Kerfisbundin auðkenning og samanburður á tjáðum sniðum á utanaðkomandi MiRNA í svínum sem eru sýkt af NADC30-eins og PRRSV stofni

Einföld samantekt:Exósóm gegna einstöku hlutverki í veirusýkingu, mótefnavakakynningu og bælingu/eflingu á ónæmi líkamans. Æxlunar- og öndunarfæraveira (PRRSV) er einn skaðlegasti sýkillinn í svínaiðnaðinum. Hér notuðum við PRRSV NADC30-eins og CHsx1401 stofn til að smita 42-dagsgömul svín tilbúnar, einangra sermisfrumur og bera kennsl á 33 marktækt ólíkt tjáð (DE) exosomal miRNA milli sýkingar og samanburðarhópa, og 18 DE miRNA sem tengjast PRRSV sýkingu og ónæmi voru skimuð sem hugsanlegar starfhæfar sameindir sem taka þátt í stjórnun PRRSV veirusýkingar með exosomes.

Ágrip:Exósóm eru líffræðilegar blöðrur sem frumur seyta og gefa út sem virka sem miðlarar millifrumusamskipta og gegna einstöku hlutverki í veirusýkingu, mótefnavakakynningu og bælingu/eflingu á ónæmi líkamans. Svínaæxlunar- og öndunarfæraheilkennisveira (PRRSV) er einn skaðlegasti sýkillinn í svínaiðnaðinum og getur valdið æxlunartruflunum hjá gyltum, öndunarfærasjúkdómum í svínum, minni vaxtarafköstum og öðrum sjúkdómum sem leiða til svínadauða. Í þessari rannsókn notuðum við PRRSV NADC30-eins og CHsx1401 stofn til að sýkja 42-dagsgömul svín tilbúnar og einangra sermisexósóm. Byggt á afkastamikilli raðgreiningartækni voru 305 miRNAs auðkennd í sermi exosomes fyrir og eftir sýkingu, þar á meðal voru 33 miRNAs tjáð á marktækan hátt á milli hópa (13 tiltölulega uppstýrt og 20 tiltölulega niðurstýrt). Raðvarðveislugreining á CHsx1401 erfðamenginu auðkenndi 8 varðveitt svæði, þar af var spáð að samtals 16 miRNA með mismunandi tjáningu (DE) myndu bindast varðveitta svæðinu næst þeim 3.0 UTR CHsx1401 erfðamengisins, þar á meðal 5 DE miRNA sem geta bundist CHsx1401 30 UTR (ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486, ssc-miR-6529). Frekari greining leiddi í ljós að markgena miRNAs sem tjáð eru með mismunun tóku víða þátt í boðleiðum sem tengjast utanaðkomandi starfsemi og meðfæddum ónæmistengdum boðleiðum og 18 DE miRNA (ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-744 , ssc-miR-320, ssc-miR-10b, ssc-miR-124a, ssc-miR-128 osfrv.) sem tengjast PRRSV sýkingu og ónæmi voru skimuð sem hugsanlegar starfhæfar sameindir sem taka þátt í að stjórna PRRSV veirusýkingu með exosomes.

cistanche plöntuaukning ónæmiskerfi

Leitarorð:PRRSV; exósóm í sermi; miRNA

1. Inngangur

Porcine reproductive and respiratory syndrome veira (PRRSV) er einþátta jákvætt RNA veira með hjúpbyggingu sem tilheyrir röðinni Nidovirales, fjölskyldu Arteriviridae, ættkvísl Betaarterivirus [1,2]. Hún er kúlulaga eða sporöskjulaga með 50–65 nm í þvermál undir frystingu rafeindasmásjá [3,4]. PRRSV erfðamengi er um það bil 15 kb að lengd með 50 hettu og 30 polyA-hala og inniheldur að minnsta kosti 10 opna lestrarramma (ORFs) hliðstæðar óþýddum svæðum (UTR) bæði á 50 og 30 endastöðvum [5,6] og er umvafið núkleókapsíðpróteini, með tvílaga lípíðhúð til að mynda veiruagnir. Exosomes tilheyra blöðrum með einlaga himnubyggingu og hafa sömu staðfræðilega uppbyggingu og frumur [7]. Lögunin er „bikarlaga“ eða „skífulaga“ í rafeindasmásjá [8,9]. Exosomes geta verið til í blóðrásarkerfinu í langan tíma og efni í exosomes geta verið frásogast af aðliggjandi frumum eða fjarlægum viðtakafrumum og stjórna síðan viðtakafrumunum til að taka þátt í skiptum á erfðaefni milli frumna [10,11]. Þau eru aðallega samsett úr himnuyfirborðsefnum og fluttu innihaldi, þar á meðal frumuyfirborðsviðtökum, himnupróteinum, leysanlegum próteinum, lípíðum, RNA (mRNA, miRNA, lncRNA og veiru RNA o.s.frv.), erfðafræðilegt DNA, hvatbera DNA [12–14 ]. MicroRNA (miRNA) eru flokkur 18–25 núkleótíða (nt) þróunarlega varðveitt innræn ókóðandi einþátta lítil RNA, sem hindra þýðingarferlið með því að framkalla niðurbrot mark-mRNA eða með því að bindast við 30 UTR af mark-mRNA, sem leiðir til að genaþöggun eftir umritun og stjórna síðan genatjáningu á eftir umritunarstigi [15-17]. Áætlað er að miRNA stýri meira en 60% af genum spendýra eftir umritun [18,19]. MiRNA gegna mikilvægu hlutverki í samskiptum milli frumna og er einnig hægt að nota sem hugsanlega starfhæfa sameind fyrir sjúkdóma og veirusýkingu, sendingu og varnir [20]. Vaxandi fjöldi rannsókna hefur sýnt að miRNA getur verið til staðar í líkamsvökva, eins og munnvatni, þvagi, brjóstamjólk og blóði, og virkað í gegnum blóðrásarkerfi líkamans [21,22]. Exosomal miRNAs eru talin vera innræn stýringar á tjáningu gena og umbrotum og geta bent til ýmissa sjúklegra sjúkdóma [23,24].

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Undanfarna tvo áratugi hefur verið sýnt fram á að miRNAs gegna mikilvægu hlutverki við að stjórna þróun ónæmisfrumna, meðfædd ónæmissvörun og áunnin ónæmissvörun. Tilkynnt er um að sum önnur miRNA skerði PRRSV sýkingu með eftirfarandi hætti, beinist beint að PRRSV erfðamengi eða PRRSV viðtaka, eða gegni hlutverki með því að stjórna meðfæddu ónæmissvörun hýsilsins. miR-26 fjölskyldan getur skaðað afritun vírusa verulega og miR-26a getur hindrað afritun PRRSV-stofna af tegund 1 og tegund 2 í lungnablöðrum átfrumna úr svínum (PAM) með því að stjórna interferóni af tegund I (IFN) braut, sem er skilvirkari en miR-26b [25,26]. miR-30c og miR-125b eru auðkennd til að móta meðfædda ónæmissvörun hýsils með því að miða á tegund I IFN feril og NF-KB feril, í sömu röð [27–29]. MiR-23, miR-378 og miR-505 eru veirueyðandi hýsilþættir sem miða á PRRSV og hafa íhaldssöm marksvæði í PRRSV-stofnum af tegund 2 [30]. Á sama tíma hefur verið greint frá hýsilmiR-506 sem hindrar PRRSV eftirmyndun með því að miða beint á PRRSV viðtaka CD151 í MARC-145 frumum [31]. miR-181 getur einnig óbeint hindrað PRRSV eftirmyndun með því að lækka PRRSV viðtaka CD163 í blóðeinfrumum og PAM [32]. Að auki geta miRNA stuðlað að afritun PRRSV með því að trufla grunn frumulífeðlisfræði. MiR-24-3p og miR-22 miða beint á 30 UTR af HO-1 meðan á PRRSV sýkingu stendur til að komast undan hömlun á heme súrefnisasa-1 (HO-1), a hitasjokkprótein (einnig þekkt sem HSP32) á PRRSV [33,34]. Vitað er að svín eru næmari fyrir PRRSV og eru síður fær um að verjast innkomu þessa sýkla inn í lífveruna [35]. Í þessari rannsókn var meðfætt ónæmi og áunnið ónæmi svína sem voru sýkt af þessari veiru rannsakað á sameindastigi með því að nota stofn sem er algengur á akrinum. Sermis exosome einangrunarsett, sendingarrafeindasmásjárskoðun (TEM), nanóparticle tracking greining (NTA) og Western blot (WB) voru notuð til að einangra og bera kennsl á sermis exosomes fyrir og eftir sýkingu með PRRSV, fylgt eftir með lítilli RNA raðgreiningu, auðkenningu, og greining á mismunatjáningarniðurstöðum með lífupplýsingaaðferðum til að fá nokkur PRRSV-tengd sermi exosome miRNAs, fylgt eftir með auðkenningu á gagnaniðurstöðum með því að nota megindlega rauntíma PCR (qRT-PCR).

