Áhrif nefrótoxíns ogratoxíns A á nýrnafrumur manna sem rannsakaðar eru með nýrri samræktunarlíkani eru undir áhrifum af nærveru trefjafrumna
Mar 01, 2022
Ágrip:Thenýruer ógnað af mörgum hugsanlegum eitruðum efnum. Til að rannsaka áhrif nefrótoxínsins ochratoxíns A (OTA) komum við á fót frumusamræktunarlíkan sem samanstendur af mönnumnýru proximal tubule frumur og fibroblasts. Við rannsökuðum áhrif OTA á lifun frumna, tjáningu gena og/eða próteina sem tengjast frumudauða, utanfrumufylki og orkujafnvægi. Drep af völdum OTA var aukið í báðum frumugerðum í nærveru viðkomandi frumutegundar, en OTA framkallað frumudauði var óháð því. Í trefjakímfrumum, en ekki í píplufrumum, voru samræktunaráhrif sýnileg varðandi tjáningu á frumuhringstengda próteininu p21. Tjáning þekjuvefs-til mesenchymal umbreytingar-vísandi próteins vimentíns var óháð ræktunarástandinu. Tjáning á OTA-örvuðu lncRNA WISP1-AS1 var aukin í samræktun. OTA útsetning leiddi til breytinga á tjáningu gena sem tengjast orkuumbrotum með glúkósavirkjandi áhrifum og minni tjáningu hvatberapróteina. Saman sýnum við fram á að viðbrögð frumna geta verið mismunandi í nærveru frumna sem eru náttúrulega nálægt, þannig að hægt er að tala um frumu. Til þess að leggja mat á eituráhrif efnis væri því kostur að íhuga notkun samrækta í stað einræktunar.
Leitarorð:okratoxín A; frumurækt; orkuefnaskipti; apoptosis-drep jafnvægi; hvatberar; nýru; nýru
CISTANCHE mun bæta nýrna-/nýrnabilun
Kynning
Vegna útskilnaðarvirkni þess ernýruer ógnað af ýmsum skaðlegum efnum eins og lyfjum eða matvælum, eins og sveppaeitur sem leiða til bráða eða – jafnvel verra – langvinnranýrnasjúkdómameð algengi um 10 prósent [1,2]. Til að skilja verkun nýrnaeitrunar er gagnlegt að finna aðferðir til að draga úr þessum skaðlegu atburðarásum og margar rannsóknir hafa verið gerðar til að leysa spurninguna um hvers vegna og hvernignýrueru í útrýmingarhættu [3–5]. Til að rannsaka áhrif efnis á lífveru er oft erfitt að nota heil dýr vegna siðferðislegra áhyggjuefna og skipulagslegra, kostnaðarsamra og vandaðra forsenda. Ennfremur tengist yfirfærsla þekkingar til mannlegra aðstæðna óvissuþáttum. Því hafa frumuræktunarlíkön verið komið á fót og eru notuð víða og hafa þau þann kost að hægt er að rannsaka ákveðna frumugerð og svörun hennar við efni eða meðferð við stýrðar aðstæður. Þrátt fyrir að margar og mikilvægar niðurstöður hafi verið gerðar með því að nota þessa nálgun, eru sumir ókostir meðfæddir: frumur í frumulínu hafa oft verið ódauðlegar með stökkbreytingum eða öðrum - stundum róttækum - aðferðum [6]. Þetta gerir auðvelda meðhöndlun og langa notkun en með þeirri hættu sem stafar af tilteknu líkanakerfi er ekki víst að hægt sé að yfirfæra það á aðstæður í öllu líffærinu eða lífverunni. Til að vinna bug á þessum ókosti er hægt að nota frumfrumur í stað ódauðlegra frumulína, en myndun frumfrumna er oft mjög erfið og krefst háþróaðrar tæknikunnáttu. Að auki lifa frumfrumur oft ekki af í langan tíma og þurfa sérstakar ræktunaraðstæður. En frumfrumur eru skrefi nær náttúrulegum aðstæðum og að minnsta kosti stundum kom í ljós að þær eru næmari fyrir td eitruðum áreiti eins og frumulínur eru [7], sem þýðir að frumulínur gætu verið sterkari. Annar ókostur er sú staðreynd að frumur eru oft hafðar í einræktun, þ.e. án áhrifa annarra frumutegunda, sem í heimalíffæri þeirra eru venjulega nálægt. Þess vegna gæti það verið skref í átt að raunhæfari aðstæðum að rannsaka svörun frumutegundar við efni eða meðferð í nærveru þeirra frumna, sem eru í innfæddu líffæri í nálægð.
