 2013; Heininger og Seward, 2006; Zerboni o.fl., 2014). Bæði er hægt að koma í veg fyrir hlaupabólu og HZ með lifandi-veiklað veirubóluefni (LAV). Fyrsta LAV til að koma í veg fyrir varicella var þróað af Takahashi o.fl. (1974) byggt á vOka veirustofni og fékk síðar leyfi sem Varivax til venjubundinnar notkunar í Bandaríkjunum. Í kjölfarið fylgdi þróun og leyfisveiting Zostavax til að koma í veg fyrir HZ (Tseng o.fl., 2011). Því miður, á þeim 10 árum sem liðin eru frá því að sáningar með Varivax hófust, hefur næstum 1/3 af HZ tilfellum verið staðfest að tengjast vOka stofninum (Galea o.fl., 2008), sem bendir til þess að vOka geti smitað og komið á leynd, eins og villidýr. -gerð vírus, og endurvirkjaðu síðan til að valda HZ. Auk þess er verkun Zostavax í öfugu hlutfalli við aldur sjúklings við lyfjagjöf, þar sem aukinn aldur tengist minni verkun (Oxman o.fl., 2005). Fyrri rannsóknir hafa sýnt að VZV glýkóprótein E (gE) er algengasta veiru glýkópróteinið á veiruhjúpinu og sýkta frumuyfirborðinu. GE er einnig einn mikilvægasti VZV verndandi mótefnavakinn sem getur framkallað frumu- og húmorónæmi við náttúrulega hlaupabólusýkingu sem og eftir vOka bólusetningu (Arvin, 1992; Oliver o.fl., 2016). Nýlega var raðbrigða HZ undireiningabóluefni, Shingrix (HZ/su), samþykkt til að koma í veg fyrir HZ og tengda taugaveiki (PHN) hjá fullorðnum eldri en eða jafnt og 50 ára (Shah o.fl., 2019; Syed, 2018). Í klínískum rannsóknum framkallaði Shingrix skilvirkt, VZV-sértækt, frumumiðlað ónæmi (CMI), með heildarvirkni bóluefnis upp á 97,2% meðal þátttakenda meira en eða jafnt og 50 ár og 91,3% verndarhlutfall hjá þátttakendum meiri en eða jafnt. til 70 ára. Þessar niðurstöður benda sameiginlega til marktækrar minni hættu á HZ hjá bólusettum einstaklingum óháð aldri og þar með öflugri bóluefnisvalkosti samanborið við ZOSTAVAX (Lal o.fl., 2015; Shah o.fl., 2019).

cistanche plöntuaukning ónæmiskerfi

Shingrix er hannað úr raðbrigða gE mótefnavaka sem tjáð er í eggjastokkafrumum kínverskra hamstra (CHO) og lípósómbundnu hjálparefnakerfi (AS01B) sem inniheldur 3-Odesacyl-4′-monophosphoryl lipid A (MPL) og Quillaja saponaria Molina, brot 21 (QS21) (Dendouga o.fl., 2012). Hins vegar þurfa raðbrigða CHO frumur langa framleiðslulotu og tengjast flóknu hreinsunarferli sem leiðir af sér háan framleiðslukostnað og takmarkað framboð. Sem slík er Shingrix ekki tilvalin bólusetningarlausn fyrir almenna notkun, sérstaklega í þróunarlöndum (Kim o.fl., 2012). Örverutjáningarkerfi bjóða upp á nokkra kosti fram yfir tjáningarkerfi spendýra, þar á meðal hraðan vöxt, auðvelda ræktun og lægri framleiðslukostnað (Overton, 2014), og eru því mikið notuð í tjáningu og framleiðslu á fjölmörgum líflyfjum (Adkins og Wagstaff, 1998; Monie). o.fl., 2008; Wu o.fl., 2012). Hins vegar þarf að yfirstíga nokkra erfiðleika meðan á framleiðslu stendur til að tjá árangursríka tjáningu heilkjörnungapróteina í dreifkjörnungakerfum, svo sem rangt brjóta saman og skortur á breytingum eftir þýðingu (Singh og Panda, 2005). Þrátt fyrir þessa erfiðleika gætu tjáningarkerfi örvera boðið upp á tilvalið kerfi fyrir víðtæka, hagkvæma bóluefnaframleiðslu og þess vegna er ástæða til að rannsaka mótefnavaka úr E. coli tjáningarkerfi fyrir VZV bóluefnisgerð. Í fyrri vinnu sýndum við árangursríka tjáningu raðbrigða gE (rgE) próteins í skordýrafrumum og fengum hreinsuð prótein fyrir músabólusetningu og mAb framleiðslu (Liu o.fl., 2015). Byggt á þessari vinnu, könnum við hér hvort gE próteinið geti verið tjáð í E. coli. Við könnuðum ósamrunaleysanlega tjáningu gE kandídata mótefnavaka með C-enda styttingu (hér eftir nefnt stytt gE (tgE) eða tgE) í E. coli og einkenndu hreinsuðu tgE próteinin. Við sýnum að hreinsað tgE er mótefnavaka svipað og innfædda gE og getur framkallað háa mótefnatítra með vOka-hlutleysandi virkni í músum. Við samanburð á ónæmingargetu tgE mótefnavakans sem myndast í rannsókn okkar við LAV og Shingrix, komumst við að því að mótefnavakinn okkar sýnir ekki aðeins skilvirka húmorsvörun heldur framkallar einnig mótefnavaka-sértækt CMI. Á heildina litið gæti E. coli stefna okkar til framleiðslu á tgE próteini rutt brautina fyrir annað iðnaðarframleitt ónæmisvaka fyrir bæði hlaupabólu og HZ bólusetningu.

