Týrósínkínasi C-Abl styrkir interferónmiðlaða veirueyðandi ónæmi með STAT1 fosfórýleringu

SAMANTEKT

Interferon (IFN)-örvuð virkjun merkjabreytisins og virkjunar umritunar (STAT) fjölskyldunnar er mikilvægur atburður í veirueyðandi ónæmi. Hér sýnum við að óviðtaka kínasarnir c-Abl og Arg hafa bein samskipti við STAT1 og efla fosfórun STAT1 á Y701. c-Abl/Arg gæti miðlað STAT1 fosfórun óháð Janus kínasa í fjarveru IFNg og aukið IFNg miðlaða STAT1 fosfórun. Ennfremur er STAT1 dimerization, kjarnaflutningur og niðurstreymis genaumritun stjórnað af c-Abl/Arg. c-Abl/Arg (abl1/abl2) skortur bælir verulega veirueyðandi svörun í blöðrum munnbólguveiru sýktum frumum. Í samanburði við burðarefni leiddi gjöf c-Abl/Arg sértæka hemlans AMN107 til marktækrar aukningar dánartíðni hjá músum sem smitaðar voru af inflúensuveiru manna. Rannsókn okkar sýnir að c-Abl gegnir mikilvægu hlutverki í STAT1 virkjunarboðaleiðinni og veitir mikilvæga nálgun við stjórnun veirueyðandi ónæmis.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

KYNNING

Interferón (IFN) gegna lykilhlutverki í meðfæddu ónæmi gegn veirusýkingu og ónæmiseftirliti með því að stjórna virkjun Janus kínasa (JAKs) og merkjabreytir og umritunarvirkja (STAT) og með því að endurforrita frumu genatjáningu (Stark og Darnell, 2012). Binding IFNs við viðkomandi viðtaka leiðir til krossfosfórunar þriggja tengdra JAKs (JAK1, JAK2 og TYK2) og nýliðunar STATs, sem gerir kleift að fosfóra stakar týrósínleifar nálægt C-enda endum þessara STATs af JAKs. (Platanias, 2005). Virkjuð STAT dreifist síðan, flytjast til kjarnans og bindast við hvata IFN-viðbragða gena til að framkalla umritun þeirra. Týrósín fosfórun STATs er mikilvægt skref í JAK-STAT ferli IFN merkja og tekur þátt í STAT dimerization, kjarnaflutningi og DNA bindingu (Stark og Darnell, 2012). Þannig virkar týrósín fosfórun sem STAT virkjunarrofi. Sönnunargögn sem fengin eru með markvissri truflun á JAK genum í músum benda til þess að JAK séu mikilvægustu STAT týrósín kínasarnir (Villarino o.fl., 2017). Hins vegar hefur einnig verið sýnt fram á að týrósínleifar í STAT1, STAT3 og STAT5 séu fosfórýleraðar í frumum sem skortir JAK með húðþekjuvaxtarþáttum og blóðflöguafleiddum vaxtarþáttaviðtökum með innri týrósínkínasavirkni (Leaman o.fl., 1996; Vignais o.fl. ., 1996). Að auki hefur myndast virkjun STATs í umbreyttum frumum sem tjá krabbameinsvaldandi týrósínkínasa eins og v-Src, v-Abl og BCR-Abl, en hvort STATs séu bein hvarfefni þessara kínasa á eftir að ákvarða (Danial og Rothman , 2000; Reddy o.fl., 2000). Spendýrið Abelson kínasi c-Abl sem er kóðaður af c-abl (abl1) geninu og Abl-tengt genaprótein Arg sem er kóðað af arg (abl2) geninu eru meðlimir í fjölskyldu innanfrumu óviðtaka týrósínkínasa sem eru nauðsynlegar fyrir marga frumuferli, þar á meðal fjölgun, frumudauði, viðloðun, frumuflutning og streituviðbrögð (Bradley og Koleske, 2009; Colicelli, 2010; Greuber o.fl., 2013; Pendergast, 2002). Kínasavirkni c-Abl er þétt stjórnað við eðlilegar lífeðlisfræðilegar aðstæður. Retróveiruflutningur og litningaflutningar gefa tilefni til tjáningar á v-Abl eða BCR-Abl, krabbameinsvaldandi form Abl, í sömu röð (Advani og Pendergast, 2002). Að auki leiðir markviss eyðing á c-abl geninu í músum til pleiotropic svipgerða sem tengjast truflun á ónæmiskerfi, þar á meðal háu burðarfallsdauða, milta og thymic rýrnun, eitilfrumnafæð og auknu næmi fyrir sýkingu (Schwartzberg o.fl., 1991). Þar að auki tengist meðferð á BCR-Abl-jákvæðu langvinnu mergblæði (CML) með Abl hemlum STI571 (imatinib) og AMN107 (nilotinib) ónæmisbælingu hjá undirhópi sjúklinga (Dietz o.fl., 2004; Hochhaus o.fl., 2016; Mattiuzzi o.fl., 2003). Fyrri rannsóknir hafa sýnt að cAbl gegnir hlutverki í stjórnun á TCR (T frumu viðtaka) og BCR (B frumu viðtaka) miðluðum merkjaflutningi, þróun, fjölgun og frumumyndun (Gu o.fl., 2009; Pendergast, 2002) ; Silberman o.fl., 2008). Mýs með skort á blóði sýna einnig minni fjölda T/B frumna (Gu o.fl., 2009; Liberatore og Goff, 2009; Schwartzberg o.fl., 1991). Hins vegar eru aðferðirnar sem liggja að baki hinu skerta ónæmis sem myndast í fjarveru eða hömlun á c-Abl enn óviðráðanlegar. Víða hefur verið greint frá því að JAK-STAT boðleiðin sé nauðsynleg fyrir BCR-Abl-framkallaða umbreytingu (Carlesso o.fl., 1996; Danial o.fl., 1998; de Groot o.fl., 1999). Þess vegna er þess virði að kanna hvort JAK-STAT geti einnig stuðlað að meðfæddu ónæmi sem tengist c-Abl. Hér greinum við frá því að STAT1 hefur samskipti við og er fosfórýlerað af c-Abl á JAK-óháðan hátt, með því er stjórnað dimmerization, kjarnastaðsetningu og niðurstreymis genaumritun STAT1. Þessar niðurstöður leiddu í ljós að, auk JAK kínasa, er c-Abl ómissandi fyrir fulla virkjun STAT1 og síðari IFN-miðlaða veirueyðandi svörun.

