ÁgripÞrátt fyrir að öldrun sé stærsti áhættuþátturinn fyrir langvinna sjúkdóma (krabbamein, sykursýki, hjarta- og æðasjúkdóma og taugahrörnunarsjúkdóma), eru fáar inngrip þekktar fyrir utan kaloríutakmarkanir og lítið magn lyfja (með verulegum aukaverkunum) sem beinlínis taka á öldrun. Því er brýn þörf á nýjum valkostum sem almennt geta tafið öldrun og komið í veg fyrir aldurstengda sjúkdóma. Frumuöldrun er undirstaða öldrunarferla. Tímabundinn líftími (CLS) ger Saccharomyces cerevisiae er rótgróið fyrirmyndarkerfi til að rannsaka inngrip í frumuöldrun eftir mítósu. CLS er skilgreint sem fjöldi daga sem frumur eru lífvænlegar í kyrrstöðu. Við þróuðum nýja, ódýra og hraðvirka megindlega aðferð til að mæla CLS í frumuræktum sem ræktaðar eru ásamt ýmsum efnafræðilegum efnum og stýriefnum á 96-brunnsplötum. PICLS samskiptareglur okkar með (1) notkun própídínjoðíðs fyrir flúrljómandi frumulifunarlestur í örplötulesara og (2) heildarfrumufjöldamælingu með OD600nm frásog frá sömu plötu veitir raunverulega háafkastagetu. Það fer eftir flutningum, hægt er að vinna mikinn fjölda platna samhliða þannig að skimun þúsunda efnasambanda verður framkvæmanleg á stuttum tíma. Aðferðin var staðfest með því að mæla áhrif rapamýsíns og kaloríutakmarkana á ger CLS. Við notuðum þessa aðferð við skimun efnafræðilegra efna. Við uppgötvuðum öldrunar-/taugavörnarmöguleika 2,5-anhýdró-D-mannitóls (2,5-AM) og mælum með notkun þess fyrir sig eða í samsettri meðferð með öðrum inngripum gegn öldrun.

Glýkósíð af cistanche getur einnig aukið virkni SOD í hjarta- og lifrarvef og dregið verulega úr innihaldi lipofuscins og MDA í hverjum vef, hreinsar í raun ýmsar hvarfgjarnar súrefnisradicals (OH-, H₂O₂, osfrv.) og verndar gegn DNA skemmdum af völdum af OH-róttækum. Cistanche phenylethanoid glýkósíð hafa sterka hreinsunargetu sindurefna, meiri afoxunargetu en C-vítamín, bæta virkni SOD í sæðisviflausn, draga úr innihaldi MDA og hafa ákveðin verndandi áhrif á virkni sæðishimnu. Cistanche fjölsykrur geta aukið virkni SOD og GSH-Px í rauðkornum og lungnavef í tilraunamúsum af völdum D-galaktósa, auk þess að draga úr innihaldi MDA og kollagens í lungum og plasma og auka innihald elastíns, hafa góð hreinsunaráhrif á DPPH, lengja tíma súrefnisskorts í öldruðum músum, bæta virkni SOD í sermi og seinka lífeðlisfræðilegri hrörnun lungna í öldruðum tilraunamúsum. Með frumuformfræðilegri hrörnun hafa tilraunir sýnt að Cistanche hefur góða andoxunargetu og hefur tilhneigingu til að vera lyf til að koma í veg fyrir og meðhöndla öldrunarsjúkdóma í húð. Á sama tíma hefur echinacoside í Cistanche umtalsverða getu til að hreinsa DPPH sindurefni og hefur getu til að hreinsa hvarfgjarnar súrefnistegundir og koma í veg fyrir niðurbrot kollagen af ​​völdum sindurefna og hefur einnig góð viðgerðaráhrif á anjónskemmdir af týmín sindurefnum.

