Terahertz háupplausnarlitrófsgreining á varma niðurbrotsgasafurðum úr blóðplasma og nýrnavefskögglum af sykursýki og ekki sykursýki
Mar 28, 2022
Tengiliður:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Ágrip
Mikilvægi:Ein af nútíma straumum í læknisfræðilegri greiningu er byggð á efnaskiptafræði, nálgun sem gerir kleift að ákvarða umbrotsefni sem geta verið sérkenni sjúkdómsins. Gaslitrófsgreining með háum upplausn gerir kleift að rannsaka innihald gasumbrotsefna í sýnum af líffræðilegum uppruna. Við kynnum útfærslu á aðferð til að rannsaka lífsýni af sykursýki og án sykursýki, unnin sem kögglar, með terahertz (THz) háupplausnarrófsgreiningu.
Markmið:Meginhugmynd verksins er að rannsaka innihald varma niðurbrotsgasafurða í þurrkuðum sykursýkisjúklingum og öðrum sem ekki eru með sykursýki.blóðvökvaognýrnaveffyrir að afhjúpa mengi gasmerkja sem einkenndu sykursýki með THz háupplausnar litrófsgreiningaraðferðinni.
Nálgun:Við kynnum nálgun til að rannsaka sykursjúka og sykursjúkablóðvökva(menn og rottur) ognýrnavef(rottur), með því að nota litrófsgreiningu með háum upplausn sem byggir á óstöðug áhrifum THz tíðnisviðsins. Þróaðar voru aðferðir við að útbúa blóð- og nýrnavefssýni sem köggla og gufa upp sýnin.
Niðurstöður:Mælingarnar á frásogsrófi snúnings gufu við upphitun á kögglum sem unnin eru úr blóði ognýrnavefvoru gerðar á 118 til 178 GHz tíðnisviðinu. Frásogslínurnar sem birtust í litrófum sýnisgufunnar voru greindar og auðkenndar. Sameindainnihald varma niðurbrotsefna var mismunandi fyrir sýni sem ekki eru sykursýki og sykursýki; td er aðalmerkið asetón sem kemur fram í blóði sykursjúkra (mönnum og rottum) og hjá sykursjúkumnýrnavef.
Ályktanir: Ritgerð okkar sýnir hugsanlega getu til að ákvarða umbrotsefnisinnihald lífsýna til greiningar og horfur sjúkdóma fyrir klíníska læknisfræði. © Höfundarnir. Gefið út af SPIE undir Creative Commons Attribution 4.0 Unported License. Dreifing eða endurgerð þessa verks í heild eða að hluta krefst fullrar úthlutunar upprunalegu útgáfunnar, þar með talið DOI þess. [DOI: 10.1117/1.JBO.26.4.043008] Leitarorð: háupplausnar terahertz litrófsgreining; varma niðurbrot; vefjum;blóðvökva; sykursýki; frostþurrkun.
Leitarorð:háupplausnar terahertz litrófsgreining; varma niðurbrot; blóðvökva; sykursýki; frostþurrkun, nýrnavefur.
1. Inngangur
Nú á dögum vekur vandamálið við greiningu félagslega mikilvægra sjúkdóma (sykursýki, krabbameinssjúkdóma o.s.frv.), þar á meðal á frumstigi, mikla athygli vísindahópa í heiminum.Ein af nýju aðferðunum sem opna nýja möguleika í greiningu og meðferð ýmissa sjúkdóma er efnaskiptafræði. Efnaskiptafræði er vísindasvið sem rannsakar loka- og milliefnaskiptaafurðir líffræðilegs kerfis (frumu, líffæra eða heilrar lífveru). Efnaskiptin geta leitt í ljós umbrotsefnin sem geta verið sérkenni sjúkdómsins og geta gegnt stóru hlutverki við greiningu og horfur á sjúkdómi. Miðlarnir, sem innihalda loka- og milliefnaskiptaafurðir í mannslíkamanum og eru gagnlegar til að sýna fram á umbrotsefni sem tengjast sjúkdómum og meinafræði, eru útöndunaröndun, blóð, þvag, munnvatn o.s.frv.