Kostir cistanche tubulosa-styrkja ónæmiskerfið

Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur

【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

NIÐURSTÖÐUR

Umritun á interferón gamma-virkjaðri röð niðurstreymis gena er stjórnað af Abl kínasa

Our previous study suggested that c-Abl widely participates in the regulation of gene transcription (Dong et al., 2017). To illustrate the role of c-Abl in gene expression, the transcription of approximately 22,000 genes in wild-type (WT) and c-abl / arg / MEFs (mouse embryonic fibroblasts) was detected using Affymetrix GeneChips (Mouse Genome 430 2.0) (GEO accession: GSE154568). A total of 1,744 differentially expressed genes (DEGs) with fold changes >4 voru auðkennd í c-abl/arg tvöföldu knockout (DKO) og WT MEFs, þar af 960 voru uppstýrðir og 784 voru niðurstýrðir (Mynd 1A, til vinstri). Til að kanna frekar hugsanlega frumuvirkni og tengda ferla þessara DEGs, gerðum við Gene Ontology (GO) greiningu (fyrir hugtök í líffræðilegu ferli, sameindavirkni og frumuþátt) (Mynd S1A). Genin sem c-Abl og Arg lækka voru aðallega tengd veiruvarnarviðbrögðum (GO: 0009615, GO: 0051607 og GO: 0045071) og ónæmissvörun (GO: 0002376, GO: 0045087). Frekari greining sýndi að IFN-sértæk gen (Liu o.fl., 2012) voru auðguð meðal niðurstýrðu gena (myndir 1A, til hægri og S1B). Til að sannreyna mismunatjáningarsniðin var umritunarmagn veirueyðandi gena, þar á meðal cxcl10, psmb9, tap1 og isg15, ákvarðað með magnbundnum rauntíma öfugum umritun-pólýmerasa keðjuverkun (RT-PCR) prófum og staðlað í gildi psma5 , sem er ekki mjög stjórnað af c-Abl. Í samanburði við WT MEFs sýndu c-abl / arg / MEF marktækt lægra umritsmagn þessara gena, en DKO-völdum lækkunum var algjörlega snúið við með c-Abl björgun á skammtaháðan hátt (myndir 1B og S1C). Þessar upplýsingar bentu til þess að hópur gena af völdum IFN væri stjórnað af c-Abl og Arg. Til að kanna helstu umritunarþætti sem stjórnað er af Abl kínasa sem svar við IFN, var lúsiferasa skýrslukerfi smíðað byggt á tap1/psmb9 sameiginlegum tvíátta verkefnisstjóra stjórnað af IFNg (Mynd 1C). Eins og búist var við hamlaði c-Abl/Arg-sértæki hemillinn AMN107 marktækt umritunarvirkni tap1-hvatans (rautt) (mynd 1D). Sérstaklega, ólíkt brottfellingu á NFkB-verkandi (bláum) eða IFN-samþykktarröð (gulum) þáttum, hafði AMN107 meðferð lítil ef engin áhrif á tap1-hvatavirkni þegar gamma-virkjaðri röð (GAS) frumefninu (grænt) var eytt (Mynd 1D ). Þessar niðurstöður benda til þess að STAT1-miðaða GAS cis-þátturinn sé þátttakandi í c-Abl-stýrðri tap1 umritun, sem bendir eindregið til þess að STAT1 sé ábyrgur fyrir c-Abl-miðlaðri stjórnun á IFN-viðkvæmri genatjáningu.