Smelltu til að skoða vörur gegn öldrun

【Frekari upplýsingar: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

LeitarorðSaccharomyces cerevisiae · Tímafræðilegur líftími · Efnaskimun · Efnasamband gegn öldrun · 2,5-anhýdró-D-mannitól

Kynning

The growing fraction of the elderly (>65 ár) meðal alls íbúa (frá ~ 10 prósentum á heimsvísu (yfir 20 prósent í fyrsta heims löndum) árið 2020 til framreiknaðra 16 prósenta árið 2050), sem og vaxandi lífslíkur þeirra (um ~ 10 ár síðan 1960 í fyrsta heims löndum ), stendur heiminn frammi fyrir sífellt erfiðari vandamálum [1, 2]. Auk þess að draga almennt úr lífsvirkni er öldrun enn stærsti áhættuþátturinn fyrir þróun langvinnra sjúkdóma sem í kjölfarið skerða sjálfstætt mannslíf og leiða að lokum til dauða [3–7]. Núverandi læknisfræðilegar aðferðir til að koma í veg fyrir aldurstengda meinafræði eru ráðleggingar um heilbrigðan lífsstíl, þar á meðal hreyfingu og mataræði. Þessi inngrip ein og sér duga þó ekki til að koma í veg fyrir upphaf aldurstengdra sjúkdóma.

Öldrun einkennist af stigvaxandi tapi á lífeðlisfræðilegum heilindum, skilvirkni í frumustarfsemi og efnaskiptaboðum [8]. Aukinni viðleitni er beint til að skilja frumuöldrunarferla sem hafa áhrif á mjög samtengda og virknilega óþarfa gen- og próteinsamskiptanet [8, 9]. Þrátt fyrir flókna öldrun hafa nýlegar rannsóknir á mismunandi líkanakerfum, þar á meðal spendýrum, sýnt fram á að seinkun á öldrun og aukið heilsufarstímabil eru möguleg með inngripum gegn öldrun eins og lyfjagjöf rapamýsíns og takmörkun á kaloríu (glúkósa) [10-15]. Þess vegna er útvíkkun á efnisskrá efnasambanda gegn öldrun sem hægt er að nota sem lækningalyf til að vernda öldrun og draga úr óæskilegum aukaverkunum þeirra ein af efnilegu aðferðunum sem geta seinkað öldrun og lengt heilsufar.

Nýlegar rannsóknir hafa sýnt að sameindakerfi sem sést við öldrun manna varðveitist í mismunandi lífverum, þar á meðal einfrumu ger [8, 10, 16, 17]. Verðandi ger Saccharomyces cerevisiae er ein mest rannsakaða líkan lífvera til að afhjúpa líffræðilega ferla sem taka þátt í öldrun frumna. Ávinningurinn af því að rannsaka öldrun í geri felur í sér stuttan kynslóðartíma, viðráðanlegan líftíma og hæfni þess fyrir mælingar með miklum afköstum. Þess vegna varð þessi lífvera öflugt tæki til að bera kennsl á inngrip gegn öldrun. Ger er almennt notað til að rannsaka öldrun á tvo mismunandi vegu: endurtekinn líftíma (RLS) og tímaröð líftíma (CLS) [18]. RLS mælir fjölda skipta sem einstök fruma skiptir sér, öldrunarlíkan fyrir mítósufrumur eins og stofnfrumur. CLS mælir þann tíma sem fruma sem ekki skiptir sig er lífvænleg í kyrrstöðu, öldrunarlíkan fyrir frumur eftir mítósu eins og taugafrumur. Lífvænleiki öldrunar gerfrumna við kyrrstæða fasa sem skortir næringarefni minnkar og þær deyja að lokum.

CLS hefur venjulega verið mæld með því að meta fjölda nýlendumyndandi eininga (CFUs) á agarplötunni [18]. Gerfrumur í flösku með heildarfjölda (meira en eða jafnt og 20 ml) verða fyrir einu efnasambandi. Á mismunandi tímapunktum (td eftir 2, 5 og 8 daga) eru litlir skammtar af öldrunarræktinni í tímaröðinni þynnt í röð, sett á næringarefnaagarplötur og ræktaðar í 2-3 daga til að mynda nýlendu og telja. Lifunarhlutfallið ákvarðar út frá CFU fyrir hvern tímaröð aldurspunkta miðað við dag 1 (talin 100 prósent frumulifun). CFU nálgunin er megindleg en tengd mörgum ókostum. Það krefst margra raðþynningar, málunarþrepa og ræktunartímabila til að koma fram í nýlendunum. Nýlendutalning fer fram annað hvort með handvirkum eða dýrum tækjum. Þar að auki er þessi aðferð óhentug og allt of dýr fyrir skimun með miklum afköstum (HTS) á þúsundum efnasambanda vegna þess að hún krefst umtalsverðs magns af þeim lyfjum sem prófuð eru, ræktun í stórum flöskum og margar agarplötur. Því miður eru CFU aðferðin og öll nýleg afbrigði til að mæla CLS mjög háð getu post-mitotic frumna til að fara aftur inn í mítósu fasa. Í grundvallaratriðum getur þessi aðferðafræði ekki greint ger í mítósustoppi frá dauðum frumum.