Einn af samfélagslega mikilvægum sjúkdómum sem ógna lífsgæðum fólks er sykursýki. Sykursýki af tegund 2 var áður miðaldra sjúkdómur en nú greinist hann hjá fullorðnum, ungu fólki og börnum. Niðurstöður efnaskiptarannsókna á blóð- og þvagsýnum sykursýkissjúklinga frá 18 ára sem og börnum frá 1 til 13 ára eru birtar í Human Metabolome Database (HMDB).1 Aðallega blóð (21 efnafræðileg efni þ. 30 efnafræðileg efni, þ.mt myndbrigði), og heila- og mænuvökvi (1 efnaefni) voru rannsökuð. Til dæmis greindist (R)-3-hýdroxýsmjörsýra í öllum þremur tegundum vökva. Sum efni (acetóediksýra, D-frúktósi og D-glúkósa) greindust í báðum vökvum (blóði og þvagi). Einkenni sykursýki (aceton, CH3COCH3) var eingöngu til staðar fyrir þvag. Vökvasýnin, niðurstöður rannsóknanna sem kynntar eru í HMDB, hafa verið rannsökuð með ýmsum aðferðum—gasskiljun;2 gasskiljun með massagreiningu;3,4 gas-vökvaskiljun með massagreiningu;5 háupplausnarrófsgreiningu á kjarna róteinda segulómun;6 og aðferðir sem nota sérstök tæki til að fylgjast með ástandi sykursýkissjúklinga, samfellda glúkósaeftirlitskerfið.7
Þróun langvinns nýrnasjúkdóms er stór fylgikvilli sykursýki. Þó að ákvörðun glýkraðs albúmíns sé algeng aðferð við skimunina, geta nýrnaskemmdir byrjað löngu áður en klínískt marktækar breytingar á albúmíni í þvagi koma fram. Með hliðsjón af fjölþættri meingerð langvinns nýrnasjúkdóms hafa ýmsar vísbendingar verið teknar til skoðunar við skimun hans.8,9 Greiningargildi þeirra án nýrnavefsýnis virtist hins vegar vafasamt.
Litrófsaðferðin getur veitt upplýsingar um innihald lífsýnanna sem hægt er að nota við læknisfræðilega greiningu. Terahertz (THz) tíðnisviðið er mjög mikilvægt til að rannsaka lofttegundir, vökva og vefi lifandi lífvera. Nokkrar umsagnir eru helgaðar beitingu aðferða á THz tíðnisviði, þar á meðal THz tímaléns litrófsgreiningu, THz endurskinsmælingu og THz myndgreiningu fyrir líffræði og læknisfræði.10
THz tímalénsrófsgreining gerir kleift að greina litróf, þar sem frásogsstuðullinn eða ljósbrotsstuðullinn hefur nokkra litrófseinkenni sem samsvara tilvist sumra lífsameinda (próteina, sykurs o.s.frv.) í sýnunum eða mismunandi styrkleika þeirra.11
Sameindagleypni litrófsgreining og sérstaklega THz gasrófsgreining er mjög efnileg aðferð við rannsóknir á fjölþátta gasblöndur af ýmsum uppruna.12 Hægt er að rannsaka sýnin í fljótandi og föstu formi með gufu- eða varma niðurbroti. Umbrotsefnismerki samfélagslega mikilvægra sjúkdóma (sykursýki, krabbamein osfrv.) geta komið í ljós með litrófslínum í frásogsrófinu sem framkvæmt er við sendingu geislunar í gegnum gassýni.
Magn asetóns í sýnum af útöndunaröndun og þvagi sem tekin voru úr sykursýkissjúklingum (12 manns) var mæld með terahertz sviðslitrófsmæli með fasaskiptingu á verkandi geislun. Tilraunir voru gerðar í samvinnu við Almazov National Medical Research Centre. Mælingarnar voru gerðar á asetóngleypnilínum með miðtíðni 150,537 og 151,647 GHz. Mælingarnar voru gerðar án upphitunar. Samtímis greining á sýnum af útöndunar- og þvagi sykursjúklinga leiddi í ljós að asetónmagn í þvagi var mun hærra en í útöndun, í sumum tilfellum stærðargráðu hærra.13,14
Niðurstöður THz háupplausnar gaslitrófsrannsókna áblóðvökvasjúklinga og rotta (skilyrt heilbrigð og með sykursýki) sem og rottunnarnýrnavef(heilbrigt og með sykursýki) þurrkað og pressað í köggla eru kynntar. Vefirnir eðablóðvökvalifandi lífvera, án nokkurs undirbúnings, skal rannsaka strax eftir sýnatöku. Undirbúningur sem kögglar leyfir rannsókn eftir nægilega langan tíma eftir blóðsýni eða nýrnavefsýni.