c-Abl hefur bein samskipti við STAT1

IFN-örvuð TAP1 tjáning er stjórnað af c-Abl, hugsanlega í gegnum STAT1, sem bendir til þess að STAT1 gæti tengst c-Abl. Til að staðfesta þessa tilgátu voru lýsöt af MCF-7 frumum gefin í and-c-Abl ónæmisútfellingu fylgt eftir með ónæmisblettingu með and-STAT1 mótefni. STAT1 var til staðar í and-c-Abl en ekki IgG ónæmisútfellingum (mynd 2A). Næst voru 293T frumur samsmitaðar með Myc-cAbl og Flag-STAT1 eða Flag-Vector sem viðmið. Tilvist Myc-c-Abl í and-Flag ónæmisútfellingum sem eru unnin úr frumum sem tjá Flag-STAT1 samtímis en ekki Flag-Vector sýndi tengsl milli utanlegs tjáðs Myc-c-Abl og Flag-STAT1 (Mynd 2B, til vinstri). Svipuð niðurstaða fékkst einnig í gagnkvæmri tilraun (Mynd 2B, til hægri). Þar að auki hafði hinn meðlimur Abl fjölskyldunnar, Arg (Abl2), sem er mjög sambærilegur c-Abl í N-enda léninu (NTD), einnig samskipti við STAT1 (Mynd S2A).

Mynd 1. c-Abl stjórnar efnahvötum gena sem svara IFN í gegnum GAS frumefni

Næst voru lýsöt unnin úr 293T frumum sem tjá Flag-c-Abl ræktuð með agarósa-tengdu GST-STAT1 eða GST einu sér og Flag-c-Abl fannst í GST-STAT1 en ekki GST adsorbötunum (Mynd 2C). Til að útiloka óbeina bindingu sem miðlað er af öðrum þáttum í frumulýsunum, voru and-Flag ónæmisútfellingar, sem voru unnin úr 293T frumum sem tjá Flag-c-Abl, látin fara í SDS-PAGE (natríumdódecýlsúlfat-pólýakrýlamíð hlaup rafdrætti), og próteinin flutt í PVDF (pólývínýlídenflúoríð) himna og síðan þeytt með leysanlegu GST-STAT1 eða GST (sem viðmið). Niðurstöðurnar sýndu að GST-STAT1, en ekki GST, tengdi c-Abl beint in vitro (mynd 2D). Til að skilgreina c-Abl-bindandi lénið, var agarósa-tengd og GST-brædd STAT1 í fullri lengd eða stytt (Mynd 2E, efri spjaldið) ræktuð með lýsum 293T frumna sem tjá Flag-c-Abl. Greining á adsorbötunum með ónæmisblettingu með and-Flag mótefni sýndi að amínósýrur 577–750 af STAT1, sem mynda svæði sem inniheldur SH2 lénið og umvirkjunarsvæðið, voru ábyrgir fyrir c-Abl víxlverkuninni (Mynd 2E, neðri spjaldið) . Á sama hátt var Flag-STAT1 ónæmisútfellt af and-Flag mótefninu skipt með SDS-PAGE og var flutt yfir á PVDF himnu. Síðan var himnan þeytt með leysanlegu GST-c-Abl SH3 eða GST-c-Abl SH2 og GST eingöngu. Niðurstaðan sýndi að c-Abl SH3 lénið var aðal lénið sem ber ábyrgð á STAT1 tengingu (Mynd 2F). Ennfremur var in situ víxlverkun innræns c-Abl við STAT1 metin með Duolink nálægðargreiningu (PLA). STAT1:c-Abl fléttur sáust aðallega í umfrymi, og myndun þessara flétta var verulega efld með IFNg örvun (Mynd 2G). Samanlagt sýna þessar niðurstöður fram á bein tengsl milli c-Abl og STAT1 bæði in vitro og in vivo.

Mynd 2. c-Abl hefur samskipti við STAT1

c-Abl miðlar JAK-óháðri STAT1 fosfórun

Til að kanna hvort STAT1 sé hvarfefni c-Abl var hreinsað His-merkt STAT1 ræktað með raðbrigða c-Abl (inniheldur hvatasvæðið við amínósýrurnar 237–643) í viðurvist ATP fyrir kínasapróf í glasi. Ónæmisbletting á hvarfefninu með and-fosfó-týrósíni og and-fosfó-STAT1 Y701 sýndi fram á að STAT1 var beint fosfórýlerað af c-Abl við týrósínleifar, þar á meðal Y701, in vitro (Mynd 3A). Næst komumst við að því að Flag-STAT1 tjáð í 293T frumum var týrósínfosfórýlerað, sérstaklega á leif Y701, með Myc-c-Abl en ekki kínasa-óvirka stökkbreyttu Myc-c-Abl (K290R). Ennfremur, við meðferð með c-Abl/Arg-sértæka hemlinum AMN107, var c-Abl-miðluð STAT1 fosfórun næstum eytt, sem gefur til kynna að týrósínfosfórun STAT1 sé háð c-Abl kínasavirkni (Mynd 3B). c-Abl-miðluð STAT1 fosfórun var verulega skert þegar STAT1 Y701 var skipt út fyrir fenýlalanín, sem gefur til kynna að Y701 sé aðal fosfósít Abl (Mynd 3C). Þar að auki var STAT1 einnig fosfórýlerað með Arg (Mynd S2B). Til að afmarka nánar tilteknar STAT1 leifar fosfórýleraðar með c-Abl, var Flag-STAT1 samtjáð með Myc-c-Abl látin fara í vökvaskiljun ásamt tandem massagreiningu greiningu. Til viðbótar við vel skilgreinda og virknilega mikilvæga STAT1 fosfósítið Y701 (Schindler o.fl., 1992; Shuai o.fl., 1993), voru einnig tvö önnur fosfósíð, Y106 og Y665, auðkennd (Mynd S4A). Í samanburði við WT STAT1 sýndu bæði Y106F og Y701F stökkbrigði skerta týrósín fosfórun (mynd 3C). Hins vegar var fosfórun STAT1 Y701 ekki fyrir miklum áhrifum af fosfórun Y106 og Y665, sem gefur til kynna að Y106 og Y665 gætu gegnt sérstöku hlutverki (Mynd S4B). Saman benda þessar niðurstöður til þess að týrósínleifar af STAT1, þar með talið leifinni Y701, sem áður hefur verið tilkynnt um, geti fosfórýlerað af Abl fjölskyldu kínasa.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