Núverandi tækniframfarir í CFU-afleiddum aðferðum mæla lifun og vöxt frumna á grundvelli vaxtar af lyfjaútsettu kyrrstöðufasa ger í næringarríkri rækt annaðhvort í fljótandi miðli eða með blettaprófi á agarplötu [17, 19-21] . Eftir 24 klst. er útvöxtur aldraðra frumna í fljótandi miðli mældur með gleypni við OD600nm, en í blettaprófi er útvöxtur aldraðrar ræktunar á agarmiðli auðkenndur eftir 48 klst. Skipulagsbreytingin felur í sér notkun á 96-brunnsplötum sem leyfa takmarkaða skimun á efnafræðilegum eða erfðafræðilegum eyðingarstofnum. Fyrir sameinaða merkta gereyðingarstofna þarf flæðisgreiningu til að mæla lífvænleika einstakra stofna [22].

Própidíumjoðíð (PI) er flúrljómandi litarefni sem fer aðeins inn í dauða frumurnar og er því öflugt merki fyrir beina magngreiningu á lífvænleika frumna [23-25]. Áður notuðu rannsóknir PI-byggða nálgun til að mæla CLS og mæla lífvænleika frumna með því að greina myndirnar sem fengnar eru með flúrljómandi frumuteljara, UV transilluminator eða flæðifrumumælingu [26, 27]. Hins vegar eru margþættar sýnisúrvinnslu-, myndgreiningar- og hugbúnaðarkröfur fyrir gagnagreiningu dýrar og tímafrekar, sem hindraði þessar aðferðir í raunverulegum afköstum. Kynning á öðrum litarefnum eins og SYTOX grænum hefur takmarkað gildi í mikilli afköstum vegna ofboðslegs kostnaðar [26].

Þess vegna er þörf á nýjum aðferðum til að mæla lífvænleika aldraðra frumunnar til að forðast takmarkanir sem tengjast núverandi aðferðafræði. Í þessari vinnu lýsum við PICLS, CLS mæliaðferð sem byggir á PI sem er óháð útvexti. Nýja nálgunin okkar byggir á því að rækta gerfrumur með ýmsum prófunarefnasamböndum eða mismunandi prófunarefnisskilyrðum í 96-brunnsplötum. Við notum PI til að mæla lifun frumna. Hratt og skilvirkt útlestur (innan ~15 mín) er veitt af örplötulesara, ódýru tæki sem er aðgengilegt á flestum rannsóknarstofum. Þessi ódýra aðferðafræði hentar vel fyrir stórfellda skimun á efnafræðilegum efnum til að bera kennsl á öldrun efnasambönd þar sem hægt er að setja mörg mismunandi efnasambönd, stýringar eða þynningar á þægilegan hátt á einni plötu og hægt er að vinna mikinn fjölda platna samhliða. Ennfremur staðfestum við aðferð okkar með því að ákvarða framlengingu CLS gers með því að nota þekktar inngrip gegn öldrun eins og rapamýsíngjöf og kaloríutakmörkun. Stutt skjámynd af tiltækum efnum á rannsóknarstofu okkar leiddi óvænt í ljós 2,5-anhýdró-D-mannitól (2,5-AM) sem lengir endingartíma ger. Við staðfestum einnig öldrunarvirkni 2,5-AM með hefðbundnum útvaxtaraðferðum. Aðrar prófaðar sykurhliðstæður skiluðu ekki svipuðum áhrifum.

Niðurstöður

Þróun aðferðar til magngreiningar á lífvænleika frumna með því að nota própidíumjoðíð flúrljómunarmælingu í örplötulesaranum

Nýja samskiptareglan okkar byrjar á því að afhjúpa villigerð gerfrumur eða stökkbrigði þeirra sem eru settar í næringarríka miðla í 96-brunnsplötum ásamt sérstökum styrk efnasambanda sem vekja áhuga. Við notum PI sem merki fyrir frumudauða þar sem þetta flúrljómandi litarefni fer aðeins inn í frumur sem ekki lifa [23-25]. Lífvænleiki frumunnar í kyrrstöðu-fasaræktinni er magnmældur eftir tiltekinn fjölda daga með því að lesa PI-flúrljómun í örplötulesaranum sem aftur gefur rafrænt læsilegt töflureikni fyrir gagnagreiningu.