2. Efni og aðferðir

2.1. Dýratilraunir

Sex PRRSV mótefnavaka og tvíneikvæð mótefnavaka heilbrigð 42-dagsgömul stór hvít svín voru sett í hreint fóðrunarkerfið fyrir svín til einangrunar, heilsugæslu og umhverfisaðlögunar. Öllum svínum var frjálst að borða og drekka án takmarkana. Þegar þeir voru kunnugir aðstæðum í einangrunartækinu voru svínin sáð í nefið með 2 ml 105 TCID50/ml PRRSV NADC 30-eins og CHsx1401, sem var nefnt af forverum [36,37]. Blóði svínanna fyrir (viðmiðunarhópur, n=6) og 7 dögum eftir (meðferðarhópur, n=6) veiru sáningu var safnað úr fremri holæð til einangrunar í sermi. Frumuruslið í sermiinu var fjarlægt með skilvindu við 3000 g í 15 mín. Allar dýratilraunir í rannsókninni okkar voru samþykktar af dýrasiðanefnd dýravísindastofnunarinnar, Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS) (Beijing, Kína), IAS2022-130.

2.2. Einangrun og hreinsun á sermi exosomes

Exosome einangrun og hreinsun voru framkvæmd með því að nota exoEasy Maxi Kit (QIAGEN, Hilden, Þýskalandi, cat. no. 76064) samkvæmt samskiptareglum framleiðanda.

2.3. Sendingarrafeindasmásjá (TEM)

Dregnar exósóm sviflausnir voru blettaðar á formvar kolefnishúðaða koparnetið og exósómin voru skoluð með PBS og sett í staðlaða úranýl asetat litun í 3 mínútur við stofuhita. Eftir þurrkun í nokkrar mínútur við stofuhita var ristið sýnt og myndað við 100 kV með rafeindasmásjá (HT-7700, Hitachi-High Tech, Tókýó, Japan).

2.4. Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)

Útdregin exósóm voru þynnt með 1 × PBS með því að breyta rúmmálinu úr 10 í 30 µL. Eftir að sýnið var prófað var styrkur og stærð sermisfrumuefna greind með N30E flæði nanógreiningartæki eftir leiðbeiningum framleiðanda (NanoFCM, Xiamen, Kína).

2.5. Western Blot

Útdregnu exosome sýnunum var bætt við RIPA lýsat blandað með próteasa hemli (Invitrogen, Waltham, MA, USA) og fenýlmetýlsúlfónýl flúoríði (PMSF) til að draga út exosome próteinið, sem var leyst á ís í 30 mínútur. Síðan, samkvæmt leiðbeiningum Bradford settsins, töluðum við styrk exosome próteins í sermi. Exosome prótein gengust undir varmaeðlun. Sama magn af próteini var aðskilið á 12% SDS-PAGE hlaupi og síðan flutt yfir á pólývínýlídenflúoríð (PVDF) himnu (Millipore, Burlington, MA, Bandaríkjunum). Það var lagt í bleyti í TBST sem innihélt 5% undanrennuduft og lokað í 1 klst við stofuhita. Við lögðum himnuna í bleyti í þynntu aðal mótefninu (and-CD9 mótefni, Abcam, Boston, MA, Bandaríkjunum, #ab92726; and-CD81 mótefni, Abcam, Boston, MA, Bandaríkjunum, #ab109201) yfir nótt við 4 ◦C, og náðum okkur aftur aðal mótefnið. Við lögðum himnuna í bleyti í þynntu aukamótefninu, ræktuðum það við stofuhita í 1 klst og endurheimtum aukamótefnið. Við lögðum þvegna filmuna af PBST á ferska geymslufilmuna, bættum við jafnmiklu rúmmáli blönduðrar ECL a/b litningalausnar og settum hana í efnaljómunarmyndarann.

cistanche ávinningur fyrir karla styrkir ónæmiskerfið

Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur

【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.6. Exosomal Small RNA raðgreining og gagnagreiningar

Heildar-RNA úr exósómunum var dregið út með Trizol samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Við fundum síðan RNA styrk og ljósþéttleika (OD) gildi og greindum niðurbrot og hreinleika RNA með 1% agarósa gel rafdrætti. Á sama tíma var Agilent Bioanalyzer 2100 notað til að greina heilleika RNA. Við notuðum heildar-RNA exósóma eftir gæðaskoðun. Samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda notuðum við NEB NEXT multiplex lítið RNA bókasafn undirbúningssett fyrir Illumina® (Illumina, San Diego, CA, Bandaríkjunum). Settið útbjó lítið RNA cDNA safn og raðaði því til að framleiða 50 nt einenda lestur með Illumina Novaseq 6000 pallinum. Allar aðferðir við undirbúning lítið RNA bókasafns voru framkvæmdar af Novogene (Beijing, Kína). Gögnin eftir gæðaeftirlit voru samræmd við viðmiðunarerfðamengi svína (Sus scrofa 11.1) með bogabindi. Þekkt miRNA var auðkennt af miRbase (v22.0) gagnagrunninum [38] (https://www.mirbase.org, skoðaður 14. janúar 2022), miRdeep2 (v0.0.5) [39] og miRevo (v1.1) ) [40] og voru notuð til að spá fyrir um ný miRNA. Á sama tíma var mismunatjáningargreining fyrir miRNA gerð með DESeq (v1.24.0) [41], sem krefst |faldrar breytingar| > 1,6 og p < 0,05. Jöfnun var framkvæmd með MEGA (V11) [42] fylgt eftir með stakri grunneinkunn með því að nota PHAST (v1.6.9) [43] og mat á mest varðveittu svæðum 10 vírusgena, þar á meðal WUH3 (GenBank aðgangsnr. HM853973), VR2332 ( GenBank aðgangsnr. U87392), JXA1 (GenBank aðgangsnr. EF112445), CH-1a (GenBank aðgangsnr. AY032626), NADC30 (GenBank aðgangsnr. HN654459), HUN4 (GenBank aðgangsnr. EF635000D6), HLJZD6. 22-1812 (GenBank aðgangsnr. MN648450), SC/DJY (GenBank aðgangsnr. MT075480) og Lelystad (GenBank aðgangsnr. M96262.2). RNAhybrid (V2.0) [44] var notað til að spá fyrir um bindingu auðkenndu miRNA röðarinnar við 3 0 UTR CHsx1401 veirunnar erfðamengi. Miranda (v3.3a) og RNAhybrid voru notuð til að miða við genaspá. Klasasniðið [45] R pakkinn var notaður fyrir GO (Gene Ontology) hagnýtur auðgunargreiningu á markgenum og KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) leiða auðgunargreiningu.

