Ágrip:Að notaCistanche DeserticolaParasitizing tvær hýsilplöntur (haloxýlon ammodendron og Atriplex canescens) sem prófunarefni, ákvarðaði þessi rannsókn fjölsykruminnihaldið í C. deserticola frá mismunandi vélum með því að nota fenól-brennisteinssýruaðferðina. Transcriptome raðgreining og greining á haloxýlon-cistanche ogAtriplex-Cistanche samtökvoru gerðar með Illumina Novaseq 6000 raðgreiningarpallinum. Rannsóknirnar beindust að því að rannsaka mismun á transkriptome á C. deserticola frá mismunandi vélum, skima lykilensímgen sem taka þátt í umbroti fjölsykru og staðfesta valin gen með QRT-PCR sannprófun. Þessi rannsókn miðar að því að skapa fræðilegan grundvöll til að kanna nýjar hýsingarplöntur og erfðabætur á C. deserticola. Niðurstaðan sýndi að fjölsykruinnihaldið sem fannst í Atriplex Quadriptera-C.Deserticola var betri en til staðar í haloxýlon ammodendron-c. Deserticola. Með samanburðargreiningu á transkriptóm voru 14089 mismunandi tjáð gen (DEG) sýnd úr holdugum stilkum Atriplex Quadriptera-C. Deserticola og haloxylon ammodendron-c. Deserticola. Niðurstöður KEGG auðgunargreiningar leiddu í ljós að þessi Degs voru áberandi auðgaðar á leiðum sem tengjast kolvetnisumbrotum, umbrotum galaktósa, umbrotum amínósýru og umbrotum fitusýru. Ennfremur voru samtals 26 þjöppun fengin frá fjórum leiðum sem tengjast umbrot fjölsykru, þar á meðal tjáningarstig frúktósídasa gena og -galaktósídasa gena í haloxýlon ammodendron -c. Deserticola var marktækt hærri en í atriplex quadriptera-c. Deserticola. Tjáningarstig UDP-glúkósa dehýdrógenasa gena og mannósa -1- fosfat guanylat transferase gen í ATRIPLEX quadriptera-C. Deserticola var marktækt hærri en í haloxýlon ammodendron-c. Deserticola, sem getur verið lykilensímgenin til að stjórna mismuninum á umbrotum fjölsykrar í C. deserticola.

Lykilorð Cistanche Deserticola; Transcriptome raðgreining; gestgjafar; Mismunur á umbroti fjölsykru

Cistanche Deserticola

 

Cistanche deserticola yc ma, fyrst og fremst dreift íGansu, Xinjiang, Ningxia og Inner Mongólía, er hefðbundin kínversk lyfjasveit nýlega innifalin í„Læknis- og matvæli einsleit“Vörulisti. Það hefur ýmsa heilsubót, svo semTónun nýrna Yang, nærandi kjarni og blóð og stuðla að þörmum, gera það víða beitt ílæknisfræði, heilsugæslu og matvælaiðnaðurinn[1]. Vegna þessHeterotrophic eðli, Cistanche DeserticolaSnillir mismunandi hýsilplöntur, meðHaloxylon ammodendronog nýlega kynntHálfgrænan runniAtriplex canescens(Pursh) Nutt.að vera aðal gestgjafar þess.

Fjölsykrur eru lykilvirku efni í matiCistanche Deserticolagæði. Við mismunandi hýsingaraðstæður,uppsöfnun og efnaskipta samsetningafCistancheFjölsykrur eru mjög breytilegar [2]. Læknisannsóknir hafa sýnt þaðCistancheFjölsykrur eigaandoxunarefni, taugavörn, ónæmisreglugerð og minni aukaLyfjafræðileg áhrif, léttir á áhrifaríkan háttAlzheimerssjúkdómur, Parkinsonssjúkdómur og miltisskortur af völdum lifrar[3]. Með framförum í nútímaÚtdráttartækni og fjölþættar greiningartækni, TheInnihald, samsetning og uppbyggingareinkenniafCistancheSmám saman er verið að skýra fjölsykrur og auka umsóknir sínar.