Ínýru, nærliggjandi píplufrumur eru umkringdar fifibroblasts og má gera ráð fyrir – líklega gagnkvæmum – áhrifum. Þetta er líka raunin ínýrnaskemmdiraðstæður sem í flestum tilfellum leiða til píplu-millivefsbólgu og bandvefsbólgu [8,9], og eru afgerandi fyrir hnignun ánýruvirka. Vegna flutnings og ensímgetu þeirra,nýruAðlægar píplufrumur eru í hættu vegna ýmissa hugsanlegra eiturefna eins og td lyfja eða leifar þeirra eða sveppaeitur. Eitt hlutverk nærliggjandi vefjafrumna er að útvega utanfrumu fylkið með losun kollagena og annarra fylkisþátta og þar af leiðandi að taka þátt í heilleika vefsins [10]. En þær eru líka - ásamt þekjufrumum - þátt í bólguferlum eða í trefjamyndunnýrnasjúkdóma[11] með hættu á að þróastnýrnabilun.
Mikið rannsakað sveppaeitur sem hefur þýðingu fyrir heilsu manna er ochratoxín A (OTA) [12,13]. Það er að finna í ýmsum matvælum [12,14] og til að forðast útsetningu þess og upptöku er nánast ómögulegt [9,15]. Þetta leiðir til athugunar að OTA greinist oft í blóði manna í lágum nanómólstyrk [16]. Hjá dýrum sem verða fyrir áhrifum leiðir OTA tilnýrnabilunog fifibrotískar breytingar [17,18]. Gert er ráð fyrir að útsetning fyrir OTA tengist mönnumnýrnasjúkdóma[19]. Í frumum frumpíplum í mönnum hefur verið sýnt fram á eituráhrif OTA, sem einnig er hægt að sjá í frumfíbróblastum úr mönnum, þó að það sé ekki eins áberandi og í nærpíplum [7]. Aðgerðirnar á bak við eiturverkun OTA eru enn ekki fullkomlega skildar og eru háðar mörgum áframhaldandi rannsóknum. Hversu langt nágrannafrumur með mismunandi virkni trufla og móta þar með frumustarfsemi er nánast ekki vitað en búast má við. Í fyrri rannsókn með samræktunarlíkani sem samanstendur af rottumnýruproximal tubule og fifibroblast frumur, kom í ljós að eins konar víxltalning milli beggja frumugerða á sér stað, sem leiðir til athugunar að áhrif OTA sem epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) áttu sér aðeins stað við samræktunaraðstæður [20]. Önnur ályktun sem hægt var að draga úr þeirri rannsókn og öðrum var að rottufrumur eru sterkari varðandi þol fyrir OTA samanborið við nærpíplufrumur úr mönnum [7,20] og því þarf líkankerfi sem byggir á frumum úr mönnum til að meta betur aðstæður mannsins og hættan á útsetningu fyrir OTA.
Þess vegna, í þessari rannsókn, komum við á fót háþróað frumusamræktarlíkan sem samanstendur af nærpíplufrumum úr mönnum (HK2 frumum) og fifibroblastum úr mönnum (CCD-1092SK frumur) til að rannsaka áhrif OTA á lifun frumna (apoptosis) , drepi) og tjáningu nokkurra fyrirmyndar valinna gena sem tengjast frumuhringnum, frumudauða, utanfrumufylki og efnaskiptum. Svipað og í fyrri rannsóknum þar sem rottufrumur [20] voru notaðar, voru nærpíplafrumurnar úr mönnum settar á síubúnað og síurnar settar fyrir ofan lag af trefjafrumum sem sáð var á botni petrískáls þannig að botnhlið þekjufrumnanna snýr að vefjafrumnanna, sem gerir eins konar samtal milli beggja frumugerða kleift.
