Rannsókn á taugainnkirtlaónæmisvirkni Cistanche Deserticola og hrísgrjónavínsgufuafurðum í rottalíkani af völdum sykurstera-Ⅰ

1. Inngangur

Cistanche eyðimörk, sem er kallað "eyðimerkur ginseng," er hefðbundið kínverskt lyf sem hefur verið notað um aldir sem yang-tonic jurt fyrirendurlífgar nýrun og styrkir yang[1]. Átta tegundir og eitt afbrigði afCistanche Herba hafa verið teknar upp í Kína og eingönguCistanche deserticolaYC Ma ogCistanche tubulosa(Schenk) Wight eru skráð í kínversku lyfjaskránni [2]. Lyfjafræðilegar rannsóknir sýndu þaðCistanches Herbasýndi taugaverndandi [3], ónæmisbælandi [4], hjartaverndandi [5], þreytueyðandi [6], bólgueyðandi [7], lifrarverndandi [8], andoxunarlyf [9], bakteríudrepandi [10], hægðalyf [11] og æxlishemjandi. áhrif [12]. Hið breiða litróf líffræðilegrar virkni þessarar ættkvíslar hefur verið rakið til flókinnar og fjölbreyttrar plöntuefnafræðilegrar samsetningar hennar.Cistanche deserticolainniheldur fenýletanóíð glýkósíð, iridoids, fjölsykrur [13] osfrv. Innihald fenýletanóíð glýkósíða er hæst í upprunalegu lyfjaefnum [14].

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA TIL AÐ FRÆÐJA NÝRA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Vinnsla á kínverskri Materia Medica (CMM) er hefðbundin lyfjatækni til að uppfylla mismunandi kröfur um meðhöndlun, afgreiðslu og undirbúning samkvæmt hefðbundinni kínverskri læknisfræði. Þessar unnar vörur eru nefndar decoction stykki, sem eru notuð á heilsugæslustöðvum. Vinnsla miðar að því að auka virkni til að draga úr eituráhrifum hrályfja. Kínverska lyfjaskráin 2015 skráði að Cistanche þykkar sneiðar (CD) og hrísgrjónavínsgufu Cistanche (WCD) væri hægt að nota sem decoction stykki á heilsugæslustöðinni. Rannsóknarhópurinn okkar sýndi að hægðalosandi áhrifin voru létt og andstæðingur-öldrun og nýra-yang endurnærandi áhrifin voru aukin eftir að Cistanche var gufað með hrísgrjónavíni [15].

Hlutverk undirstúku-heiladinguls-nýrnahettu-hóstarkirtils (HPAT) áss er truflað í nýrna-yang skortsheilkenninu [16]. Sjúklingar með nýrna-yang skort hafa einnig mikla ónæmisstarfsemi. HPA ás truflun er náskyld ónæmisbrest. Kenning um taugainnkirtla-ónæmisnet (NEI) sýnir að ónæmis- og taugainnkirtlakerfin deila mörgum bindlum og viðtökum [17], og undirstúkan er talin vera kjafturinn til að tengja taugainnkirtla við ónæmiskerfin.

Í þessari rannsókn endurtókum við skort á nýra-yang í líkanrottum með utanaðkomandi barksterasprautun og könnuðum gangverk nýrna-yang skorts sem svar við mismunandi unnum afurðum Cistanche deserticola frá sjónarhóli innkirtla-ónæmisvirkni.

2. Efni og aðferðir

2.1. Efni og hvarfefni

Cistanche deserticola var safnað frá Alashan Neimenggu árið 2019.5 og auðkenndur sem þurrkaðir holdugir stilkar Cistanche deserticola YC Ma af prófessor Yanjun Zhai (School of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Kína). Skírteinissýnin voru varðveitt í Liaoning Processing Engineering Technology Center.

