Thrombomodulin bætir umbreytandi vaxtarþátt-b1-miðlaðan langvarandi nýrnasjúkdóm í gegnum G-prótein tengda viðtakann 15/Akt merkjaleið

Tengiliður:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Atsuro Takeshita1,2,8 , Taro Yasuma1,2,8 , Kota Nishihama1 , Corina N. D'Alessandro-Gabazza2, Masaaki Toda2 , Toshiaki Totoki4 , Yuko Okano1,2 , Akihiro Uchida1 , Ryo Inoue inoue6 , Liqi Vali Wangeria6 , Liq Fridman D'Alessandro2, Tetsu Kobayashi3, Yoshiyuki Takei4, Akira Mizoguchi5, Yutaka Yano1,9 og Esteban C. Gabazza2,9

1 Deild sykursýki, efnaskipti og innkirtlafræði, Mie University Graduate School of Medicine, Tsu-city, Mie, Japan; 2 Department of Immunology, Mie University Graduate School of Medicine, Tsu-city, Mie, Japan; 3 Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Mie University Graduate School of Medicine, Tsu-city, Mie, Japan; 4 Deild meltingar- og lifrarlækningar, Mie University Graduate School of Medicine, Tsu-city, Mie, Japan; 5 Department of Neural Regeneration and Cell Communication, Mie University Graduate School of Medicine, Tsu-city, Mie, Japan; 6 Central Institute for Experimental Animals, Kawasaki-ku, Kawasaki, Kanawaga, Japan; og 7 nýrnalækningadeild, Taizhou sjúkrahúsið, Wenzhou Medical University, Lihai, Zhejiang héraði, Alþýðulýðveldið Kína.

Nýra International (2020) 98, 1179–1192; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.05.041

Höfundarréttur ª 2020, International Society of Nephrology. Gefin út af Elsevier Inc. Þetta er grein með opnum aðgangi undir CC BY-NC-ND leyfinu (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Bréfaskipti: Esteban C. Gabazza, Department of Immunology, Mie University School of Medicine, Edobashi 2-174, Tsu-city, Mie 514-8507, Japan. Netfang: gabazza@doc.medic.mie-u.ac.jp; eða Yutaka Yano, sykursýki, efnaskipti og innkirtlafræði, Mie University Graduate School of Medicine, Edobashi 2-174, Tsu-city, Mie 514-8507, Japan. Tölvupóstur: yanoyuta@clin.medic.mie-u.ac.jp 8 AT og TY lögðu jafnt sitt af mörkum til þessarar vinnu. 9 YY og hjartalínurit eru meðvirkir höfundar. Móttekið 1. september 2019; endurskoðað 24. apríl 2020; samþykkt 7. maí 2020

LYKILORÐ: apoptosis; langvarandi nýrnasjúkdómur; G-prótein tengdur viðtaki; raðbrigða thrombomodulin úr mönnum; umbreytandi vaxtarþáttur-b1

Fifibrosis í nýrum er algeng afleiðing langvinnra nýrnasjúkdóma sem þróast óumflýjanlega yfir í lokastigs nýrnasjúkdóm með líffærabilun sem aðeins er hægt að meðhöndla með uppbótarmeðferð. Þar sem umbreytandi vaxtarþáttur-b1 er aðalþátturinn í meingerð nýrnafíbrósa, settum við fram þá tilgátu að raðbrigða thrombomodulin geti bætt umbreytandi vaxtarþátt-b1-miðlaða versnandi nýrnafíbrósu og bilun. Til að yfirheyra tilgátu okkar, bjuggum við til nýja glomerulus-sértæka, erfðabreytandi vaxtarþátt-b1, erfðabreytta mús úr mönnum til að meta lækningaáhrif raðbrigða thrombomodulins. Þessi erfðabreytta mús þróaði með sér versnandi glomerular sclerosis og tubulointerstitial fifibrosis með nýrnabilun. Meðferð með raðbrigða thrombomodulin í fjórar vikur hamlaði marktækt fifibrosis í nýrum og bætti líffærastarfsemi samanborið við ómeðhöndlaðar erfðabreyttar mýs. Meðferð með raðbrigða thrombomodulin hamlaði marktækt apoptosis og mesenchymal sérhæfingu fræfrumna með því að hafa samskipti við G-prótein tengda viðtakann 15 til að virkja Akt boðferilinn og til að auka tjáningu and-apoptotic próteina þar á meðal survivin. Þannig bendir rannsókn okkar eindregið til hugsanlegrar meðferðaráhrifa raðbrigða thrombomodulin til meðferðar álangvinnan nýrnasjúkdómog líffærabilun í kjölfarið.

cistanchedósmeðhöndla nýrnasjúkdómbæta nýrnastarfsemi

Þýðingaryfirlýsing

Fibrosis og truflun á starfseminýrueru nú mikil heilsufarsvandamál um allan heim. Sem stendur er ekkert trefjalyf sem er samþykkt til að meðhöndla fíbrósu í nýrum. Umbreytandi vaxtarþáttur-b1 er helsti og algengi drifkrafturinn fyrir trefjamyndun nýrna í langvinnum nýrnasjúkdómum af völdum margra sjúkdóma. Við komumst að því að raðbrigða thrombomodulin, lyf sem er samþykkt í Japan til að meðhöndla dreifða blóðstorknun í æðum, bælir framgang gauklaherslis, tubulointerstitial fifibrosis og nýrnabilun af völdum oftjáningar á umbreytandi vaxtarþáttum-b1 úr mönnum, sem bendir til hugsanlegs meðferðargildis fyrir meðferðina. aflangvinnir nýrnasjúkdómar.

Langvinn nýrnasjúkdómurer stórt lýðheilsuvandamál sem tengist mikilli veikindum og dánartíðni sem hefur áhrif á um 13 prósent fullorðinna íbúa í þróuðum löndum.1 Alþjóðaheilbrigðismálastofnunin greindi frá því aðlangvinnan nýrnasjúkdóm(CKD) var orsök 1,5 prósenta dauðsfalla um allan heim árið 2012.1 Ennfremur benda nýlegar faraldsfræðilegar upplýsingar til stöðugrar aukningar á fjölda sjúklinga með langvinnan langvinnan sjúkdóm. nýrnabilun á stigi, sem eingöngu er hægt að meðhöndla með ævilangri skilun eða nýrnaígræðslu.4,5 Sykursýki (DM) og slagæðaháþrýstingur eru algengustu orsakir langvinnrar lungnateppu og síðan blóðþurrð, gauklakölkun af óþekktri orsök, þvagfærastíflur og langvarandi sýkingar.6 Burtséð frá undirliggjandi röskun, er síðasta og algenga sjúklega afleiðing langvinnrar nýrnasjúkdóms fifibrosis í nýrum.7 Renal fifibrosis er afbrigðileg lækning og endurgerð á parenchymal byggingum nýrna sem verða fyrir langvarandi eða endurteknum áverka sem einkennist af nærveru tubulointerstitial fifibrosis, glomerulosclerosis og píplurýrnun.8 Helsti drifkraftur fifibrogenesis í nýrum er umbreytandi vöxtur staðreynd eða (TGF)-b1.8,9 TGFb1 getur stuðlað að fifibrosis með því að örva seytingu utanfrumu fylkispróteina og efnafræðilegra þátta eða fjölgun þátta trefjafrumuefna, með því að hindra málmpróteinasa og með því að stuðla að þekju-mesenchymal umskiptum.10 Fyrir utan að meðhöndla undirliggjandi sjúkdóm. , viðurkennt lyf sem beinist sérstaklega að nýrnafíbrósu er ekki fáanlegt eins og er.6

Thrombomodulin (TM) er yfirhimnu glýkóprótein með margar líffræðilegar aðgerðir, þar með talið mótun storkukerfisins, ónæmissvörun, bólguviðbrögð og lifun frumna.11 Sameindabygging TM inniheldur lektín-líkt lén, 6 húðþekjuvaxtarþáttalík lén. , serín/þreónínríkt lén, transhimnuhluti og umfrymishala.12 Thrombin, procoagulant factor sem myndast við virkjun storkukerfis, verður segavarnarlyf og antifibrinolytic þáttur eftir bindingu við TM.13 TM-thrombin flókið eykur myndun virkjaðs próteins C (APC), segavarnarlyfs með bólgueyðandi og frumuverndandi virkni, með því að virkja prótein C. Að auki getur TM eitt sér beinlínis dregið úr bólgusvöruninni með því að hamla virkni próteins hóps B með mikla hreyfigetu-1 (HMGB1), með því að bæla ónæmisvaldandi dendritfrumur, eósínófíla, mastfrumur og komplementkerfið.13–18

Það eru birtar niðurstöður sem sýna fyrirbyggjandi áhrif TM við nýrnakvilla vegna sykursýki og nýrnaskaða vegna blóðþurrðar-endurflæðis.19-21 Engin rannsókn hefur hins vegar metið áhrif raðbrigða TM á versnandi nýrnafíbrósu af völdum TGFb1, sem er algengur drifkraftur nýrnabólga hjá nokkrir sjúkdómar sem valda langvinnri lungnateppu. Við settum fram þá tilgátu að TM geti bætt TGFb1-miðlaða nýrnafíbrósu og nýrnabilun. Til að yfirheyra þessa tilgátu, metum við meðferðaráhrif raðbrigða TM í nýþróaðri glomerulus-sértækri TGFb1 erfðabreyttri (TG) mús sem þróar stigvaxandififibrosis í nýrum og nýrnabilun.

cistanche fyrir nýru

NIÐURSTÖÐUR

Aukin TM brot í blóðrás hafa fylgni við skerta nýrnastarfsemi

TM, æðaþelsfrumuhimnubundið glýkóprótein, er klofið í bútum, missir verndandi virkni sína við æðaþelsskaða.22 Sykursýkisnýrnakvilli tengist æðaþelsskaða.23,24 Sjúklingar með DM með nýrnakvilla, samanborið við sjúklinga án merkjanlegs nýrnakvilla, sýndu verulegan nýrnakvilla. blóðrásarmagn TM (4,4 á móti 3,3 pg/ml) og virku TGFb1 (0.28 á móti 0.24 ng/ml) (viðbótartafla S1, aukamynd S1A). TM er marktæk fylgni við kreatínín, virkt TGFb1 og leysanlegt podósín (viðbótarmynd S1B). Þessar athuganir benda til þess að tap á virku himnubundnu TM tengist aukinni losun virks TGFb1 og truflun á nýrnastarfsemi.