Hvað varðarSameindalíffræði rannsóknirÁCistancheTegundir, rannsóknir á raðgreiningarrannsóknum hafa aðallega beinst aðCistanche TubulosaOgHaloxýlon-Cistancheflókin kerfi.Til dæmis,Hou o.fl.[4] framkvæmtRöðun umritunar í fullri lengd og genatjáningarsniðafCistanche Tubulosaað notaPacbio og Bgiseq -500 RNA-seq tækni, að bera kennsl á237.772 einstök afritog skimunar lykilensímgena sem taka þátt íFenýletanoid glýkósíð lífmyndun. Á sama hátt,Feng o.fl.[5] FramkvæmdTranscriptomic og umbrotsgreiningaraf haustoria og aðliggjandi vefjumHaloxylon rætur ogCistancheHoldy stilkar, afhjúpa hlutverk gestgjafans í uppsöfnunCistancheUmbrotsefni. Rannsókn þeirra lagði áherslu á aðhýsingarverksmiðja hefur ekki aðeins áhrif á ávöxtunCistancheen einnig gæði þess. Rannsóknir áCistancheParasitizing mismunandi hýsilplöntur er áfram takmörkuð.

Atriplex canescens, a djúpstæð og mjög streituþolin planta, er frábrugðið hinu hefðbundnaHaloxylon gestgjafiog á uppruna sinn fráHálfþurrt hásléttur í Mið-Bandaríkjunum. Undanfarin ár hefur það verið kynnt og kynnt sem anýr gestgjafi fyrirCistanche DeserticolaRæktunInNorðvestur Kína. An Qing o.fl.[6] greindi og bar samanFjölsykrur uppsöfnunCistancheParasitizing Haloxylon og Atriplex Canescensá sama framleiðslusvæði, finnaVerulegur munur á fjölsykruinnihaldimilli hýsingaraðstæðna tveggja.

Þannig miðar þessi rannsókn aðRöð holdugar stilkar afCistanche DeserticolaParasitizing Haloxylon og Atriplex Canescens, að greinaMismunandi tjáning lykilensímgena sem taka þátt í lífmyndun fjölsykrar. Niðurstöðurnar munu veita afræðilegur grunnur fyrir frekari rannsóknir áCistancheFjölsykrur lífmyndunaraðferðir, auðga umritunarrannsóknir á ATRIPLEX-Cistanchekerfi, og stuðla að nýsköpun í hágæðaCistancheVísbendingar um kímplasm.

 

Efni og aðferðir

1.1 Tilraunaefni

Cistanche DeserticolaSýnishorn sníkjudýrHaloxylon ammodendronOgAtriplex canescensvar safnað úrCistancheRæktunargrundvöllur íXiquan bær, Jingtai sýsla, Gansu hérað(Breidd36 gráðu 5 'n, lengdargráða103 gráðu 42 'e). BáðirHaloxýlonOgAtriplex canescensvoru ræktaðir í sama umhverfi. Sýnin voru flokkuð semHaloxýlon-Cistanche(Sýnishorn a)OgAtriplex-Cistanche(Sýnishorn h),með þremur endurtekningum fyrir hvern flokk (fimm plöntur á hverja endurtekningu). Sýnataka var gerð íApríl 2024, og sýnin voru auðkennd semCistanche DeserticolaHoldugar perur hjáPrófessor Guo YehongfráLandbúnaðarháskóli, Gansu landbúnaðarháskóli.

Í kjölfarLeiðbeiningar um sýnatöku Shanghai Oe Biotech Co., Ltd., TheCistancheHoldy stilkar voru skolaðir með útfjólubláu vatni og umfram raka var fjarlægður með síupappír. Þunnar sneiðar voru teknar úrtoppur, miðja og botnaf hverjum stilk, blandað vandlega og sett í kryógenískt hettuglös. Sýnin voruhratt frosið í fljótandi köfnunarefnifyrir2 klukkustundiráður en það er flutt í a-80 gráðu frystifyrir geymslu [7].