2 Tilraunir og aðferðafræði
2.1 Aðferð til að undirbúa blóðplasmaköggla og nýrnaköggla
Bláæðablóði frá sjúklingum með sykursýki af tegund 2 og skilyrt heilbrigðum þátttakendum var safnað á innkirtladeild Almazov National Medical Research Centre; miðstöðin veitir læknishjálp fyrir sykursjúka. Þrír sjúklingar og tveir þátttakendur voru karlmenn, aldurssamræmdir (39 til 43 ára). Allar tilraunareglur sem notaðar voru í þessari rannsókn voru skoðaðar og samþykktar af sjúklingum og þátttakendum og notkunarnefnd læknastöðvarinnar. Bláæðablóði var safnað að morgni eftir 8 til 12 klukkustunda föstu í slöngu með segavarnarlyfinu K3EDTA (Vacutest Kima, Ítalíu). Plasma var fengið til greiningar á lífefnafræðilegum breytum með skilvindu heilblóðs við 3000 snúninga á mínútu í 15 mínútur í skilvindu á rannsóknarstofu (Eppendorf 5702R, Þýskalandi) við þ4 gráðu hita. Gildi lífefnafræðilegra breytur afblóðvökvasýni og viðmiðunarbil eru sýnd í töflu 1 (magn glýkraðs blóðrauða fékkst í heilblóðinu). Tafla 1 sýnir að styrkur glúkósa, þríglýseríða og glýkraðs hemóglóbíns í sýnum sjúklings með sykursýki eykst 1,5, 2 og 2,3 sinnum, í sömu röð.
Rannsóknin var einnig gerð með Wistar karlkyns rottum á aldrinum 8 vikna og þyngd 180 til 200 g, samkvæmt siðareglum tilraunarannsókna sem samþykktar voru af dýraumönnunar- og notkunarnefndinni á Tilraunastofnuninni Almazov National Medical Research Centre. Glúkósamagn í dýrum úr tilraunahópnum var 21 mmól ∕ l eftir 120 mínútur eftir glúkósahleðslu. Ósnortnar rottur voru notaðar sem viðmiðunarhópur. Bláæðablóði var safnað úr neðri holæð áður en dýr voru aflífuð. Einnig var nýrað uppskorið. Blóðsýnum var safnað í glös sem innihéldu segavarnarlyf.
Prófsýni voru fryst við -80 gráðu hita (lághitakæliskápur DW-86L388A, Haier, Kína). Síðan var það frostþurrkað með því að frostþurrka Vaco 2 (ZirBus, Þýskalandi) við -50 gráðu hita og 3 Pa þrýsting. Frysting fer fram fyrir frostþurrkun þar sem líffræðilegir þættir geta við frostþurrkun undir áhrifum hás innri þrýstings. vera eytt. Þurrkuð sýni voru svampur sem samanstendur af líffræðilegum kristöllum. Svampurinn var eyðilagður með málmspaða og mulinn í kristalla að stærð upp á nokkra tugi míkrómetra. Notkun steypuhræra og stöpuls var ómöguleg, þar sem mölun próteina í samsetningu sýnanna myndi leiða til óæskilegrar viðloðun þeirra og myndunar kringlóttra korna.
Frostþurrkað sýnisduftið var vegið (greiningarvog OHAUS Discovery, Sviss) og síðan sett í stálpressumót. Með því að nota rannsóknarstofupressur (Angkor, Rússland og Specac, Bretlandi) við ákveðinn mótunarþrýstingblóðvökvafengust kögglar og nýrnakögglar. Hver kristal af kögglum inniheldur ákveðið hlutfall af fitu (þríglýseríðum), próteinum (albúmíni) og fíbrínógeni - allt eðlilegt eða glýkrað (í sykursýkistilfelli). Kögglar sýna úr samanburðarhópnum eru hér á eftir nefndir „kögglar án sykursýki“ og kögglar sýna úrsykursýkishópur hér á eftir nefndur "sykursýkiskorn".