TG mús með glomerulus-sértæka tjáningu á mannlegu TGFb1 geni í fullri lengd

Við þróuðum TG mús sem oftjáir TGFb1 genið í fullri lengd mannsins í fræfrumum. Músin var mynduð með því að setja TGFb1 úr mönnum undir stjórn pódósínhvatarans á gervilitningagerð (BAC) (viðbótarmynd S2; viðbótarmynd S3). Við fengum 5 stofnmýs sem tjáðu 3 eintök og 3 stofnmýs sem tjáðu 1 eintak af TGFb1 transgeninu úr mönnum. Tjáning transgensins var nýrnasértæk og afkvæmi stofnendanna voru lífvænleg (viðbótarmynd S3). Mýsnar voru á fullu meðgöngu og rusl var af eðlilegri stærð. Mýs fæddust í væntanlegu Mendelian hlutfalli.

Til að einkenna TG mýsnar mældum við nokkrarnýrnabreyturá 4 vikna fresti í 16 vikna tímabil (viðbótarmynd S4). Plasma- og þvagþéttni TGFb1 jókst marktækt í TGFb1- TG músum samanborið við villigerð (WT) mús frá fyrstu vikum eftir fæðingu og hélst síðan stöðug á háu stigi (Mynd 1a). TGFb1-TG mýs sýndu marktæka aukningu á nýrnavefsinnihaldi hýdroxýprólíns á 20 viku (190.5 á móti 96.0 mg/nýra ), þensla á millibili frá 4. viku (1,9 á móti 1,1 stigum) og í kollagenútfellingu frá 12. viku (0,9 prósent á móti 0,1 prósent ) eftir fæðingu samanborið við hliðstæða þeirra í WT (mynd 1a–f) ). Hefðbundin sjónsmásjárskoðun sýndi breikkun á grunnhimnu Bowman-hylkisins, þykknun á gauklagrunnhimnu, aukna kollagenútfellingu í miðhimnu- og millivefsrýmum og píplurýrnun (Mynd 1bd). Sendingarrafeindasmásjár sýndi gauklakölkun, þar með talið umbreytingu smávillu og útfellingu á fótfrumum í fótfrumum, minnkuð æðaþels æðaþels gauklaháræða, þykknun á gauklagrunnhimnu og aukna útfellingu á mesangial fylki (mynd 2a–i). Þvagþéttni fyrstu merkja nýrnakvilla Fitusýrubindandi prótein (185,1 á móti 87,0 pg/ml) ognýrnaskaðasameind 1 (441,9 á móti 256,9 pg/ml) var verulega aukin í TGFb1-TG músum frá 4. og 8. viku aldri, í sömu röð, samanborið við aldurssamsvörunar WT mýs þeirra (viðbótarmynd S5). Heildarpróteinmigu og heildarprótein-kreatínín hlutfall í þvagi jókst marktækt á 4., 8., 12., 16. og 20. viku hjá TGFb1-TG músum samanborið við WT hliðstæða þeirra (Mynd 3a) . Plasmaþéttni þvagefnis köfnunarefnis í blóði var marktækt hækkað frá 4. viku (5,1 á móti 4,1 mg/dl) og styrkur kreatíníns frá 8. viku (1,1 á móti 0,4 mg/dl) í TGFb1-TG músum borið saman við WT hliðstæða þeirra (Mynd 3b).

rhTM hamlar glomerulosclerosis og tubulointerstitial fifibrosis

Þegar borið er saman við TGFb{{0}}TG mýs meðhöndlaðar með saltvatni (SAL) og WT mýs sem voru meðhöndlaðar með raðbrigða manna (RH) TM eða SAL, sýndu TGFb1-TG mýs sem voru meðhöndlaðar með takti marktækt skert mesangial stækkun/frumuvirkni (1,3 á móti 3.{{30}} skori) og marktækt lágt pípumillivefs kollagenútfellingu og gauklakölkun (121,3 prósent á móti 139,7 prósent) (Mynd 4a–e). Í samræmi við þessar athuganir, hýdroxýprólíninnihald (11,7 á móti 19,9 mg/g), nýrnavefsstyrkur kollagens I (101,3 á móti 196,7 ng/mg próteins) og períóstíni (21,7 á móti 40,8 ng/ mg prótein), og hlutfallsleg mRNA tjáning kollagens I var marktæk minnkuð í nýrnavef frá TGFb1-TG músum sem fengu rhTM samanborið við nýrnavef frá samanburðarmúsum (Mynd 4f, viðbótartöflur S2 og S3). Sendingarrafeindasmásjáin sýndi marktæka minnkun á útbroti fótfrumna í fótfrumum og þykknun á gauklagrunnhimnu í músum sem fengu rhTM samanborið við mús sem voru meðhöndlaðar með SAL eingöngu (viðbótarmynd S6AB og B). Að auki er nýrnavefsstyrkur efnafræðilega frumufrumuefna próteinsins -1 (45,0 á móti 76,1 pg/mg próteini), interleukin-13 (612,1 á móti 1002,0 pg/mg próteini) og virkt TGFb1 (131,0 á móti 151,5 pg/ mg próteini) minnkaði verulega í TGFb1-TG músum sem fengu rhTM samanborið við viðmiðunarmús (viðbótarmynd S7). Styrkur nýrnavefs HMGB1 lækkaði einnig marktækt í nýrnavef frá TGFb1-TG músum sem fengu rhTM samanborið viðnýrnaveffrá viðmiðunarmúsum (viðbótarmynd S7). Plasmaþéttni trombín andtrombínsamstæðu jókst marktækt í TGFb1-TG/SAL hópnum samanborið við WT/SAL hópinn en enginn munur fannst á milli TGFb1-TG/rhTM og WT/rhTM hópanna. (Viðbótarmynd S8A). Eins og búist var við var mikill styrkur TM í plasma TGFb1-TG og WT músa sem fengu rhTM. Plasmaþéttni APC/antitrypsin fléttunnar var marktæk minnkuð í TGFb1-TG/SAL hópnum samanborið við WT/SAL og TGFb1-TG/rhTM hópana (280,5 á móti 384,6 pg/ml) , og enginn marktækur munur var á magni plasmínógenvirkjahemils-1 (viðbótarmynd S8A). Magn C5a í plasma, þvagi ognýrnavef(630,1 á móti 1075,0 pg/mg próteini) og plasmaleysanlegt podocin minnkaði marktækt í TGFb1-TG músum sem fengu rhTM samanborið við TGFb1-TG músum sem fengu SAL (Viðbótarmynd S8B). Magn podókíns í þvagi var hærra í TGFb1-TG/SAL hópnum en í WT/SAL og TGFb1-TG/rhTM hópunum (viðbótarmynd S9A–C).