cistanche ávinningur fyrir karla styrkir ónæmiskerfið

Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur

【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

NIÐURSTÖÐUR

Tjáning og hreinsun á raðbrigða tgE í E. coli

DNA raðir sem kóða fyrir VZV gE utanfrumu lénið voru útbúnar sem smíði með ýmsum N- eða C-enda styttingum, og klónaðar inn í pTO-T7 vektorinn fyrir prótein tjáningu í E. coli. Utanfrumusvæði gE í fullri lengd hafði tilhneigingu til að mynda innlimunarhluta í E. coli við tjáningu og það væri hægt að bæta það með C-enda styttingu. Af hinum ýmsu stýfðu próteinum náðist bestur leysni með gE (aa 31-358) smíðinni (Mynd 1A), hér á eftir nefnt stytt gE eða tgE. Frambjóðandinn tgE var tjáður með góðum árangri sem leysanlegt raðbrigða prótein og hreinsað úr floti bakteríulýsa með því að nota þriggja þrepa litskiljun á rannsóknarstofukvarða til frekari mats og þróunar sem hugsanlegs bóluefnis. Sterk anjónaskiptaskiljun var notuð til að fanga fylgt eftir með keramikhýdroxýapatit og vatnsfælin litskiljunarskref (Mynd 1B). Eftirfarandi stig í hreinsunarferlinu sáu aukningu á hreinleika tgE á SDS-PAGE (Mynd 1C). tgE flutti sem um það bil 40 kD band og sýndi góða hvarfgirni við sértæka mótefnið 1B11 (mynd 1D). Heildarafraksturinn var um 500 ug af hreinsuðu tgE á hvert gramm af bakteríum.

Einkenni stytta gE

High-performance size-exclusion chromatography (HPSEC) og analytical ultracentrifugation (AUC) voru notuð til að greina einsleitni og setmyndunarstuðla hreinsaðra próteina. rgE prótein hreinsað úr skordýrafrumukerfinu (Liu o.fl., 2015) var notað sem viðmið. Í HPSEC virtist tgE vera skarpur toppur við ríkjandi varðveislutíma 16,1 mín (Mynd 2A), sem endurspeglar mikla einsleitni fyrir hreinsuð tgE prótein. Í AUC tilraunum sást ríkjandi botnfallstoppur við ~2,3 S (Mynd 2B), sem jafngildir ~39,4 kD, sem gefur til kynna að tgE komi fram sem einliða í lausn. Differential scanning kalorimetry (DSC) var notuð til að prófa varmastöðugleika tgE próteinsins með því að fylgjast með hitagetu meðan á hitauppbrotsferlinu stóð. DSC sniðin sýndu aðeins eina hitabreytingu meðan prótein þróaðist við umbreytingshitastig (Tm) gildi 63,80 gráður fyrir tgE, sambærilegt við rgE (63,64 gráður) (Mynd 2C). Til að kanna sköpulagsheilleika hreinsaðra tgE próteina, greindum við mótefnavaka tgE með því að nota ELISA próf, þar sem hreinsuð rgE prótein tjáð í skordýrafrumum þjónuðu sem viðmið. Níu mAbs sem gátu greint sköpulagðar epitopur (mAb 1B11, 4G4, 14G1) eða línulegar epitopur (4A2, 11B11, 11B12, 6H6, 10H6, 11E3) voru notuð í ELISA prófinu (Mynd 3). Við fundum svipað miðgildi virks styrks (EC50, ng ml-1) fyrir tgE og rgE prótein fyrir flest mótefnin nema 1B11, sem hafði næstum 10-falt lægri hvarfgirni, sem bendir til svipaðrar mótefnavaka þeirra. Þessar niðurstöður benda til þess að lykileitópur á rgE séu vel varðveittar í tgE próteini.