Niðurstöður
Prótein, laktat dehýdrógenasa losun og kaspasa-3 virkniTil að fá fyrstu kynni af mögulegum áhrifum ræktunaraðstæðna sjálfra sem og um áhrif á breytingar af völdum OTA, bárum við saman caspasa-3 virkni sem mælikvarða á frumudauða frumna sem ræktaðar eru í einrækt við virkni frumna sem ræktaðar eru í samsetningu. -rækt ræktuð með eða án 100 nM OTA í tvo tímapunkta, 24 og 48 klst. Að auki var losun laktat dehýdrógenasa (LDH) sem mælikvarði á drep ákvörðuð sem og próteininnihald til að gefa heildarmynd af frumustöðu. Því var jafnt magn af frumum sett annaðhvort í brunnbotninn (fifibroblasts) eða á fifilíu (proximal tubule cells). Eftir að hafa náð samruna voru fifilsíur settar í holurnar þar sem fifibroblastarnir voru staðsettir (sjá myndrænt ágrip). Eins og sýnt er á mynd 1A, gæti nánast engin ræktunarástand háð áhrif á próteininnihald komið fram í báðum frumugerðum eftir 24 eða 48 klst (sjá einnig viðbótarskrá S1). Í fifibroblasts leiddi útsetning fyrir OTA til lítillar aukningar á próteininnihaldi en í píplufrumum leiddi OTA til lítilsháttar minnkunar á próteininnihaldi sem sýnir að OTA gæti haft neikvæð áhrif á píplufrumur. Þessi áhrif voru nánast óháð ræktunarástandi í báðum frumugerðum
Mynd 1. Áhrif okratoxíns A (OTA) og/eða ræktunarskilyrða á próteininnihald (A), kaspasa-3 virkni (B) og losun laktatdehýdrógensasa (LDH) (C). Frumur voru ræktaðar annað hvort í einræktun eða í samrækt og útsettar fyrir 100 nM OTA í 24 eða 48 klst. N=3–6, n=14–18 (prótein, LDH) eða 8–9 (kaspasi-3). * gefur til kynna ap < 0,05="" fyrir="" frumur="" sem="" ekki="" eru="" ota-útsettar="" (samanburður="" á="" ota-áhrifum,="" annars="" vegar="" vinstri="" hlið)="" eða="" fyrir="" frumur="" í="" einræktun="" (samanburður="" á="" ræktunaráhrifum,="" hins="" vegar="" hægra="" megin).="" til="" að="" útskýra="" frekar="" áhrifin="" á="" próteininnihald="" rannsökuðum="" við="" frumudauða="" og="" drep.="" í="" samanburði="" við="" fifibroblasts="" hafði="" ota="" greinileg="" áhrif="" á="" frumudauða="" í="" píplufrumum="" eftir="" 24="" klst="" útsetningu="" með="" um="" það="" bil="" 2.5-faldri="" aukningu="" á="" virkni="" (mynd="" 1b).="" eftir="" 48="" klst="" útsetningu="" var="" aukningin="" enn="" sjáanleg="" en="" ekki="" eins="" áberandi="" og="" eftir="" 24="" klst.="" hins="" vegar="" voru="" þessar="" aukningar="" nánast="" óháðar="" ræktunarskilyrðum="" nema="" að="" eftir="" 48="" klst.="" í="" nærveru="" fifibroblasts="" minnkaði="" kaspasavirknin="" í="" píplufrumunum="" lítillega,="" sem="" gefur="" til="" kynna="" hóflega="" verndaráhrif="" samræktarinnar.="" hins="" vegar="" var="" hægt="" að="" sjá="" verndandi="" áhrif="" samræktunar="" fyrir="" fifibroblasts,="" sérstaklega="" í="" nærveru="" ota.="" í="" samræktun="" var="" losun="" ldh="" greinilega="" aukin="" í="" fifibroblasts="" og="" píplafrumum="" samanborið="" við="" einræktunaraðstæður="" óháð="" tilvist="" ota="" (mynd="" 1c).="" í="" píplufrumum="" leiddi="" ota="" til="" aukningar="" á="" ldh="" sem="" losað="" var="" út="" í="" fjölmiðla,="" sérstaklega="" eftir="" 48="" klst="" útsetningu,="" sem="" var="" ekki="" eins="" áberandi="" í="" trefjakímfrumum.="" samanlagt="" leiddi="" tilvist="" viðkomandi="" frumutegundar="" til="" aukins="" dreps="" en="" til="" minni="" frumudauða="" þannig="" að="" heildarpróteininnihaldið="" breyttist="" ekki="" verulega.="" áhrif="" ota="" á="" frumudauða="" og="" drep="" voru="" einnig="" að="" mestu="" óháð="" tilvist="" eða="" fjarveru="" hinnar="">
Western blot og mRNA tjáning
CDKN1A/p21Sýnt var fram á að frumuhringurinn væri undir áhrifum af OTA og hægt var að sýna fram á að p21 próteinið sem tekur þátt í frumuhringnum var uppstýrt af OTA í píplufrumum [21]. Til að kanna hversu langt próteinið, sem og tjáning mRNA sem kóðar fyrir p21, er undir áhrifum frá nærveru trefjafruma, gerðum við Western blot og RT-PCR. Eins og sýnt er á myndum 2A,B og 3, leiddi 48 klst útsetning fyrir 100 nM OTA til aukningar á p21 próteinmagni í mónó en einnig í samræktunarskilyrðum í píplufrumum. Í fibsoblastum við samræktunarskilyrði hafði OTA engin áhrif á p21-próteintjáningu þó að mRNA tjáningin hafi aukist með OTA óháð tilvist hinnar frumugerðarinnar. Athyglisvert er að við samræktunaraðstæður jók útsetning fyrir OTA ekki frekar p21 prótein tjáningu. Í píplufrumum var tjáning RNA ekki breytt vegna tilvistar trefjakímfruma en í trefjakímfrumur í samræktun var pZlmRNA tjáning aukin, ekki aðeins í OTA-útsettum heldur einnig þegar í frumum sem ekki verða fyrir OTA (sjá einnig viðbótarskrá S1). Þetta sýnir að p resenee af hinni frumugerðinni hefur áhrif á p21 prótein tjáningu, sérstaklega í trefjakímfrumum.