2.7. Staðfesting á miRNA tjáningu með RT-qPCR

Heildar-RNA var einangrað úr sermi exosomes með Trizol (Invitrogen, Shanghai, Kína) samkvæmt samskiptareglum framleiðanda. Einangraða RNA var staðfest með RT-qPCR á sýnum (n=6 á hóp). cDNA var búið til samkvæmt leiðbeiningum miRNA 1. strengs cDNA nýmyndunar (með stofnlykkja) setti (Vazyme, Nanjing, Kína) og flúrljómunarmagngreiningin var framkvæmd með því að nota ABI 7500 samkvæmt leiðbeiningar um alhliða miRNA SYBR qPCR master mix (Vazyme, Nanjing, Kína). Hitalotubreyturnar sem notaðar voru voru sem hér segir: fyrsta stigið: 95 ◦C í 30 s; Stig 2: 95 ◦C í 5 sek., 60 ◦C í 34 sek. og 40 lotur; Stig 3: 95 ◦C í 15 sek., 60 ◦C í 1 mín. og 95 ◦C í 15 sek. Grunnraðir miRNA, U6 gensins, voru notaðar sem viðmið [46] og skráðar í aukatöflu S1. Allar qRT-PCR sannprófanir voru gerðar með því að nota þrjár líffræðilegar endurtekningar og með þremur endurteknum fyrir hvert sýni. Hlutfallslegt magn afrita var reiknað út með 2-Ct aðferðinni og SPSS (v22.0) og GraphPad Prism (v8.0) voru notuð til gagnagreiningar og kortlagningar, í sömu röð. p < 0,05 þýðir að munurinn er tölfræðilega marktækur.

3. Úrslit

3.1. Hlutfallslegt gildi mótefnavaka og mótefna eftir vírusbólusetningu

Niðurstöður PRRSV mótefnavaka og mótefnaprófa fyrir (dagur 0) og eftir (dagur 7) áskorun eru sýndar í töflu 1. Sermisfræðileg uppgötvun PRRSV mótefnavaka og mótefna fyrir áskorun var neikvæð og mótefnavakinn var neikvæður. jákvætt eftir áskorunina, sem gefur til kynna að svínin hafi verið sýkt af CHsx1401.

3.2. Einangrun og auðkenning á sermi exosomes

Blöðrurnar sem voru einangraðar úr sermi voru uppgötvaðar með TEM. Flestar blöðrur geta séð íhvolfur undirskála- eða skífulaga exosomes í miðjunni. Himnubrún exósóma er sýnileg og formgerðin er tiltölulega fullkomin (Mynd 1A, B). Nanóagnagreiningin sýndi að 95,73% af exósómunum höfðu 30–150 nm þvermál, aðallega um 72,25 nm, með meðalþvermál 76,22 nm, sem var í samræmi við stærðareiginleika exósóma (Mynd 1C). Þetta stærðarbil var svipað því sem greindist með TEM og staðfesti enn frekar auðkenni þessara blaðra sem exósóm. Western blot greining sýndi að blöðrurnar sem voru einangraðar úr sermissýnunum voru jákvæðar fyrir CD9 og CD81 próteinum (mynd 1D). Ofangreind einkenni eru í samræmi við exosome auðkenningarstaðla sem mótuð voru af International Society for Extrace Vesicles (ISEV) í MISEV2018 [47].

Tafla 1. Mótefnavaka og mótefni (dagur 0) og (dagur 7) með áskorunarveiru.

Mynd 1. Helstu einkenni sermi exosomes. (A, B) sýna formfræðilega eiginleika blöðru með TEM. Kvarðastikur eru 500 nm og 100 nm, í sömu röð. (C) NTA sýnir þvermál og styrk flestra blaðra. (D) Western blot sýndi nærveru exosome merkja CD81 og CD9 í sermi exosomes. Athugið: Blandað í WB niðurstöður er sýnisblandaða sviflausnin einangruð með exoEasy Maxi settinu

3.3. Lítil RNA raðgreining á sermi exosomes

Fyrir hvert sýni náðu hreinu gögnin 0,5 Gb og Q30 grunnprósentan var yfir 96,20%. Hrein lesin af hverju sýni var samræmd við viðmiðunarerfðamengi svína. Af sýnunum 12 fékk viðmiðunarhópurinn 10.920.887, 10.248.696, 10.109.117, 10.655.494, 9.217.285 og 9.782.523 lestir, í sömu röð. Meðferðarhópurinn fékk 11.889.518, 10.593.504, 10.593.504, 12.846.080, 10.105.325, 11.729.451 og 9.789.542 lestir, í sömu röð. Að meðaltali voru 77,96% af heildar hreinum lestum 19–22 kirni (nt) að lengd (Mynd 2A). Lestur eftir gæðaeftirlit voru meira en 92,59% af heildarlestri. Unnuð hrein lesning var samræmd við viðmiðunarerfðamengi svína og kortlagt hlutfall 12 söfn á erfðamenginu var meira en 92,30% og kortlagt hlutfall var 94,98% (Mynd 2B). Það gaf til kynna að smíðaða sermi exosomal miRNA safnið væri hágæða og hentugur til frekari greiningar. Upplýsingar eru skráðar í viðbótartöflu S2.

Mynd 2. Yfirlit yfir litlu RNA umritagögnin. (A) Lengdardreifing á aflestri fjölda exósómsýna í sermi (nt=núkleótíð); (B) hlutfall 12 sýna kortlagt á viðmiðunarerfðamengi

3.4. Mismunandi tjáningargreining á miRNA

Eftir megindlega greiningu á auðkenndri miRNA tjáningu voru miRNAs skimuð með þeim þröskuldum sem lýst var áður í kafla 2.6. Alls fengust 305 miRNA fyrir og eftir sáningu á CHsx1401 stofninum (viðmiðun, n=6; meðferð, n=6). Alls voru 33 miRNA með mismunandi tjáningu (DE) auðkennd á milli hópanna tveggja, 13 DE miRNA voru stýrð upp og 20 DE miRNA voru lækkuð í meðferðarhópnum (mynd 3 og viðbótartafla S3).

3.5. Hagnýtur auðgunargreining á miRNA markgenum

Alls var spáð fyrir um 7283 markgena af 33 DE miRNA, og virkni markgena var aðallega einbeitt í jákvæðri stjórnun MAPK fossa, fituefnaskiptaferlis, stjórnun á innanfrumu merkjaflutningi, ERK1 og ERK2 hlaup o.s.frv. (Mynd 4A ). Hvað varðar sameindavirkni, einblína miRNA markgenin á mismunastigi aðallega á GTP-ensímstýringarvirkni, kínasavirkni, stjórnunarvirkni núkleósíðþrífosfatasa og aðrar aðgerðir sem tengjast merkjaflutningi og orkuefnaskiptum (Mynd 4B). Að auki, meðal frumuþáttanna, taka markgenin aðallega þátt í líffræðilegri virkni supramolecular fjölliða, Golgi, autophagosomes, frumuyfirborðs, snemma endosomes, osfrv. (Mynd 4C). Aðgerðir þessara íhluta eru nátengdar myndun exósóma, sem skýrir einnig nákvæmni raðgreiningarinnar. Auðgunargreining KEGG ferla sýndi að markgenin auðguðust marktækt í innfrumumyndun, MAPK boðferillinn, Rap1 boðferillinn, sphingólípíð boðferillinn og PI3K Akt boðferillinn (p < 0.05) (Mynd 5A) ). Á sama tíma voru auðguðu leiðirnar flokkaðar og greindar. Niðurstöðurnar sýndu að KEGG ferill markgensins var aðallega auðgaður í úrvinnslu umhverfisupplýsinga, sjúkdómum í mönnum og líffræðilegum kerfum (Mynd 5B).

Mynd 3. Mismunandi tjáning miRNA í exósómum. (A) Eldfjallalóð miRNA milli stjórnunar- og meðferðarhópa; (B) stigveldisþyrping hitakorts DE miRNAs milli stjórnunar- og meðferðarhópa.

Mynd 4. GO-virkni auðgunargreining á DE miRNA markgenum. (A) Líffræðilegt ferli DE miRNA markgena; (B) sameindavirkni DE miRNA markgena; (C) frumuhlutar DE miRNA markgena

Mynd 5. KEGG ferli auðgunargreining á markgenum. (A) Verulega auðgað KEGG leið með markgenum af DE miRNA; (B) flokkun verulega auðgaðra KEGG ferla.