Mynd 1 (Litur á netinu) Tjáning og hreinsun próteina. Skýringarmynd af tgE smíðahönnun. E. coli frumum var umbreytt með raðbrigðum plasmíðum sem báru gE (aa 31-358) stytta genið. B, Skýringarmynd af tgE hreinsunarferlinu. tgE var hreinsað úr lýstu floti með því að nota þriggja þrepa litskiljun. C, SDS-PAGE prófíl tgE meðan á hreinsunarferlinu stendur. Mólþungi tgE er um það bil 40 kD. M: mólþyngdarmerki. Braut 1: flot aðskilið frá frumulýsi; braut 2: brot sem inniheldur tgE frá Q-FF litskiljunni; braut 3: brot sem inniheldur tgE frá CHT litskiljun; braut 4: brot úr bútýlskiljunni, sem inniheldur tgE próteinið með miklum hreinleika. D, ónæmisbletting á hreinsuðu tgE.

Greining á ónæmissvörun af völdum tgE í músum

Til að bera ónæmingargetu tgE saman við rgE, mótuðum við próteinin með tveimur hjálparefnum sem almennt eru notuð við rannsóknarvinnu: ál-bundið ónæmisglæði Al-001 og Freunds ónæmisglæði. Mýs voru bólusettar þrisvar sinnum á viku 0, 2 og 4 með 1 ug skammti fyrir bæði tgE og rgE með ónæmisglæði. gE-sérstök mótefnatítrar og T-frumuviðbrögð í viku 5 eftir fyrstu bólusetningu voru notuð til að ákvarða ónæmingargetu mismunandi hjálparefnasamsetninga. Mýs sem voru bólusettar með tgE bóluefninu sem var samsett með Al-001 sýndu svipað mótefnasnið og mýs í rgE hópnum og Freunds ónæmisglæði sýndi betri örvunaráhrif þegar hún var samsett með tgE en með rgE (Mynd 4A). Hlutleysingartítrar sýndu engan mun á músum sem voru bólusettar með tgE eða rgE bóluefni, með hlutleysandi títra upp á ~103 fyrir tgE samsett með mismunandi hjálparefnum (Mynd 4B). Hins vegar, í greiningu á CD4+ T-frumum úr miltisfrumum með frumu frumulitun (ICS), leiddu bæði tgE og rgE bóluefni fram svipað magn af gE-sértæku IFN- samanborið við saltvatnshópinn (Mynd 4C, ~{ {22}},1% fyrir annaðhvort bóluefnahópa eða saltvatnshópa), og aðeins hóflega eftirlíkingu af gE-sértæku IL{{20}} (Mynd 4D, ~0,2% fyrir bóluefnahópa á móti ~0,1 % fyrir saltvatnshóp). Samanlagt sýna þessar niðurstöður að tgE/Al-001 og hjálparefni tgE/Freund framkalla gE-sértæk ónæmissvörun sem er sambærileg við þau sem rgE framkallar, með sérstaklega sterkri húmorsvörun.

Mat á tgE hlaupabólubóluefni í samanburði við LAV

Við metum næst mótefnaframleiðslu og þrávirkni tgE próteina með áli í BALB/c músum. Tveir hópar af músum (n=5 í hverjum hópi) voru bólusettir þrisvar sinnum á viku 0, 2 og 4 með mismunandi skömmtum 0.5 ug og 5 ug af tgE/Al{{ 8}} (Mynd 5A og B). Mótefnasvörunarsniðin sýndu að aðal sáningin á tgE prótíninu framkallaði háa mótefnatítra, með viðvarandi aukningu eftir tvær örvunarbólusetningarnar í viku 2 og 4, og náði hámarksgildi í viku 6 áður en það lækkaði hægt í meira en 1{{ 20}}4 yfir vöktunartímabil. Mismunandi skammtahópar deildu svipuðum mótefnatítrasniði á eftirlitstímabilinu, með svipaða háa hlutleysandi títra í viku 6. Ónæmingargeta tgE var metin og borin saman við vodka. Hálfvirkur skammtur (ED50) í músum var notaður sem mælikvarði á sermisbreytingu, þar sem lægri ED50 benti til betri ónæmingargetu. Balb/c mýs voru aðgreindar í hópa og bólusettar í kviðarhol með tgE með áli (1, 0.5, 0.25, {{50}}.125, {{ 54}}.0625, eða 0.03125 ug; n{{30}}) eða vOka bóluefni (1,000, 500, 250, 125 eða 62,5 pfu; n=6) í raðþynningum. Serum var safnað eftir 4 vikur og prófað með ELISA. Seroconversion var greind samkvæmt Reed og Muench aðferðinni (Mynd 5C). Í aldurshópunum höfðu mýs seroconversion hlutfall 83%, 100%, 100%, 100%, 50% og 17% fyrir 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625 og 0,03125 ug skammta, í sömu röð. Í vodkahópunum höfðu mýs lægri sermisbreytingarhlutfall, 67%, 50%, 33%, 17% og 0% fyrir 1,000, 500, 250, 125 eða 62,5 pfu skammta, í sömu röð. ED50 gildin voru 0,063 ug fyrir tgE og 449,425 pfu fyrir vOka, sem gefur til kynna að ónæmingargeta tgE í lægri skömmtum 0,3 ug jafngildi því sem náðist með einum skammti af hlaupabólubóluefni sem inniheldur vOka (venjulega yfir 2,{{78} } pfu í hverjum skammti).