JAK eru fyrst og fremst ábyrg fyrir STAT1 Y701 fosfórun af völdum IFN (Villarino o.fl., 2017). Eins og búist var við, var STAT1 Y701 fosfórun framkallað af IFNg og var marktækt hamlað af ruxolitinibi, tvísérhæfðum hemli JAK1 og JAK2 (mynd 3D). Sérstaklega sást einnig skert Y701 fosfórun við Abl hömlun (Mynd 3D, braut 4), sem gefur til kynna að c-Abl stuðlar að hluta til IFNg-framkallaða STAT1 virkjun. Ennfremur var STAT1 Y701 fosfórun einnig framkölluð af DPH, frumugegndræpum c-Abl virkjun, í minna mæli en með IFNg, sem gæti verið algjörlega snúið við með AMN107 (Mynd 3E). Til að staðfesta DPH-framkallaða Abl virkjun, var c-Abl Y412 fosfórun, vísbending um Abl virkjun, einnig greind (Mynd 3E). Sýnt hefur verið fram á að JAK2 virkjun á sér stað fyrst og er nauðsynleg fyrir síðari virkjun JAK1 (Briscoe o.fl., 1996). Til að útiloka áhrif JAK2 á STAT1 virkjun, stofnuðum við jak2-KO MCF-7 frumulínu í gegnum CRISPR. Minnkuð en greinanleg STAT1 Y701 fosfórun kom fram í jak2-KO MCF-7 frumum samanborið við það í móður MCF-7 frumum, sem gæti verið aukið á svipaðan hátt í nærveru Myc-c-Abl en ekki Myc-c-Abl (K290R) (Mynd 3F) og minnkaði enn frekar eftir AMN107 meðferð. Í c-abl / arg/frumum var IFNg-framkallað fosfórýlering á STAT1 við Y701 mjög í hættu á tíma- og skammtaháðan hátt (Mynd 3G). Allar þessar athuganir sýna fram á að c-Abl kínasi gæti beint fosfórýlerað og virkjað STAT1 óháð IFNg-JAK boðleiðinni og að, mikilvægur, þessir tveir kínasar gætu haft samverkandi áhrif á STAT1 fosfórun við Y701.

Mynd 3. STAT1 er fosfórýlerað með c-Abl

Mynd 4. c-Abl stuðlar að STAT1 dimer myndun og kjarnorkuinnflutningi

c-Abl-miðluð fosfórun stjórnar STAT1 umvirkjunarvirkni

Týrósín fosfórun STATs er nauðsynlegt skref í JAK-STAT ferli IFN merkja og tekur þátt í STAT tvískiptingu, kjarnaflutningi og DNA bindingu. Til að kanna hvort c-Abl-miðluð fosfórun stjórnar STAT dimmerization, voru GFP-STAT1 og Flag-STAT1 samtjáð í 293T frumum í nærveru eða fjarveru Myc-c-Abl. Magn GFP-STAT1 í and-Flag ónæmisútfellingum var skoðað til að gefa til kynna STAT1 dimerization. Eins og sýnt er á mynd 4A, efldi samtjáning c-Abl myndun STAT1-STAT1 homodimera. Ónæmisflúrljómunarsmásjá á MCF-7 frumum sýndi ennfremur fram á að brottnám c-abl/arg eða meðferð með AMN107 skerti verulega IFNg-framkallaða STAT1 kjarnaflutning (myndir 4B og 4C).