1.2 Tilraunaaðferðir

1.2.1 Stofnun staðals ferils og ákvörðun fjölsykrarinnihalds

A 10 mg filmuhúðaðar töflursýnishorn afD-glúkósa staðallvar vegið nákvæmlega og leyst upp í a100 ml rúmmálmeð eimuðu vatni til að undirbúa a100 ug · ml⁻¹ lager lausn. Kvörðunarlausnir af{{0}}. 2, 0. 4, 0. 6, 0.af stofnlausninni voru flutt í10 ml tappa prófunarrör, þynnt með vatni til1. 0 ml, og síðan blandað saman við1. 0 ml af 6% fenóllausnOg5 ml af þéttri brennisteinssýru. Eftir hvirfingu voru lausnirnar hitaðar í sjóðandi vatnsbaði fyrir20 mínútur, kælt síðan í ísbað fyrir10 mínútur. A autt stjórnvar undirbúið með því að nota1. 0 ml af eimuðu vatnií stað glúkósa lausnarinnar. Frásogið var mælt á482 nmNotkun aUV-Vis litrófsmæli, og aVenjulegur ferillvar búið til meðstyrkur (x) sem lárétta ásinnOgfrásog (y) sem lóðrétti ásinn.

Í kjölfar breyttrar nálgunar fráLi Jie o.fl. [8], 0. 2 g af þurrkuðumCistancheduftvar veginn nákvæmlega og settur í a20 ml tappa prófunarrör. 10 ml af 80% etanólivar bætt við og blandan var háðUltrasonic útdráttur við 80 gráðu (100 W, 40 kHz) í 30 mínútur. Útdrátturinn var síaður meðan hann var heitur og aðgerðin var endurtekin einu sinni. Eftir að hafa þurrkað leifarnar,10 ml af eimuðu vatnivar bætt við og ultrasonic útdráttur var endurtekinn tvisvar. Síur voru sameinuð og þynnt til20 mlmeð eimuðu vatni.1. 0 ml af þessari lausnvar enn frekar þynntur10 mlmeð eimuðu vatni.

A 1. 0 Ml deiliskammtaf undirbúnumCistancheSýnishitun var greind með sömu aðferð og glúkósa staðallinn. Frásog kl482 nmvar mælt og fjölsykruinnihaldiCistancheFrá mismunandi hýsilplöntum var reiknað.

1.2.2 RNA útdráttur, smíði cDNA bókasafns og raðgreining

Heildar RNA var dregið út úrCistanche DeserticolaSýnishorn sníkjudýrHaloxylon ammodendronOgAtriplex canescensnotaTiangen DP441 RNA Kit (Kína), í kjölfarTrizol hvarfefni siðareglur. RNA hreinleiki var metinn með aNanodrop 2000 litrófsmæli (Thermo Scientific, Bandaríkjunum), meðan RNA styrkur og heiðarleiki var metinn með því að notaAgilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Bandaríkjunum).

Transcriptome bókasöfn voru smíðuð meðVahts Universal V6 RNA-Seq bókasafn Prep Kit. Eftir gæðaeftirlit meðAgilent 2100 líffræði greiningartæki, bókasöfnunum var raðgreint áIllumina Novaseq 6000 pallur, að búa til150 bp pared endalestur.

1.3 Gagnagreining

1.3.1 Transcriptome samsetning og virkni umsögn

Hrá les innFastQ sniðvoru unnar með því að notaTrimmomaticað fjarlægjaPloy-N les og litlar gæði, sem leiðir tilHreinn lestur. Millistykki og lággæða svæði voru fjarlægð og hreinu lestrin voru sett saman ístykki(tjáð röð merki) með því að notaTrinity hugbúnaður. Lengsta afritið frá hverri þyrpingu var valineinhliðatil frekari greiningar.