Staðlað efnasambönd af ajugoli voru keypt frá Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Chengdu, Kína); cistanoside F,echinacoside, cistanoside A og isoacteosidevoru keyptir frá Must Company (Sichuan Kína); acteoside var keypt frá Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Dalian, Kína). MS-gráðu asetónítríl og metanól voru keypt frá Merck KGaA (Darmstadt, Þýskalandi). HPLC-gráðu maurasýru var keypt frá Merck KGaA (Darmstadt, Þýskalandi). Hrísgrjónavín var keypt frá Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Kína).

Cortíkósterón (CAS: 50-22-6, hreinleiki > 98%, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), chinkuei shin chewan pillur (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), rotta ACTH, CRH, T, IL{{ 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2 og IL-10 ELISA greiningarsett voru keypt frá Nanjing Jiancheng Co., Ltd. Rottukortisól ELISA settið var útvegað af BOSK Co., rotta CD4 mótefni, CD8a mótefni (nr. 561833 og 559976), RBC lysate (Solarbio, R1010), PBS jafnalausn (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM og -actin upstream og downstream primers voru útvegaðir af Guangzhou Invitrogen Co. Reverse Transcription Kit (nr. RR037A) og cDNA Synthesis Kit (nr. 10000068167) voru útvegaðir af Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Klóróform, ísóprópanól, 75% etanól og úretan lausnir voru allar greiningarhreinar og framleiddar af Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Ultrapure vatn var framleitt af Milli-Q kerfinu (18,2 MΩ, Millipore, MA, Bandaríkjunum).

2.2. Tilraunahljóðfæri

Ensímmerki (Thermo, tegund 3530911931), sjálfvirk plötuþvottavél (gerð HBS- 4009), stafrænn skjáþrýstikraftmælir (gerð VICTOR- 50N), háhraða frystiskilvinda (gerð Sigma 3k15 ), örmíkrólitrófsmælir (líkan B-50Q), genamagnari (gerð L96G), magn-PCR í rauntíma flúrljómun (gerð StepOne), frumuflæðismælir (gerð AC66051710132), paraffínmíkrótóm (gerð Laika), smásjá (Olympus) , gerð BS-53), og hljóðfæri fyrir hreint vatn (gerð F7JA36507) voru notuð.

2.3. Undirbúningur sýna fyrir UPLC-Q-TOF-MS og lyfjafræðilegar tilraunir

WCD var unnið úr sömu lotu afCistanche eyðimörká rannsóknarstofu okkar. Til að undirbúa WCD voru þurrir CD stykki (5 mm á þykkt) (100 g) settir með hrísgrjónavíni (30 ml), gufaðir við háþrýsting (1,25 kPa) í 4 klst og síðan þurrkaðir við 55 gráður.

Gróft duft CD og WCD var lagt í bleyti í 10 sinnum 95% etanóli í 0,5 klst., bakflæðisútdráttur 3 sinnum í hvert skipti í 1 klst, og síaður og síuvökvanum 3 sinnum var blandað saman. Etanólið var endurheimt við lækkaðan þrýsting og útdrátturinn var fenginn til inngjafar. Útdrættinum (1 ml) var bætt út í 50% metanól, sem færði heildarrúmmálið í 20 ml, og geymt við 4 gráður til innihaldsgreiningar.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA TIL AÐ BÆTTA KYNFERÐ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.4. UPLC-QqQ-MS Skilyrði fyrir greiningu á CD og WCD útdrætti

2.4.1. LCThMS greiningarskilyrði

UPLC-MSThMS kerfið með MassLynx 4.1 Analyst hugbúnaði var notað til að framkvæma gagnaöflun og vinnslu. Greiningarsúlan var Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) við 40 gráðu hitastig. Hreyfanlegur fasi var 0,1% maurasýruvatnslausn (A) og asetónítríl sem innihélt 0,1% maurasýru (B). Skolunarstiglinn var 0.00–1.00 mín með 3% B, 1.01–2.00 mín með 3%–11.5% B, 2.01–3.{{29 }} mín. með 12% B, 3,01–4.00 mín. með 15% B, 4,01–5.00 mín. með 20% B, 5,01–6.00 mín. með 22 % B, 6,01–8.00 mín með 25% B, og 8,01–9.00 mín með 10% B. Rennslishraði var 0,3 mLTh mín og inndælingarrúmmálið var 1,0 μL.