Ennfremur voru rafhreyfanleikavaktarprófanir notaðar til að greina kynningarbindivirkni STAT1. Bíótínmerkt IRF1 stýrikerfi sem innihélt STAT1 bindandi samstöðuröðina var notað sem greiningarrannsókn (Aaronson og Horvath, 2002). Þessi rannsakandi var ræktaður með kjarnaútdrætti úr 293T frumum sem tjáðu STAT1 utanaðkomandi með eða án c-Abl, sem var jafnvægi byggt á mynd S5A. Eins og sýnt er á mynd 4D, sáust fjölmargir IRF1 rannsakandi fléttur sem innihéldu STAT1 í kjarnaútdrætti (Mynd 4D, braut 1). Flókin myndun jókst lítillega við IFNg meðferð (Mynd 4D, braut 2) og jókst verulega í frumum sem tjáðu c-Abl útlegð (Mynd 4D, braut 3). Samt sem áður, samanborið við WT STAT1, sýndi c-Abl lítil ef nokkur áhrif á kynningarbindingu STAT1 sem hýsir Y701F (Mynd 4D, brautir 7 og 8), á meðan Y106F og Y665F stökkbreytingar sýndu næstum engan mun á WT STAT1. Sérhæfni fléttanna sem innihéldu STAT1 og greiningarnemans var staðfest með því að bæta við ómerktum keppandanema (Mynd 4D, braut 9). Ennfremur leiddi viðbót við STAT1 mótefni til myndunar á ofskiptu bandi (Mynd 4D, braut 11). Þegar merktu rannsakanirnar voru ræktaðar með kjarnaútdrætti 293T frumna sem viðmiðunar, sáust engar fléttur (Mynd 4D, braut 10). Þessar niðurstöður sýna fram á að c-Abl-miðluð STAT1 Y701 fosfórýlering eflir bindingu STAT1 við markhvata þess.

Mynd 5. c-Abl stjórnar IFN-tengdri genatjáningu

Síðan var IFNg-framkölluð umvirkjun helstu STAT1-stýrðra gena, þar á meðal ccl5, cxcl10, cxcl11, gbp2, ido1, ifi35, irf1, isg15, oasl, psmb9 og tap1, metin í WT eða c-abl/ arg DKO MCF-7 frumur með RT-PCR. Eins og búist var við, var umritun gena verulega skert vegna c-abl/arg eyðingar (Mynd 5A). Þar að auki tókst ekki að örva gen sem venjulega eru framkölluð af IFNg og IFNa af IFNs í viðurvist AMN107 (myndir 5B og 5C). Þessar niðurstöður sýna að umvirkjunarvirkni STAT1 er jákvætt stjórnað af c-Abl.

c-Abl ýtir undir IFN-háð veirueyðandi áhrif

TAP1 og PSMB9 taka þátt í framleiðslu og framsetningu peptíða í MHC flokki I mótefnavakavinnsluferli (Ghannam o.fl., 2014; Vitale o.fl., 1998). Í samræmi við fyrri niðurstöður var framsetning mótefnavaka á ovalbumin af JAWS II frumum til B3Z frumna verulega bæld af AMN107 vegna minnkaðrar IL2 framleiðslu (Mynd 6A). Til að meta frekar veirueyðandi líffræðilegar afleiðingar STAT1-stjórnunar með c-Abl, WT og c-abl/arg/MEF sem formeðhöndluð voru með eða án raðþynntra IFNg voru sýkt af blöðrumunnbólguveiru (VSV). VSV sýking olli alvarlegri frumudauða í c-abl / arg / MEF og WT frumum sem voru meðhöndlaðar með AMN107 en í WT MEF sem voru meðhöndlaðir með burðarefni (Mynd 6B). Meðferð með IFNg dró sérstaklega úr frumudauða af völdum veirusýkingar, en hún hafði mun minna áberandi áhrif í viðurvist AMN107. Í samræmi við þessa niðurstöðu leiddi c-abl/arg brottnám í MEF til ónæmis fyrir IFN örvun, en þessum áhrifum var einkum snúið við með c-Abl björgun (Mynd 6B). Næst voru A549 frumur meðhöndlaðar með eða án AMN107 sýktar af Newcastle-veiki veiru (NDV) sem tjáir GFP og niðurstöðurnar leiddu í ljós að veiruafritun var einnig efld með AMN107 meðferð en bæld með c-Abl tjáningu (Mynd 6C). Í samræmi við þá niðurstöðu að DNA transfection leiði til virkjunar á innrænu IFN svörun (Park o.fl., 2003), hamlaði transfection með pcDNA ferjunni útbreiðslu veiru. Sérstaklega leiddi transfection með Flag-c-Abl til áberandi hamlandi áhrifa á veirufjölgun en transfection með tómri vektor (Mynd 6C). Ennfremur hafði IFNg meðferð lítil ef nokkur áhrif á veirusýkingu í viðurvist c-Abl-sértæka hemlans AMN107 (Mynd 6D). Þessar upplýsingar benda til þess að c-Abl gegni mikilvægu hlutverki í STAT1-miðluðum veirueyðandi áhrifum. Næst könnuðum við hlutverk c-Abl í veirusýkingu í call/fl, Lck-Cre (c-abl-skilyrt knockout, c-abl-cKO) músum, þar sem c-abl var sérstaklega slegið út í thymocytes (Mynd S7A) ) þar sem kímlínuútfall c-abl geni leiðir til hlaups og dauða á fyrstu tveimur vikum eftir fæðingu (Koleske o.fl., 1998; Schwartzberg o.fl., 1991). Síðan voru WT og c-abl-cKO mýs sýktar í nef af inflúensu A veiru (IAV). Tölfræðilega ómarktækt hærri dánartíðni sást meðal c-abl-cKO músa en meðal WT músa. WT mýs sem fengu stöðugt AMN107, sem bælir kerfisbundið c-Abl/Arg kínasa í öllum vefjum, sýndu marktækt aukið næmi fyrir IAV (Mynd 6E). Samanlagt benda þessar niðurstöður til þess að c-Abl sé nauðsynlegt fyrir veirueyðandi ónæmi hjá dýrum.