Sýklóoxýgenasi 2 (COX2)Sýnt hefur verið fram á að sýklóoxýgenasa 2 (COX2) prótein auk mRNA stigs hækka á meðannýrnabilun[22]. Eins og sýnt er á myndum 2C, D og 3, var aðeins í fifibroblasts próteintjáning aukin með OTA útsetningu. Að auki, í viðurvist píplufruma, var COX2 próteintjáning aukin í ómeðhöndluðum sem og OTA-útsettum frumum, sem sýnir skýrt áhrif píplafrumna. MRNA tjáningin var hins vegar ekki undir áhrifum frá OTA og mjög lítil áhrif samræktunar komu fram við OTA útsetningu. Aftur á móti, í píplufrumum, var mRNA og prótein tjáning COX2 algjörlega óháð OTA eða nærveru fifibroblasts. Það sýnir að varðandi COX2 píplufrumur geta haft áhrif á fíbróblastar en fífíbróblastar hafa engin áhrif á píplufrumur.
FibronectinNýrnabilunfylgir oft fifibrosis. Við fifibrosis á sér stað uppsöfnun utanfrumufylkis og ein athugun fyrir utan aðra er aukning á magni fifibronectin próteins [23]. Þess vegna var OTA háð breyting á fibronectinkóða mRNA og próteintjáningu ákvörðuð við ein- eða samræktunaraðstæður. Eins og sýnt er á myndum 3 og 4A,B, leiddi 48 klst útsetning píplafrumna fyrir 100 nM OTA til lækkunar á innanfrumu fifibrónektíni bæði í ein- og samræktun. OTA-áhrifin voru minni í samræktun. Þar að auki minnkaði magn mRNA sem kóðar fyrir fifibrónectin vegna OTA útsetningar óháð ræktunaraðstæðum og nærvera fifibroblasta leiddi til minni mRNA tjáningar í stjórnunar- og OTA-útsettum frumum. Aftur á móti breyttist tjáning fifibrónektíns í fifibroblastum nánast ekki, hvorki vegna OTA né ræktunaraðstæðna vegna mikils breytileika, sérstaklega í Western blotinu. Tilhneiging til tjáningar af völdum OTA gæti verið sýnileg í einmenningu.
VimentinVimentin er prótein þar sem magn eykst þegar þekju-til-mesenchymal umskipti (EMT) eiga sér stað og EMT þróun getur leitt tilnýrnabilun[23]. Þess vegna var OTA-háð breyting á vimentín mRNA og prótein tjáningu ákvörðuð við ein- og samræktunaraðstæður. Eins og sýnt er á myndum 3 og 4C,D leiddi 48 klst útsetning píplafrumna fyrir 100 nM OTA til minni magns vimentínpróteina bæði við ein- og samræktunaraðstæður. Hins vegar, í nærveru fifibroblasta, var tjáning vimentínpróteina óháð ræktunarskilyrðum. Tjáning mRNA sem kóðar fyrir vímentín breyttist nánast ekki, hvorki vegna OTA né ræktunaraðstæðna, að því undanskildu að OTA útsetning í samrækt sýndi lítilsháttar aukningu. Í fifibroblasts var tjáning vímentínpróteins algjörlega óháð OTA útsetningu sem og nærveru píplafrumna. Að auki var tjáning mRNA sem kóðar vimentín nánast ekki breytt
Tjáning sumra valinna genaTil að prófa frekar til fyrirmyndar hversu langt ræktunaraðstæður geta haft áhrif á tjáningu annarra RNA, völdum við nokkur gen, sem gegna hlutverki í frumudauðadrep, krabbameinsþróun eða orkuefnaskipti (sjá einnig viðbótarskrá S1).
WISP1-AS1er langt ókóðandi RNA (lncRNA) framkallað af OTA sem hefur áhrif á umritunarstjórnun og gegnir hlutverki í jafnvægi frumudauða og dreps og líklega í þróun krabbameins [24]. Eins og sést á mynd 5A leiddi 48 klst útsetning fyrir 100 nM OTA í báðum frumugerðum til marktækrar aukningar á tjáningu þess lncRNA. Án OTA hafði nærvera viðkomandi frumutegundar nánast engin áhrif á tjáninguna. Hins vegar, í viðurvist OTA, var tjáning þess hærri í samræktun samanborið við einræktun.
