Rannsókn á áhrifum acteoside (virkt innihaldsefni í cistanche deserticola) á NAFLD með því að örva autophagy

Ágrip:

 

Markmið:Til að kanna autophagy örvandi virkni virks innihaldsefnis acteoside (ACT) í Cistanche Deserticola og áhrifum þess á óáfengan fitusjúkdóm í lifur (NAFLD).

AðferðirTil að taka echinacoside og virka sem rannsóknarhlutir, voru 1 0 0 μmol/l ACT og echinacoside (ech) sameinuð með autophagy-lysósóm hemli bleomycin A1 til íhlutunarmeðferðar. Prótein ónæmisblöðru var notað til að greina hlutfallslegt tjáningarstig autophagy merkis prótein míkrótúlu tengd prótein 1 ljósakeðja 3 (LC 3- II). HepG2 frumur voru gripin inn með mismunandi styrk ACT in vitro og lífvænleiki frumna fannst með því að nota tetrazolium saltaðferðina. Í vitro íhlutun HepG2 frumna með mismunandi styrk ACT ásamt balofloxacin A1 og greining á LC 3- II próteintjáningu með því að nota prótein ónæmisblokkatækni. NAFLD líkan smíðað in vitro með lyfjaíhlutun var notuð til að bletti lípíðdropa með því að nota olíu rauða O litunaraðferð og greina þríglýseríðmagn innanfrumna. Fylgstu með staðsetningu LC3 próteins og lípíðdropa með ónæmisflúrljómunartækni. Niðurstöður Act geta framkallað verulega autophagy í HepG2 frumum og tjáningarstig LC 3- II próteins er verulega aukið miðað við samanburðarhópinn (meðhöndlað með ACT eingöngu) (1,36 ± {0. hver um sig), með tölfræðilega þýðingu (P0.05). 50 μmól/l virka marktækt framkallaði autophagy í HepG2 frumum og tjáningarstig LC 3- II próteins var verulega aukið (1,83 ± 0,53, 0,35 ± 0,18, í sömu röð). Tg stig Hepg2 frumna í ACT íhlutunarhópnum (19,11 ± 1,68) var marktækt lægra en í NAFLD in vitro frumulíkanahópi (34,15 ± 1,90), og munurinn var tölfræðilega marktækur (P<0.05). The number of positive lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group decreased significantly, and the number of autophagosomes inside the cells increased significantly, showing clear co localization with lipid droplets in space. Conclusion Cistanche deserticola ACT has significant autophagy induction ability, and it may have potential preventive and therapeutic effects on NAFLD.

 

Lykilorð:Óáfengur fitusjúkdómur í lifur;Cistanche Deserticola;Acteoside; Autophagy

 

TCM Herb Cistanche til meðferðar á óáfengum fitusjúkdómi (NAFLD)

Smelltu á myndina til að fá frekari upplýsingar

 

Undanfarna áratugi var óáfengur feiturlifrarsjúkdómur(NAFLD) er orðið algengasturLangvinn lifrarsjúkdómur, með alheims algengi um það bil 25% fullorðinna íbúa og er talið vera nátengt efnaskiptaheilkenni [1]. Þrátt fyrir að líkurnar á fylgikvillum sem tengjast lifur hjá NAFLD sjúklingum séu innan við 10%, er NAFLD áhættuþáttur fyrir lifrartengda sjúkdóma eins og skorpulifur og aðal lifrarkrabbamein, sem leggur mikla efnahagslega byrði á sjúklinga [{5}}]. Þrátt fyrir vaxandi athygli sem NAFLD hefur veitt hefur NAFLD sem mikilvægur langvinnur sjúkdómur ekki fengið næga athygli. Þess vegna hefur frekari ítarlegur skilningur á meingerð NAFLD og leit að árangursríkum meðferðaráætlunum orðið brýn vandamál sem á að leysa [6-7].