Mynd 6. c-Abl ýtir undir IFN-háð veirueyðandi áhrif

UMRÆÐA

IFNg er eitt mikilvægasta ónæmisstýrandi cýtókínið og gegnir mikilvægu hlutverki í meðfæddu ónæmi gegn veirusýkingu. Í kanónískum IFNg boðefnum, við IFNg örvun, eru JAK1 og JAK2 ráðnir til umfrymishala samanlagðra IFNg viðtaka (IFNGRs) og virkjaðir með raðbundinni sjálffosfórun og umfosfórunartilvikum (Stark, 2007; Villarino o.fl., 2017). Þá festist STAT1 við IFNGR með því að tengja SH2 lén þess við viðurkenningarröð í IFNGR (Y440DKPH444), þar sem Y440 er fosfórýlerað af JAK (Greenlund o.fl., 1995). Eftir fosfórun þess við Y701 af JAKs, dimerizes STAT1 og færist inn í kjarnann, þar sem það stuðlar að umritun fjölda IFNg-viðbragða gena (Aaronson og Horvath, 2002; Stark og Darnell, 2012). Stat1 brottnám í músum leiðir til skorts á umritunarsvörun við IFN og skorts á IFN-örvuðum sýkla- og veirueyðandi virkni í frumum (Meraz o.fl., 1996). Stat1 / mýs sýna einnig aukið næmi fyrir þróun sjálfkrafa og efnafræðilegra (3-metýlkólantren)-framkallaða æxla (Kaplan o.fl., 1998) og ofnæmi fyrir ákveðnum bólgusjúkdómum (Bettelli o.fl., 2004; Villarino o.fl. ., 2010). Ennfremur verndar STAT1 merkjasendingar T frumur fyrir frumudrepandi frumudrepandi áhrifum af náttúrulegum drápsfrumum (Kang o.fl., 2019).Þessar niðurstöður benda til þess að STAT1 miðli meðfæddri ónæmisvirkjun og æxlisónæmi.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Schlatterer o.fl. greint frá því að c-Abl, en ekki Arg, gæti valdið tapi á taugafrumum með því að hvetja til STAT1 virkjunar og interferónframleiðslu. Hins vegar hefur ekki verið útskýrt nákvæmlega fyrirkomulagið sem ber ábyrgð á c-Abl-háðri STAT1 virkjun (Schlatterer o.fl., 2012). Hér sýnum við að c-Abl binst og fosfórýlerar STAT1 og hefur samskipti við STAT2 beint in vitro (myndir 2 og 3, S8A, S9A og S10A). STAT1 Y701 er eingöngu fosfórýlerað af JAK kínasa, sem stjórnar STAT1 dimer myndun (Schindler o.fl., 1992; Shuai o.fl., 1993) og kjarnafrymisflutningi við IFNg merkjasendingar (Mao o.fl., 2005; Mertens o.fl., 2006; Zhong o.fl., 2005). Rannsókn okkar leiddi óvænt í ljós að c-Abl, annar kínasi annar en JAKs, stuðlar einnig að STAT1 Y701 fosfórýleringu sjálfstætt (mynd 3). Þó að c-Abl-miðluð Y701 fosfórun sé ekki eins öflug og JAK, virðist nauðsynlegt fyrir Y701 að ná hámarks fosfórun þar sem alvarlega skert Y701 fosfórun sást í c-abl / arg/frumum við IFNg áreiti og IFNg- framkölluð STAT1 Y701 fosfórun var hindrað af AMN107, frá 1,25 mM til 5 mM, á skammtaháðan hátt (myndir 3G og S11A). Hins vegar er Y701 fosfórun ekki mikil áhrif á fosfórunarástand Y106 og Y665, hinna tveggja fosfósíða c-Abl, sem gefur til kynna að aukin STAT1 Y701 fosfórun stafar ekki af c-Abl miðlðri fjölseta fosfórun á STAT1 en er mögulega rekja til aukinnar JAK virkni. Fyrri rannsóknir hafa sýnt að stofnandi virkjun JAK1 og breytileg virkjun JAK2 hefur sést í frumum sem tjá BCR-Abl (Chai o.fl., 1997; Henderson o.fl., 1997; Shuai o.fl., 1996). Ennfremur hefur verið sýnt fram á að BCR-Abl virkjar í hófi STAT1 og STAT2 með týrósínfosfórun á JAK1, JAK2 og JAK3 (Henderson o.fl., 1997). Núverandi vísbendingar styðja að Abl og JAKs gætu haft áberandi samverkandi áhrif á STAT1 fosfórun við Y701 (Mynd 3E).