Mynd 1|Mannlega umbreytandi vaxtarþáttur b1 (TGFb1) erfðabreytt (TG) mús þróar versnandi nýrnafíbrósu. (a) Styrkur TGFb1 próteins í plasma og þvagi var mældur með ensímónæmisprófi og innihald hýdroxýprólíns í vefjum með litamælingu. (b–d) Hlutar af nýrnavef voru litaðir með (b) periodic acid–Schiff (stangir ¼ 20 mm) og með (c,d) Masson tríkrómi (stikur ¼ 10{{ 40}} mm) og síðan (e,f) magnmælt með því að nota stigakerfi eða WinROOF myndhugbúnaðinn (Mitani Corporation, Tókýó, Japan). Fjöldi músa til nýrnavefsmats: fyrir villigerð (WT) mús, n ¼ 4 eftir 4, 12 og 20 vikur; fyrir TG mýs, n ¼ 7 eftir 4 vikur, n ¼ 8 eftir 16 vikur og n ¼ 9 hjá 20 vikna börnum. Fjöldi músa til að meta plasma og þvag: fyrir WT mýs, n ¼ 12 eftir 4 vikur, n ¼ 8 eftir 8 vikur, n ¼ 7 eftir 12 vikur og n ¼ 4 eftir 16 og 20 vikur; fyrir TG mýs, n ¼ 24 eftir 4 vikur, n ¼ 17 eftir 8 og 12 vikur og n ¼ 9 við 16 og 20 vikur. Gögn eru gefin upp sem miðgildi millifjórðungsbils. Tölfræðileg greining með Mann-Whitney U prófi. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ****p="">< 0,0001.="" ns,="" ekki="" marktækt.="" til="" að="" hámarka="" áhorf="" á="" þessa="" mynd="" skaltu="" skoða="" netútgáfu="" þessarar="" greinar="" á="">

Mynd 2|Sendingarrafeindasmásjárniðurstöður í umbreytandi vaxtarþáttum b1-framkallaðri nýrnafíbrósulíkani. Festing, meðhöndlun og fjarlæging nýrna úr músum var framkvæmd eins og lýst er í aðferðunum. (a,b) Örvilluumbreyting og (a,b,d,e,g) fótferliseyðing (hvítir örvahausar) á fræfrumum, (c–e) minnkuð æðaþels gauklaháræða (gulir örvahausar), (f) þykknun á gauklabotnhimna (stjörnur) og (h,i) aukin útfelling á mesangial fylki (hvítar örvar) eru til staðar. CL, háræðaholum. Til að hámarka áhorf á þessa mynd skaltu skoða netútgáfu þessarar greinar á www.kidney-international.org.

rhTM bætir nýrnastarfsemi

Magn L-fitusýrubindandi próteins (197.0 á móti 313,4 pg/ml),nýrnaskaða sameind1 (299,9 á móti 596,2 pg/ml), þvagefni köfnunarefnis í blóði (12,9 á móti 34,8 mg/dl), kreatíníni (0,5 á móti 1,4 mg/dl), og albúmín-kreatínín hlutfallið var marktækt lækkað í TGFb1-TG mýs með fifibrosis í nýrum meðhöndlaðir með rhTM samanborið við ómeðhöndlaða TG hliðstæða þeirra (Mynd 5). Heildarprótein í þvagi og heildarprótein kreatínín hlutfall lækkuðu einnig í TGFb1-TG músum sem fengu rhTM samanborið við ómeðhöndlaða hliðstæða þeirra (mynd 5).

rhTM dregur úr apoptosis gaukulfrumna

Endanleg deoxýnukleótídýl transferasa-miðluð dUTP nick end-merking litun sýndi marktækt minnkaðan fjölda apoptótískra frumna í glomeruli frá TGFb1-TG músum sem fengu rhTM samanborið við glomeruli frá TGFb1- TG músum sem fengu SAL (uppbótarefni) Mynd S10A og B). Klofnun kaspasa-3 minnkaði einnig verulega í nýrnavef frá TGFb1-TG músum sem fengu rhTM samanborið við nýrnavef úr TGFb1-TG músum sem fengu SAL (viðbótarmynd S10C). Thenýrnaveffrá TGFb1-TG músum sem fengu rhTM, samanborið við þær frá TGFb1-TG sem fengu SAL, sýndu marktæka hækkun á mRNA-gildum B-frumu eitilfrumukrabbameins 2 (Bcl-2), B. -frumu eitilæxli-extra stórt (Bcl-XL), bakkelsihemill apoptosis sem inniheldur 5 (BIRC5, einnig þekkt sem survivin), og BIRC6 (Apollon) með auknu Bcl-2-Bax hlutfalli (viðbótarmynd S11) ).

Mynd 3|Mannlega umbreytandi vaxtarþáttur b1 (TGFb1) erfðabreytt (TG) mús er með skerta nýrnastarfsemi. (a) Heildarprótein og (b) blóðþvagefnisnitur (BUN) voru mæld með litamælingum og kreatínín með ensímaðferð. Fjöldi músa til að meta plasma og þvag: fyrir villigerð (WT) mýs, n ¼ 12 eftir 4 vikur, n=7 eftir 8 og 12 vikur og n=4 við 16 og 2{ {21}} vikur; fyrir TG mýs, n =24 eftir 4 vikur, n=17 eftir 8 og 12 vikur og n=9 eftir 16 og 20 vikur. Gögn eru gefin upp sem miðgildi ± millifjórðungsbil. Tölfræðileg greining með Mann-Whitney U prófi. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ****p=""><>

rhTM hindrar frumufrumufrumufrumur

Formeðferð á fræfrumum með rhTM minnkaði marktækt frumudauða fræfrumna sem ræktaðar voru í viðurvist TGFb1 eins og metið er með fjölda frumna í subG1 fasa (3,2 prósent á móti 5,2 prósent), endanlegum deoxýnukleótidýl transferasa-miðluðum dUTP nick-endamerkingum (–jákvæð frumumerking) 1.0 á móti 5.4 frumum/Fifield) og hversu mikið kaspasa-3 klofnar (0.9 á móti 1.1 hlutföllum) (Mynd 6a–e). Skimun á mænueyðandi þáttum í ræktuðum fræfrumum sýndi að rhTM eykur marktækt mRNA tjáningu mænueyðandi þáttarins Bcl-2 samanborið við tjáningu í ómeðhöndluðum frumum (viðbótarmynd S12). MRNA tjáning andapoptotic þáttarins BIRC5 jókst einnig í frumum sem fengu rhTM samanborið við tjáningu í ómeðhöndluðum frumum (viðbótarmynd S12). Tjáning mRNA á proapoptotic þættinum Bax minnkaði verulega með rhTM meðferð samanborið við enga meðferð (viðbótarmynd S12). Meðferð með rhTM hamlaði einnig verulega tjáningu annexíns V og endanlegs deoxýnukleótidýltransferasa-miðlaðrar dUTP nick-endamerkingarlitunar í fræfrumum sem ræktaðar voru í nærveru vetnisperoxíðs (viðbótarmynd S13A–E) og við háan glúkósaskilyrði (aukamynd S14A–E) ) sem staðfestir enn frekar andapoptotic eiginleika rhTM á fræfrumum. Könnun á andapoptótískum próteinkínasa B (Akt) ferli25 sýndi að rhTM jók fosfórun Akt í frumfrumufrumum manna ræktaðar í nærveru vetnisperoxíðs eða TGFb1 (viðbótarmynd S15A og B). Við einangruðum síðan fræfrumur úr hverjum hópi músa og metum Akt fosfórun með Western blotting. Það var marktækt aukin fosfórun á Akt í fræfrumum einangruðum úr TGFb{{30}}TG/rhTM hópnum samanborið við fræfrumur úr ómeðhöndlaða hópnum (1,1 á móti 0,7 hlutföllum) (viðbótarmynd S16A og B).

GPR15 miðlun

Fyrri rannsóknir greindu frá því að TM virkjar innanfrumuleiðir með því að hafa samskipti við vefjafrumuvaxtarþáttsviðtaka 1 (FGFR1) ogG-prótein tengdur viðtaki15 (GPR15).26,27 Podocytes tjá FGFR128 en hvort þær tjá GPR15 er óljóst. Hér einangruðum við podocytes úr hverjum hópi músa og sýndum að podocytes tjá einnig GPR15 (viðbótarmynd S17A–E). Við komumst að því að fræfrumur frá heilbrigðri stjórn og sjúklingi með glomerulosclerosis tjá einnig GPR15 (viðbótarmynd S18). Til að skýra hvort FGFR1 eða GPR15 miðlar rhTM hamlandi virkni á frumudreifingu fræfrumna, metum við andafæðandi virkni rhTM í TGFb1-meðhöndluðum fræfrumum í viðurvist FGFR1 hemla eða eftir að frumurnar hafa verið fluttar með litlu truflun RNA (siRNA) gegn FGFR1 eða GPR15. Formeðferð á fræfrumum með FGFR1 hemli (viðbótarmynd S19A og B) eða FGFR1 siRNA (13,2 prósent á móti 7,9 prósent) (Mynd 7a og b) tókst ekki að afnema hamlandi virkni rhTM við frumuddrun fræfrumna. Hins vegar afnám frumna með GPR15 siRNA algjörlega hamlandi virkni rhTM (14,6 prósent á móti 13,8 prósent) áfrumufrumufrumufrumur(Mynd 7a–c).

