Hlutverk erfðaprófa í greiningarferli barnasjúklinga með nýrnasjúkdóma: Reynsla einstakrar stofnunar

ÁgripTilgangurErfðir nýrnasjúkdómar eru meðal helstu orsök nýrnabilunar hjá börnum, sem leiðir til aukinnar dánartíðni, hás heilbrigðiskostnaðar og þörf fyrir líffæraígræðslu. Næsta kynslóð raðgreiningartækni getur hjálpað til við að greina sjaldgæfa einhæfa sjúkdóma, sem gerir ráð fyrir hámarks læknisstjórnun og meðferðarvali.

Aðferðir Clinical exome sequencing (CES) var framkvæmd á hópi 191 barnasjúklinga frá einni stofnun, fylgt eftir með Sanger raðgreiningu til að staðfesta auðkennd afbrigði og til aðgreiningarrannsókna á fjölskyldu. Niðurstöður Allir sjúklingar voru með klíníska greiningu á nýrnasjúkdómi: Helstu sjúkdómaflokkar voru gauklasjúkdómar (32,5%), ciliopathy (20,4%), CAKUT (17,8%), nýrnasteina (11,5%) og píplusjúkdómar (10,5%). 7,3% sjúklinga fengu aðra sjúkdóma. Óyggjandi erfðapróf, byggt á CES og Sanger staðfestingu, fékkst hjá 37,1% sjúklinga. Hæsta greiningarhlutfallið fékkst fyrir ciliopathies (74,4%), þar á eftir komu nýrnasteina (45,5%) og píplusjúkdóma (45%), en flestir gauklasjúkdómar og CAKUT voru ógreindir. Niðurstöður Niðurstöður benda til þess að erfðapróf sem stöðugt er notað í greiningarvinnuflæði barna með langvinnan nýrnasjúkdóm geti (i) staðfest klíníska greiningu, (ii) veitt snemma greiningu ef um erfðasjúkdóma er að ræða, (iii) og erfðafræðilega orsök áður óþekktrar sjúkdóma og (iv) sérsníða ígræðsluáætlanir.

Leitarorð Klínísk exóm raðgreining, Næsta kynslóð raðgreining,Nýrnasjúkdómar, Erfðapróf, Barnahópur

SMELLTU HÉR TIL AÐ FÁ CISTANCHE FYRIRLOKASTIG NÝRASJÚKDÓMI

Kynning

Nýrnakvillar barna samanstanda af mjög mismunandi sjúkdómseiningum hvað varðar klíníska framsetningu, þróun og meðferðarmöguleika [1-4]. Um það bil 30% barna með langvinnan nýrnasjúkdóm (CKD) þjást af einhæfu ástandi, hlutfall hækkar þegar litið er til barna með lokastigs nýrnasjúkdóm (ESRD) [5, 6]. Mörg þessara barna eru enn ógreind við ígræðslu [4, 6, 7]. Að ná greiningu fyrir þessa sjúklinga felur ekki aðeins í sér endalok greiningarferða, heldur hefur það nokkra kosti fyrir horfur, stjórnun og meðferð

Brautryðjandi rannsóknir hafa stöðugt sýnt að innleiðing næstu kynslóðar raðgreiningartækni (NGS) hefur verulega bætt greiningarávöxtun hjá sjúklingum með arfgenga nýrnasjúkdóma (IKD) [8]. Nýlega hefur víðtæk notkun NGS gert tiltæka erfðagreiningu á hæfilegum tíma og á viðráðanlegu verði, sem hefur vakið upp þá spurningu hvort og hvenær það ætti að vera samþætt í venjubundnu greiningarferli [5].