3.6. Markaðsspá um sermi exosomal miRNA og PRRSV CHsx1401 erfðamengi

Samkvæmt phastCons skori á einum basa eftir aðlögun með PHAST, fengust samtals átta mest varðveittu hlutar (svört bönd fyrir ofan toppkortið) meðal veiru erfðamengisins (Mynd 6). Alls reyndust 31 DE miRNA bindast varðveitta hlutanum með því að spá fyrir um miRNA bundið við varðveitta hlutann. Meðal þeirra, á varðveitta svæðinu (14.644–15.020 nt) næst 30 UTR (14.870–15.020) CHsx1401 erfðamengisins, er spáð að 16 DE miRNA bindist því, þar á meðal 5 miRNA (ssc-miR}{{15} c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486 og ssc-miR-6529) sem geta tengst 30 UTR CHsx1401. Meðal þessara miRNA var aðeins ssc-miR-223 stýrt upp eftir sýkingu og önnur miRNA voru lækkað eftir sýkingu. Sjá viðbótartöflu S4 fyrir frekari upplýsingar.

Mynd 6. Varðveittir hlutar í erfðamengi CHsx1401 stofns sem spáð er fyrir um af PHAST

3.7. Skimun DE miRNA sem tengist Exosome Function og PRRSV

Margvísleg miRNA sem eru tjáð með mismunandi hætti sem tengjast starfsemi exosomas og PRRSV fundust með virkni auðgunargreiningu á markgenum. Þar á meðal eru 11 DE miRNA eins og ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-744 og ssc-miR-320 þátt í upptöku exósóma og markgen þeirra eru aðallega einbeitt í Ras genafjölskyldan, annexínfjölskyldan og ADP ríbósýleringargenafjölskyldan. Átján DE miRNA, þar á meðal sscmiR-10b, ssc-miR-124a og ssc-miR-128, taka þátt í ónæmistengdum ferlum og markgen þeirra eru aðallega einbeitt í MAPK genafjölskyldu, PIK3 genafjölskyldu og próteinfosfatasa genafjölskyldu. Þó að 11 DE miRNAs séu þátttakendur í veiruinnrás, eru tengdar markgenin aðallega einbeitt í MAPK genafjölskyldunni og próteinfosfatasa genafjölskyldunni. Ennfremur, mörg miRNA sem eru tjáð á mismunandi hátt, svo sem ný_102. Sex DE miRNA, þar á meðal ssc-miR-320, ssc-miR-423-5p, ssc-miR-4331-3p,ssc-miR-7137-3p og ssc-miR{{ 25}}, eru samtjáð í exosome virkni, PRRSV veiru innrás og ónæmistengdum ferlum, eins og sýnt er á mynd 7. Upplýsingar eru sýndar í viðbótartöflu S5.

Mynd 7. DE miRNA tengt exósómupptöku, PRRSV innrás og ónæmi

3.8. QRT-PCR próf á DE miRNA milli hópanna tveggja

Fimm DE miRNA voru valin af handahófi til sannprófunar. Samkvæmt qRT-PCR niðurstöðum jókst tjáning ssc-miR-19a og ssc-miR-32 í meðferðarhópnum, en ssc-miR-124a, ssc-miR{ {8}} og ssc-miR-34c sýndu hærri tjáningu í samanburðarhópnum, í samræmi við raðgreiningargögnin (mynd 8).

Mynd 8. Fimm DE miRNAs staðfest með qRT-PCR

4. Umræður

PRRSV er enn þrjóskur sýkill í alþjóðlegum svínaiðnaði, sem veldur miklu efnahagslegu tapi í heiminum. Sem stendur er bólusetning aðallega notuð til að koma í veg fyrir og stjórna PRRSV, þar á meðal er bóluefnið með breyttu lifandi (MLV) veiru bóluefninu mest notað [48]. Þrátt fyrir að þetta bóluefni hafi verið áhrifaríkt til að draga úr PRRS uppkomu og tíðni, jók það einnig erfðafræðilegan breytileika og fjölbreytileika veirunnar og leiddi til endursamsetningar veiru á milli villtra og lifandi bóluefnaveira á sviði [49,50]. Undanfarin ár hefur útbreiðsla og algengi raðbrigða veirunnar NADC30-eins og PRRSV stofnsins valdið margvíslegum uppkomu æxlunar- og öndunarfæraheilkennis svína í Kína. Líkindin milli CHsx1401 og NADC30 sem notuð voru í þessari rannsókn hélst 92,2–99,1%. Síðan þá hefur það orðið faraldursstofn í Kína. Exósóm, sem miðlar frumusamskipta, finnast víða í ýmsum líkamsvökvum og hafa einstaka kosti við greiningu og meðferð sjúkdóma [51,52]. Samkvæmt fyrri skýrslum gegna exósóm mikilvægu samskiptahlutverki við kynningu mótefnavaka [53], ónæmissvörun [53,54], afritun vírusa [54], krabbameini [55], taugahrörnunarsjúkdómum [56], æðamyndun [57], æxlisfrumum. fólksflutninga [58] og innrásar [59], og hafa mikið rannsóknargildi.

Í þessari rannsókn var raðgreiningartækni með mikilli afköstum notuð til að smíða miRNA tjáningarprófíl sermisexósóma og 33 DE miRNA voru auðkennd. Eins og við vitum öll getur hýsilkóðað miRNA tengst erfðamengi veiru og síðan stjórnað eftirmyndun, myndun og losun veirunnar til að takmarka sýkingu og hafa áhrif á meinafræðilegt ferli [15]. Einnig hefur ítrekað verið greint frá rannsóknum á miRNA sem miða að veiruerfðamengi í dýrum. gga-miR-454 og gga-miR-130b í smitandi bursalsjúkdómi kjúklinga geta miðað á erfðamengi veiru til að hindra veiruafritun, á meðan gga-miR-21 beinist beint að veirupróteininu VP1 til að hindra þýðing á veirupróteinum [60,61]. Í PRRSV rannsóknum binst ssc-miR-181 sérstaklega við mjög varðveitt svæði niðurstreymis veiru erfðamengisins ORF4 og hamlar mjög afritun PRRSV [62]. Í þessari rannsókn náði tjáningarmunur á ssc-miR-181 milli hópanna tveggja ekki marktæku marki. Í rannsókn okkar voru erfðamengi níu mismunandi PRRSV-vírusa borin saman við CHsx1401-stofninn og átta varðveittustu hlutarnir voru auðkenndir. Því var spáð að 31 DE miRNA gætu tengst 8 mest varðveittu hluta CHsx1401 og 16 DE miRNA gætu tengst varðveittu röðunum nálægt 30 UTR CHsx1401. Meðal þeirra, 5 DE miRNA (ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486 og ssc-miR{{ 36}}) getur samtímis tengst CHsx1401 30 UTR. Að auki var spáð að uppstýrð tjáning ssc-miR-223 myndi bindast við 30 UTR mark PRRSV erfðamengisins. Niðurstöðurnar sýndu að varðveittar raðir erfðamengis veirunnar gætu gegnt lykilhlutverki í sjúkdómsvaldandi áhrifum þess og miRNA sem geta bundist varðveittu röðunum milli erfðamengis mismunandi PRRSV stofna gætu haft mikilvæga þýðingu við að stjórna sjúkdómsvaldandi áhrifum veirunnar. Sýnt hefur verið fram á að sum mismunagreind miRNA tengist PRRSV með fyrri rannsóknum og taka jafnvel beint þátt í stjórnun PRRSV, þar á meðal ssc-miR-10b [63], ssc-miR-378 [30] , ssc-miR-124a [64], let-7f-5p [65], ssc-miR-744 [66] og ssc-miR{{57 }}a [67].