Mynd 2 Einkenni tgE og rgE próteina. A, HPSEC snið af hreinsuðu tgE. Varðveislutími gE er sýndur. B, Sedimentation hraðagreining á hreinsaða tgE próteini. Setmyndunarstuðull og mólþungi tgE voru ákvarðaðir með c(s) og c(M) aðferðum óháð öðru. Í (A) og (B) er tgE sýnd í svörtu og rauðu í bláu. C, Mismunaskönnun hitaeiningaprófíla hreinsaðs tgE og rgE próteins.

Mynd 3 Hvarfgirni tgE og rgE með mAbs. mAbs voru raðþynnt og hvarfast við húðuð tgE eða rgE prótein í ELISA prófi. Viðbrögð fundust með því að nota HRP-merkt mótefni gegn músum. Tvíteknar holur voru mældar á sömu plötu fyrir hverja þynningu. EC50 gildi voru reiknuð út með sigmoid stefna með því að nota GraphPad Prism hugbúnað.

Mynd 4 Ónæmingargeta tgE og rgE prófuð í BALB/c músum 1 viku eftir þriggja skammta ónæmisaðgerð. A, Mótefnaframleiðsla í músum fyrir tgE og rgE samsett með mismunandi hjálparefnum. B, Hlutleysandi mótefnatítrar í músum fyrir tgE og rgE samsettar með mismunandi hjálparefnum. C og D, Mat á gE sértækum IFN- og IL-2 svörum sem framkölluð eru af tgE eða rgE bóluefnum.

Mynd 5 Ónæmingarprófanir á tgE bóluefni í BALB/c músum. A og B, Mótefnaþol og hlutleysandi mótefnasvörun tgE/Al-001. Fylgst var með titlum í allt að 16 vikur. C, ED50 í músum fyrir álformað tgE og vodka.

Mat á tgE Zoster bóluefnisframbjóðanda samanborið við Shingrix

Til að bera saman ónæmingargetu tgE bóluefnisins okkar og Shingrix, var frostþurrkað tgE prótein samsett með Shingrix ónæmisglæðinu, AS01B. C57BL/6 mýs voru bólusettar með tveimur skömmtum af tgE/AS01B eða Shingrix í vöðva í sköflungsvöðvanum á viku 0 og 4. Mótefnamagn eftir fyrstu bólusetningu bentu til þess að bólusetning með Shingrix væri nægjanleg til að framkalla mikið magn af and-gE mótefnum, verulega hærri en þær sem tgE/ AS01B framleiðir; eftir seinni bólusetninguna var hins vegar enginn marktækur munur á mótefnaframleiðslu milli hópanna tveggja (Mynd 6A). Hvað varðar magn hlutleysandi mótefna, leiddi stakskammta bólusetning á tgE/AS01B til framleiðslu á óverulegu magni af hlutleysandi mótefni, marktækt lægra en það sem Shingrix framleiðir. Hins vegar, aftur, eftir örvunarbólusetninguna, gátum við ekki séð marktækan mun hvað varðar hlutleysandi mótefnaframleiðslu milli hópanna tveggja (Mynd 6B). Til að sannreyna hvernig ónæmisaðgerð hefur áhrif á CMI, gE-sértæk IFN- og IL-2 gildi greindust eftir fyrstu og seinni bólusetninguna með því að nota ensímtengda ónæmissogandi blettinn (ELISPOT) próf og frumu frumulitun. tgE/AS01B ónæmisaðgerðin framkallaði lélegt ónæmissvörun í húmor samanborið við stakan skammt af Shingrix en sýndi sambærilegan virkni hvað varðar örvun IFN- - og IL-2-framleiðandi miltisfrumna (Mynd 6C). Reyndar, eftir seinni bólusetninguna, greindist umtalsverður fjöldi gE-sértækra frumuefna sem framleiða frumur í tgE/AS01B hópnum samanborið við saltvatns samanburðarhópinn, sem voru einnig sambærilegar eða betri en fyrir Shingrix hópinn (Mynd 6D ). Svipaðar niðurstöður komu fram í frumuflæðisgreiningu, með athugunum á svipuðum hlutföllum IFN- -tjáa CD4+ T-frumum (Mynd 6E), IL-2-tjá CD4+ T frumur (Mynd 6F), og IFN- -CD8+ T frumur (Mynd 6G) ​​á milli tgE/AS01B- og Shingriximmunized músanna, óháð stakri bólusetningu eða örskammtabólusetningu. Þessar niðurstöður sýna fram á að tgE próteinið sem er unnið úr tjáningarkerfi baktería getur framkallað bæði húmor og frumu ónæmissvörun þegar það er samsett með viðeigandi hjálparefnum og því má líta á það sem mótefnavaka til að mynda bóluefni gegn VZV.