Erfðagreining hjá börnum er afar mikilvæg fyrir mismunandi þætti. Hið fyrra er að það gæti skipt máli í klínískri nálgun á sjúkdóminn, dæmigerð dæmi um nýrnaheilkenni þar sem auðkenning á byggingarafbrigðum í fræfrumatengdum genum stangast á við ónæmisbælandi meðferð sem annars væri venjulega notuð yfir nokkurra ára tímabil. mánuði [9]. Annað er að það getur skipt miklu máli fyrir fjölskyldu barnsins og fyrir auðkenningu annarra meðlima sem bera afbrigðið sem hugsanlega er hægt að senda til komandi kynslóða. Þegar sjúkdómsvaldandi afbrigði hefur verið greint í proband, eru fossprófanir á fjölskyldumeðlimum og erfðafræðileg ráðgjöf hjá afbrigðaberum staðlaðar venjur í klínískri erfðafræði [5]. Í þriðja lagi er nauðsynlegt að þekkja sjúkdómsvaldandi afbrigðið í ígræðslusamhengi þar sem gjafinn getur verið ættingi. Reyndar er mikilvægt að útiloka að sama afbrigði eða afbrigði séu til staðar í líffæragjafanum, auk þess sem það er mikilvægt að bera kennsl á alla fjölskyldumeðlimi sem gætu þurft á ígræðslu að halda. Sú fjórða er sú að sumir sjúkdómar eru í mikilli hættu á bakslagi eftir líffæraígræðsluna, svo sem focal segmental glomerulosclerosis [10] eða útkoma þeirra gæti batnað með sérsniðnara vali á ígræðslunni sem á að framkvæma, svo sem þegar um er að ræða frumkomið of hár oxalúría þar sem sameinuð nýra-lifrarígræðsla getur leitt til betri útkomu [11]. Að lokum getur verið gagnlegt fyrir sjúklinginn að hafa skýra sjúkdómsgreiningu til að taka þátt í klínískum rannsóknum og njóta góðs af nýjum meðferðarúrræðum [12, 13].

Í lok árs 2018, í samstarfi barnanýrnalækna og erfðafræðinga, byrjuðum við að gera erfðafræðilegar prófanir á einhæfum sjúkdómum sem gætu hugsanlega leitt til ESRD og þar af leiðandi ígræðslu. Spítalinn okkar er sá stærsti á Norðvestur-Ítalíu og tæmist frá svæði sem telur um 5 milljónir manna. Við völdum „ein stærð sem hentar öllum“ tegund greininga, með raðgreiningu á klínísku exóminu, þ.e. um það bil 6700 genum sem tengjast einhæfum sjúkdómum, með áherslu á greiningu á genaspjöldum sem eru sérsniðnar að klínískum grunsemdum og takmarka því tilfallandi niðurstöður og styttingu tíma fyrir raðgreiningu.

Á heildina litið, með því að beita þessari leiðslu, fengum við greiningarávöxtun í samræmi við birt gögn, með nokkurri misleitni milli mismunandi klínískra gruns, eins og búist var við. Niðurstöðurnar sem fengust staðfesta mikilvægi þess að taka með venjubundnar erfðafræðilegar prófanir og ráðgjöf í greiningarvinnuflæði barnasjúklinga sem hafa áhrif á nýrnakvilla. Reyndar er auðkenning á orsakaafbrigðum mikilvæg fyrir klíníska stjórnun þeirra og hugsanlega fyrir bestu val á lifandi gjafa.

efni og aðferðir

Ráðning sjúklinga

Rannsóknin var byggð á greiningarhópi 191 barnasjúklinga í röð (aldur við nýliðun < 18 ára), sem var ráðinn af nýrnalækninga-, skilunar- og ígræðsludeildum barna á Regina Margherita barnaspítalanum og vísað til Ónæmis- og ígræðslulíffræðiþjónustunnar fyrir erfðagreiningu. Allir sjúklingar sem tóku þátt í rannsókninni veittu skriflegt upplýst samþykki undirritað af báðum foreldrum, þegar mögulegt var.