GDF15Vaxtaraðgreiningarstuðull 15 (GDF15) er meðlimur í umbreytandi vaxtarþátta yfirfjölskyldunni sem bregst við streitu. Það er rætt sem lífmerki einnig fyrirnýrnasjúkdómaeða sem spá fyrir lifun afnýruígræðslusjúklingar [25,26]. Tjáning mRNA sem kóðar fyrir GDF15 var aukin í báðum frumugerðum eftir OTA útsetningu eins og sýnt er á mynd 5B. Þessi áhrif af völdum OTA voru ívilnuð í fifibroblasts þegar píplufrumur voru í nágrenninu. Í píplufrumum var tjáningin hins vegar óháð nærveru fifibroblasts (mynd 5B).CDK2Sýklínháður kínasi 2 (CDK2) var auðkenndur með veginni fylgninetsgreiningu sem helsti eftirlitsaðili á óstjórn frumuhrings af völdum OTA [21]. Í fifibroblasts í einræktun var tjáning mRNA sem kóðar fyrir CDK2 ekki breytt af OTA. Ennfremur hafði tilvist píplafrumna ekki áhrif á mRNA tjáningu. Hins vegar, í píplafrumum, leiddi OTA til örlítið aukinnar tjáningar aðeins í viðurvist fíbróblasta (Mynd 5C).
Glýkógen og glúkósatengd prótein: PYGM, GYS1 og GLUT1 (SLC2A1)Thenýrutekur einnig þátt í glúkósajafnvægi og getur séð líkamanum fyrir glúkósa annað hvort með glúkógenmyndun eða með því að virkja glýkógenforða [27]. Glýkógen fosfórýlasi (PYGM) gegnir hlutverki í niðurbroti glýkógenforða og virkar þar með glúkósa [28]. Eins og sést á mynd 6A leiddi 48 klst útsetning fyrir 100 nM OTA til marktækrar aukningar á tjáningu mRNA sem kóðar fyrir glýkógen fosfórýlasa, sérstaklega í píplufrumunum. Hins vegar, í píplufrumum var þessi aukning ekki háð ræktunarástandi en í fifibroblasts var tjáningin af völdum OTA meiri í nærveru píplafrumna samanborið við ástandið án píplafrumna, glýkógensyntasi 1 (G^YSl) hvatar hið gagnstæða viðbragð. og þar sem tjáningu fosfórýlasans var uppstýrt, var tjáningu syntasans stjórnað niður af OTA í píplufrumum og í trefjakímfrumum í samræktun (Mynd 6B). Þetta gefur til kynna glúkósavirkjandi áhrif OTA. Athyglisvert er að mRNA-tjáning glúkósaflutningsefnisins GLUTl (SLC2A1) var einnig stýrt af OTA (Mynd 6C), sem undirstrikar hugmyndina um aukna glúkósaeftirspurn vegna OTA-útsetningar kannski vegna
Hvatberatengd prótein: NDUFB10 og MRPS16
Vísbendingar eru um að útsetning fyrir OTA geti leitt til minnkunar á hvatberagetu ínýrufrumur [24] sem sýna að starfsemi hvatbera getur verið undir áhrifum af útsetningu fyrir OTA, sem gæti verið undir áhrifum til viðbótar af nærveru trefjafrumna. Þess vegna, fulltrúi annarra RNA sem kóðar fyrir hvatberaprótein, sýnum við hér tjáningu mRNA sem kóða fyrir NDUFB10 og MRPS16. NDUFBt0 kóðar fyrir hvatbera NADH:ubiquinone oxidoreductase undireininguna B10, sem er hluti af hvatbera öndunarfléttunni I og er mjög tjáð í hjarta ognýru(NCBI gen. Fáanlegt á netinu: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4716 (sótt 17. mars 2021)). MRPS16 genið kóðar fyrir hvatbera ríbósómaprótein S16, sem gegnir hlutverki í nýmyndun hvatbera próteina. Eins og sýnt er á mynd 7 leiddi 24 klst OTA útsetning í báðum frumugerðum til minnkaðrar tjáningar beggja mRNA. Í píplafrumum var minnkuð tjáning NDUFB10 gena ekki fyrir áhrifum af nærveru trefjafrumna, en í trefjafrumum var OTA-framkallaðri minnkun NDUFB10 tjáningar örlítið bjargað í viðurvist píplafrumna (Mynd 7A). Í píplafrumum var þegar minnkað tjáning gensins sem kóðar fyrir hvatbera ríbósóma undireininguna með OTA að auki minni í viðurvist trefjafrumna, en í trefjafrumum leiddi tilvist píplafrumna til aðeins meiri tjáningar á MRPS16 mRNA (Mynd 7B). Þetta sýnir að starfsemi hvatbera getur orðið fyrir áhrifum af OTA en að OTA áhrifum er einnig hægt að breyta þegar frumugerðirnar tvær eru þétt saman.