Mynd 4|Raðbrigða trombomodulin úr mönnum (rhTM) hamlar glomerulosclerosis og tubulointerstitial fifibrosis. Hlutar af nýrnavef voru litaðir (a,b) með periodic acid–Schiff og (c,d) með Masson trichrome og (e) síðan magngreindir með stigakerfi eða WinROOF myndhugbúnaðinum. (e) Meðalgildi villigerðar (WT)/saltvatns (SAL) hópsins var tekið sem 100 prósent. Tölfræðileg greining með Mann-Whitney U prófi. (f) Hýdroxýprólíninnihald í vefjum var mælt með litamælingu, styrk kollagens I-a1 (Col1a1) og períóstíns með ensímónæmisprófi og mRNA tjáningu með öfugri transkriptasa-pólýmerasa keðjuverkun. Tölfræðigreining Kruskal Wallis dreifnigreiningar og leiðrétt Dunn próf. n=8 í hverjum hópi. Barir {{10}} (a,c) 50 mm og (d) 20 mm. Gögn eru gefin upp sem miðgildi ± millifjórðungsbil. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" ****p="">< 0,0001.="" tg,="" erfðabreytt;="" tgfb1,="" umbreytandi="" vaxtarþáttur="" b1.="" til="" að="" hámarka="" áhorf="" á="" þessa="" mynd="" skaltu="" skoða="" netútgáfu="" þessarar="" greinar="" á="">

rhTM hamlar EMT fræfrumna

Það var marktækt aukið svæði með jákvæðri litun fyrir podocin og a-sléttvöðvaaktín (a-SMA) (1,4 prósent á móti 11,2 prósent) í TGFb1-TG/SAL músum samanborið við TGFb1-TG / rhTM mýs (Mynd 8a og b). Við ræktuðum síðan frumfrumur úr mönnum in vitro, formeðhöndluð með rhTM áður en TGFb1 próteini var bætt við ræktunarmiðilinn. Fibroblast-eins formgerð og aukin tjáning a-SMA var bæld í fræfrumum sem voru meðhöndlaðir með rhTM samanborið við ómeðhöndlaðar frumur (viðbótarmynd S20A). Að auki hamlaði rhTM mRNA tjáningu fíbrónektíns og vimentíns, þó það hafi aukið mRNA tjáningu E-cadheríns í fræfrumum samanborið við tjáningu í ómeðhöndluðum frumum (viðbótarmynd S20B). SMAD fjölskyldumeðlimir 2 (Smad2) og Smad3 gegna mikilvægu hlutverki í TGFb1-miðluðum þekju-mesenchymal umbreytingum (EMT).29 Meðferð með rhTM bældi verulega virkjun Smad2 og Smad3 í TGFb1-TG músum borið saman við ómeðhöndlaðar TG mýs (mynd 8c) og í fræfrumum úr mönnum sem ræktaðar eru í viðurvist TGFb1 (viðbótarmynd S20C).29 TG mýs sem meðhöndlaðar eru með rhTM (TGFb1-TG/rhTM) sýna einnig minni tjáningu á a-SMA (3,7 prósent á móti 17,2 prósent) í pípulaga þekjufrumum samanborið við ómeðhöndlaða hliðstæða þeirra (viðbótarmynd S21A og B).

Mynd 5|Raðbrigða trombomodulin úr mönnum (rhTM) bætir nýrnaskaða og skerta nýrnastarfsemi. Kreatínín var mælt með ensímaðferð; heildarprótein með litamælingaraðferð; og þvagefnis köfnunarefni í blóði (BUN) og albúmín, nýrnaskaðasameind 1 (KIM-1), L-fitusýrubindandi prótein (L-FABP) og heildarbreytandi vaxtarþáttur b1 (TGFb1) með ensímónæmisprófi. n=8 í hverjum hópi. Gögnin eru gefin upp sem miðgildi±fjórðungsbil. Tölfræðileg greining með Kruskal-Wallis dreifigreiningu og óleiðréttu Dunn prófi. * P < {{10}}.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001,="" ****="" p="">< 0.0001,="" #p="0.06." ns,="" ekki="" marktækur;="" sal,="" saltvatn;="" tg,="" erfðabreytt;="" wt,="">

GPR15 miðlar hamlandi virkni rhTM á EMT

Flutningur fræfrumna með FGFR1 siRNA tókst ekki að afnema hamlandi virkni rhTM á hlutfallslega mRNA tjáningu bæði kollagens I-a1 og a-SMA í TGFb1- meðhöndluðum fræfrumum (viðbótarmynd S22). Hins vegar afnam flutning frumna með GPR15 siRNA verulega hamlandi virkni rhTM á hlutfallslega mRNA tjáningu bæði kollagens I-a1 og a-SMA í TGFb1-meðhöndluðum fræfrumum (viðbótarmynd S22).

UMRÆÐA

TGFb1 og skaði á gauklafrumum

Algeng afleiðing sjúkdóma sem valda langvinnri nýrnahettu er fifibrosis í nýrum.8,30,31 TGFb1 er algengur drifkraftur vefjamyndunar í nýrum sem tengist langvinnri nýrnahettu af völdum sjúkdóma þar á meðal DM, slagæðaháþrýstings og sjálfsofnæmissjúkdóma. getur seytt duldum formum TGFb1 sem, þegar það er of virkjað við vefjaskaða, getur leitt til nýrnaármyndunar.32 Þar sem TGFb1 getur örvað eigin seytingu verður trefjaferlið almennt að vítahring.8 Snemma atburður í sjúkdómsvaldandi ferli TGFb. 1- miðlaðififibrosis í nýrumer skaði á fræfrumum og gauklaæðaþelsfrumum.33–35 Plasmamagn leysanlegs TM er merki um æðaþelsskaða. Í samræmi við hlutverk TGFb1 í nýrnafrumuskaða, hér fundum við marktæka fylgni virks TGFb1 við leysanlegt TM, leysanlegt podocin og kreatínín í plasma frá sjúklingum með DM. Víxlun milli gauklaæðaþelsfrumna og fræfrumna meðan á anýrnaskaðaleiðir til staðbundinnar tjáningar próteasa sem veldur niðurbroti gauklagrunnhimnu.34–36 Þetta gæti skýrt greiningu á leysanlegu podósíni og marktækri fylgni þess við leysanlegt TM hjá sjúklingum okkar með DM.

Mynd 6|Raðbrigða trombomodulin úr mönnum (rhTM) bælir frumudreifingu fræfrumna sem framkallast af umbreytingu vaxtarþáttar b1 (TGFb1). (a) rhTM var bætt við ræktunarmiðil fræfrumna 1 klukkustund áður en framkallað var frumudauða með 10 ng/ml TGFb1 í 48 klukkustundir. (b) Hlutfall frumna í subG1 fasa var greint með samfrumugreiningu. (a,b) n=3 í hverjum hópi. (c,d) Fjöldi frumna með DNA sundrun var mældur með endanlega deoxýnukleótidýl transferasa-miðluðum dUTP nick end-merkingar (TUNEL) greiningu (n=3 í saltvatns [SAL]/SAL og rhTM/SAL hópum; n=6 í SAL/TGFb1 og rhTM/TGFb1 hópum), og (e) magn caspasa-3 klofnings var mælt með Western blotting (n=4 í hverjum hópi). Barir=100 mm. Gögn eru gefin upp sem miðgildi ± millifjórðungsbil. Tölfræðileg greining með Mann-Whitney U prófi. *P < 0,05.="" dapi,="" 40="" ,6-diamidínó-2-fenýlindól;="" hpf,="" öflugur="" field;="" ns,="" ekki="" marktækt.="" vísumyndir="" eru="" birtar="" sem="" prósentuhámark="" (prósenta="" af="" hámarksgildi),="" skala="" hverja="" feril="" í="" stillingu="100" prósent="" .="" til="" að="" hámarka="" áhorf="" á="" þessa="" mynd="" skaltu="" skoða="" netútgáfu="" þessarar="" greinar="" á="">

Podocyte-sértæk TGFb1 oftjáningartengd nýrnafíbrósa í mönnum

Lyf sem getur unnið gegn áhrifum TGFb1 væri tilvalið til að hindra nýrnafíbrósu. Hér höfum við búið til TG-mús sem oftjáir TGFb1 genið úr mönnum í gaukla sem þróar sjálfkrafa og versnandi gauklahersli og millivefsfíbrós í tubulointerstitial með nýrnabilun strax 4 vikum eftir fæðingu. Líkanið sýnir háþróaðan gauklakvilla með skaða á fræfrumum og gauklaæðaþelsfrumum; gauklabotnhimnuþykknun og mesangial stækkun með millivefs ör; aukin merki um nýrnavefsskaða og skerta nýrnastarfsemi; og aukið TGFb1 í plasma,nýrnavef, og þvagi. Aukning á útskilnaði próteina í þvagi, TGFb1, og virkjun komplementkerfisins gæti skýrt samhliða þróun millivefs örmyndunar í núverandi líkani okkar.37–40 Frekari tilraunir leiddu í ljós auknar apoptotic frumur og virkjun Smad próteina í nýrnavef frá ómeðhöndluðu TGFb{ {3}}TG mýs samanborið við WT mýs. Á heildina litið benda þessar niðurstöður til þessarar nýju TGFb1-TG mús sem hentug fyrirmynd fyrir uppgötvun lyfja ífifibrosis í nýrum.