Nýlegar rannsóknir hafa sýnt að frumu autophagy gegnir mikilvægu hlutverki í lífeðlisfræði og meinafræði í lifur [8]. Truflun á autophagy eða truflun tengist ýmsum lifrarsjúkdómum eins ogÁfengistengd lifrarsjúkdómur[9], NAFLD [10], óáfengur steatohepatitis [11] og lifrarfrumukrabbamein [12]. Meinafræðileg einkenni NAFLD eru óhófleg útfelling þríglýseríða (TG) og annarra hlutlausra fitudropa (LD) í lifrarfrumum undir óáfengum örvun. Fyrir lifur eru tvær helstu leiðir sem stjórna niðurbrot þessara LDs fitusjúkdóms og autophagy.
Lipolysis ferillinn er stjórnaður af umfrymis hlutlausum lípasa, svo sem hormónnæmum lípasa og fitu Tg lípasa. Í samsvarandi lípóutophagy ferli er hægt að taka LDS sértækt með því að ráða beint autophagy-tengt prótein til að mynda autophagosomes, og síðan eru LDS sem eru umlukaðir af autophagosomes skilaðir frekar til lysosomes og niðurbrots af sýru lípasa í lýsósómum. Þess vegna hefur virkjun lipoautophagy í lifrarfrumum orðið árangursrík stefna til að koma í veg fyrir og meðhöndla NAFLD.
Cistanche Deserticola er dýrmætt kínverskt jurtalyf sem hefur verið mikið notað í klínískri framkvæmd í hefðbundnum kínverskum lyfjaformúlum. Á sama tíma hefur það lengi verið notað sem heilsufæði. Cistanche Deserticola inniheldur margs konar lífvirk innihaldsefni, en það mikilvægasta er Cistanche Deserticola fenýletanól glýkósíð. Sem fulltrúar fenýletanóíðs glýkósíðs hefur verið greint frá því að echinacoside (ECH) og Verbaskosíð (ACT) hafi margar mikilvægar líffræðilegar athafnir, svo sem andoxunarefni, taugavörn, ónæmisbælandi og lifrarvörn [13]. Hvað varðar lifrarvernd hafa rannsóknir komist að því að ECH getur verndað lifur með því að draga úr bólgusjúkdómum, hindra umbreytingu vaxtarþáttar og draga úr tjáningarstigi lifrarvefjatengdra gena. ACT hefur veruleg verndandi áhrif á lifrarskemmdir af völdum efna og lyfja, svo sem áfengi, koltetraklóríð og lípópólýsakkaríði. ACT dregur úr oxunarálagi af völdum eitruðra efna, fjarlægir viðbrögð súrefnis sem safnast í lifur og dregur úr styrk malondialdehýðs. Á sama tíma eykur það verulega lifrar superoxíð dismutase virkni og minnkað glútatíóninnihald og bætir verulega vefjameinafræðilega skemmdir og apoptosis. Hins vegar er engin viðeigandi bókmenntaskýrsla um hvort fenýletanóíð glýkósíð af Cistanche Deserticola taki þátt í ferli autophagy við að beita lifrarvernd. Byggt á þessu notaði þessi rannsókn hefðbundnar frumulíffræðiaðferðir og in vitro frumulíkan til að kanna forköntunaráhrif á autophagy-örvandi áhrif cistanche deserticola fenýletanoid glýkósíðs og kannaði mögulegar lyfjafræðilegar aðgerðir þess, sem miðaði að því að veita vísindalegan grundvöll fyrir þróun lyfja í framtíðinni.

 

1 Efni og aðferðir

1.1 Efni

1.1.1 Rannsóknargreinar ECH og ACT voru notaðir sem rannsóknargreinar.

1.1.2 Efni HepG2 frumur voru keyptar frá Wuhan Punosai Life Science Co., Ltd., ECH (lotufjöldi: B21209) og ACT (hópnúmer: B20715, HPLC Purity Meira en eða jafnt og 98%) voru keyptir frá Shanhai Yuanye Biological Compan Buffer, og trypsin voru keypt frá Hyclone Company, USA, fóstur nautgripasermi (lotunúmer: 04-002-1 a) var keypt af BI Company, Ísrael, Penicillin/Streptomycin (Batch Number: SV300.01) var keypt frá Hyclone Company, USA, MTT (Batch Number: M8180) Power) Fyrirtæki, Peking, Kína, TG (lotunúmer: BC0625) Greiningarbúnað var keypt frá Solebao Company, Peking, Kína, Oil Red O (Lot Number: O 0625-100 g), dimetýlsúlfoxíð (Lot Number: BCBZ1685) voru keypt af Sigma-Aldrich, USA; Autophagy-Lysosome hemillinn Bafilomycin A1 (BAFA1, Lot Number: TLRL-BAF1) var keyptur frá Invitrogen, Bandaríkjunum; Autophagy Activator Rapamycin (Lot Number: S17098) var keypt af Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., Kína; Microtubule-tengt prótein 1 Ljósakeðja 3 (LC3, Lot Number: L7543, tegundir: kanína, þynningarhlutfall: 1: 1 000) og -Actin (lóðanúmer: ZRB1312, tegundir: kanínu, þynningarhlutfall: 1: 5 000) Mótefni voru keypt frá SIGMA-ALRICH, USA; Hiperarót peroxídasa merkt aukamótefni (lóðanúmer: 4010-05, tegundir: geitar gegn kanínu, þynningarhlutfalli: 1: 1 000) var keypt frá Southern Biotech, USA Company, Alexa Fluorescent LaBeled Seconary Antibody: 1000) var Keypt af Sigma-Aldrich Company, Bandaríkjunum, og BoDipy 493/501 (Lot Number: D3922) var keypt frá Invitrogen Company, Bandaríkjunum.