Sem fyrsta sannprófun sýnum við að vinna með lítið magn í örplötuholum skilar niðurstöðum sem eru svipaðar og kúvettu byggðar á aðferðum og að örplötulesarinn er nægilega næmur til að fanga gögn um lifun frumna. Þannig greindum við PI litun gerfrumna. Gerfrumur voru ræktaðar í glerflöskunni og þær soðnar í 15 mínútur við 100 gráðu. Lifandi og dauðar frumur voru þvegnar og ræktaðar í 1×PBS (fosfat-bufferða saltvatni) án og með PI (5 µg/ml) í 15 mínútur. Eftir ræktun voru frumur þvegnar og endursviflausnar í PBS. Frumur voru sýndar með smásjá og styrkleiki flúrljómunar var mældur með örplötulesaranum (viðbótarmynd S1). Eftir staðfestingu á því að PI sé heppilegt merki fyrir frumudauða var síðari greining gerð til að þróa aðferðina. PI-litaðar dauðar frumur voru endursviflausnar í PBS í loka 48 OD600nm mældar í kúvettunni með litrófsmæli. Næst voru frumur raðþynntar í PBS (OD600nm 48 til 0,05) og fluttar yfir á svarta 96-brunnsplötu (costar 3603). Til að hafa í huga, eru svartar örplötur fjórum sinnum dýrari en glærar plötur og minna aðgengilegar, en við notuðum þær þar sem þær henta betur fyrir flúrljómun vegna dempandi sjálfflúrljómunar sem kemur frá sýnunum og yfirborði örplötunnar. Með GelDoc myndgreiningarkerfi (mynd 1A) sýndum við hversu mikið PI litun var innlimuð í dauða gerfrumurnar við ýmsar þynningar. Með því að nota sömu plötuna mældum við PI flúrljómunarstyrkinn með örplötulesara við örvun 535 nm og losun 617 nm bylgjulengdir. Við fundum mikla línulega fylgni milli PI flúrljómunarstyrks og frumugleypni við OD600nm (mynd 1B). Þessi niðurstaða gefur til kynna að afbrigði okkar af PI flúrljómunaraðferðinni sé árangursríkt til að mæla lífvænleika frumna.

As a next step, we determined the optimal range of cell density (quantified by OD600nm) so that cell density could be directly measured in 96-well   plates instead of in cuvettes. Using the black microplates with dead yeast cells from the previous experiment, we determined the correlation of  OD600nm measurements taken from the cuvettes and from the microplate directly. We found a high linear correlation between the two series of measurements in the OD600nm range of 0.05 to 12 of the cuvette (Fig.  1C). However, the trend is no longer maintained for higher OD600nm values>12 af kúvettunni (mynd 1D). Næst ákváðum við tengslin milli PI-flúrljómunarstyrks og frumu OD600nm á 96-brunnplötunni innan ákjósanlegasta OD600nm bilsins 0,05–12. Við sjáum næstum fullkomna línulega fylgni (mynd 1E). Þannig táknar siðareglur okkar öfluga aðferð til að mæla lífvænleika frumna.

Áhrif örplötugerða á magngreiningu á lífvænleika frumna með því að nota própídíumjoðíð flúrljómunarmælingu í örplötulesaranum

Áhrif rapamýsíns á líftíma gersins í tímaröð

Rapamýsín er ein af vel þekktu inngripunum gegn öldrun sem sýnt hefur verið fram á að lengja líftíma nokkurra líkanlífvera, þar á meðal ger, þráðorma, ávaxtaflugur og músa [10, 14, 15, 28-30]. Það hamlar næringarefnisskynjandi fléttunni TORC1 (markmið rapamýsínfléttunnar 1). TORC1 er varðveitt fjöleininga próteinkomplex í heilkjörnungafrumum sem tengir næringarefni í umhverfinu við frumuvöxt og fjölgun [19, 29, 31-34].