Mynd 7|G-prótein tengdur viðtaki (GPR15) miðlar hömlun á apoptosis raðbrigða manna thrombomodulin (rhTM) í fræfrumum. Frumfrumur úr frumufrumum úr mönnum voru umbreyttar með fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1) small interfering RNA (siRNA), GPR15 siRNA, eða scrambled siRNA í 48 klst. (TGFb1). Apoptotic frumur voru (a) metnar með samfrumugreiningu og (b) síðan magngreindar. (c) Frumulýsi voru útbúin fyrir Western blotting. n{{10}} í hverjum hópi. Gögn eru gefin upp sem miðgildi ± millifjórðungsbil. Tölfræðileg greining með Mann-Whitney U prófi. *P < 0,05,="" #p="0.1." sal,="">

Mynd 8|Hömlun á þekju-mesenchymal umskiptum með raðbrigða trombomodulin úr mönnum (rhTM). (a) Podocin og a-sléttvöðvaaktín (a-SMA) voru lituð eins og lýst er í aðferðunum. (b) Svæðið sem er jákvætt fyrir a-SMA litun var magnmælt með WinROOF myndvinnsluhugbúnaðinum. n=3 í villigerð (WT)/saltvatns (SAL) og WT/rhTM hópum og n=5 íumbreytandi vaxtarþáttur-b1–erfðabreyttur(TGFb{{0}}TG)/SAL og TGFb1-TG/rhTM hópar. (c) Heildar (t) og fosfórýleruð (p) SMAD fjölskyldumeðlimur (Smad) prótein voru metin með Western blotting. n=8 í hverjum hópi. Gögn eru gefin upp sem miðgildi ± millifjórðungsbil. Tölfræðileg greining með Kruskal-Wallis dreifigreiningu og leiðréttu Dunn prófi. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" #p="0.08." til="" að="" hámarka="" áhorf="" á="" þessa="" mynd="" skaltu="" skoða="" netútgáfu="" þessarar="" greinar="" á="">

rhTM dregur úr fifibrosis í nýrum

Við höfum sýnt fram á að rhTM bætir lungnafifibrosis sem þróast í músum sem oftjáa TGFb1 úr mönnum í lungum með því að bæla lungnaþekjufrumna apoptosis.41 Klínískar rannsóknir hafa einnig sýnt fram á bata á sjálfvakinni lungnafifibrosis eftir rhTM meðferð. fyrir líffærafíbrósumeðferð. Við gerðum tilgátu um að rhTM myndi vera áhrifaríkt í TGFb1- tengdri fíbrósu í nýrum. Til að prófa þessa tilgátu, meðhöndluðum við nýrnasértækar TGFb1-TG mýs með rhTM.44 Gjöf rhTM í 4 vikur, verulega veikt áverka, vanstarfsemi og fifibrosis í nýrum. Mýs sem voru meðhöndlaðar með rhTM sýndu lágt magn af heildarpróteini, albúmíni, TGFb1, C5a í þvagi, og minnkað nýrnamagn profibrotic cýtókína, C5a og HMGB1.45 Meðferð með rhTM hamlaði einnig bæði frumudauða og EMT fræfrumna. Hins vegar hafði rhTM engin áhrif á thrombin antithrombin complex, sem er storkuvirkjunarmerki, þó það hafi aukið myndun APC, segavarnarlyfsþáttar með bólgueyðandi og apoptótísk virkni.23 Rétt er að taka fram að thrombin, procoagulant ensímið, getur efla blóðstorknun við lágstigs segamyndunarástand með því að mynda TM/thrombin flókið, sem eykur myndun segavarnarlyfsins APC. Hins vegar virkar þrombín aðallega sem procoagulant við of mikið segamyndunarástand (td blóðsýkingu).46 Þessi tvöföldu og mótsagnakenndu áhrif þrombíns geta útskýrt augljósa óvirkni rhTM til að hindra storkuvirkjun í líkaninu okkar, sem er í lágstigs segamyndunarástandi. . Á heildina litið benda þessar athuganir til þess að rhTM lækki versnandi fifibrosis og truflun á starfseminýrumeð því að lengja lifun eða koma í veg fyrir EMT gaukulfrumna og með því að bæla bólgu, komplement virkjun og virkni vaxtarþátta beint eða óbeint með virkjun á prótein C ferli og minnkun á HMGB1 tjáningu. Framfarir á nýrnakvilla af völdum sykursýki hjá músum með aukið TM lektínlíkt lén í blóðrás og versnun sjúkdóma hjá músum sem skortir lektínlíka lénið styðja jákvæð áhrif rhTM á fifibrosis í nýrum.20,21

Hindrun á frumudauða frumufrumna

Podocytes gegna mikilvægu hlutverki við að viðhalda gaukulsíunarhindrun og myndun rifþindarinnar til að koma í veg fyrir tap nauðsynlegra próteina í blóðrásinni.47Nýrnaskaðaraf völdum hvarfgjarnra súrefnistegunda, hás glúkósa eða bólgumiðla, þar á meðal TGFb1, veldur frumufrumu frumufrumna sem leiðir til tæmingar á fræfrumum sem getur að lokum valdið skertri nýrnastarfsemi.47 Eftir að serín/þreónín kínasa transhimnu flókið er heterómer tegund I og tegund II virkjuð. , TGFb1 gefur frá sér innanfrumuboð í gegnum Smad fjölskyldu umritunarþátta eða í gegnum Smad-óháða boðleiðir.48 Virkjun á Smad-háða brautinni á sér stað þegar virkjaðir TGFb1 viðtaka fosfórar Smad2 og Smad3, sem með Smad4 flytjast yfir í kjarnann.49 The Smad2/ Smad3/Smad4 flókið örvar umritun proapoptotic þátta og dregur úr andapoptotic þáttum sem leiða til frumu apoptosis.49 Í samræmi við þetta fundum við hátt nýrnagildi proapoptotic þáttarins Bax og lágt magn antiapoptotic þáttanna Bcl2 og Bcl-XL í TGFb1- TG músum. TM getur hindrað frumufrumu af mismunandi frumugerðum.21,41,49 Í samræmi við þetta komumst við að hér að rhTM hamlar frumudauða fræfrumna af völdum vetnisperoxíðs, hás glúkósa eða TGFb1, og þessi niðurstaða gæti útskýrt jákvæð áhrif rhTM í langvinnri lungnabólgu. . Að auki hallaði rhTM jafnvægið í átt að hömlun á frumudauða með því að draga úr tjáningu Bax, með því að auka tjáningu Bcl2, Bcl-XL, BIRC5 og BIRC6 og með því að auka virkjun Akt ferilsins ínýrnavef. Á heildina litið benda þessar athuganir til þess að rhTM örvi lifun fræfrumna með því að stuðla að Akt virkjun og tjáningu andapoptótískra þátta.

cistanche fyrir langvinnan nýrnasjúkdóm

Hömlun á EMT

EMT fræfrumna stuðlar einnig að fifibrosis í nýrum. Frumfrumur sem gangast undir EMT losa utanfrumu fylkisprótein sem safnast fyrir og safnast fyrir við TGFb1-tengda fifibrogenesis í nýrum.50 TGFb1 ýtir undir EMT með viðtakamiðlaðri virkjun Smad2/Smad3/Smad4 flókins. Fosfórýleruð Smad3 ýtir undir EMT með því að örva umritun fylkispróteina og með því að draga úr tjáningu þekjumerkja.51 Í samræmi við þetta fundum við aukið EMT á fræfrumum í TGFb1-TG músum og fræfrumum sem ræktaðar voru í viðurvist TGFb1 eða undir. oxunarefni eða háan glúkósaskilyrði. Fyrri skýrslur bentu til þess að rhTM bæli EMT.52,53 Hér komumst við að því að rhTM hamlar EMT fræfrumna og millivefsþekjufrumna í TGFb1-TG músum. Hömlun á virkjun Smad próteins virðist vera verkunarháttur hinna jákvæðu áhrifa rhTM á EMT vegna þess að TGFb1-TG mýs og frumfrumur meðhöndlaðar með rhTM sýndu marktækt minni fosfórun Smad2 og Smad3 samanborið við ómeðhöndlaðar aðstæður. Þessar niðurstöður styðja hamlandi virkni TM á EMT.

Viðtakamiðlun í rhTM verndarvirkni

Fyrri rannsóknir hafa sýnt að GPR15 eða FGFR1 miðlar frumuverndandi virkni TM.26,27,54 Við prófuðum hvort þessir viðtakar miðla verndandi virkni rhTM gegn apoptosis og EMT. Þó að niðurstýring á GPR15 próteini með siRNA hafi algjörlega afnumið bælandi virkni rhTM á TGFb 1-miðlaðri frumudreifingu fræfrumna, afnam hvorki FGFR1 siRNA né hemill þess, sem bendir til þess að GPR15 miðli rhTM verndandi virkni. Aukin fosfórun á Akt var í ræktuðum fræfrumum og fræfrumum einangruðum úr TGFb1-TG músum eftir meðferð með rhTM, sem bendir til þátttöku á innanfrumu Akt ferli. Verk sem sýnir að rhTM virkjar Akt-ferilinn í æðaþelsfrumum styður þessa niðurstöðu.55 Virkjun Akt-boðaferilsins getur aukið rhTM-áhrifin enn frekar með því að auka GPR15 yfirborðstjáninguna.56 Þessar athuganir benda til þess að rhTM verndar frumufrumur gegn frumufrumu í okkar TGFb{ {13}}TG mýs með því að virkja GPR15/Akt ásinn sem leiðir til aukinnar tjáningar á and-apoptótískum þáttum og minni tjáningu proapoptótískra þátta.57 Á hinn bóginn sýndu fyrri rannsóknir að bráðaofnæminu C3a og C5a í gegnum GPR þeirra gætu stuðlað að CKD með því að skaða podocytes og að APC gæti hamlað frumudauða frumufrumna og nýrnafifibrosis í gegnum æðaþelsprótein C viðtaka og próteasavirkjaðan viðtaka 1.23,58–61 Hér komumst við að því að rhTM hamlar komplementkerfinu og eykur myndun APC. Þess vegna, fyrir utan virkjun GPR15/Akt ferilsins, getur hömlun á komplementþáttum og aukin virkjun á próteini C og viðtökum þess einnig útskýrt jákvæð áhrif rhTM í TGFb1-tengdum okkarlíkan af fifibrosis nýrna.