Auk Y701 var fosfórun Y106 og Y665 auðkennd samtímis (myndir 3C og S4A). Þessi fosfósít tóku ekki þátt í STAT1 Y701 fosfórun eða STAT1 homodimerization (myndir S4B og S4C). Hins vegar komust Murphy og félagar að því að víxlverkun milli NTDs (N-terminal protein interaction domain, amínósýrur 1–136) einliða er nauðsynleg til að dimmerisera ófosfórýleruðum STAT sameindum í fullri lengd (Ota o.fl., 2004). STAT1 stökkbrigði (F77A og/eða L78A) ná ekki að mynda ófosfórýleraðar tvíliða og þessar stökkbrigði sýna viðvarandi fosfórun í IFN-meðhöndluðum frumum og ónæmi fyrir TC45-miðlaðri affosfórun in vitro (Mertens et al., 2006). Y106 í NTD, sem er nálægt F77 og L78, gæti verið ábyrgur fyrir því að viðhalda STAT1 í fosfórýleruðu tvíliða ástandi og fyrir að viðhalda STAT1 í kjarnanum undir jónandi geislun (myndir S6A og S6B). Þar að auki hefur SH2 lénið samskipti við lénið sem inniheldur fosfórýlerað týrósín þegar fosfórýleruð homodimer myndun er framkölluð af IFN (Shuai et al., 1994). Y665, sem liggur í SH2 léninu, getur haft áhrif á dimerization. Aðgerðir c-Abl-miðlaðra fosfórunarstaða (Y106 og Y665) krefjast frekari rannsóknar.

Líkt og JAK, stjórnar c-Abl-miðluð fosfórun myndun STAT1 dimera (þar á meðal STAT1- STAT1 homodimer og STAT1-STAT2 heterodimer myndun (myndir 4A, S12A og S12B)), kjarnaflutning, DNA bindingu , og umritun IFN-örvaðra gena. Abl truflun stuðlaði að aukinni veiruútbreiðslu og auknum frumudauða af völdum vírusa (myndir 6B, 6C og 6D). Ennfremur komumst við að því að jónandi geislun (IR) olli STAT1 kjarnaflutningi í fjarveru c-Abl hemlans (myndir S6A og S6B). IR virkjar c-Abl beint (Pendergast, 2002) og í kjölfarið STAT1-háð IFNg merki, sem getur veitt undirliggjandi kerfi þar sem geislameðferð kemur af stað IFN-fallandi meðfæddri og aðlagandi ónæmisárás á æxlið (Burnette o.fl. ., 2011) og býður upp á sterkari meðfædda ónæmisstöðu sem svar við IR áreiti. Í samanburði við WT gotfélaga sýndu mýs þar sem c-abl var slegið út með skilyrðum í skjaldkirtilum hærri en ekki tölfræðilega marktækan dánartíðni. Athyglisvert er að mýs sem kerfisbundið var gefin c-Abl/Arg hemill AMN107 höfðu hærri dánartíðni (Mynd 6E), sem gefur til kynna að c-Abl tjáning í ýmsum vefjum hafi stuðlað að veirueyðandi ónæmi hjá dýrum. Út frá þessum gögnum leggjum við til að innrænt Abl bjóði upp á dulda grunnviðnám gegn veirusýkingu og að virkjað Abl sem örvað er með jónandi geislun verndar frumur. Abl kínasar eru virkjaðir með formlegum hætti hjá flestum sjúklingum með CML. Abl kínasa hemlar STI571 og AMN107 tákna framlínumeðferð fyrir CML meðferð. Hins vegar er almennt vart við sýkingu í efri öndunarvegi og ónæmisbælingu, sem getur stafað af bælingu á STAT miðluðu ónæmisstjórnunarferlinu (Hochhaus o.fl., 2016; Mattiuzzi o.fl., 2003). Niðurstöður okkar bættu við fræðilegum grunni til að hámarka meðferðina.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Í stuttu máli kom í ljós að týrósínkínasinn c-Abl tengist STAT1 in vivo og in vitro, stuðlar að STAT1 fosfórun við Y701 óháð JAK, til að auka umvirkjun og miðla meðfæddum ónæmissvörun gegn sýkingu, sérstaklega í tengslum við c. -Abl-tengt streita. Niðurstaða okkar veitir viðbótaraðferð fyrir STAT1 virkjun, sem stuðlar að vaxandi þekkingu varðandi stjórnun á IFN niðurstreymis merkjaleiðinni.

HEIMILDIR

Aaronson, DS og Horvath, CM (2002). Vegakort fyrir þá sem ekki þekkja JAK-STAT. Vísindi 296, 1653–1655.

Advani, AS og Pendergast, AM (2002). BcrAbl afbrigði: líffræðilegir og klínískir þættir. Leuk. Res. 26, 713–720.

Bettelli, E., Sullivan, B., Szabo, SJ, Sobel, RA, Glimcher, LH og Kuchroo, VK (2004). Tap á T-veðmáli, en ekki STAT1, kemur í veg fyrir þróun sjálfsofnæmis heilahimnubólgu. J. Exp. Med. 200, 79–87.

Bradley, WD og Koleske, AJ (2009). Reglugerð um flutning frumna og formgerð með Abl-fjölskyldu kínasa: vaxandi aðferðir og lífeðlisfræðilegt samhengi. J. Cell Sci. 122, 3441–3454.

Briscoe, J., Rogers, NC, Witthuhn, BA, Watling, D., Harpur, AG, Wilks, AF, Stark, GR, Ihle, JN og Kerr, IM (1996). Kínasa-neikvæð stökkbrigði af JAK1 geta haldið uppi interferón-gamma-örvandi genatjáningu en ekki veirueyðandi ástand. EMBO J. 15, 799–809.