Við höfum kannað áhrif rapamýsíns á tímaröð (CLS) gerstofnsins til að staðfesta nýlega þróaða siðareglur okkar. Hér og hér að neðan notuðum við frumgerjastofninn (CEN.PK113- 7D) í tilraunum okkar til að forðast sterk áhrif amínósýruauka á lifun frumna í kyrrstöðuræktun [35, 36]. Frumur voru eldri með mismunandi styrk rapamýsíns í tilbúnu skilgreindu (SD) miðli. Frumuvöxtur var mældur á mismunandi tímapunktum (24 klst., 48 klst. og 72 klst.). Við komumst að því að frumuvöxtur náði mettun um það bil 24 klst. eftir ræktun með 5 nM eða minna rapamýsíni (mynd 4A). Hins vegar hægði gjöf 10 nM rapamýsíns á frumuvexti og mettun náðist aðeins eftir 48 klst (mynd 4A). Áður kom fram svipuð þróun fyrir frumur sem vaxa með rapamýsíni í CLS tilraun [37].

Sem næsta skref var CLS frumna sem ræktaðar voru í mismunandi styrk rapamýsíns mæld. Við ákváðum frumulifun með því að nota PI flúrljómun á mismunandi tímaröð aldurstíma. Vaxtartíminn 72 klst. var talinn vera dagur 1. Við getum ályktað af lifunargrafinu að mismunandi styrkur rapamýsíns viðbótar framlengir CLS gersins (mynd 4B). Lifun aldraðra frumna með rapamýsíni (5 nM og 10 nM) á degi 4 var ~75 prósent; hins vegar án rapamýsíns var ~50 prósent. Á 7. degi var lifun aldraðra frumna með rapamýsínbættu 70 prósent; þó, án rapamýsíns var minnkað í minna en 20 prósent. CLS framlenging aldraðra frumna má einnig sjá við lægri styrk (0,62-2,5 nM) af rapamýsíni (mynd 4B).

Við höfum staðfest samskiptareglur okkar með því að bera hana beint saman við tvær hefðbundnar útvaxtaraðferðir sem mæla CLS gersins. Í fyrsta lagi gerðum við útvaxtargreininguna í fljótandi miðli til að mæla áhrif rapamýsíns á líftíma. Fylgst var með lifunartíma öldrunarfrumna á mismunandi aldursstigum með því að flytja 3-µl ræktun yfir í 200μL af YPD miðli í ferskum 96-brunnsplötu. Útvöxtur samsvarar fjölda lífvænlegra frumna í sáðefninu (mynd 4C). Útvöxtur aldraðra frumna, skráður með OD600nm gleypni, var ákvarðaður með því að nota örplötulesara. Lifunarhlutfallið var reiknað út frá útvexti OD600nm gleypni fyrir hvern aldurspunkt miðað við dag 1 (talin 100 prósent frumulifun). Lifunargrafið er sýnt á mynd 4D.

Sömuleiðis framkvæmdum við útvöxtinn með blettagreiningu á agarmiðlinum. Við sáum 3-µl öldrunarrækt á YPD agarplötunni og ræktuðum hana í 48 klst. Útvöxtur aldraðra frumna á YPD agarplötunni var sýndur með GelDoc myndgreiningarkerfinu (mynd 4E). Eins og við var að búast getum við fylgst með þróun líftímalengingar með rapamýsíni undir bæði YPD vökva- og agarútvaxtarmælingum sem eru samhliða þeim sem ákvarðaðar eru með nýju samskiptareglunum okkar.

Þessar niðurstöður sýna að HTS samskiptareglur okkar endurskapa að rapamýsín lengir líftíma frumunnar. Ennfremur metum við Z-þáttinn til að meta gæði þessarar aðferðar [38]. Almennt eru Z-stuðlar á bilinu 0.5–1.0 vísbending um framúrskarandi HTS próf. Z-stuðullinn var ákvarðaður fyrir mismunandi styrk rapamýsíns með PI flúrljómun aldraðra frumna (viðbótarmynd S2). Fjármögnun okkar, Z-stuðull {{10}},70 fyrir 5 nM rapamýsín og 0,74 fyrir 10 nM rapamýsín setur þessa HTS aðferð í hágæðaflokkinn. Þannig er samskiptareglan okkar nógu öflug til að bera kennsl á hugsanleg öldrunarefnasambönd.