Mynd 6 Ónæmingargeta tgE í C57BL/6 músum. Gefnir voru 5 ug tgE skammtar með 50 μL AS01B ónæmisglæði. Þetta var 1/10 skammtur af Shingrix bóluefninu. Bólusetning var framkvæmd á viku 0 og 4. A, Samanburður á mótefnaframleiðslu af völdum tgE/AS01B bóluefnis samanborið við Shingrix. Sermistítrar voru ákvarðaðir með ELISA prófun með því að nota rgE húðaðar plötur. B, Samanburður á hlutleysandi mótefnasvörun við vOka eftir bólusetningu með tgE/AS01B bóluefni eða Shingrix. Hlutleysingartítrar mótsermis í viku 2 (vinstri spjaldið) og viku 6 (hægra spjaldið) eru gefin upp sem gagnkvæm sermisþynning sem leiðir til 50% hömlunar. C, Mat á gE-sértækum IFN- og IL-2 svörun af völdum tgE/AS01B bóluefnis eða Shingrix í viku 2. Fjöldi IFN- - og IL-2-myndandi miltisfrumna var reiknaður út frá ELISPOT próf eftir endurörvun með safni af gE peptíðum. D, Mat á gE-sértækum IFN- og IL-2 svörun af völdum tgE/AS01B bóluefnis eða Shingrix í viku 8. Fjöldi IFN- - og IL-2-myndandi miltisfrumna var reiknaður út frá ELISPOT próf eftir endurörvun með safni af gE peptíðum. E–G, Flæðifrumumælingar fyrir gE-sértækar frumufrumur sem tjá CD4+ og CD8+ frumur. Hlutfall IFN- -framleiðandi CD4+ T-frumna, IL-2-framleiðandi CD4+ T-frumna og IFN- -framleiðandi CD8+ T frumur meðal miltisfruma voru ákvarðaðar.

UMRÆÐA

VZV gE er aðalmarkmið húmors og frumumiðlaðrar ónæmissvörunar við náttúrulega hlaupabólusýkingu og eftir VZV Oka bólusetningu. Shingrix (GSK) er raðbrigða undireiningabóluefni sem samanstendur af VZV gE tjáð í CHO frumum og lípósóm-undirstaða ónæmisglæðisins AS01B. Önnur vinna hefur leitast við að rannsaka undireiningabóluefni gegn HZ með því að nota gE prótein mynduð úr CHO eða skordýrafrumum sem eru samsettar með nýjum hjálparefnum (Cao o.fl., 2021; Lee o.fl., 2020; Luan o.fl., 2022a, Luan o.fl., 2022b; Wang o.fl., 2021; Wui o.fl., 2019; Wui o.fl., 2021). Hér könnuðum við og sýndum að gE próteinið gæti verið tjáð og hreinsað úr E. coli og síðan mótað sem bóluefnisframbjóðanda undireininga með viðeigandi hjálparefni til að framkalla ekki aðeins öflugan hlutleysandi titer heldur einnig sterka CMI svörun.

cistanche plöntuaukning ónæmiskerfi

E. coli sem tjáningarkerfi býður upp á nokkra kosti: hraðan frumuvöxt, ódýr ræktunarskilyrði og skilvirkt og fjölhæft tæki til að framleiða raðbrigða prótein. Herpes veiru tengdar mótefnavakarannsóknir hafa skilað nokkrum árangri með því að nota tjáningarkerfið sem byggir á E. coli. Hlutleysandi línuleg epitope gE (aa 121–135) hefur verið blandað saman við 149 aa af lifrarbólgu B veiru kjarna (HBc) próteininu til að framleiða kímerísk VLP sem gætu framkallað VZV-sértæk hlutleysandi mótefni í músum (Zhu et al., 2016). Í annarri rannsókn var einsleitt gE prótein úr Simian varicella veiru (SVV) tjáð í E. coli með því að nota GST samrunamerki til að mynda gE andsermi (Gray o.fl., 2001). Enn sem komið er hefur ekki verið greint frá VZV gE próteini án samrunamerkis sem hreinsað er úr E. coli sem bóluefnisefni.