Hagnýtur athugasemd Unigenes var framkvæmd með því að bera þau saman viðNCBI Non-Ofnefnd (NR) prótein gagnagrunnur, svissneskur-prot og þróunar ættfræði gena: gagnagrunnur sem ekki eru undir eftirliti (eggnog)að notaDiamond hugbúnaður (e-gildi <1e -5). Heilkjörnunga réttindahópar (KOG) athugasemdirvar framkvæmt til að bera kennsl á einsleitt gen. Að auki voru unigenes kortlagðirKyoto alfræðiorðabók gena og genamengi (KEGG) ferlaFyrir umbrotsúrskurð.Gen ontology (GO) Flokkun og virkni athugasemdvoru gerðar með kortlagningu úr svissneska gagnagrunninum.

1.3.2 Genatjáningargreining og auðkenning á mismunandi tjáðum unigenes (Degs)

Genatjáningarstig voru magngreind meðSlaufa 2Til að samræma hreina lestur við Unigenes. Tjáningargildi voru reiknuð semBrot á hvern kílóbasa af afriti á hverja milljón kortlagðar Reads (FPKM)að notaExpress hugbúnaður. Mismunandi tjáningargreining var gerð meðDeseq2 hugbúnaður, meðNeikvæðar binomial dreifing (NB) prófNotað til marktækniprófa. Gen (Degs) á mismunandi hátt voru skilgreind sem þau sem voru meðQ-gildi <0. 05OgFellisbreyting (FC)> 2.

1.3.3 QRT-PCR staðfesting á mismunandi tjáðum genum

Lykilensím gen sem taka þátt íFjölsykrur lífmyndunmeðveruleg mismunadrifvoru valdir fyrirMagn rauntíma PCR (QRT-PCR) staðfesting. RNA sýni voru gæðakennd og OD gildi voru mæld fyrir öfug umritun. cDNA myndun var framkvæmd með því að notaTransScript All-in-One First-Strand cDNA myndun SuperMix fyrir QPCR Kit. Samstillta cDNA var þynnt10- brjóta saman, og QRT-PCR var framkvæmt með aFlúrperur QPCR kerfivið mismunandi hjólreiðarskilyrði.ACTB (beta-aktín) var notað sem innra viðmiðunargen, og hlutfallslegt genatjáningarstig var reiknað með því að nota2⁻ΔΔCt aðferð.

 

Tafla 1 grunnröð

Gen ID	Genanafn	Áfram grunnur (5 '-3')	Reverse Primer (5 '-3')
Trinity _ dn 21412_ c 0_ g 1_ i 1_2	GMPP	GATAGTGGCTACAACATCCACTT	CCTCCTCTTCGTCGTAGGATTC
Trinity _ dn 30174_ c 0_ g 1_ i 17_2	Pfp	TATATGGGACCATGGAACCAÇAA	Gaccataggccgtgatcgatc
Trinity _ dn 25715_ c 0_ g 2_ i 4_1	Ugdh	Aaagatcttccagttcgtaagc	Accaattcgttgatgctacc
Trinity _ dn 28766_ c 1_ g 1_ i 6_1	lacz	Gtctccttgttattcgtgaggat	GTCGATGGTGGTGAAGCAGAT
Trinity _ dn 24102_ c 0_ g 6_ i 1_1	Saca	Ttacgaggatagtgaggtgcta	AATGGAAGATGAGGAGGTTGA
Trinity _ dn 21508_ c 1_ g 2_ i 4_2	lacz	Ggcacagtcaaggagtacgatg	CACTGGCATCGACGAGGAAAG
-	Actb	Caatggatgatgatatcgccgcgt	CACTGGCATCGACGAGGAAAG

 

 

1.4 Gagnagreining

Stigveldisþyrpingargreining áGen (Degs) á mismunandi háttvar flutt með því að notaR (v3.2.0)Til að sjá genatjáningarmynstur milli hópa og sýna. GO (Gene Ontology) auðgunargreining ogKEGG (KYOTO alfræðiorðabók gena og genamengi) auðgunargreining leiðarvoru gerðar með því að notaR, byggt áHypergeometric dreifing. Verulega auðguðu virkni hugtökin voru sýnd meðStrikakort, kúlulóðir og auðgunarhringlóðir.