Til að kanna hvort aðferðin sé áhrifarík í öðrum erfðafræðilegum bakgrunni ger, prófuðum við áhrif rapamýsíns á CLS BY4743 stofnsins. Saccharomyces cerevisiae BY4743 stofninn er auxotrophic fyrir histidín, leucine og uracil. BY4743 stofninn var ræktaður í mismunandi styrkleika rapamýsíns í SD miðli sem bætt var við sjálfvirkum innihaldsefnum. Lifun aldraðra frumna var magngreind með því að nota PI flúrljómun (aukamynd. S3). Við komumst að því að rapamýsín jók lífvænleika BY4743 frumna magnbundið á svipaðan hátt og CEN.PK113-7D. Þannig sýna þessar niðurstöður að aðferðin okkar er áhrifarík í mismunandi gerstofnum.

Áhrif glúkósa á tímaröð líftíma gersins

Við staðfestum einnig aðferð okkar með því að skoða áhrif kaloríutakmarkana á tímaröð líftíma gersins. Kaloríutakmörkun er ein af þekktum inngripum til að seinka öldrun og lengja líftíma líkansins, þar með talið ger- og spendýrafrumur [11, 13, 16]. Til að ákvarða áhrif hitaeiningatakmarkana á CLS gersins minnkum við glúkósainnihaldið í ræktunarmiðlinum. Við ræktuðum frumuna við þrjár mismunandi SD miðilsaðstæður sem innihéldu 0,25 prósent, 0,5 prósent og 2 prósent glúkósa. Við mældum frumuvöxt á mismunandi tímapunktum (24 klst, 48 klst og 72 klst). Allar ræktanir náðu vaxtarmettun eftir 24 klst (mynd 5A). Frumuvöxtur var minni við 0,25 prósent og 0,5 prósent samanborið við 2 prósent glúkósa (mynd 5A). Við mældum lifun öldrunar í tímaröð fyrir frumur ræktaðar undir mismunandi styrk glúkósa með því að nota PI flúrljómunaraðferðina (mynd 5B). Við ályktum af lifunargrafinu að glúkósatakmörkun framlengi CLS gersins. Við staðfestum einnig samhliða framlengingu CLS með útvaxtarmælingum (mynd 5C, D og E), sem staðfestum enn frekar nýja aðferð okkar til að ákvarða CLS gersins. Áhrif glúkósatakmarkana á CLS framlengingu BY4743 stofnsins voru einnig sýnd með PICLS aðferðinni (viðbótarmynd S3). Þannig er nálgun okkar til að mæla CLS gersins ný, fljótleg og ódýr aðferð til að skima efnafræðileg efni og ræktunaraðstæður til að bera kennsl á öldrunaraðgerðirnar.

Skimun efnafræðilegra efna með nýþróaðri aðferð leiddi í ljós að 2,5-vatnsfrítt-D-mannitól væri nýtt öldrunarefni.

Eftir að hafa þróað og staðfest nýju samskiptareglurnar notuðum við þessa aðferð til að skima hundruð efnafræðilegra efna til að bera kennsl á öldrunarefnasambönd (viðbótarmynd S4 og viðbótartafla 1). Sem ein af þeim niðurstöðum sem komu á óvart fundum við vísbendingar um að efnasambandið 2,5-anhýdró-D-mannitóli (2,5-AM) gæti framlengt CLS gersins. Á mynd 6 kynnum við niðurstöður nákvæmra eftirfylgnitilrauna fyrir þetta efnasamband. Við prófuðum öldrunarvirkni 2,5-AM við mismunandi styrk á 96-brunnsplötunni. Í fyrsta lagi ákváðum við áhrif 2,5-AM á frumuvöxt. Gerfrumur voru ræktaðar með mismunandi styrkleika 2,5-AM í SD miðlinum. Frumuvöxtur var mældur á mismunandi tímapunktum (24 klst., 48 klst. og 72 klst.). Við komumst að því að frumuvöxtur náði sama mettunarstigi eftir 24 klst fyrir alla prófaða styrkleika 2,5-AM (mynd 6A). Síðan mældum við lifun tímarnfræðilega aldraðra frumna með mismunandi styrkleika 2,5-AM með PI flúrljómunaraðferðinni. Eins og áður var 72 klst vaxtarræktin talin dagur 1 fyrir CLS greiningu. Lifunargrafið er teiknað fyrir mismunandi tímaröð aldurstíma (mynd 6B). Við komumst að því að 2,5-AM framlengir CLS á einbeitingarháðan hátt. Lifun aldraðra frumna með 2,5-AM (8 mM) á degi 4 var ~ 80 prósent; hins vegar, án 2,5- AM var ~ 50 prósent . Á 7. degi var lifun aldraðra frumna með 2,5-AM viðbót ~ 75 prósent; þó, án 2,5-AM var minnkað niður í minna en 20 prósent. Öldrunarvirkni 2,5-AM var einnig staðfest með útvaxtargreiningum (mynd 6C, D og E).