gE samanstendur af þremur svæðum: 544-aa vatnssæknu ectodomein með merkjapeptíð (aa 1–30), 17-aa vatnsfælnu yfirhimnusvæði og 62-aa umfrymishalasvæði. Við rannsökuðum nokkrar kandídata sameindir með mismunandi styttingar á N- eða C-enda svæðum gE ectodomeinsins og komumst að því að utanaðkomandi tjáning þessara próteina í E. coli var best með því að nota stytta hlutann (gögn ekki sýnd). Ósnortið gE ectodomein án samrunamerkis hefur tilhneigingu til að mynda innilokunarhluta þegar það er tjáð af E. coli og er erfitt að hreinsa það. Meðal styttingarframbjóðenda sem prófaðir voru sýndi gE (aa 31-358) prótein mikla leysanlega tjáningu með lágmarks erfiðleikum við hreinsun þess, sem og mikinn hreinleika og mikla einsleitni (Mynd 1). Þess vegna var þessi styttingarbygging talin tilvalið bóluefni. mótefnavaka. Þessi styttingaraðferð gæti hafa haft möguleg áhrif á eiginleika próteinsins, sérstaklega mótefnavaka þess. Við höfðum áður tjáð raðbrigða gE í skordýrafrumum og hreinsað þessa byggingu til að bólusetja BALB/c mýs, og fengum 70 gE einstofna mótefni fyrir epitópagreiningu (Liu et al., 2015). Með greiningu okkar greindum við aa 1-194 sem ónæmisráðandi svæðið (gögn ekki sýnd). Svipaðar niðurstöður fengust annars staðar, þar sem gE-sértæk mAbs benda til aa 109-123 og 160-316 svæði sem eru þau svæði sem bera ábyrgð á stöðugri mótefnabindingu mótefna meðal afbrigða einangra (Vafai, 1994). Í annarri rannsókn, með því að nota raðbrigða blendinga gE brot-VLPs, greindu höfundarnir leifar 1–134 sem mótefnavakasvæði gE próteins og sýndu að C-enda gE (leifar 303–623) sem innihélt nokkrar cystein leifar tókst ekki að framleiða agnir í ger (Fowler o.fl., 1995), sem bendir til þess að misleit tjáning gE ætti ekki aðeins að taka tillit til mótefnavaka heldur einnig auðveldrar tjáningar. Hér fínstilltum við lengd gE próteinsins fyrir skilvirka leysanlega tjáningu þess með lágmarks lækkun á mótefnavaka. tgE sýndi svipaða hvarfgirni og flest mótefnin á mynd 3 og rgE framleitt í skordýrafrumum, sem bendir til þess að lykileitópur séu vel varðveittar í tgE próteininu sem hreinsað er úr E. coli. Hins vegar sýndi ein rannsókn að ónæmisráðandi CD4+ T-frumueiginleikar sem þekktir voru af Shingrix bóluefnisgjöfum voru dreifðir um gE próteinið (Voic o.fl., 2020). Ónæmingargeta tgE í rannsókn okkar var eins og fannst fyrir gE úr CHO frumum í Shingrix þegar mótefnavaki var blandað við AS01B hjálparefni, með álíka skilvirkum húmorsvörun og CMI svörum, eins og sýnt er á mynd 5. Þessar niðurstöður gáfu til kynna að stytta gE ættað frá dreifkjörnungakerfinu var jafn gott og ósnortið gE ektolén frá heilkjörnungakerfinu hvað varðar mótefnavaka.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Það er töluverður munur á gE próteinum sem eru unnin úr mismunandi tjáningarkerfum. Mest áberandi munurinn kemur fram með breytingum eftir þýðingu, sérstaklega glýkósýleringu. O-tengd glýkan úr himnu glýkópróteinum hafa þýðingu hvað varðar T-frumu- og mótefnaþekkingu á veiru glýkópeptíðeitópum, og þessi viðurkenning hefur möguleika á að hafa mikla líflæknisfræðilega þýðingu í tilraunum okkar til að miðla ónæmisvörn gegn veirum með því að nota undireiningabóluefni. Fjarlæging á glýkanum í gE sem framleitt er í CHO-K1 frumum leiddi til 17% minnkunar á hvarfgirni með VZV-jákvæðum sermi. Aftur á móti getur O-glýkósýlering truflað ónæmissvörun B-frumueitópa: Sumar mikilvægar epitopur eru læstar af viðbótar O-tengdum glýkönum (Nordén o.fl., 2019). Í rannsókn okkar virðist tgE sem myndast úr E. coli hegða sér eins vel og rgE sem er af skordýrafrumum hvað varðar ónæmisvirkni þess og ónæmingargetu, sem bendir til þess að „nakta“ tgE próteinið hafi lofað góðu sem bóluefnisframbjóðanda. Líklegt er að bóluefni með tgE sem mótefnavaka framkalli ekki aðeins háa IgG títra, sem gefur til kynna möguleika þess sem undireininga hlaupabólubóluefnis án hugsanlegrar hættu á leynd veirunnar, heldur einnig hátt CMI, sem bendir einnig til möguleika þess sem bóluefnis gegn hlaupabólu. Á heildina litið býður gE mótefnavakinn sem er fenginn úr tjáningarkerfi baktería í þessari rannsókn mun hagkvæmari stefnu fyrir þróun VZV bóluefna.