PRRSV getur forðast vörn hýsils með því að trufla meðfædd ónæmissvörun. Þessu ferli er stjórnað af mörgum boðleiðum, þar á meðal MAPK boðleið, PI3K Akt boðleið, sjálfsáhrif, chemokine og TNF boðleið. Sem stendur inniheldur MAPK merkjaleiðin þrjár meginleiðir: ERK1/2, JNK og p38 leið. Virkjun MAPK-fallsins getur stuðlað að frumudreifingu hýsilfrumna, aðstoðað vírusinn við að komast undan ónæmisvörn hýsilsins og stuðlað að afritun PRRSV [68]. Þar að auki getur virkjun c-Jun N-enda kínasa (JNKs) og p38 einnig stuðlað að losun bólguþáttarins IL -10 [68-70] og aukið bólguáhrifin. Auk þess að framkalla frumudauða getur PRRSV einnig framkallað sjálfsát, sem getur stuðlað að afritun PRRSV. Virkjun PI3K/Akt er nauðsynleg fyrir innkomu vírusa og eflingu vírusafritunar, og PRRSV-virkjað Akt hindrar frumufrumumyndun hýsils með því að stjórna JNK ferlinum á neikvæðan hátt [71]. TNF Það getur gegnt mikilvægu hlutverki í framköllun og stjórnun bólgusvörunar ásamt öðrum bólguþáttum, en TNF tjáning hefur áhrif á neikvæða stjórnun PRRSV afritunar [72]. Í þessari rannsókn, miRNA (ssc-miR-10b, ssc-miR-122-5p, ssc-miR-124a, ssc-miR-128, ssc-miR{ {24}}a-5p, o.s.frv.), sem auðgað er á þessum brautum, taka þátt í frumudauði af völdum PRRSV, sjálfsáts og bólgu og eru nátengd veiruónæmissvörun, ónæmissniðgangi og eftirmyndun.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Frumuplasmahimnan er rík af ýmsum lípíðflekum og sfingólípíð- og kólesterólrík sfingólípíð (sfingómýelín og glýkósfíngólípíð) eru lykilsameindir lípíðfleka. Viðurkenning á lípíðum af sumum próteinum veirunnar getur verið nauðsynlegt skilyrði fyrir innkomu veirunnar [73]. Hjúpveirur setja glýkóprótein veiruhjúps í lípíðfleka á því stigi að vírusinn kemst inn, hafa samskipti við viðtaka sem staðsettir eru í lípíðflekum eða breyta úr náttúrulegu ástandi í virkjað form til að hefja eða stuðla að innbyrðis/samruna veiru, svo sem HSV, SARS kransæðaveiru og niðurgangsveira með gríslingafaraldri [73,74]. Fyrri rannsóknir komust að því að fjarlæging kólesteróls af yfirborði MARC-145 frumna dró verulega úr PRRSV sýkingu, sem sýndi fram á að hömlun á PRRSV sýkingu var sérstaklega miðlað með því að fjarlægja kólesteról í frumum. Eyðing á kólesteróli í frumuhimnu hamlaði verulega innkomu veira, sérstaklega viðhengi og losun veira [75]. Umbrot sphingólípíða geta stjórnað himnubyggingu og viðloðun, sem hefur mikla þýðingu við innrás PRRSV veira. Endocytosis var mikilvægasta auðgunin í þessari rannsókn. Endocytosis er mikilvægur aðferð við upptöku exósóma af markfrumum. Fyrri rannsóknir hafa sýnt að upptaka utanfrumna er orkukrefjandi og frumubeina-háð ferli, sem undirstrikar hugsanlegt hlutverk innfrumna í þessu ferli [76]. Það hefur verið sannað að nokkrir leiðir geta miðlað þessu ferli, þar á meðal átfrumnaafgangur, átfrumnafrumur, clathrin, osfrv. [77,78], sem leiddi til mismunandi flokkunar og hlutverka innfrumuefna. Auðgun á mismunandi tjáðum exosomal miRNAs á þessari leið gefur til kynna að exosomes gegni mikilvægu hlutverki í PRRSV sýkingu og stjórnun á efnisflutningi og upptöku í exosomes getur leitt til meinalífeðlisfræðilegra breytinga í markfrumum og líffærum.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

5. Ályktanir

Með auðkenningu og lífupplýsingafræðilegri greiningu á sermi exosomal miRNA frá PRRSV sýktum svínum, fengust margs konar PRRSV tengdar ferlar og mismunað tjáð miRNA í þessari rannsókn, svo sem ssc-miR-4331-3p, ssc-miR{{ 5}}, sscmiR-320, ssc-miR-10b, ssc-miR-124a, ssc-miR-128 o.s.frv., sem gegna hugsanlegum hlutverkum í PRRSV -framkallað ónæmissvörun, innrás og upptöku exósóma. Þar að auki, vegna þess að eitt miRNA getur miðað á mörg gena og eitt gen er einnig stjórnað af mörgum miRNA, gegna nokkur miRNA margvísleg hlutverk á ofangreindum leiðum. Sum miRNA hafa verið staðfest til að stjórna PRRSV sýkingu með því að virka á lykilviðtaka eða miða beint á erfðamengi veirunnar, svo sem ssc-miR-10b, ssc-miR-378, miR-124a, láttu-7f-5p, ssc-miR-744, ssc-miR-19a o.s.frv. Á sama tíma spáði þessi rannsókn einnig fyrir um margs konar miRNA sem geta tengst mest varðveitta brotið af 30 UTR erfðamengi CHX1401 veirunnar, þar á meðal ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR{{34} } og ssc-miR-6529, sem gæti verið mikilvægt til að stjórna veirusjúkdómsvaldandi áhrifum.

Heimildir

1. Snijder, EJ; Kikkert, M.; Fang, Y. Arterivirus sameindalíffræði og meingerð. J. Gen. Virol. 2013, 94 Pt 10, 2141–2163. [CrossRef] [PubMed]

2. Lu, Y.; Zhang, Y.; Xiang, X.; Sharma, M.; Liu, K.; Wei, J.; Shao, D.; Li, B.; Tong, G.; Olszewski, MA; o.fl. Notch merki stuðlar að tjáningu bólgusýtókína sem orsakast af mjög sjúkdómsvaldandi svínaæxlunar- og öndunarfæraheilkennisveiru (HP-PRRSV) sýkingu í lungnablöðrum átfrumna svína. Dev. Samgr. Immunol. 2020, 108, 103690. [CrossRef] [PubMed]

3. Dea, S.; Sawyer, N.; Alain, R.; Athanassious, R. Ofurstrúktúraleiginleikar og formgerð svínaæxlunar- og öndunarfæraheilkennisveiru sem fjölgað er í hinni mjög leyfilegu MARC-145 frumuklóni. Adv. Exp. Med. Biol. 1995, 380, 95–98. [PubMed]

4. Dokland, T. Byggingarlíffræði PRRSV. Virus Res. 2010, 154, 86–97. [CrossRef] [PubMed]

5. Johnson, CR; Griggs, TF; Gnanandarajah, J.; Murtaugh, MP Nýtt byggingarprótein í svínaæxlunar- og öndunarfæraheilkennisveiru sem er kóðað af öðrum ORF5 sem er til staðar í öllum slagæðaveirum. J. Gen. Virol. 2011, 92 Pt 5, 1107–1116. [CrossRef] [PubMed]

6. Lee, SC; Lee, S.; Jú, GW; Choi, HW; Nei, YH; Park, CE; Shin, JH; Yoon, IJ; Kang, SY; Lee, C. Svipgerðar- og arfgerðargreiningar á veiklaðri svínaæxlunar- og öndunarfæraheilkenni veirustofni eftir raðleiðir í ræktuðum lungnablöðrum átfrumna svína. J. Vet. Sci. 2018, 19, 358–367. [CrossRef] [PubMed]

7. Zebrowska, A.; Skowronek, A.; Wojakowska, A.; Widlak, P.; Pietrowska, M. Metabolome of exosomes: Áhersla á blöðrur sem losnar af krabbameinsfrumum og eru til staðar í líkamsvökva manna. Alþj. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3461. [Krossvísun]