Sýnagerð, raðgreining og lífupplýsingagreiningar

Kjarnsýruútdráttur úr útæðablóði, greining á DNA gæðum, undirbúningur safns og raðgreining var framkvæmd eins og áður hefur verið greint frá [14]. Hrágögnum sem fengust með raðgreiningu var breytt í FASTQ skrár og síðan samræmd við Enrichment 3.1.0 eða DRAGEN Enrichment verkfæri (Illumina) og kortlögð á TruSight One Expanded v2.0 birtingarmynd með því að nota Homo Sapiens UCSC GRCh37 erfðamengi sem tilvísun til að fá staka núkleótíðafbrigði, afritanúmerafbrigði (CNV) og byggingarafbrigði af skrám. Til að bera kennsl á afritsnúmer var grunnlína gerð úr raðgreiningargögnum frá 5 mismunandi sjúklingum, öll neikvæð fyrir CNV (samkvæmt array samanburðargögnum um erfðablöndun). Þessi nálgun gerir kleift að greina CNV jafnvel í kynlitningum þar sem viðmiðunarhópurinn var gerður úr bæði kvenkyns og karlkyns einstaklingum og kyn viðfangsefnisins sem á að greina var alltaf tilgreint á meðan á aðlögun stóð. Afbrigðiskall og forgangsröðun var gerð eftir skilgreindum forsendum. Lesajöfnun og utanaðkomandi umfjöllun um gena sem vekur áhuga var athugað og sýnd af Integrative Genomics Viewer IGV, ókeypis fáanlegt frá UC San Diego-háskólanum í Kaliforníu og Broad Institute of MIT og Harvard háskólanum-Boston (https://software.broadinstitute. org/ software/igv/). Afbrigði sem eiga að vera með í loka erfðafræðilegu skýrslunni voru flokkuð samkvæmt American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) viðmiðunum.

Myndun lista yfir genasjúkdóma í silico

Gen sem koma til greina til að bera kennsl á afbrigði og forgangsröðun voru skilgreind út frá klínískum grunsemdum. Í kísilgenalistum voru búnir til sem passa (i) gögn úr mismunandi gagnagrunnum, sem tengdu arfgerð við svipgerð (OMIM, PanelApp England, ClinGen, Malacards) og (ii) gögn úr bókmenntum. Tiltækir genalistar eru uppfærðir einu sinni á ári byggt á nýjum vísbendingum um tengsl gena og sjúkdóma.

Sanger raðgreining og margfeldisbindingarháð rannsakamafjölgun (MLPA)

Sanger raðgreining og/eða MLPA greiningar voru gerðar til að sannreyna afbrigði sem NGS skilgreindu og til rannsókna á fjölskylduaðskilnaði. Í stuttu máli var DNA dregið út frá öðrum óháðum skammti af útlæga blóðinu og frá foreldrum. DNA svæðin sem áhuga voru á voru mögnuð upp með PCR með sérstökum tilraunaaðstæðum. Hreinleiki og sérhæfni mögnuðu svæðanna var athugað með 0.8 eða 1.5% agarósa hlaupi. Magnaðar PCR afurðir voru síðan Sanger raðgreindar með því að nota sömu primera. Fyrir PKD1 afbrigði var sannprófun framkvæmd með langdrægri PCR og síðan hreiður PCR til að forðast ályktanir frá gerviefnin.

Niðurstöður

Skilgreining á viðmiðum fyrir skil á niðurstöðum erfðagreiningar

We previously reported on the design and set-up of a "kidney" gene panel that comprises>400 gen sem öll taka þátt í mismunandi gerðum nýrnasjúkdóma [14]. Fyrir þessa rannsókn innleiddum við greiningu með undirsviðum með áherslu á tiltekinn klínískan flokk gruns (td CAKUT, gauklakvilla, píplukvilla osfrv.) og settum sérstakan hóp gena í forgang til greiningar. Þessi nálgun takmarkaði fjölda greindra gena, einfaldaði greiningar og fækkaði tilfallandi niðurstöðum. Einungis þegar, í lok greiningarsviðs með viðkomandi spjaldi(um), erfðafræðileg niðurstaða var neikvæð og (i) klínísk svipgerð ekki skýrt til kynna eða (ii) skarast mismunandi sjúkdómsflokka, var erfðagreiningin stækkað til s.k. „nýra fullur listi eða nýra“, ofurpanel sem samanstendur af öllum genunum sem eru í undirspjöldunum.