Umræða
Thenýruer í hættu vegna ýmissa efna sem hafa eiturverkanir á nýru með hættu á bráðri eða langvinnri hættunýrnabilun[1]. Til að rannsaka áhrif nýrnaeitrandi efna á mismunandi frumugerðir og til að draga úr meðhöndlun dýra hefur frumurækt verið mikið notað. Þessar frumuræktanir hafa þann viðbótarkost að hægt er að stjórna tilraunaaðstæðum og rannsaka sértæk áhrif efnis með því að nota skilgreinda frumugerð. Fyrir utan þessa óumdeildu kosti, eru nokkur atriði eftir: til dæmis, í "heimalíffærinu" eina frumutegund (td nærliggjandi píplufrumur ínýru) er umkringdur öðrum frumutegundum (td trefjakímfrumum) með margfólb háð innbyrðis. Þess vegna geta viðbrögð við efni sem sést þegar aðeins ein frumutegund er notuð ekki verið þau sömu og þegar frumurnar eru nálægt í upprunalega vefnum. Í líkani sem samanstendur af tveimur mismunandi nýrnafrumugerðum úr rottum hefur verið sýnt fram á að víxlspjall sé á milli píplu- og vefjafrumna, sem leiðir til viðbragða sem komu eingöngu fram þegar frumugerðirnar tvær voru nátengdar [20]. Hins vegar, þegar borin eru saman niðurstöður þessarar könnunar við niðurstöður sem komu fram með nýrnapíplufrumum úr mönnum kemur í ljós að rottufrumur eru augljóslega sterkari en maðurinn segir til um viðbrögð þeirra við meðferð með alls staðar nálægu nýrnatoxíni, ochrafoxin A (OTA) [7]. Þess vegna er samræktunarlíkan sem samanstendur af mannafrumum nauðsynlegt. Við komum á slíku líkani með því að nota proximal tubule frumulínu HK2 úr mönnum og trefjafrumur úr mönnum. HK2 frumur blautræktaðar á síuinnskotum og færðar saman með trefjafrumum, ræktaðar á botni 6-brunnsplötu. Eftir að hafa skráð grunnbreytur eins og frumudauða og drep, notuðum við þetta líkan til að fá upphafsgögn um áhrif okratoxíns A á útbreiðslu sumra próteina og RNA sem tengjast frumuhring, EMT og frumuefnaskiptum.
Frumulifun Miðað við próteininnihald virtist hvorki OTA né ræktunarástandið hafa merkileg áhrif. Hins vegar var sambandið milli frumudauða og dreps færðist í átt að drepi í báðum frumugerðum þegar frumur voru ræktaðar saman. Vitað er að OTA framkallar apoptosis í píplufrumum [29] og í minna mæli einnig í trefjakímfrumum [7]. Þetta endurspeglast einnig í þessum niðurstöðum. Athyglisvert er að tilvist viðkomandi annarrar frumutegundar leiddi til minnkaðrar frumufrumutíðni í báðum frumugerðum en til aukinnar losunar LDH. Þetta er fyrsta vísbending um að tilvist annarrar frumutegundar geti þegar haft áhrif á starfsemi frumna og að viðbrögð frumna við eitruðu efni geti verið önnur í samrækt miðað við einræktun.
Prótein og RNA tjáning Við útvíkkuðum rannsóknir okkar með því að ákvarða prótein og RNA tjáningu sumra fyrirmyndar valinna próteina og RNA sem kóða fyrir þau. Þar sem sýnt var fram á að OTA hefði áhrif á frumuhringinn [21,30] var tjáning CDKN1A/p21 rannsökuð. Samkvæmt niðurstöðum Dubourg et.al [21] leiddi OTA til aukinnar tjáningar ekki aðeins á CDKN1A mRNA heldur einnig CDKN1A/p21 próteini í píplufrumum. Í þessum frumum hafði nærvera trefjafrumna ekki áhrif á tjáningu CDKN1A mRNA, en í trefjafrumum voru skýr samræktunaráhrif sýnileg með auknu magni mRNA sem aðeins var sýnilegt í samræktun. Hins vegar var þessi aukning á gnægð mRNA ekki alveg endurspegluð af próteintjáningu, sem bendir til frekari stjórnunaraðferða. Hægt er að bæta við frumuhringsrannsóknum til að fá frekari innsýn í áhrifin á frumuhringinn. Í ljós kom að sýklínháður kínasi 2 (CDK2) gegndi hlutverki í röskun á frumuhringnum af völdum OTA [21]. Í píplufrumum var mRNA tjáning þess aukin með OTA í samræktun á meðan vefjafrumur voru ekki undir áhrifum frá píplafrumum. Saman benda niðurstöðurnar til þess að frumuhringurinn í píplufrumum sé undir áhrifum frá nærveru trefjakímfrumna.