2 Niðurstöður og greining

2.1 Ákvörðun um fjölsykla innihald

Línuleg aðhvarfsjöfnun sem fengin var úr frásogsmælingum var:

y {{0}}. 0 154x - 0.1636 (r 2=0. 9963) y=0. 0154x - 0. 1636 \ quad (R^2=0. 9963) y =0. 0154x - 0.1636 (r 2=0. 9963)

með línulegu úrvali20–90 ug · ml⁻¹. Nákvæmni, endurtekningarhæfni, stöðugleiki og endurheimtarhlutfall sýnisins voru{{0}}. 38%, 0. 86%, 0,53%og 99,67%, hver um sig.

MældInnihald fjölsykruInCistanche DeserticolaSýnishorn frá mismunandi hýsilplöntum voru:

Haloxýlon-Cistanche: 6.51%

Atriplex-Cistanche: 11.83%

2.2 Röðun umritunar og gagnasamsetning

Transcriptome raðgreining ásex sýnimyndað samtals41,77 g af hreinum gögnum. Gild gögn á hvert sýnishorn voru frá6,89 g til 7,04 g, meðQ30 grunnprósentur á milli 95,38% og 95,91%, og anMeðal GC innihald 45,13%.

Samtals61.423 Unigenesvoru settir saman, með heildarlengd65.962.858 bpog anMeðallengd 1.073,91 bp.

2.3 Gena virkni athugasemd

Samtals61.423 Unigenesvoru fengnar úr röðinniCistanche DeserticolaSýnishorn sníkjudýr sem eru tvær mismunandi hýsilplöntur. Niðurstöður umsagnarinnar eru eftirfarandi:

30.689 unigenes (49,96%)voru merktir íNR (ekki ofgnótt) prótein gagnagrunnur.

18.698 unigenes (30,44%)voru merktir íSvissneskur gagnagrunnur.

3.998 unigenes (6,51%)voru merktir íKEGG gagnagrunnur.

17.188 Unigenes (27,98%)voru merktir íKOG (heilkjörnungafræðilegir orthologous hópar) gagnagrunnur.

25.280 unigenes (41,16%)voru merktir íEggnog (Evolutionary Genealogy of Genes: Gagnagrunnur sem ekki eru undir eftirliti).

16.210 Unigenes (26,39%)voru merktir íGO (Gene Ontology) gagnagrunnur.

16.153 Unigenes (26,30%)voru merktir íPFAM (próteinfjölskyldur) gagnagrunnur.

Meðal þessara,21.650 unigenesvoru lengri en1 kb.

Samheitagreining byggð áNR gagnagrunnurleiddi í ljós að þrjár efstu tegundirnar tengdust voru:

Paulownia Fortunei (30,23%)

Phtheirospermum japonicum (14,15%)

Chenopodium Quinoa (7,1%)

 

 

Tafla 2 umsögn upplýsingar umCistanche DeserticolaGenvirkni

Gagnagrunnur	Skýringargenanúmer	Hlutfall (%)
Nr	30,689	49.96
Svissneskur	18,698	30.44
KEGG	3,998	6.51
Kog	17,188	27.98
Eggnog	25,280	41.16
Farðu	16,210	26.39

 

 

2.4 Fara og KEGG virkni og flokkun

TheGO (Gene Ontology) gagnagrunnurvar notað til að gera enn frekar til greina unigenes sem greind voru íNR gagnagrunnur, sem leiðir til samtals16.210 Unigenes. Þessar einingar voru flokkaðar íÞrír helstu starfshópar:

Líffræðilegt ferli (BP)

Sameindaaðgerð (MF)

Frumuhlutinn (CC)

ÍLíffræðilegt ferli (BP) flokkur, algengustu unigene þyrpingarnir voru:

„Frumuferli“ (11.023 Unigenes)

„Efnaskiptaferli“ (9,117 Unigenes)

FyrirFlokkur frumuhluta (CC), 17 undirflokkarvoru greindir, með hverjum undirflokki sem innihélt að minnsta kosti30 Unigenes. Stærstu þyrpingarnir voru:

"Klefi" (13.947 Unigenes)

"Cell Part" (13.918 Unigenes)

ÍFlokkur sameindaaðgerðar (MF), auðguðu virku hóparnir voru:

"Bindandi" (10.039 Unigenes)

„Hvatavirkni“ (8.490 unigenes)

Mynd 2

 

KEGG virkni og flokkun

Meðan áTranscriptome raðgreining, samtals3.998 Unigenesvoru merktir íKEGG (KYOTO alfræðiorðabók um gen og genamengi). Þessar unigenes voru flokkaðar ísex aðalflokkar, með viðkomandi unigene talningum og hlutföllum á eftirfarandi hátt:

Frumuferli: 326 Unigenes (8.15%)

Vinnsla umhverfisupplýsinga: 299 Unigenes (7.47%)

Erfðafræðileg upplýsingavinnsla: 1.771 unigenes (44.30%)

Mannasjúkdómar: 14 Unigenes (0.35%)

Umbrot: 1.465 unigenes (36.64%)

Lífverukerfi: 123 Unigenes (3.07%)

Þessum sex aðalflokkum var frekar skipt í20 aukaflokkunarstig. Meðal þeirra,Erfðafræðileg upplýsingavinnslahafði hæsta hlutfallið, á eftirUmbrot. InnanUmbrotFlokkur, algengustu leiðirnar voru:

Umbrot kolvetna

Umbrot fitusýru

Flavonoid umbrot

Fig.3 KEGG Metasiol Pathway umritun Unigenes

 

2.5 Mismunandi genatjáning og auðgunargreiningCistanche Deserticolafrá mismunandi vélum

Transcriptome raðgreiningargögn voru síuð meðSjálfgefin viðmið við val á tjáningu, sem leiðir til auðkenningar14.089 mismunandi tjáð gen (Degs):

6.576 gen voru uppstýrð

7.513 gen voru stjórnað niður

A Volcano söguþræðivar búið til til að sjá heildardreifingu Degs.

ÍTopp 30 Go auðgun virkni flokkunaf Degs kom fram að:

Í samanburði viðLíffræðilegt ferli (BP)OgFrumuhlutinn (CC)flokkar,Sameindaaðgerð (MF)sýndi mikilvægari auðgun DEG.

Einstaklega auðguðu Degs tengdustUmbrot kjarnsýru, umbrot próteina og lykilensím í umbroti galaktósa.

Að auki voru Degs auðgaðir verulega íGO hugtök sem tengjast umbrot fjölsykrar, þar á meðal:

Sterkja efnaskiptaferli

Líffræðileg ferli glýkógen

Súkrósa katabolísk ferli

Virkni glúkósídasa

UDP-L-Rhamnose synthase virkni

Fjölsykruhýdrólasavirkni

Fig.4 Volcanic kort af mismunandi tjáðum genum

 

Auðgunargreining KEGG leiðar á DEG íCistanche Deserticolafrá mismunandi vélum

Til að kanna frekarGen (Degs) á mismunandi háttInCistanche Deserticolafrá mismunandi hýsilplöntum,Auðgunargreining KEGG leiðarvar flutt. Greiningin leiddi í ljós að:

Degs voru kortlagðir á 117 efnaskiptaferli.

Thetopp 20 leiðirsýntveruleg auðgun DEG, með auðguðum leiðum þar á meðal:

Umbrot fitusýru

-Línólensýruumbrot

Umbrot galaktósa

Lýsín niðurbrot

Frekari auðgunargreining á20 efstu efnaskipta flokka með minnstu Q-gildibenti til þess að DEG væru verulega auðgaðir í:

Lífverukerfi

Umbrot

Erfðafræðileg upplýsingavinnsla

Meðal þessara flokka,„Umbrot“hafði mestan fjölda auðgaðra DEG og sýnt mikilvægustu auðgunina. Að auki, í auðguðum efnaskiptaferlum,Hlutfall uppstýrðra og niðurregluðu unigenes var næstum jafnt.

Þessar niðurstöður benda til þessefnaskiptaferli gegna lykilhlutverkiÍ mismunadrifi genatjáningarCistanche Deserticolafrá mismunandi hýsilplöntum, sérstaklega íLípíð, kolvetni og amínósýrum umbrot.