8. Bebelman, þingmaður; Smit, MJ; Pegtel, DM; Baglio, SR Líffræðileg tilurð og virkni utanfrumublaðra í krabbameini. Pharmacol. Þr. 2018, 188, 1–11. [Krossvísun]

9. Zaborowski, þingmaður; Balaj, L.; Breakefield, XO; Lai, CP Utanfrumublöðrur: Samsetning, líffræðilegt mikilvægi og rannsóknaraðferðir. Lífvísindi 2015, 65, 783–797. [Krossvísun]

10. Almughlliq, FB; Koh, YQ; Peiris, HN; Vaswani, K.; Holland, O.; Meier, S.; Roche, JR; Burke, CR; Crookenden, MA; Arachchige, BJ; o.fl. Exósóm í hringrás geta greint lífmerki fyrir kýr í hættu á efnaskiptatruflunum. Sci. Rep. 2019, 9, 13879. [Krossvísun]

11. Zhang, RC; Du, WQ; Zhang, JY; Yu, SX; Lu, FZ; Ding, HM; Cheng, YB; Ren, C.; Geng, DQ Mesenchymal stofnfrumumeðferð fyrir úttaugaskaða: frásagnarrýni. Tauga Regen. Res. 2021, 16, 2170–2176. [PubMed]

12. Bryzgunova, OE; Zaripov, MM; Skvortsova, TE; Lekchnov, EA; Grigor'eva, AE; Zaporozhchenko, ÍA; Morozkin, ES; Ryabchikova, EI; Yurchenko, YB; Voitsitskiy, VE; o.fl. Samanburðarrannsókn á utanfrumublöðrum úr þvagi heilbrigðra einstaklinga og sjúklinga með krabbamein í blöðruhálskirtli. PLoS ONE 2016, 11, e0157566. [CrossRef] [PubMed]

13. Camussi, G.; Deregibus, MC; Bruno, S.; Grange, C.; Fonsato, V.; Tetta, C. Exosome/microvesicle-miðluð epigenetic endurforritun frumna. Am. J. Cancer Res. 2011, 1, 98–110. [PubMed]

14. Tamkovich, SN; Tutanov, OS; Laktionov, PP Exosomes: Myndun, uppbygging, flutningur, líffræðileg virkni og greiningarnotkun. Biochem. Mosc. Suppl. Ser. Meðlimur. Cell Biol. 2016, 10, 163–173. [Krossvísun]

15. Bartel, DP MicroRNAs: Erfðafræði, líffræðileg myndun, vélbúnaður og virkni. Cell 2004, 116, 281-297. [Krossvísun]

16. Gornino, G.; Costa-Pereira, S.; Corredeira, P.; Alves, P.; Costa, L.; Gomes, AQ; Silva-Santos, B.; Ribot, JC MicroRNA-181a takmarkar aðgreiningu δ T-frumna manna með því að miða á Map3k2 og Notch2. EMBO Rep. 2022, 23, e52234. [Krossvísun]

17. Liu, B.; Yan, L.; Chi, Y.; Sun, Y.; Yang, X. Langt, ókóðarandi RNA AFAP1-AS1 auðveldar framgang krabbameins í eggjastokkum með því að stjórna miR-107/PDK4 ásnum. J. Ovarian Res. 2021, 14, 60. [Krossvísun]

18. Kim, Y.; Lee, DH; Park, SH; Jeon, TI; Jung, CH Samspil míkróRNA og umritunarþátta í sjálfsáhrifastjórnun í óáfengum fitulifursjúkdómum. Exp. Mol. Med. 2021, 53, 548–559. [Krossvísun]

19. Kazmierczak, D.; Jopek, K.; Sterzynska, K.; Nowicki, M.; Rucinski, M.; Januchowski, R. Upplýsingar um tjáningu míkróRNA og hugsanlegt hlutverk í stjórnun lyfjaónæmra gena í cisplatín- og paklítaxel-ónæmum krabbameinsfrumulínum í eggjastokkum. Alþj. J. Mol. Sci. 2022, 23, 526. [Krossvísun]

20. Gong, Y.; Wei, X.; Sun, W.; Ren, X.; Chen, J.; Aweya, JJ; Ma, H.; Chan, KG; Zhang, Y.; Li, S. Exosomal miR-224 stuðlar að blóðvökvajafnvægi við bakteríusýkingu í krabbadýrum. PLoS Pathog. 2021, 17, e1009837. [Krossvísun]

21. Cheng, Y.; Kou, W.; Zhu, D.; Yu, X.; Zhu, Y. Framtíðarleiðbeiningar í greiningu, horfum og eftirliti með sjúkdómum á nýrnahettukrabbameini: Nýir ekki ífarandi lífmerki. Framan. Endocrinol. 2022, 12, 811293. [CrossRef] [PubMed]

22. Gallo, A.; Tandon, M.; Alevizos, I.; Illei, GG Meirihluti míkróRNA sem hægt er að greina í sermi og munnvatni er einbeitt í exosomes. PLoS ONE 2012, 7, e30679. [CrossRef] [PubMed]

23. Fan, B.; Chopp, M.; Zhang, ZG; Liu, XS Nýtt hlutverk míkróRNA sem lífmerki og meðferðarmarkmið fyrir sykursýkis taugakvilla. Framan. Neurol. 2020, 11, 558758. [CrossRef] [PubMed]

24. Wei, H.; Chen, Q.; Lin, L.; Sha, C.; Logandi.; Liu, Y.; Yin, X.; Xu, Y.; Chen, L.; Gao, W.; o.fl. Reglugerð um exósómaframleiðslu og farmflokkun. Alþj. J. Biol. Sci. 2021, 17, 163–177. [Krossvísun]

25. Jia, X.; Bi, Y.; Li, J.; Xie, Q.; Yang, H.; Liu, W. Cellular microRNA miR-26a bælir eftirmyndun svínaæxlunar- og öndunarfæraheilkennisveiru með því að virkja meðfædd veirueyðandi ónæmi. Sci. Rep. 2015, 5, 10651. [CrossRef]

26. Li, L.; Wei, Z.; Zhou, Y.; Jiang, Y.; Yu, L.; Zheng, H.; Tong, W.; Yang, S.; Zheng, H.; Shan, T.; o.fl. Host miR-26a bælir eftirmyndun svínaæxlunar- og öndunarfæraheilkennisveiru með því að stýra interferónum af tegund I. Virus Res. 2015, 195, 86–94. [Krossvísun]

27. Liu, F.; Wang, H.; Du, L.; Wei, Z.; Zhang, Q.; Feng, WH MicroRNA-30c miðar á beta-keðju interferón-alfa/beta viðtaka til að stuðla að PRRSV sýkingu af tegund 2. J. Gen. Virol. 2018, 99, 1671–1680. [Krossvísun]

28. Zhang, Q.; Huang, C.; Yang, Q.; Gao, L.; Liu, HC; Tang, J.; Feng, WH MicroRNA-30c mótar IFN svörun af tegund I til að auðvelda sýkingu af svínum æxlunar- og öndunarfæraheilkenni veiru með því að miða á JAK1. J. Immunol. 2016, 196, 2272–2282. [Krossvísun]

29. Wang, D.; Cao, L.; Xu, Z.; Fang, L.; Zhong, Y.; Chen, Q.; Luo, R.; Chen, H.; Li, K.; Xiao, S. MiR-125b dregur úr fjölgun svínaæxlunar- og öndunarfæraheilkennisveiru með því að stjórna NF-κB ferlinum á neikvæðan hátt. PLoS ONE 2013, 8, e55838. [Krossvísun]

30. Zhang, Q.; Guo, XK; Gao, L.; Huang, C.; Li, N.; Jia, X.; Liu, W.; Feng, WH MicroRNA-23 hindrar PRRSV eftirmyndun með því að miða beint á PRRSV RNA og hugsanlega með því að auka stjórnun interferóna af tegund I. Veirufræði 2014, 450–451, 182–195. [Krossvísun]