2,5-AM er sykursameind sem getur farið inn í glýkólýsuleiðina. Það verður aðeins vatnsrofið í andstreymis glýkólýsandi þrepum sem valda uppsöfnun á óumbrotnu 2,5-AM-1,6-bisfosfati (2,5-AMBP) í frumunum [39–41 ]. Til að prófa hvort 2,5-AM í sambærilegum styrk og CLS tilraunin hafi verið unnið með glýkólýsuensímum, skoðuðum við vaxandi næmni SNF1 genaeyðingarstofnsins. SNF1 er frumuorkuskynjari og mjög varðveittur AMP-virkjaður próteinkínasa (AMPK) í heilkjörnungum [42, 43]. Gerfrumur sem skortir AMPK virkni eru tengdar ofnæmri vaxtarsvipgerð í viðurvist óumbrotna glýkólýsandi milliefni [44]. Við mældum vöxt snf1Δ eyðingarstofnsins með mismunandi styrkleika 2,5-AM. Við komumst að því að 2,5-AM hamlar vexti snf1Δ eyðingarstofnsins samanborið við villigerðastofninn (viðbótarmynd S5). Þessi vaxtarsvipgerð gefur til kynna að 2,5-AM gangist undir glýkólýsu og verður vatnsrofið í óumbrotnar glýkólýsandi milliefni.

2,5-AM er hliðstæða sykurhlutans frúktósa [39]. Til að skýra hvort önnur sykur hafi einnig áhrif á CLS, skoðuðum við áhrif frúktósa, mannitóls og maltósa á öldrun ger. Við tókum einnig inn sorbitól sem er óumbrotinn sykur sem greint er frá að eykur CLS gerfrumna með því að auka osmólarstyrk ræktunarmiðilsins [20, 45]. Í fyrsta lagi prófuðum við áhrif frúktósa, mannitóls, maltósa og sorbitóls á frumuvöxt. Gerfrumur voru ræktaðar með ýmsum styrkjum frúktósa, mannitóls, maltósa og sorbitóls svipað og 2,5-AM í SD miðlinum. Eins og 2, 5-AM, frúktósa, mannitól, maltósa og sorbitól ræktaðar frumur náðu vaxtarmettun eftir 24 klst. (Mynd 7A). Næst mældum við lifun frumna sem aldna í tímaröð á degi 1, degi 7, degi 14 og degi 21. Ólíkt 2, 5-AM, frúktósa, mannitól, maltósa og sorbitól viðbót lengdi ekki líftíma ger (mynd 7B, C, D, E og aukamynd S6). Merkilegt nokk, 2,5-AM lengir líftímann jafnvel á seint stigi öldrunar í tímaröð. Aldraðar frumur sem bættar eru við 2,5-AM (8 mM) lifa af (~65 prósent) á degi 21. Hins vegar var lifun aldraðra frumna án 2,5-AM viðbót innan við 10 prósent.

Okkur til mikillar undrunar komumst við að því að sorbitól í lágum styrk sem prófað var getur ekki aukið CLS (mynd 7B, C, D, E og viðbótarmynd S6). Við gerðum tilgátu um að hærri sorbitólþéttni gæti þurft til að auka CLS. Við prófuðum úrval af hærri styrkjum, þar á meðal 1 M sorbitóli, styrkurinn sem áður hefur verið tilkynntur að hafi áhrif á CLS (18 prósent jafngildir 1 M) [20, 45]. Í samræmi við fyrri skýrslur, komumst við einnig að því að mjög hár styrkur sorbitóls (á milli 0,5 og 1 M) eykur CLS gers (viðbótarmynd S7), að því er virðist með því að auka osmolarity miðilsins. Athyglisvert er að CLS-aukningin um 2,5-AM við mjög lágan styrk (2 mM) bendir til þess að virkni þess gegn öldrun sé aðgreindur frá osmótísku. Þessar niðurstöður benda til þess að öldrunarvirkni 2,5-AM sé sértæk fyrir þetta sykurefnasamband og sést ekki fyrir nokkur önnur efni með svipað uppbygging.

【Frekari upplýsingar: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】