 

1.2 Aðferðir

1.2.1 Frumurækt

HepG2 frumur voru ræktaðar í breyttum örn með háum glúkósa miðli Dulbecco sem innihélt 10% fóstursermi, 100 U/ml penicillín og 100 ug/ml streptómýcín í 37 gráðu, 5% koltvísýringur. Þegar samflot frumunnar náði 85%var undirmenning, málun, íhlutun og aðrar aðgerðir framkvæmdar.

 

1.2.2 Prótein ónæmisblokka uppgötvun

1.2.2.1 Act og ECH meðferð

LC 3- ⅱ Prótein tjáningarstig í HepG2 frumum BAFA1, sem róteindardæluhemill, getur valdið LC 3- ⅱ próteini samanlagt í miklu magni í frumum og magnað þannig örvunargetu autophagy. Þess vegna er hægt að nota sameinaða notkun BAFA1 sem eftirlitskerfi autophagy til að meta getu autophagy örvunar. HepG2 frumur í logaritmískum vaxtarstigi voru fluttar í 3,5 cm frumuræktarrétti fyrir gistinækt. 100 μmól/l ACT, ECH og BAFA1 voru notuð til íhlutunar í 12 klst. Frumurnar voru þvegnar með forkældum fosfatjafnalausn (PBS) og lýsir strax í RIPA próteinlýsisjafnalausn í 10 mínútur. Flotvatnið var skilvindt og heildarpróteinstyrkur var ákvarðaður með því að nota bikínkónínsýru próteinstyrk. Eftir magngreiningu með natríum dodecýlsúlfatjafnalausn var sýnið hitað við 95 gráðu í 10 mínútur til að afnema próteinið. Síðan var 30 μl af sýninu tekin með örpípettu og rafskautum á pólýakrýlamíð hlaupi.
Eftir rafskautið var próteinið flutt frá hlaupinu yfir í nitrocellulose himnun, lokað með 1 0% mjólk á einni nóttu, ræktað með sérstöku aðal mótefni við stofuhita í 1 klukkustund, þvegið með fosfatjafnalausn sem innihélt 0,5% þríhyrning og smurði með sértæku sýningarhita við stofuhita í 1 klst. ECL aðferðin var notuð við litaþróun. Þeir voru settir sem auður samanburðarhópur, Rapamycin Group, Ech Group, ACT Group, Rapamycin+BAFA1 Group, ECH+BAFA1 Group og ACT+BAFA1 Group.

 

1.2.2.2 Mismunandi styrkur ACT greip inn í tjáningarstig LC 3- ⅱ prótein í Hepg2 frumum

Lógaritmískt vaxtarfasi HepG2 frumur voru fluttir í 3,5 cm frumuræktarrétti fyrir gistinækt og 25, 50 og 100 μmól/L ACT ásamt BAFA1 voru notaðir til íhlutunarmeðferðar í 12 klukkustundir, og tjáningarstig LC 3- ⅱ prótein fannst með prótein ónæmisbletti. Viðmiðunarhópurinn (CON Group, auður stjórn), hungurshópur (STA Group, Sultip Treatment HepG2 frumur), 25, 50 og 100 μmól/L ACT hóp og BAFA1 ásamt 25, 50 og 100 μmól/L ACT hópnum voru settir upp.

1.2.3 MTT aðferð til að greina lifunarhraða HepG2 frumna sem meðhöndlaðar eru með mismunandi styrk ACT í 24 og 48 klst.
HepG2 frumur í logaritmískum vaxtarstigi voru sáð í 96- vel plötu með hóflegum sáðþéttleika og ræktað í útungunarvél í 12 klst. 2 0, 40, 60, 80 og 100 μmól/l lögum var bætt við í 24 og 48 klst. 0,5 mg/ml MTT lausn var bætt við í dimmu umhverfi og ræktað í útungunarvél. Eftir 4 klst. Var flotinu hent, 100 μl af dímetýlsúlfoxíði var bætt við hverja holu og frumurnar voru hristar í stöðugu hitastigi við 37 gráðu í 10 mínútur. Ljósþéttleiki (OD) gildi við bylgjulengd 490 nm fannst með ensímmerki og lifunarhraði frumna var reiknaður.