31. Wu, J.; Peng, X.; Zhou, A.; Qiao, M.; Wu, H.; Xiao, H.; Liu, G.; Zheng, X.; Zhang, S.; Mei, S. MiR-506 hindrar PRRSV afritun í MARC-145 frumum með CD151. Mol. Cell. Biochem. 2014, 394, 275–281. [Krossvísun]

32. Gao, L.; Guo, XK; Wang, L.; Zhang, Q.; Li, N.; Chen, XX; Wang, Y.; Feng, WH MicroRNA 181 bælir svínaæxlunar- og öndunarfæraheilkennisveiru (PRRSV) sýkingu með því að miða á PRRSV viðtaka CD163. J. Virol. 2013, 87, 8808–8812. [Krossvísun]

33. Xiao, S.; Du, T.; Wang, X.; NIH.; Yan, Y.; Li, N.; Zhang, C.; Zhang, A.; Gao, J.; Liu, H.; o.fl. MiR-22 stuðlar að afritun svínaæxlunar- og öndunarfæraheilkennisveiru með því að miða á hýsilþáttinn HO-1. Dýralæknir. Örverur. 2016, 192, 226–230. [Krossvísun]

34. Xiao, S.; Wang, X.; NIH.; Li, N.; Zhang, A.; Liu, H.; Pu, F.; Xu, L.; Gao, J.; Zhao, Q.; o.fl. MicroRNA miR-24-3p stuðlar að afritun vírusa til æxlunar og öndunarfæraheilkennis með því að bæla heme súrefnisasa-1 tjáningu. J. Virol. 2015, 89, 4494–4503. [Krossvísun]

35. Butler, JE; Sinkora, M.; Wang, G.; Stepanova, K.; Li, Y.; Cai, X. Truflun á þróun skjaldkirtils liggur að baki PRRS heimsfaraldursins: Prófanleg tilgáta. Framan. Immunol. 2019, 10, 1077. [Krossvísun]

36. Zhou, L.; Wang, Z.; Ding, Y.; Stepanova, K.; Li, Y.; Cai, X. NADC30-líkur stofn af svínaæxlunar- og öndunarfæraheilkennisveiru, Kína. Koma fram. Smitast. Dis. 2015, 21, 2256–2257. [Krossvísun]

37. Zhou, L.; Yang, B.; Xu, L.; Jin, H.; Ge, X.; Guo, X.; Han, J.; Yang, H. Virknimat á þremur breyttum lifandi veirubóluefnum gegn stofni af svínaæxlunar- og öndunarfæraheilkennisveiru NADC30-líkt. Dýralæknir. Örverur. 2017, 207, 108–116. [Krossvísun]

38. Wong, N.; Wang, X. miRDB: Tilföng á netinu fyrir spá um microRNA-markmið og hagnýtar athugasemdir. Nucleic Acids Res. 2015, 43, D146–D152. [Krossvísun]

39. Friedländer, MR; Mackowiak, SD; Li, N.; Chen, W.; Rajewsky, N. miRDeep2 auðkennir nákvæmlega þekkt og hundruð nýrra míkróRNA gena í sjö dýraklæðum. Nucleic Acids Res. 2012, 40, 37–52. [Krossvísun]

40. Wen, M.; Shen, Y.; Shi, S.; Tang, T. miREvo: Samþættur microRNA þróunargreiningarvettvangur fyrir næstu kynslóðar raðgreiningartilraunir. BMC Bioinform. 2012, 13, 140. [Krossvísun]

41. Anders, S.; Huber, W. Mismunadrifatjáningargreining fyrir raðtölugögn. Erfðamengi Biol. 2010, 11, R106. [CrossRef] [PubMed]

42. Tamura, K.; Stecher, G.; Kumar, S. MEGA11: Sameindaþróunarerfðafræðigreining útgáfa 11. Mol. Biol. Evol. 2021, 38, 3022–3027. [CrossRef] [PubMed]

43. Hubisz, MJ; Pollard, KS; Siepel, A. PHAST og RPHAST: Sýklafræðileg greining með rúm/tíma líkönum. Stutt. Lífupplýsa. 2011, 12, 41–51. [CrossRef] [PubMed]

44. Krüger, J.; Rehmsmeier, M. RNAhybrid: örRNA markmiðsspá auðveld, hröð og sveigjanleg. Nucleic Acids Res. 2006, 34, W451–W454. [Krossvísun]

45. Yu, G.; Wang, LG; Han, Y.; Hann, QY clusterProfiler: R pakki til að bera saman líffræðileg þemu meðal genaþyrpinga. OMICS 2012, 16, 284–287. [Krossvísun]

46. ​​Que, R.; Ding, G.; Chen, J.; Cao, L. Greining á sermi exosomal microRNAs og klínískum meinafræðilegum eiginleikum sjúklinga með kirtilkrabbamein í brisi. Heimur J. Surg. Oncol. 2013, 11, 219. [Krossvísun]

47. Théry, C.; Witwer, KW; Aikawa, E.; Alcaraz, MJ; Anderson, JD; Andriantsitohaina, R.; Antoniou, A.; Arabi, T.; Archer, F.; Atkin-Smith, GK; o.fl. Lágmarksupplýsingar fyrir rannsóknir á utanfrumublöðrum 2018 (MISEV2018): Afstöðuyfirlýsing Alþjóðasamtaka um utanfrumublöðrur og uppfærsla á leiðbeiningum MISEV2014. J. Extracell. Blár 2018, 7, 1535750. [CrossRef]

48. Lyoo, K.-S.; Choi, JY; Hahn, TW; Park, KT; Kim, HK Áhrif bólusetningar með breyttu lifandi svínaæxlunar- og öndunarfæraheilkennisveirubóluefni á vaxtarafköst í eldisvínum við aðstæður á akri. J. Vet. Med. Sci. 2016, 78, 1533–1536. [Krossvísun]

49. Bian, T.; Sun, Y.; Hao, M.; Zhou, L.; Ge, X.; Guo, X.; Han, J.; Yang, H. Raðbrigða tegund 2 svínaæxlunar- og öndunarfæraheilkennisveiru milli NADC 30-lík og MLV-lík: Erfðafræðileg einkenni og sjúkdómsvaldandi áhrif fyrir grísa. Smitast. Genet. Evol. 2017, 54, 279–286. [Krossvísun]

50. Li, Y.; Ji, G.; Wang, J.; Tan, F.; Zhuang, J.; Li, X.; Tian, ​​K. Heill erfðamengisröð NADC30-Eins og svínaæxlunar- og öndunarfæraheilkennisveiru sem einkennist af endurröðun við aðra stofna. Erfðamengi tilkynnt. 2016, 4, e00330-16. [Krossvísun]

51. Kalluri, R.; Lebleu, VS Líffræði, virkni og lífeðlisfræðileg notkun exósóma. Vísindi 2020, 367, eau6977. [CrossRef] [PubMed]

52. Miao, XY Nýlegar framfarir í skilningi á hlutverki miRNAs í exosomes og lækningamöguleika þeirra. J. Samþ. Agric. 2017, 16, 753–761. [Krossvísun]

53. Shenoda, BB; Ajit, SK Stöðun ónæmissvörunar með exósómum úr frumum sem sýna mótefnavaka. Clin. Med. Innsýn Pathol. 2016, 9 (Viðauki S1), CPath-S39925. [CrossRef] [PubMed]

54. Li, S.; Li, S.; Wu, S.; Chen, L. Exosomes móta veiruafritunina og hýsa ónæmissvörun í HBV sýkingu. BioMed Res. Alþj. 2019, 2019, 2103943. [Krossvísun]

55. Græning, DW; Gopal, SK; Xu, R.; Simpson, RJ; Chen, W. Exosomes og hlutverk þeirra í ónæmisstjórnun og krabbameini. Í námskeiðum í frumu- og þroskalíffræði; Academic Press: Cambridge, MA, Bandaríkjunum, 2015; 40. bindi, bls. 72–81.