2,2 THz Tilraunauppsetning litrófsspeglunar með háum upplausn
Háupplausn THz litrófsgreining sem byggir á óstöðug áhrif gerir kleift að greina íhlutasamsetningu gas- og gufufjölþátta gasblandna. Litrófsmælar veita næmni nálægt fræðilegum mörkum með upplausn sem takmarkast aðeins af Doppler áhrifum og geta skráð hröð ferli. Næmnin er varðveitt jafnvel þó að gasþrýstingurinn minnki verulega og er um það bil 0.2 ppb í skönnunarham fyrir sumar lofttegundir (td ammoníak við mælingar á frásogslínu nálægt tíðninni 572 GHz). Að auki gerir það kleift að ákvarða íhlutasamsetningu gasblöndu með mikilli áreiðanleika.12 Rannsókn á varma niðurbrotsafurðum köggla var framkvæmd með aðferðinni THz óstöðugrar gaslitrófsgreiningar á bilinu 118 til 178 GHz. Litrófsmælirinn notar fasalæsta lykkju fyrir sjálfvirka stjórn á tíðni afturábaks bylgjulampans og fasaskiptingu, skráningu í tímasviðinu, meðaltal og úrvinnslu litrófsbreytingamerkisins. Tækið skráir merki í tímalénið. Gufa sýna var greind með eftirfarandi aðferð. Kögglar voru settir í tilraunaglas, með því að nota lofttæmd, tilraunaglas var hitað smám saman (allt að 240 gráður) og blöndunni af varma niðurbrotsefnum úr sýninu var hleypt inn í mæliklefann. Gagnaskrá inniheldur venjulega upptökur af völdum eða af heildarvirknisviði litrófsmælisins. Þess vegna er hægt að bera kennsl á efni með frásogslínum sem birtast í heildarrófi sýnisins og hægt er að rekja gangverk styrks í blöndu með því að bera saman nokkrar gagnaskrár. Efni voru auðkennd með því að leita í þeim í opnum MW, mmw og THz gagnagrunnum.15,16
Greining á 3 blóðplasmagufum og nýrnagufum með notkun háupplausnar Terahertz litrófsmælis
Með THz-TDS kerfum okkar mældum við flutning köggla á litrófssviðinu 0.2 til 1.4 THz,17 en við vitum að lífsameindir og sérstaklega niðurbrotsefni þeirra í gasástandi hafa upplýsandi svörun (snúningsgleypni) litróf) við þessar tíðnir og einnig lægri, þannig gerðum við viðbótarrannsókn á THz háupplausnar gasrófsmæli. Uppgötvuðu frásogslínur efna hjá sykursjúkum mönnumblóðvökvafalla saman við efni úr mönnum án sykursýkiblóðvökva, nema asetóni. Það eru margar frásogslínur af asetoni sem liggja á vinnutíðnisviði litrófsmælisins (118 til 178 GHz). Venjulega er meira en nóg að greina einhverja frásogslínu eins efnis til að ákvarða ótvírætt tilvist efnisins í fjölþátta gasblöndunni. Dæmi um skráningu hluta frásogsrófsins með frásogslínu asetóns er sýnt á mynd 1. Asetón getur birst í blóði þegar kolvetnaefnaskiptaröskun. Eins og fram kemur í fræðiritum innihélt blóð sjúklinga með sykursýki -OH-bútýrat og asetóasetat, en síðar brotnuðu þessi efni niður í asetón og koltvísýring.18 Koltvísýringur hefur ekkert tvípól augnablik; þess vegna hefur það engar snúningsbreytingar. Aukið innihald þess er aðeins hægt að greina með því að rannsaka titringsróf sýnisins á IR sviðinu.