Að auki hindraði niðurstýring á GPR15 en ekki FGFR1 hamlandi áhrif rhTM á EMT, sem bendir til þess að GPR15 miðli einnig þessari rhTM verndarvirkni. Hömlun á Smad próteinum tekur þátt í EMT bælingu vegna þess að meðferð með rhTM hamlaði fosfórun bæði Smad2 og Smad3 í TGFb1-TG músum og ræktuðum fræfrumum. Hins vegar er nákvæmur gangur Smad próteinhömlunar með GPR15 óljós. Sumar vísbendingar sýna að Akt-ferillinn gæti víxlað við og stjórnað Smad-boðaleiðinni,62–64 og að Akt getur komið í veg fyrir fosfórun á Smad3 með því að hafa bein samskipti við ófosfórýlerað Smad3 til að binda það utan kjarnans sem leiðir til hömlunar á umritun og EMT.62– 64 Byggt á þessum skýrslum er hugsanlegt að Akt hafi verið virkjað eftir rhTM bindingu við GPR15 bindandi ófosfórýlerað Smad3 sem leiði til hömlunar á frumufrumu EMT. Rétt er að hafa í huga að þessi Akt-miðluðu jákvæðu áhrif koma aðeins fram í illkynja frumum.65–67 Í illkynja frumum getur víxlverkun TGFb1 við viðtaka þess beint virkjað fosfóínósítíð 3-kínasa/Akt/snigla ferilinn og valdið EMT.65–67 Á heildina litið styðja niðurstöður rannsóknar okkar hlutverk GPR15 sem viðtakans sem miðlar jákvæðum áhrifum rhTM á fræfrumur.

Niðurstaða

Í stuttu máli, hér greinum við í fyrsta skipti frá nýrri erfðabreyttri TG-mús sem oftjáir TGFb1-genið í fullri lengd, sérstaklega í gaukla sem þróar sjálfkrafa og versnandi glomerular sclerosis, tubulointerstitial fifibrosis ognýrnabilun, og úrbætur á staðfestri fifibrosis/nýrnabilun í nýrum með rhTM milliverkun við GPR15 sem hindrar frumufrumu og mesenchymal umskipti á fræfrumum.

AÐFERÐIR

Myndun TGFb1 BAC TG músarinnar

TGFb1-BAC-TG mús sem tjáir TGFb1-genið úr mönnum í fullri lengd undir músarpodocin-stýringu var mynduð með frumkjarnasprautun í 392 C57BL/6J músafósturvísa (CLEA Japan, Inc., Tókýó, Japan). Við metum TG stofnendur og kímlínuflutning BAC TG smíðinnar með Southern blotting (viðbótarefni og aðferðir).

Tilraunadýr

TGFb1-TG mýsnar voru ræktaðar í meira en 10 kynslóðir undir C57BL/6 bakgrunni áður en þær voru notaðar í tilraununum. WT ruslfélagar voru notaðir sem viðmiðunardýr. Öllum dýrunum var haldið í tilteknu umhverfi án sjúkdómsvalda og þau gefin 12-klukkutíma ljós-myrkri hringrás við umhverfishita og raka á bilinu 22 gráður til 26 gráður og 40 prósent og 70 prósent, og með aðgengi að frjálsum vilja. til matar og vatns í dýrahúsi Mie háskólans (viðbótarefni og aðferðir).

Siðferðileg yfirlýsing

Öryggisnefnd raðbrigða DNA tilrauna (samþykki nr. I-629; dagsetning: 19. september 2013) og dýrarannsóknarnefnd Mie háskólans (samþykki nr. 27-4; dagsetning: 19. ágúst 2015) samþykkti siðareglur rannsóknarinnar. Allar dýraaðgerðir voru framkvæmdar í samræmi við stofnanaleiðbeiningar Mie háskólans og í samræmi við alþjóðlega viðurkenndar reglur um umönnun tilraunadýra sem gefin voru út af National Institute of Health (https://olaw.nih.gov/).

Fyrir klíníska rannsóknina var skriflegt upplýst samþykki gefið af öllum sjúklingum og heilbrigðum einstaklingum og rannsóknaraðferðin var samþykkt af siðanefnd um klínískar rannsóknir Mie háskólans (samþykki nr. 1043 og 2194).

Tilraunahönnun

Til að lýsanýrufifibrosis líkan, við úthlutuðum karlkyns TGFb{{0}}TG músum (n=24) og WT karlkyns músum (n=12) 4 vikna að aldri og vógu 20 til 23 g í 3 hópa með 8 TGF b1-TG músum og 4 WT músum í hverjum hópi. Mýs úr hverjum WT og TGFb1-TG hópi voru aflífaðar vikur 0, 8 eða 16 til að safna sýnum af þvagi, blóði og nýrum til að meta breytingar á fifibrosis og nýrnastarfsemi með tímanum.

Til að meta lækningavirkni rhTM (rhTM var vinsamlega veitt af Asahi Kasei Pharma Corporation, Tókýó, Japan) í nýrnafíbrósu, TGFb1-TG músum (n= 8) eða WT ruslfélaga (n {{2 }}) voru meðhöndluð með rhTM (3 mg/kg) með ip inndælingu, 3 sinnum í viku á 4 vikum áður en mýsnar voru drepnar. TGFb1-TG mýs (n =8) eða WT gotfélagar (n= 8) ​​sem fengu jafnt magn af lífeðlisfræðilegu SAL með ip inndælingu voru notaðar sem neikvæðar samanburðarmýs.

Samskiptareglur þessarar rannsóknar fylgdu viðmiðunarreglum um dýrarannsóknir: skýrslur um In Vivo tilraunir (ARRIVE) fyrir rannsóknir á dýrum. Músum var slembiraðað og vísindamenn sem mældu breytur voru blindaðir fyrir meðferðarhópa.

Lífefnafræðileg greining

Styrkur heildarpróteins (BCA próteinprófunarsett; Pierce, Rockford, IL), TGFb1 (R&D System, Minneapolis, MN), einkýtu efnafræðilega prótein-1 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), trombín andtrombín flókið (Cedarlane Laboratories, Hornby, Ontario, Kanada) voru mældar með því að nota ensímónæmisprófunarsett í sölu eftir leiðbeiningum framleiðanda (viðbótarefni og aðferðir).

Frumuræktun

Frumfrumur úr mönnum voru keyptar frá CELPR OGEN (Torrance, CA). Frumfrumur úr frumufrumum úr mönnum voru ræktaðar í Dulbecco's breyttu Eagle miðli í rakaðri, 5% CO2 andrúmslofti við 37 gráður. Miðillinn var bætt við 10 prósent hitaóvirkt fóstursermi (Bio Whittaker, Walkersville, MD), 100 ae/ml penicillín, 100 mg/ml streptomycin og L-glútamín (viðbótarefni og aðferðir).

tölfræðigreining

Gögnin eru gefin upp sem miðgildi±fjórðungsbil. Tölfræðilegur munur milli breyta var reiknaður út með Kruskal-Wallis dreifigreiningu með post hoc greiningu með Dunn prófinu. Mann-Whitney U próf var notað til að meta mun á 2 hópum. Tölfræðilegar greiningar voru gerðar með því að nota GraphPad Prism útgáfu 8.0.1 (GraphPad Software, San Diego, CA). Tölfræðileg marktækni var talin P <>

UPPLÝSINGAR

EKG, CND-G og YY hafa einkaleyfi á TGFb1-TG músinni meðfifibrosis í nýrumnotað í þessari rannsókn. CND-G og YY fengu styrk frá mennta-, menningar-, íþrótta-, vísinda- og tækniráðuneyti Japans fyrir þessa rannsókn. EKG, TY, CND-G og MT fengu styrk frá Shionogi Pharmaceuticals. Allir aðrir höfundar lýstu ekki yfir hagsmunum í samkeppni.

VIÐTAKNINGAR

Þessi rannsókn var studd að hluta til með styrkjum frá mennta-, menningar-, íþrótta-, vísinda- og tækniráðuneyti Japans (Kakenhi nr. 17K09824 fyrir YY; Kakenhi nr. 17K08442 fyrir CND-G), og að hluta til með styrk frá Shionogi & Co, Ltd., Japan. Fjármögnunaraðilar höfðu ekkert hlutverk við hönnun náms, greiningu gagna, ákvörðun um útgáfu eða gerð handritsins.

Hluti þessa verks var gefinn út í abstraktformi.

HÖFUNDARFRAMLAG

AT útbjó sjúkdómslíkanið og skrifaði fyrstu drög að handritinu. TY, KN, TT, RI og CND-G útbjuggu sjúkdómslíkönin og mældu breytur. AM og SW gerðu útsendingarsmásjárrannsóknina. MT, YO og AU mældu breytur og framkvæmdu in vitro tilraunirnar. YT, LQ, TK og VFD veittu vitsmunalegum framlögum. YY og hjartalínuriti leiðréttu handritsuppkastið og hönnuðu rannsóknina.

cistanche fyrir einkenni nýrnabilunar

VIÐBÓTAEFNI

Viðbótarskrá (PDF) Viðbótarefni og aðferðir.