Heimildir

Adkins, JC og Wagstaff, AJ (1998). Raðbrigða lifrarbólgu B bóluefni: endurskoðun á ónæmingargetu þess og verndandi virkni gegn lifrarbólgu B. Biodrugs 10, 137-158.

Arvin, AM (1992). Frumumiðlað ónæmi fyrir varicella-zoster veiru. J Infect Dis 166, S35–S41.

Cao, H., Wang, Y., Luan, N. og Liu, C. (2021). Ónæmingargeta hlaupabólu-zoster veiru glýkópróteins E samsett með lípíð nanóögnum og kjarnaónæmisörvum í músum. Bóluefni 9, 310.

Chen, L., Liu, J., Wang, W., Ye, J., Wen, L., Zhao, Q., Zhu, H., Cheng, T. og Xia, N. (2014). Þróun á hlaupabólu-zoster veiru hlutleysandi prófun með því að nota glýkóprótein K mótefnaensímtengda ónæmissogandi blettagreiningu. J Virol Methods 200, 10–14.

Cohen, JI (2013). Klínísk æfing: herpes zoster. N Engl J Med 369, 255– 263. Dendouga, N., Fochesato, M., Lockman, L., Mossman, S. og Giannini, SL (2012). Frumumiðluð ónæmissvörun við hlaupabólu-zoster veiru glýkóprótein E bóluefni með því að nota bæði TLR örva og QS21 í músum. Bóluefni 30, 3126–3135.

Fowler, WJ, Garcia-Valcarcel, M., Hill-Perkins, MS, Murphy, G., Harper, DR, Jeffries, DJ, Burns, NR, Adams, SE, Kingsman, AJ og Layton, GT (1995). Auðkenning ónæmisráðandi svæða og línulegra B-frumueiginleika gE hjúpspróteins hlaupabólu-zoster veirunnar. Veirufræði 214, 531–540.

Galea, SA, Sweet, A., Beninger, P., Steinberg, SP, LaRussa, PS, Gershon, AA og Sharrar, RG (2008). Öryggissnið bóluefnis gegn hlaupabólu: 10-ársskoðun. J Infect Dis 197, S165–S169.

Gray, WL, Mullis, LB og Soike, KF (2001). Tjáning á Simian varicella veiru glýkóprótein E. Virus Res 79, 27–37.

Heininger, U. og Seward, JF (2006). Varicella. Lancet 368, 1365–1376.

Kim, JY, Kim, YG og Lee, GM (2012). CHO frumur í líftækni til framleiðslu á raðbrigðapróteinum: núverandi ástand og frekari möguleikar. Appl Microbiol Biotechnol 93, 917–930.

Lal, H., Cunningham, AL, Godeaux, O., Chlibek, R., Diez-Domingo, J., Hwang, SJ, Levin, MJ, McElhaney, JE, Poder, A., Puig-Barberà, J., o.fl. (2015). Virkni bóluefnis með ónæmisglæði gegn herpes zoster undireiningu hjá eldri fullorðnum. N Engl J Med 372, 2087–2096.

Lee, SJ, Park, HJ, Ko, HL, Lee, JE, Lee, HJ, Kim, H. og Nam, JH (2020). Mat á glýkópróteini E undireiningu og lifandi veiklaðri hlaupabólu-zoster veiru bóluefni samsett með einþátta RNA byggt hjálparefni. Immun Inflamm Dis 8, 216-227.

Liu, J., Zhu, R., Ye, X., Yang, L., Wang, Y., Huang, Y., Wu, J., Wang, W., Ye, J., Li, Y., o.fl. (2015). Einstofna mótefna-undirstaða VZV glýkóprótein E megindleg prófun og beiting þess á magngreiningu mótefnavaka í VZV bóluefni. Appl Microbiol Biotechnol 99, 4845– 4853.

Luan, N., Cao, H., Wang, Y., Lin, K. og Liu, C. (2022a). Jónaðar lípíð nanóagnir jók samverkandi hjálparáhrif CpG ODNs og QS21 í hlaupabólu-zoster veiru glýkópróteini E undireiningabóluefni. Lyfjafræði 14, 973.

Luan, N., Cao, H., Wang, Y., Lin, K. og Liu, C. (2022b). LNP-CpG ODN ónæmisglæða hlaupabólu-zoster veiru glýkóprótein E framkallaði sambærilegt magn ónæmis með Shingrix™ í VZV-bættum músum. Virol Sin 37, 731–739.

Monie, A., Hung, CF, Roden, R. og Wu, TC (2008). Cervarix: bóluefni til að koma í veg fyrir HPV 16, 18-tengt leghálskrabbameini. Líffræði 2, 97–105.