Sem fyrsta skref skilgreindum við sett af viðmiðum fyrir túlkun á NGS niðurstöðum. Eftir að hafa framkvæmt klíníska exome raðgreiningu (CES) og gagnaaðlögun, var greiningarleiðsla ákveðin til að sía í viðkomandi afbrigði. Sérstaklega, byggt á klínískum grunsemdum, voru auðkennd afbrigði síuð út frá kísilgenalistum, sértækum fyrir hina ýmsu stórflokka sjúkdóma. Samheiti afbrigði sem hafa ekki áhrif á splicing vélbúnaðinn eða innrætt afbrigði sem ekki kortleggjast innan splæsingarsvæðisins voru útilokuð, með aðeins ósamheiti, vitleysu, frameshift og splicing-áhrif afbrigði. Tíu, aðeins sjaldgæf afbrigði (tíðni minni en 1% í þýðinu) og afbrigði með samsætutíðni hjá sjúklingi upp á að minnsta kosti 0.2 og umfang að minnsta kosti 20 lestra voru tekin með. Afbrigðin sem eftir voru voru skrifuð með athugasemdum og söfnuð frekar út frá (i) erfðamáta, (ii) varðveislu núkleótíða, (iii) próteináhrifum, nýtingu mismunandi gagnagrunna til að athuga stigin og (iv) bókmenntum, ef einhver er. Á þessum tímapunkti voru síuð afbrigði skráð í svokallaðri "tækniskýrslu". Tækniskýrslan var túlkuð af lækniserfðafræðingi til að framleiða endanlega erfðafræðilega skýrsluna fyrir sjúklinginn og fjölskyldu hans. Meðan á erfðafræðilegu samráðinu stóð var lagt til að rannsóknum á fjölskylduaðskilnaði til að (i) staðfesta afbrigðin í sjúkdómnum og (ii) að innihalda/útiloka afbrigði sem ekki eru orsakavaldar byggðar á aðskilnaði þeirra í fjölskyldunni (mynd 1).

Með því að samþykkja þessi viðmið gátum við skilgreint þrjá mismunandi flokka erfðafræðilegra skýrslna. Í fyrsta lagi „afgerandi skýrsla“ sem innihélt sjúkdómsvaldandi (C5) og líklega sjúkdómsvaldandi (C4) afbrigði. Tilkynningar um afbrigði af óþekktri þýðingu (C3) voru aðeins taldar óyggjandi ef þær samrýmdust fullkomlega klínísku myndinni og ef rannsóknir á aðskilnaði fjölskyldunnar staðfestu hugsanlegt hlutverk þeirra. Í öðru lagi „óviss skýrsla“ sem innihélt C3 afbrigði sem voru auðkennd af CES sem eru ekki enn eða ekki hægt að staðfesta í samhengi við fjölskylduaðskilnaðarrannsóknir eða C4/C5 afbrigði sem voru ekki í fullu samræmi við klíníska svipgerð. Í þriðja lagi, "ófullnægjandi skýrsla" sem innihélt (i) neikvæða CES greiningu, sem þýðir að engin afbrigði voru auðkennd af NGS; (ii) einstök afbrigði í víkjandi genum; og (iii) C3 afbrigði sem eru ekki í samræmi við klíníska svipgerð, auðkennd þegar greiningin var útvíkkuð til allragen sem tengjast nýrnasjúkdómum(Mynd 1).

Helstu einkenni hins ráðna árgangs

Þessi rannsókn lýsir hópi 191 barnasjúklinga (0–18 ára) sem var vísað í röð af nýrnalækningadeild barna til erfðagreiningar frá nóvember 2018 til maí 2022, með að meðaltali 50 nýir sjúklingar skráðir á ári hverju. . Viðmið fyrir erfðarannsóknir voru (i) nýrnakvilli tengdur jákvæðri fjölskyldusögu um nýrnasjúkdóm eða (ii) klínískur grunur um einhæft ástand eða (iii) þörf á að útiloka einhæft ástand (eins og þegar um nýrnaheilkenni er að ræða, þar sem greint er frá einvalda versus óeinvalda sjúkdóma hefur klínískt þýðingu fyrir horfur og meðferð).