56. Howitt, J.; Hill, AF Exosomes í meinafræði taugahrörnunarsjúkdóma. J. Biol. Chem. 2016, 291, 26589–26597. [Krossvísun]

57. Ribeiro, MF; Zhu, H.; Millard, RW; Fan, G. Exosomes virka í pro-og and-angiogenesis. Curr. Æðamyndun 2013, 2, 54–59. [Krossvísun]

58. Lan, J.; Sun, L.; Xu, F.; Liu, L.; Hu, F.; Söngur, D.; Hou, Z.; Wu, W.; Luo, X.; Wang, J.; o.fl. M2 átfrumuafleidd exósóm stuðla að frumuflutningi og innrás í ristilkrabbameini. Cancer Res. 2019, 79, 146–158. [Krossvísun]

59. Aga, M.; Bentz, GL; Raffa, S.; Torrisi, MR; Kondo, S.; Wakisaka, N.; Yoshizaki, T.; Pagano, JS; Shackelford, J. Exosomal HIF1 styður ífarandi möguleika á krabbameini í nefkoki sem tengist LMP 1-jákvæðum exósómum. Oncogene 2014, 33, 4613–4622. [Krossvísun]

60. Fu, M.; Wang, B.; Chen, X.; Hann, Z.; Wang, Y.; Li, X.; Cao, H.; Zheng, SJ gga-miR-454 bælir afritun smitandi bursal sjúkdómsveiru (IBDV) með því að miða beint á IBDV erfðafræðilega hluta B og frumu bæla frumuboða 6 (SOCS6). Virus Res. 2018, 252, 29–40. [Krossvísun]

61. Fu, M.; Wang, B.; Chen, X.; Hann, Z.; Wang, Y.; Li, X.; Cao, H.; Zheng, SJ MicroRNA gga-miR-130b bælir afritun smitandi bursal sjúkdómsveiru með því að miða á erfðamengi veiru og frumubæla frumuboða 5. J. Virol. 2018, 92, e01646-17. [Krossvísun]

62. Guo, XK; Zhang, Q.; Gao, L.; Li, N.; Chen, XX; Feng, WH Aukin tjáning á microRNA 181 hamlar afritun vírusa í æxlunar- og öndunarfæraheilkenni og hefur áhrif á að stjórna veirusýkingu. J. Virol. 2013, 87, 1159–1171. [CrossRef] [PubMed]

63. Cong, P.; Xiao, S.; Chen, Y.; Wang, L.; Gao, J.; Li, M.; Hann, Z.; Guo, Y.; Zhao, G.; Zhang, X.; o.fl. Samþætt miRNA og mRNA umrit af lungnablöðrum átfrumna úr svínum (PAM frumur) auðkenna stofnsértækar miRNA sameinda einkenni sem tengjast H-PRRSV og N-PRRSV sýkingu. Mol. Biol. þingmaður 2014, 41, 5863–5875. [CrossRef] [PubMed]

64. Li, N.; Huang, K.; Chen, Y.; Huang, Z.; Zhang, Y.; Leng, C.; Liu, Y.; Shi, J.; Xiao, S.; Yao, L. MicroRNA ssc-miR-124a sýnir veirueyðandi virkni gegn svínaæxlunar- og öndunarfæraheilkennisveiru með bælingu hýsilgenanna CD163. Dýralæknir. Örverur. 2021, 261, 109216. [CrossRef] [PubMed]

65. Li, N.; Du, T.; Yan, Y.; Zhang, A.; Gao, J.; Hou, G.; Xiao, S.; Zhou, EM MicroRNA let-7f-5p hindrar svínaæxlunar- og öndunarfæraheilkennisveiru með því að miða á MYH9. Sci. Rep. 2016, 6, 34332. [Krossvísun]

66. Zhen, Y.; Wang, F.; Liang, W.; Liu, J.; Gao, G.; Wang, Y.; Xu, X.; Su, Q.; Zhang, Q.; Liu, B. Auðkenning á misjafnlega tjáð RNA sem ekki er kóðað í lungnablöðrum átfrumna úr svínum frá Tongcheng og stórum hvítum svínum svöruðu PRRSV. Sci. Rep. 2018, 8, 15621. [Krossvísun]

67. Zhou, X.; Michal, JJ; Jiang, Z.; Liu, B. MicroRNA tjáningarsnið í lungnablöðrum átfrumum frumbyggja kínverskra Tongcheng svína sem eru sýkt af PRRSV in vivo. J. Appl. Genet. 2017, 58, 539–544. [Krossvísun]

68. Lee, YJ; Lee, C. Æxlunar- og öndunarfæraheilkenni veira eftirmyndun svína er bæld með hömlun á utanfrumumerkjastýrðum kínasa (ERK) boðleiðinni. Virus Res. 2010, 152, 50–58. [Krossvísun]

69. Söngur, S.; Bi, J.; Wang, D.; Fang, L.; Zhang, L.; Li, F.; Chen, H.; Xiao, S. Veirusýking í æxlunar- og öndunarfæraheilkenni virkjar IL-10 framleiðslu með NF-κB og p38 MAPK ferlum í lungnablöðrum átfrumna svína. Dev. Samgr. Immunol. 2013, 39, 265–272. [Krossvísun]

70. Yin, S.; Huo, Y.; Dong, Y.; Fan, L.; Yang, H.; Wang, L.; Ning, Y.; Hu, H. Nauðsynlegt er að virkja c-Jun NH (2)-enda kínasa fyrir æxlunar- og öndunarfæraheilkenni veira af völdum frumudauða, en ekki fyrir vírusafritun. Virus Res. 2012, 166, 103–108. [Krossvísun]

71. Fan, L. Merkjaleiðir sem taka þátt í að stjórna frumufrumuvirkjun í hýsilfrumum við PRRSV sýkingu. Veiru gen 2019, 55, 433–439. [Krossvísun]

72. Lopez-Fuertes, L.; Campos, E.; Domenech, N.; Ezquerra, A.; Castro, JM; Dominguez, J.; Alonso, F. Porcine æxlunar- og öndunarfæraheilkenni (PRRS) veira minnkar TNF-framleiðslu í sýktum átfrumum. Virus Res. 2000, 69, 41–46. [Krossvísun]

73. Teissier, É.; Pécheur, EI Lipíð sem mótara himnusamruna sem miðlað er af veirusamrunapróteinum. Eur. Lífeðlisfræði. J. 2007, 36, 887–899. [Krossvísun]

74. Jeon, JH; Lee, C. Kólesteról í frumum er nauðsynlegt fyrir nídóveirusýkingu úr svínum. Arch. Virol. 2017, 162, 3753–3767. [Krossvísun]

75. Sun, Y.; Xiao, S.; Wang, D.; Luo, R.; Li, B.; Chen, H.; Fang, L. Kólesteról í frumuhimnu er nauðsynlegt fyrir innkomu og losun svínaæxlunar- og öndunarfæraheilkennisveiru í MARC-145 frumum. Sci. Kína lífvísindi. 2011, 54, 1011–1018. [Krossvísun]

76. Tian, ​​T.; Zhu, YL; Zhou, YY; Liang, GF; Wang, YY; Hu, FH; Xiao, ZD Upptaka exósóma í gegnum clathrin-miðlaða endocytosis og macropinocytosis og miðla miR-21 afhendingu. J. Biol. Chem. 2014, 289, 22258–22267. [Krossvísun]

77. Mulcahy, LA; Bleikur, RC; Carter, DRF Leiðir og aðferðir við upptöku utanfrumublöðru. J. Extracell. Vesicles 2014, 3, 24641. [CrossRef]

78. Zhang, M.; Zang, X.; Wang, M.; Li, Z.; Qiao, M.; Hu, H.; Chen, D. Nanóberar sem byggjast á exósómi sem líffræðilega innblásin og fjölhæf farartæki fyrir lyfjagjöf: Nýlegar framfarir og áskoranir. J. Mater. Chem. B 2019, 7, 2421–2433. [Krossvísun]