Carlesso, N., Frank, DA og Griffin, JD (1996). Týrósýl fosfórun og DNA bindandi virkni merkjabreyta og virkjunar umritunar (STAT) próteina í blóðmyndandi frumulínum umbreyttum með Bcr/Abl. J. Exp. Med. 183, 811–820.

Chai, SK, Nichols, GL og Rothman, P. (1997). Stofnandi virkjun JAKs og STATs í BCR Abl-tjáandi frumulínum og útlægum blóðfrumum úr hvítblæðissjúklingum. J. Immunol. 159, 4720–4728.

Colicelli, J. (2010). ABL týrósín kínasar: þróun virkni, stjórnun og sérhæfni. Sci. Merki. 3, aftur6.

Danial, NN, Losman, JA, Lu, T., Yip, N., Krishnan, K., Krolewski, J., Goff, SP, Wang, JY og Rothman, PB (1998). Bein víxlverkun Jak1 og v-Abl er nauðsynleg fyrir v-Abl-framkallaða virkjun á STAT og fjölgun. Mol. Cell Biol. 18, 6795–6804.

Danial, NN og Rothman, P. (2000). JAK-STAT merki virkjuð af Abl krabbameinsgenum. Oncogene 19, 2523–2531.

de Groot, RP, Raaijmakers, JA, Lammers, JW, Jove, R. og Koenderman, L. (1999). STAT5 virkjun með BCR-Abl stuðlar að umbreytingu K562 hvítblæðisfrumna. Blóð 94, 1108–1112.

Dietz, AB, Souan, L., Knutson, GJ, Bulur, PA, Litzow, MR og Vuk-Pavlovic, S. (2004). Imatinib mesýlat hamlar útbreiðslu T-frumna in vitro og ofnæmi fyrir seinkaðri gerð in vivo. Blóð 104, 1094–1099.

Dong, Q., Li, C., Qu, X., Cao, C. og Liu, X. (2017). Alheimsstjórnun á mismunatjáningu gena með c-abl/arg krabbameinsvaldandi kínasa. Med. Sci. Monit. 23, 2625–2635.

Ghannam, K., Martinez-Gamboa, L., Spengler, L., Krause, S., Smiljanovic, B., Bonin, M., Bhattarai, S., Grutzkau, A., Burmester, GR, Haupl, T. , o.fl. (2014). Uppstjórnun ónæmispróteasóma undireininga í vöðvabólgu gefur til kynna virka bólgu með þátttöku frumna sem sýna mótefnavaka, CD8 T-frumur og IFNGamma. PLoS One 9, e104048.

Greenlund, AC, Morales, MO, Viviano, BL, Yan, H., Krolewski, J. og Schreiber, RD (1995). Statsráðning með týrósínfosfórýleruðum cýtókínviðtökum: skipað afturkræf sæknidrifið ferli. Ónæmi 2, 677–687.

Greuber, EK, Smith-Pearson, P., Wang, J. og Pendergast, AM (2013). Hlutverk ABL fjölskyldu kínasa í krabbameini: frá hvítblæði til fastra æxla. Nat. Séra Krabbamein 13, 559–571.

Gu, JJ, Ryu, JR og Pendergast, AM (2009). Abl týrósín kínasar í T-frumuboðum. Immunol. 228, 170–183.

Henderson, YC, Guo, XY, Greenberger, J. og Deisseroth, AB (1997). Hugsanlegt hlutverk bcr-abl í virkjun JAK1 kínasa. Clin. Cancer Res. 3, 145–149.

Hochhaus, A., Saglio, G., Hughes, TP, Larson, RA, Kim, DW, Issaragrisil, S., le Coutre, PD, Etienne, G., Dorlhiac-Llacer, PE, Clark, RE, o.fl. (2016). Langtímaávinningur og áhætta af framlínu nilotinibi vs imatinibi við langvarandi kyrningahvítblæði í langvinnum fasa: 5-ársuppfærsla á slembiröðuðu ENESTnd rannsókninni. Hvítblæði 30, 1044-1054.

Kang, YH, Biswas, A., Field, M. og Snapper, SB (2019). STAT1 boð verndar T frumur fyrir frumudrepandi eiturverkunum af völdum NK frumu. Nat. Samfélag. 10, 912.

Kaplan, DH, Shankaran, V., Dighe, AS, Stockert, E., Aguet, M., Old, LJ og Schreiber, RD (1998). Sýning á interferón gamma háð æxliseftirlitskerfi í ónæmishæfum músum. Frv. Natl. Acad. Sci. Bandaríkin 95, 7556–7561.

Koleske, AJ, Gifford, AM, Scott, ML, Nee, M., Bronson, RT, Miczek, KA og Baltimore, D. (1998). Nauðsynleg hlutverk fyrir Abl og Arg týrósín kínasa í taugakerfi. Neuron 21, 1259–1272.

Leaman, DW, Pisharody, S., Flickinger, TW, Commane, MA, Schlessinger, J., Kerr, IM, Levy, DE og Stark, GR (1996). Hlutverk JAKs í virkjun STATs og örvun á tjáningu c-fos gena með húðþekjuvaxtarþætti. Mol. Cell Biol. 16, 369–375.