Hópnum var skipt á grundvelli klínísks gruns, með hliðsjón af 6 mismunandi stórflokkum sjúkdóma: meðfædda frávik í nýrum og þvagfærum (CAKUT; n=34), ciliopathy (n=39), gauklakvilli (n=62), nýrnabólgu (n=22), tauopathies (n=20) og aðrir sjúkdómar sem innihéldu einnig heilkennissvipgerðir (n=14). Fyrir utan CAKUT og tubulopathies sem sýndu jafna dreifingu milli kvenna og karla, í öllum hinum flokkunum, var algengi karlkyns einstaklinga (mynd 2a). Þegar litið var á aldur nýliðunar kom ekki fram marktækt mismunandi dreifing meðal hinna ólíku hópa, en meðalaldur var á bilinu 6,7 til 10 ára í „Aðrir sjúkdómar“ og gauklakvilla, í sömu röð. Hins vegar, þegar miðgildi aldurs var skoðað, sýndu CAKUT-sjúkdómar lægsta gildið (4,6 ára), í samræmi við meðfædda svipgerð. Frá sjónarhóli þjóðernis, óháð sjúkdómsfjöldaflokknum sem tekinn var til greina, voru flestir sjúklingar evrópskir, þar á eftir afrískir, þar sem aðeins fáir sjúklingar voru asískir, rómönsk-amerískir eða kynblandaðir (mynd 2b). Af hópnum áttu aðeins 8 sjúklingar samkynhneigða foreldra.

Mynd 1 Erfðafræðileg gagnagreiningarleiðsla og viðmið fyrir skráningu afbrigða. Skýringarmynd greiningarleiðslunnar sem notuð var til að auðkenna afbrigði og forgangsraða, þar á meðal öll inn- og útsíunsviðmiðin. Afbrigðin sem urðu til voru tekin með í loka erfðafræðilegu skýrslunni. Þar sem það var hægt, voru gerðar rannsóknir á afbrigðaprófun og fjölskylduaðskilnaði. Erfðafræðilegar skýrslur voru flokkaðar sem óyggjandi, óvissar eða ófullnægjandi miðað við tilgreind viðmið. Út frá þessari flokkun var greiningarhlutfall næstu kynslóðar raðgreiningar (NGS) vinnuflæðis okkar reiknað út. 1 KG: 1000 erfðamengi gagnagrunnur; Alt fr: breytt tíðni; C3: afbrigði af óþekktri þýðingu; C4: líklega sjúkdómsvaldandi afbrigði; C5: sjúkdómsvaldandi afbrigði; AR: autosomal víkjandi

Að lokum, þegar tekið er tillit til fjölskyldusögu um nýrnasjúkdóma, þar sem karlkyns og kvenkyns einstaklingar eru tekin sérstaklega til greina, var misleitni í dreifingu milli jákvæðra og neikvæðra tilfella augljós með tilliti til mismunandi sjúkdómsflokka. Á heildina litið einkenndist flestir af hópnum sem ráðinn var og óháð kyni ekki af jákvæðri fjölskyldusögu, eins og sýnt er fyrir CAKUT, gauklakvilla, tauopathy og aðra nýrnasjúkdóma. Hins vegar, í ciliopathies og nefrolithiasis, verulegur hluti tilfella kom fram hjá jákvæðri fjölskyldu hans sögu með mismunandi dreifingu milli kvenna og karla (13 tilfelli af 22 fyrir ciliopathies, og 5 af 12 fyrir nýrnabólgu; mynd 2c).

Frá klínísku sjónarhorni var hópurinn nokkuð ólíkur með mismunandi frumsjúkdóma (mynd 2d). Meðal þeirra voru klínískar grunsemdir sem voru endurteknar fjölblöðru nýrnasjúkdómur (n=27), CAKUT (n=25), nýrnaheilkenni (n=19), focal segmental glomerulosclerosis (FSGS; n) =14) og Alport heilkenni (n=13; mynd 2d).

Stuðningsþjónusta Wecistanche - Stærsti útflytjandi cistanche í Kína:

Netfang:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Sími:+86 15292862950

Verslaðu fyrir frekari upplýsingar:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

SMELLTU HÉR TIL AÐ FÁ NÁTTÚRLEGT LÍFFRÆNT CISTANCHE ÚTDRÆT MEÐ 25% ECHINACOSIÐ OG 9% ACTEOSÍÐ VEGNA NÝRASÝKINGAR