Önnur samræktunaráhrif komu fram fyrir tjáningu COX2 í trefjakímfrumum. Fyrir trefjafrumur leiddi tilvist píplafrumna til greinilega aukinnar próteintjáningar (svipað og niðurstöður sem sáust í rottufrumum [20]), sem var ekki sýnilegt fyrir píplafrumurnar sem sýndu ekki ræktunarháð. Þetta gefur til kynna að hlutverk vefjafrumuefna í bólgunýrnasjúkdómakann að hafa verið vanmetið með rannsóknum þar sem fifibroblasts voru notaðir í einræktun. Milliþráðarpróteinið vimentín er myndað í vefjafrumum og er í auknum mæli tjáð við þekju-til-mesenchymal umskipti (EMT) í þekjufrumum [10]. Þrátt fyrir að sýnt hafi verið fram á að langvarandi útsetning fyrir OTA geti leitt til aukinnar tjáningar á kollageni III eða fíbrónektíni í píplufrumum [7], í þessari rannsókn var tjáning EMT-vísandi próteins vimentíns í píplufrumum enn minni eftir útsetningu fyrir OTA, óháð af menningarskilyrðum. Að auki var tjáning fíbrónektíns mRNA og próteins frekar minni og ekki aukin. Ennfremur, í trefjakímfrumum, var ekki hægt að sýna fram á breytta tjáningu þannig að þessar niðurstöður mæla ekki með EMT framkallað af OTA, eins og aðrir sýndu [31].
CISTANCHE MUN BÆTA NÝRA/NÝRAVERK
Til að prófa enn frekar hvort samræktun geti haft áhrif á frumusvar við streitu af völdum OTA, ákváðum við tjáningu nokkurra fyrirmyndar valinna RNA sem tengjast frumudauða-drepi, krabbameinsþróun og orkuefnaskiptum. Löng RNA sem ekki eru kóðað gegna mikilvægu hlutverki í mörgum frumustjórnunarferlum og afsporun þeirra, og einnig í nýrnatrefjun eða krabbameini [32]. WISP1-AS1 er langt ókóðarandi RNA sem framkallað er af OTA og tjáð í nýrnaæxlisfrumum [24]. Við fundum uppstýringu þess með OTA í báðum frumugerðum og samræktun jók uppstjórnunina. Þetta gerir kleift að versna áhrif WISP1-AS1 á jafnvægi frumudauða og dreps og líklega æxlismyndun. Auka LDH losun sem sést í samræktun má því að minnsta kosti að hluta til skýra með auknu innihaldi WISP1-AS1, sem sýnt var að væri nauðsynlegt fyrir drep af völdum OTA [24].
WISP1-AS1var einnig grunaður um að gegna hlutverki í efnaskiptum þar á meðal hvatbera dría [24]. Í magaþekjufrumum var sýnt fram á að OTA veldur truflun á starfsemi hvatbera [33]. Fyrirnýrufrumur, eru umdeildar niðurstöður um hvort útsetning fyrir OTA hafi áhrif á hvatbera möguleika eða ekki [21,24]. Minnkuð möguleiki á hvatberum gæti verið afleiðing af skertum hvatberum eða gæti valdið skemmdum á hvatberum. Minnkuð tjáning hvatberapróteina getur leitt til skertrar starfsemi sem endurspeglast eða fylgt eftir af breyttum hvatberagetu. Skert starfsemi hvatbera neyðir frumuna til að nota aðrar leiðir til að tryggja orkuöflun. Hægt er að viðhalda orkuframlagi undir óviðeigandi framlagi hvatbera með aukinni notkun glýkólýsu sem leiðir til aukinnar framleiðslu á laktati. Hins vegar, í HEK293 frumum, fósturvísir mannanýrufrumulínu, kom í ljós að OTA leiddi frekar til minnkunar á glýkólýsu og aukið magn laktats vegna laktatsframleiðslu úr glútamíni var háð tjáningu lncRNA WISP1-AS1 [24]. Aftur á móti, í magaþekjufrumum, var hægt að sýna fram á að OTA útsetning leiði til endurforritunar á efnaskiptum glúkósa í átt að glýkólýsu og minni virkni tríkarboxýsýruhringsins [34]. Við getum sýnt hér að (1) OTA leiðir til minnkaðrar mRNA tjáningar tveggja dæmigerða valinna hvatberapróteina, sem gegna hlutverki í nýmyndun hvatbera próteina (MRPS16) og orkuframleiðslu (NDUFB10) og (2) að glýkógen-meðhöndlun ensímum var stjórnað. á þann hátt að hægt sé að virkja aukinn glúkósa (GYS1 niður og PYGM upp). Að auki virðist meiri GLUT1 flutningsgeta vera framkölluð. Hins vegar voru þessar breytingar af völdum OTA nánast óháðar ræktunaraðstæðum.