Plasmagufuefni, eins og karbónýlsúlfíð (OCS), brennisteinsdíoxíð (SO2), maurasýra (HCOOH), ísósýansýru (HNCO) og ammoníak (NH3), greindust bæði í sýnum af sykursýki úr mönnum og í sýnum án sykursýki. Í sumum tilfellum er ein tilraunalína greind í litróf sýnisins sem samsvarar fleiri línum en einni fyrir eitt efni (td ísósýansýru) í vörulistagögnum (sjá töflu 2).15,16
Þetta skýrist af því að vörulistarnir innihalda gögn um offín uppbyggingu efna sem eru ekki leyst upp í þessari tilraun þar sem línurnar hafa takmarkaða breidd af stærðargráðunni nokkur hundruð kHz. Þær frásogslínur sem rannsakaðar eru falla saman við frásogsróf gufu háræðablóðs ogblóðvökvasjúklinga með sykursýki og skilyrt heilbrigða þátttakendur sem birt voru í fyrri verkum okkar.19 Gagngreindu loftkenndu efnin gætu hafa myndast við undirbúning sýna sem afurðir efnafræðilegrar umbreytingar amínósýra. Spurningin um hvort þessi efnasambönd séu greiningarmikil þarfnast rannsóknar. Í klínískri starfsemi í sykursýkisfræði er greining á innihaldi þessara efna ekki notuð ennþá.
Gufurnar afblóðvökvaaf heilbrigðum rottum innihélt karbónýlsúlfíð (OCS), metanetíól (CH3SH), bútýrónítríl (C3H7CN), asetaldehýð (CH3CHO) og maurasýru (HCOOH). Sýnishornið afblóðvökvahjá rottum með sykursýki var mismunandi eftir asetóni. Auk frásogslína própíónítríls (C2H5CN) greindist metýlformíat (CH3OCHO).
Gufusýnin af þurrkuðum kögglum af heilbrigðum og sykursjúkum rottumnýrnavefvoru rannsökuð. Gufurnar afnýrnavefaf heilbrigðum rottum innihalda karbónýlsúlfíð (OCS), brennisteinsdíoxíð (SO2), maurasýru (HCOOH), ísósýansýru (HNCO), etýlformat (C2H5OCHO) og própýlenglýkól (CH2ðOHÞCHðOHÞCH3). Gufuinnihald rotta með sykursýkinýrnavefvar frábrugðin heilbrigðu rottum vegna nærveru ekki aðeins karbónýlsúlfíðs (OCS) heldur einnig samsætufræðings OCS-34. Asetaldehýðið (CH3CHO), metanetíól (CH3SH), etýlensúlfíð (C2H4S), metanól (CH3OH) og glýkóaldehýð (CH2ðOHÞCHO) greindust einnig í gufum rotta með sykursýki.nýrnavef(sjá mynd 2 og mynd 3).
Tilvist brennisteinssambanda, eins og metanetíóls, getur verið tilgreind með varma niðurbroti brennisteins amínósýra (meþíóníns, cysteins og cystíns) í blóðpróteinsamsetningunni. Metíónín er nauðsynleg amínósýra sem er ekki mynduð í mannlegum lífverum. Það er fengið úr matvælum og er brennisteinsgjafi fyrir cysteine lífmyndun. Þegar brennisteins amínósýrur voru hitaðar upp í um það bil 240 gráðu hita, greindust metanetíól og etýlensúlfíð (metíónín niðurbrot) í massarófi þessara efna.20
4 Niðurstaða
Sameindainnihald manna og rottablóðvökvaog rottanýrnavefvið varma niðurbrot sýnanna var rannsakað með THz háupplausnarrófsmæli. Kynnt var aðferðin við að útbúa lífsýnin sem köggla. Þessi aðferð gefur möguleika á að geyma og flytja sýni. Háupplausnar gaslitrófsgreiningin gerir kleift að ákvarða innihald fjölþátta gasblandna af hvaða uppruna sem er, þar með talið líffræðilegar með snefilstyrk gasíhluta. Asetón greindist hjá sykursýkiblóðvökvasýnishorn. Upplýsingar um muninn á innihaldi sykursjúkra og heilbrigðrablóðvökvaaf körlum og rottum og sykursjúkum og heilbrigðum rottumnýrnavefvar fengin úr frásogssnúningsrófi gufu. Notkun THz háupplausnar litrófsgreiningar veitir eigindlega greiningu á innihaldi innihaldsefna sýna af blóðgufum ognýrnavefkögglar. Möguleikinn á að framkvæma magnmat á styrk mikilvægra sykursýkisgasmerkja eftir ástandi sjúklingaætti að rannsaka í frekari rannsóknum.