Nordén, R., Nilsson, J., Samuelsson, E., Risinger, C., Sihlbom, C., Blixt, O., Larson, G., Olofsson, S. og Bergström, T. (2019). Raðbrigða glýkóprótein E af hlaupabólu-zoster veiru inniheldur glýkan-peptíð mótíf sem móta B frumu epitopes í stakar ónæmisfræðilegar undirskriftir. Int J Mol Sci 20, 954.

Oliver, SL, Yang, E. og Arvin, AM (2016). Varicella-zoster veiru glýkóprótein: innkoma, afritun og meingerð. Curr Clin Microbiol Rep 3, 204–215.

Overton, TW (2014). Raðbrigða próteinframleiðsla í bakteríuhýslum. Drug Discovery Today 19, 590–601.

Oxman, MN, Levin, MJ, Johnson, GR, Schmader, KE, Straus, SE, Gelb, LD, Arbeit, RD, Simberkoff, MS, Gershon, AA, Davis, LE, o.fl. (2005). Bóluefni til að koma í veg fyrir herpes zoster og postherpetic taugaverki hjá eldri fullorðnum. N Engl J Med 352, 2271–2284.

Shah, RA, Limmer, AL, Nwannunu, CE, Patel, RR, Mui, SÞ og Tyring, SK (2019). Shingrix fyrir herpes zoster: umsögn. Húðmeðferð Lett 24, 5–7. Singh, SM og Panda, AK (2005). Uppleysing og endurbrot á bakteríuinnihaldspróteinum. J Biosci Bioeng 99, 303-310.

Syed, YY (2018). Raðbrigða bóluefni gegn ristil (Shingrix®): endurskoðun á herpes zoster. Lyfjaöldrun 35, 1031–1040.

Takahashi, M., Otsuka, T., Okuno, Y., Asano, Y., Yazaki, T. og Isomura, S. (1974). Lifandi bóluefnið er notað til að koma í veg fyrir útbreiðslu hlaupabólu hjá börnum á sjúkrahúsum. Lancet 304, 1288–1290.

Tseng, HF, Smith, N., Harpaz, R., Bialek, SR, Sy, LS og Jacobsen, SJ (2011). Herpes zoster bóluefni hjá eldri fullorðnum og hætta á síðari herpes zoster sjúkdómi. JAMA 305, 160–166.

Vafai, A. (1994). Mótefnabindingarstaðir á styttum formum gpI(gE) glýkópróteins hlaupabóluveiru. Bóluefni 12, 1265–1269.

Voic, H., de Vries, RD, Sidney, J., Rubiro, P., Moore, E., Phillips, E., Mallal, S., Schwan, B., Weiskopf, D., Sette, A., o.fl. (2020). Auðkenning og lýsing á CD4+ T-frumueitrunum eftir Shingrix bólusetningu. J Virol 94, e01641-20.

Wang, Y., Qi, J., Cao, H. og Liu, C. (2021). Ónæmissvörun við hlaupabólu-zoster veiru glýkóprótein E sem er samsett með pólý(mjólkur-kóglýkólsýru) nanóögnum og kjarnsýru hjálparefnum í músum. Virol Sin 36, 122–132.

Wu, T., Li, SW, Zhang, J., Ng, MH, Xia, NS og Zhao, Q. (2012). Þróun bóluefnis gegn lifrarbólgu E: 14-árs ferðalag. Hum Vaccin Immunother 8, 823-827.

Wui, SR, Kim, KS, Ryu, JI, Ko, A., Do, HTT, Lee, YJ, Kim, HJ, Lim, SJ, Park, SA, Cho, YJ, o.fl. (2019). Skilvirk framköllun frumumiðlaðs ónæmis fyrir glýkópróteini E af hlaupabólu-zoster veiru frostþurrkað með ónæmisglæði sem byggir á katjónískum fitukornum í músum. Bóluefni 37, 2131–2141.

Wui, SR, Ko, A., Ryu, JI, Sim, E., Lim, SJ, Park, SA, Kim, KS, Kim, H., Youn, H. og Lee, NG (2021). Áhrif TLR4 örva/katjónísks lípósóm hjálparefnis á verkun glýkópróteins E bóluefnis gegn hlaupabólu-zoster veiru: mótefnavakakynning, upptaka og sending til eitla. Lyfjafræði 13, 390.

Zerboni, L., Sen, N., Oliver, SL og Arvin, AM (2014). Sameindaleiðir sjúkdómsvaldandi veirusjúkdóma. Nat Rev Microbiol 12, 197–210.

Zhu, R., Liu, J., Chen, C., Ye, X., Xu, L., Wang, W., Zhao, Q., Zhu, H., Cheng, T. og Xia, N. (2016). Mjög varðveitt epitope-bóluefni gegn hlaupabólu-zoster veiru framkallar hlutleysandi mótefni í músum. Bóluefni 34, 1589–1596.