 

1.2.4 In vitro smíði NAFLD frumulíkans

Ákveðin þyngd palmitínsýru (PA) var vegin og uppleyst að fullu í ákveðnu magni af ísóprópanóli til að útbúa 100 mmól/L PA lager lausn, sem síðan var skipt og geymd í -20 gráðu ísskáp til síðari notkunar. PA stofnlausnin var þynnt niður í 100 μmól/L með því að nota fullkominn ræktunarmiðil og 1% fitusýrulausu albúmíni í sermi var bætt við. Frumurnar voru ræktaðar við 37 gráðu í 3 klst. Til að undirbúa örvunarlausnina. HepG2 frumur í logaritmískum vaxtarstigi voru fluttar í 3,5 cm frumuræktarrétt með viðeigandi þéttleika fyrir gistinækt og síðan var tilbúin örvunarlausn notuð til íhlutunar.

 

1.2.5 Virkja íhlutun NAFLD in vitro frumulíkans Tg uppgötvun og olía rauða O litun

 

1.2.5.1 TG uppgötvun

HepG2 frumur í logaritmískum vaxtarstigi voru fluttar í 3,5 cm frumuræktarrétt fyrir ræktun í samræmi við auðan samanburðarhóp, fyrirmyndarhóp og ACT íhlutunarhóp. Líkanahópurinn var framkallaður með 100 μmól/L PA örvunarlausn og ACT íhlutunarhópurinn var framkallaður með 100 μmól/L PA örvunarlausn og 50 μmól/L ACT var bætt við á sama tíma. Íhlutunartíminn var 24 klst. Fjarlægðu gömlu ræktunarmiðilinn varlega, þvoðu frumuyfirborðið hægt með forkældum PBS einu sinni, bætið við 100 μl/rétti af forkældum RIPA lýsislausn, að fullu lyse á ís í 15 mínútur, skilvindu við 4 gráðu og {12}} r/mín. Leiðbeiningar TG Kit og leiðréttu að lokum TG stig á mg af próteini.

1.2.5.2 Olíu rauður o litun

HepG2 frumur í logaritmískum vaxtarstigi voru fluttar í 3,5 cm ræktunarrétti þakinn sæfðum þekju fyrir gistinækt. 100 μmól/L PA framkallaði frumurnar til að mynda lípíðdropa. Á sama tíma var 50 μmól/L lögum bætt við íhlutun í 24 klukkustundir.
The cell slides were collected, washed 3 times with pre-cooled PBS, fixed with 4% formaldehyde at room temperature for 10 min, washed the cell surface with PBS, added the prepared Oil Red O staining working solution, stained at room temperature in the dark for 15 min, aspirated the Oil Red O staining solution, washed the excess staining solution with double distilled water, rinsed with 60% isopropanol, washed with double distilled water, and innsiglað og ljósmyndað undir smásjá.

 

1.2.6 Ónæmisflúrljómunar Athugun á autophagosomes og lípíðdropum eftir ACT meðferð

HepG2 frumur í logaritmískum vaxtarstigi voru fluttar í 3,5 cm ræktunarrétti þakinn sæfðum þekju fyrir gistinækt. 1 0 0 μmól/l Pa var notað til að framkalla myndun lípíðdropa í frumunum. Á sama tíma var ACT bætt við í íhlutunarmeðferð í 24 klukkustundir. Frumur rennibrautirnar voru safnað, þvegnar 3 sinnum með forkældum PBS, festar við stofuhita í 10 mínútur með 4% formaldehýð, permeabilized við stofuhita í 15 mínútur með gegndræpi með permeabilization sem innihélt 0,1% saponín, lokað við stofuhita í 1 klst. Með geitasermi, ræktað, sem var í stofu, með 1 klst. Með LC 3- sértækum aðalhópnum, sem var ræktað, skaffað með 1 klst. Með 1 klst. PBS, og bætt við með sérstökum flúrperlumerktum efri mótefni, ræktað við stofuhita og fjarri ljósi í 1 klst. Eftir ræktun mótefna voru glærurnar þvegnar 3 sinnum með PBS, álagðar með lípíðdropa-sértækum rannsaka Bodypy 493/503 við stofuhita í 10 mínútur, þvegnar með PBS, og innsiglaðar með þéttingarmiðli, loftþurrkuðum í myrkrinu, sáu með leysir concal smásjá, og skráðri. Tómur samanburðarhópurinn, Rapamycin meðferðarhópurinn og ACT íhlutunarhópurinn voru settir.

 

1.3 Tölfræðileg greining

SPSS25. 0 Tölfræðilegur hugbúnaður var notaður til gagnagreiningar. Töluleg gögn voru gefin upp sem x ± s. Einhliða greining á dreifni og LSD-T próf voru notuð. P.<0.05 was considered statistically significant.