Tafla S1. Einkenni námsgreina.

Tafla S2. Grunnur fyrir RT-PCR vefja músa.

Tafla S3. Grunnur fyrir RT-PCR af fræfrumum úr mönnum.

Mynd S1. Leysanleg thrombomodulin brot hafa fylgni við TGFb1 og kreatínín hjá sjúklingum með DM.

Mynd S2. Mannleg TGFb1–bakteríur gervilitningur (BAC) smíði. Mynd S3. Stofnamýs sem tjá TGFb1 gen í fullri lengd.

Mynd S4. Einkenni glomerulus-sértækrar umbreytandi vaxtarþáttar b1 erfðabreyttrar músar.

Mynd S5. TGFb1 erfðabreytta músin úr mönnum hefur aukið merki um nýrnaskaða.

Mynd S6. Meðferð með raðbrigða thrombomodulin úr mönnum (rhTM) dregur úr eyðingu fótfrumna á fótfrumum og þykknun á gauklagrunnhimnu.

Mynd S7. TGFb1 erfðabreyttar mýs sem meðhöndlaðar eru með raðbrigða thrombomodulin úr mönnum (rhTM) eru með lágan styrk af profibrotic þáttum og HMGB1 í nýrnavef. Mynd S8. Meðferð með raðbrigða thrombomodulin úr mönnum (rhTM) eykur myndun virkjaðs próteins C, hindrar komplementkerfið, minnkar leysanlegt podocin í blóðrásinni, þó að það hafi engin áhrif á storkukerfið í TGFb1 erfðabreyttum músum.

Mynd S9. Meðferð með raðbrigða thrombomodulin úr mönnum (rhTM) dregur úr þvagþéttni podocins.

Mynd S10. Meðferð með raðbrigða thrombomodulin úr mönnum (rhTM) dregur úr apoptosis gaukulfrumna.

Mynd S11. Meðhöndlun á TGFb1-oftjáningu tengdri fifibrosis í nýrum með raðbrigða thrombomodulin úr mönnum (rhTM) hindrar frumudauða í nýrnavef.

Mynd S12. Raðbrigðablóðmagnaðir úr mönnum (rhTM) eykur tjáningu andapoptótískra þátta í fræfrumum.

Mynd S13. Raðbrigða trombomodulin úr mönnum (rhTM) bælir frumudauða fræfrumna af völdum vetnisperoxíðs.

Mynd S14. Raðbrigða trombomodulin úr mönnum (rhTM) bælir frumudauða fræfrumna sem orsakast af háu glúkósagildi.

Mynd S15. Raðbrigðablóðmagnaðir úr mönnum (rhTM) eykur virkjun Akt ferla í fræfrumum.

Mynd S16. Meðferð með raðbrigða thrombomodulin úr mönnum (rhTM) eykur Akt fosfórun í fræfrumum úr TGFb1-TG músum.

Mynd S17. Podocytes úr hverjum meðferðarhópi músa tjá GPR15 mRNA.

Mynd S18. Litun á GPR15 í fræfrumum frá heilbrigðum einstaklingi og sjúklingi með focal segmental glomerulosclerosis.

Mynd S19. Vaxtarþáttarviðtaka vefjafruma-1 tekur ekki þátt í hamlandi virkni raðbrigða blóðflagna úr mönnum (rhTM) í fræfrumum.

Mynd S20. Raðbrigða trombomodulin úr mönnum (rhTM) hindrar þekju- og mesenchymal umskipti fræfrumna.

Mynd S21. Meðferð með raðbrigða thrombomodulin úr mönnum (rhTM) hamlar tjáningu á a-sléttum vöðvaaktíni í nýrnapíplum.

Mynd S22. G-prótein tengdur viðtaki (GPR15) miðlar hamlandi virkni raðbrigða blóðflagna úr mönnum (rhTM) á þekju-mesenchymal umskipti fræfrumna.

Viðbótarheimildir.

HEIMILDIR

1. Webster AC, Nagler EV, Morton RL, o.fl. Langvinn nýrnasjúkdómur. Lancet. 2017;389:1238–1252.

2. Bello AK, Levin A, Tonelli M, o.fl. Mat á alþjóðlegri nýrnaheilbrigðisstöðu. JAMA. 2017;317:1864–1881.

3. Levin A, Tonelli M, Bonventre J, o.fl. Alþjóðleg nýrnaheilbrigði 2017 og víðar: vegvísir til að loka eyður í umönnun, rannsóknum og stefnu. Lancet. 2017;390:1888–1917.

4. Ackland P. Algengi, uppgötvun, mat og stjórnun langvinns nýrnasjúkdóms. BMJ. 2014;348:f7688.

5. Turner JM, Bauer C, Abramowitz MK, o.fl. Meðferð við langvinnum nýrnasjúkdómum. Nýra Int. 2012;81:351–362.

6. Breyer MD, Susztak K. Næsta kynslóð lækninga fyrir langvinnan nýrnasjúkdóm. Nat Rev Drug Discov. 2016;15:568–588.

7. Liu Y. Fifibrosis í nýrum: ný innsýn í meingerð og meðferð. Nýra Int. 2006;69:213–217.

8. Liu Y. Frumu- og sameindaaðferðir við fifibrosis í nýrum. Nat Rev Nephrol. 2011;7:684–696.

9. Xavier S, Vasko R, Matsumoto K, et al. Að draga úr æðaþels TGF-beta merkjum er nægjanlegt til að draga úr æðaþels-mesenchymal umskiptum og fifibrosis í langvinnri nýrnastarfsemi. J Am Soc Nephrol. 2015;26:817–829.

10. Higgins SP, Tang Y, Higgins CE, o.fl. TGF-beta1/p53 merkjagjöf í fifibrogenesis í nýrum. Cell Merki. 2018;43:1–10.

11. Conway EM. Thrombomodulin og hlutverk þess í bólgu. Semin Immunopathol. 2012;34:107–125.

12. Martin FA, Murphy RP, Cummins PM. Thrombomodulin og æðaþelið: innsýn í virkni, stjórnunar- og lækningaþætti. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2013;304:H1585–H1597.

13. Morser J. Thrombomodulin tengir storknun við bólgu og ónæmi. Curr Drug Targets. 2012;13:421–431.

14. Roeen Z, Toda M, D'Alessandro-Gabazza CN, et al. Thrombomodulin hindrar virkjun eósínófíla og mastfrumna. Cell Immunol. 2015;293:34–40.

15. Takagi T, Taguchi O, Toda M, o.fl. Hömlun á ofnæmisberkjuastma með thrombomodulin er miðlað af dendritic frumum. Am J Respir Crit Care Med. 2011;183:31–42.

16. Tateishi K, Imaoka M, Matsushita M. Tvöfaldar mótunaraðgerðir thrombomodulin í öðrum viðbótarferli. Biosci Trends. 2016;10:231–234.

17. Toda M, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi T, et al. Thrombomodulin mótar dendritic frumur með bæði andstæðingum háhreyfanleika hóps próteins B1 og óháðu kerfi. Allergol Int. 2014;63:57–66.

18. Van de Wouwer M, Plaisance S, De Vriese A, o.fl. Lektín-líkt lén thrombomodulin truflar komplement virkjun og verndar gegn liðagigt. J Thromb Haemost. 2006;4:1813–1824.

19. Sharfuddin AA, Sandoval RM, Berg DT, o.fl. Leysanlegt thrombomodulin verndar nýru með blóðþurrð. J Am Soc Nephrol. 2009;20:524–534.

20. Wang H, Vinnikov I, Shahzad K, o.fl. Lektínlíka svið thrombomodulin bætir gauklakvilla með sykursýki með komplementhömlun. Thromb Haemost. 2012;108:1141–1153.

21. Yang SM, Ka SM, Wu HL, o.fl. Thrombomodulin domain 1 bætir nýrnakvilla af sykursýki í músum með and-NF-kappaB/NLRP3 bólgumiðlaðri bólgu, aukningu á NRF2 andoxunarvirkni og hömlun á apoptosis. Sykursýki. 2014;57:424–434.

22. Ohlin AK, Larsson K, Hansson M. Leysanleg thrombomodulin virkni og leysanlegt thrombomodulin mótefnavaka í plasma. J Thromb Haemost. 2005;3: 976–982.

23. Gil-Bernabe P, D'Alessandro-Gabazza CN, Toda M, et al. Utanaðkomandi virkjað prótein C hindrar framgang nýrnakvilla af völdum sykursýki. J Thromb Haemost. 2012;10:337–346.

24. Yasuma T, Yano Y, D'Alessandro-Gabazza CN, o.fl. Bæta sykursýki með próteini S. Sykursýki. 2016;65:1940–1951.

25. Havasi A, Borkan SC. Apoptosis og bráður nýrnaskaði. Nýra Int. 2011;80:29–40.

26. Kuo CH, Sung MC, Chen PK, o.fl. FGFR1 miðlar raðbrigða thrombomodulin domain æðamyndun. Cardiovasc Res. 2015;105:107–117.