Að lokum höfum við sýnt fram á að við samræktunaraðstæður geta viðbrögð frumnanna verið önnur en viðbrögðin sem sjást í einræktun, þó að ekki væru allar breytur sem rannsakaðar voru hér ræktunarháðar. Hins vegar, miðað við þær niðurstöður sem kynntar eru hér, ætti að nota samræktun ef mögulegt er, þannig að forðast möguleika á að hafa umsjón með áhrifunum sem eiga sér ekki stað þegar aðeins ein frumutegund er rannsökuð. Eftir stendur spurningin um hvernig frumurnar eiga samskipti sín á milli. Rannsóknir á samræktarlíkani fyrir rottu leiddu í ljós COX2-háð kerfi [20] og í músum virðist retínósýra taka þátt í frumuvíxlunnýrufrumur [35]. Að auki er spurningin enn, hvort, hvers vegna og hvernig OTA truflar umbrot frumuorku og hlutverk hvatbera þar í.
Ákvörðun á LDH og Caspase-3 virkni og próteininnihaldiTil að lýsa voru frumur þvegnar tvisvar í ísköldu PBS jafnalausn, safnað og leyst í MOPSTriton jafnalausn (20 mM 3-(N-morfólínó)própansúlfónsýru, pH 7,4, 0. 1 prósent Triton X100). Próteininnihald í frumulýsum var ákvarðað með bicinchoninsýru [36,37]. LDH virkni í miðlum eða frumulýsum sem mælikvarði á drep var ákvörðuð samkvæmt Bergmeyer [38] eins og lýst er í smáatriðum í [20]. Kaspasa-3 virkni sem mælikvarði á frumudauða var ákvörðuð með því að nota flórigenískt kaspasa-3 hvarfefnið (DEVD-AFC) eins og lýst er í [39]. Í stuttu máli var 60 µL frumulysat ræktað með 65 µL hvarfjafna (20 mmól/L píperasín-1,4-bis(2etansúlfónsýra (PIPES), 4 mmól/L EDTA, 0,2 prósent {{26} [(3-kólamínóprópýl)dímetýlammóníó]-1-própansúlfat (CHAPS), 10 mmól/L dítíótreítól (DTT), pH 7,4) sem inniheldur 42 µmól/L DEVD-AFC (Aspglu-val-asp{{ 36}}amínó-4-tríflúormetýlkúmarín, endastyrkur) við 37 ◦C. Flúorljómun klofnu afurðarinnar (AFC) var mæld við 400 nm örvun og 505 nm losun. Klofnað AFC var magnmælt með AFC kvörðunarferil með þekktum styrkir.
RT-PCR Einangrun á heildarríbónsýru (RNA) var framkvæmd með því að nota Trizol hvarfefni (Life Technologies, Darmstadt, Þýskalandi). Frumur voru þvegnar og síðan ljósaðar með Trizol hvarfefni og fluttar í hvarfglas. Eftir að klóróformi var bætt við og skilvindu (12,000× g) var efri fasanum safnað saman og honum blandað saman við ísköldu ísóprópanóli. Eftir skilvindu (12,000× g) var flotið fjarlægt og kúlan þvegin tvisvar með 75 prósent etanóli og að lokum leyst upp í vatni. Öfug umritun var framkvæmd með því að nota auglýsingasett frá Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Bandaríkjunum) samkvæmt leiðbeiningum þeirra. Rauntíma PCR var framkvæmd með því að nota SYBR Green hvarfefni (Invitrogen). Primers voru smíðaðir af Microsynth AG, Balgach, Sviss. Grunnraðir eru sýndar í töflu 1. Fallbreyting á genatjáningu var reiknuð út með 2∆∆Ct aðferðinni með tjáningu EEF2 og RPS17 sem viðmið. Tjáning þessara tveggja gena reyndist vera þau minna breyttu (ef yfirhöfuð) í RNA raðgreiningargögnum þegar borin voru saman OTA meðhöndlaðar og ómeðhöndlaðar HK2 frumur (ekki birtar niðurstöður).
Western Blots Eftir aðskilnað próteina með natríumdódesýlsúlfat-pólýakrýlamíð hlaup rafdrætti (SDS-PAGE), voru prótein flutt yfir á nítrósellulósahimnu. Eftir það voru lausir bindistaðir himnunnar lokaðir með 5 prósenta lausn af fitulausri þurrmjólk í TRIS-bufferðri saltlausn (3 mM TRIS basi, 140 mM NaCl, 0.17 mM Tris -HCl, pH 7,4) sem inniheldur 0,1 prósent Tween20. Fyrstu mótefnin þynnt í TRIS saltvatni auk 5 prósenta sermi albúmíns úr nautgripum (TRIS-BSA, fyrir þynningar sjá töflu 2) var bætt við og himnur ræktaðar yfir nótt. Eftir þvott var flúrljómunartengdum aukamótefnum í TRIS-BSA bætt við í 90 mín. Flúrljómun seinni mótefnanna var skráð með því að nota LICOR greiningarkerfi.
CISTANCHE MUN BÆTA NÝRA/NÝRAVERKI