27. Pan B, Wang X, Kojima S, o.fl. Fimmta húðþekjuvaxtarþátta-líka svæðið af thrombomodulin dregur úr blóðsýkingu af völdum LPS með því að hafa samskipti við GPR15. Thromb Haemost. 2017;117:570– 579.

28. Lu Y, Ye Y, Bao W, o.fl. Greining um allt erfðamengi á genum sem eru nauðsynleg fyrir frumubeinagrind frumufrumna byggt á einfrumu RNA raðgreiningu. Nýra Int. 2017;92:1119–1129.

29. Vigolo E, Marko L, Hinze C, o.fl. Canonical BMP merki í pípulaga frumum miðlar bata eftir bráðan nýrnaskaða. Nýra Int. 2019;95:108–122.

30. Nangaku M. Langvarandi súrefnisskortur og millivefsskemmdir: loka algeng leið til nýrnabilunar á lokastigi. J Am Soc Nephrol. 2006;17: 17–25.

31. Thomas R, Kanso A, Sedor JR. Langvinnir nýrnasjúkdómar og fylgikvillar hans. Prim Care. 2008;35:329–344, vii.

32. Mozes MM, Bottinger EP, Jacot TA, o.fl. Nýrnatjáning fibrotískra fylkispróteina og umbreytandi vaxtarþáttar-beta (TGF-beta) ísóformum í TGF-beta erfðabreyttum músum. J Am Soc Nephrol. 1999;10:271–280.

33. Arif E, Solanki AK, Srivastava P, o.fl. Hreyfipróteinið Myo1c stjórnar umbreytandi vaxtarþáttum-beta-boðum og fifibrosis í fræfrumum. Nýra Int. 2019;96:139–158.

34. Ebefors K, Wiener RJ, Yu L, o.fl. Endóþelínviðtaki-A miðlar niðurbroti á yfirborðslagi gauklaæðaþels með sjúklegri víxlun á milli virkjaðra fræfrumna og gauklaæðaþelsfrumna. Nýra Int. 2019;96:957–970.

35. Fu J, Lee K, Chuang PY, o.fl. Skaði á gauklaæðaþelsfrumum og krosstal í nýrnasjúkdómi með sykursýki. Am J Physiol Renal Physiol. 2015;308:F287– F297.

36. Masum MA, Ichii O, Elewa YHA, o.fl. Breytt skönnun rafeindasmásjár sýnir sjúklega víxlun milli æðaþelsfrumna og fræfrumna í músalíkani af himnufjölgunarheklabólgu. Sci Rep. 2018;8:10276.

37. Abbate M, Zoja C, Rottoli D, o.fl. Aðlægar pípulaga frumur stuðla að fifibrogenesis með TGF-beta1-miðlaðri örvun peritubular myofifibroblasts. Nýra Int. 2002;61:2066–2077.

38. Liu BC, Tang TT, Lv LL, o.fl. Nýrnapípluskaðar: drifkraftur í átt að langvinnum nýrnasjúkdómum. Nýra Int. 2018;93:568–579.

39. Loefflfler I, Wolf G. Umbreytandi vaxtarþáttur-beta og framgangur nýrnasjúkdóms. Nephrol Dial ígræðsla. 2014;29 (fylgi 1):i37–i45.

40. Murakami K, Takemura T, Hino S, o.fl. Þvagbreytandi vaxtarþáttur-beta hjá sjúklingum með gauklasjúkdóma. Barnalæknir Nephrol. 1997;11:334–336.

41. Fujiwara K, Kobayashi T, Fujimoto H, et al. Hömlun frumudauða og bót á lungnafíbrósu með thrombomodulin. Am J Pathol. 2017;187:2312–2322.

42. Kataoka K, Taniguchi H, Kondoh Y, o.fl. Raðbrigða trombomodulin úr mönnum við bráða versnun á sjálfvakinni lungnafíbrósu. Bringa. 2015;148:436–443.

43. Tsushima K, Yamaguchi K, Yokoyama T, o.fl. Thrombomodulin fyrir bráða versnun á sjálfvakinni lungnafíbrósi: sönnun um hugmyndarannsókn. Pulm Pharmacol Ther. 2014;29:233–240.

44. Umemura Y, Yamakawa K. Besta val sjúklinga fyrir segavarnarlyfjameðferð við blóðsýkingu: gagnreynd tillaga frá Japan. J Thromb Haemost. 2018;16:462–464.

45. Chen Q, Guan X, Zuo X, o.fl. Hlutverk hópkassa 1 með mikla hreyfanleika (HMGB1) í meingerð nýrnasjúkdóma. Acta Pharm Sin B. 2016;6:183–188.

46. ​​Miyake Y, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi T, o.fl. Skammtaháð mismunaáhrif þrombíns við ofnæmisberkjuastma. J Thromb Haemost. 2013;11:1903–1915.

47. Assady S, Wanner N, Skorecki KL, o.fl. Ný innsýn í frumulíffræði í gauklaheilsu og sjúkdómum. J Am Soc Nephrol. 2017;28: 1707–1715.

48. Derynck R, Zhang YE. Smad-háðar og Smad-óháðar leiðir í TGF-beta fjölskylduboðum. Náttúran. 2003;425:577–584.

49. Schuster N, Krieglstein K. Mechanisms of TGF-beta-mediated apoptosis. Cell Tissue Res. 2002;307:1–14.

50. Greka A, Mundel P. Frumulíffræði og meinafræði fræfrumna. Annu Rev Physiol. 2012;74:299–323.

51. Isaka Y. Að miða á TGF-beta merki í fifibrosis í nýrum. Int J Mol Sci. 2018;19:2532.

52. Chang YJ, Cheng YW, Lin RK, o.fl. Thrombomodulin hefur áhrif á lifun sjúklinga með krabbamein í ristli og endaþarmi sem ekki er meinvarpað með þekju-til-mesenchymal umskipti (EMT). PLoS One. 2016;11:e0160550.

53. Zheng N, Huo Z, Zhang B, o.fl. Thrombomodulin dregur úr æxlismyndun og meinvörpum í lungnakrabbameinsfrumum með því að uppstilla E-cadherin og minnka N-cadherin tjáningu. Biochem Biophys Res Commun. 2016;476:252–259.

54. Pan B, Wang X, Nishioka C, o.fl. G-prótein tengdur viðtaki 15 miðlar æðamyndun og frumuverndandi virkni thrombomodulins. Sci Rep. 2017;7:692.

55. Chen PS, Wang KC, Chao TH, o.fl. Raðbrigða thrombomodulin verkar gegn sjálfsát í æðaþelsfrumum og veitir æðakölkun í músum sem skortir apólípóprótein E. Sci Rep. 2017;7: 3284.

56. Chung JJ, Okamoto Y, Coblitz B, et al. PI3K/Akt merkjamiðlað yfirborð próteinatjáningar skynjað af 14-3-3 víxlverkandi mótífi. FEB J. 2009;276:5547–5558.

57. Sanchez-Capelo A. Tvíþætt hlutverk fyrir TGF-beta1 í frumudauða. Cytokine Growth Factor Rev. 2005;16:15–34.

58. Griffifin JH, Zlokovic BV, Mosnier LO. Virkjað prótein C, próteasavirkjaður viðtaki 1 og taugavörn. Blóð. 2018;132:159–169.

59. Isermann B, Vinnikov IA, Madhusudhan T, o.fl. Virkjað prótein C verndar gegn nýrnakvilla með sykursýki með því að hindra frumufrumu í æðaþels og fræfrumu. Nat Med. 2007;13:1349–1358.

60. Klos A, Tenner AJ, Johswich KO, o.fl. Hlutverk bráðaofnæmis í heilsu og sjúkdómum. Mol Immunol. 2009;46:2753–2766.

61. Morigi M, Perico L, Corna D, o.fl. C3a viðtakablokkun verndar fræfrumurnar gegn meiðslum í nýrnakvilla af völdum sykursýki. JCI innsýn. 2020;5: e131849.

62. Conery AR, Cao Y, Thompson EA, o.fl. Akt hefur bein samskipti við Smad3 til að stjórna næmni fyrir TGF-beta völdum frumudauða. Nat Cell Biol. 2004;6:366–372.

63. Derynck R, Muthusamy BP, Saeteurn KY. Samvinna merkjaleiða í TGF-beta-framkallaðri þekjuvefja-mesenchymal umskipti. Curr Opin Cell Biol. 2014;31:56–66.

64. Remy I, Montmarquette A, Michnick SW. PKB/Akt mótar TGF-beta boð með beinni samskiptum við Smad3. Nat Cell Biol. 2004;6: 358–365.

65. Hamidi A, Song J, Thakur N, o.fl. TGF-beta stuðlar að PI3K-AKT merkjasendingum og flutningi krabbameinsfrumna í blöðruhálskirtli í gegnum TRAF6-miðlaða ubiquitylation p85alpha. Sci merki. 2017;10:eaal4186.

66. Peng Z, Weber JC, Han Z, o.fl. Tvískiptaáhrif Akt-boða í brjóstakrabbameini. Mol Krabbamein. 2012;11:61.

67. Zhou F, Geng J, Xu S, o.fl. FAM83A merkjagjöf framkallar þekjuvefjaskipti með PI3K/AKT/Snigla leiðinni í NSCLC. Öldrun (Albany NY). 2019;11:6069–6088.