Waters þrefaldur fjórfaldur massarófsmælirinn (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, Bandaríkjunum) búinn rafúðajónunargjafa (ESI) var notaður í neikvæðu jónahamnum. Losunargasið var köfnunarefni með flæðihraða 500 LThh við 250 gráðu hita. Öll greind efnasambönd voru mæld í margfeldisviðbragðseftirliti (MRM) ham; Tafla 1 sýnir orkubreyturnar og tafla 2 sýnir kvörðunarferla greindu íhlutanna.

2.4.2. Undirbúningur viðmiðunarefna

Túbúlósíð A (3.02 mg), echinakósíð (3.00 mg), 2'-asetýlakteósíð (2,34 mg), akteósíð (2,45 mg), ísóakteósíð (0,61 mg), cistanosíð F ( 2,14 mg), salidrósíð (3,39 mg), genipósíðsýra (2,84 mg), ajúgól (1,58 mg) og katalpól (2,39 mg) voru leyst upp í metanóli til að búa til stofnlausn. Stofnlausnin var þynnt með metanóli til að fá viðeigandi styrk fyrir vinnustaðlalausnirnar. Allar tilbúnar lausnir voru geymdar við 4 gráður fyrir notkun.

2.5. Undirbúningur og flokkun dýralíkana

SD karlkyns rottur (180–220 g) voru keyptar frá Liaoning Changsheng Biotechnological Co., Dýraleyfisnúmer: SCXK (Liao) 2015–0001. Öllum rottum var haldið með frjálsan aðgang að mat og vatni við 25 gráður og hlutfallslegan raka 30–50%. Dýrin voru hýst í 7 daga fyrir tilraunirnar.

Hundrað rottum var skipt af handahófi í 10 hópa: óútgáfu (BC) hópur, módelviðmiðunarhópur (MC) hópur, jákvæður samanburðarhópur (PC) hópur, hrísgrjónavínsviðmiðunarhópur (WC) hópur, geisladiskur háskammtur (CD) -HD) hópur, CD miðskammta (CD-MD) hópur, CD lágskammtahópur (CD-LD) hópur, WCD háskammtahópur (WCD-HD) hópur, WCD miðskammtahópur (WCD-MD) og WCD lágskammta (WCD-LD) hópur. Skammtarnir af CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD og CD-LDThWCD-LD voru 5,48 gTh(kg ∙ d), 2,74 gTh (kg ∙ d) og 1,37 gTh(kg ∙ d), í sömu röð. Skammturinn fyrir PC hópinn var 1.646 gTh(kg ∙ d) og fyrir WC hópinn 1 mLTh100 g í 40 daga. Á 6. degi eftir gjöf var rottunum sprautað undir húð með kortikósterónvatnssviflausn (kortikósterón + 0,1% dímetýlsúlfoxíð + 0,1% Tween-80 + 0,9% natríumklóríð) nema fyrir BC hópinn [18]. Styrkur kortikósteróns var 5 gThL og skammturinn var 0,1 mLTh100 g. Rotturnar í BC hópnum fengu venjulegt saltvatn + 0,1% dímetýlsúlfoxíð + 0,1% Tween- 80 + 0,9% natríumklóríð með inndælingu í sama skammti.

2.6. Ákvörðun HPA-ásaðgerða

2.6.1. Þyngd, hitastig og þolpróf

Þyngdarpróf var gert á 3 daga fresti og hitastigið var tekið á 6 daga fresti. meðan á tilrauninni stóð. Á 39. degi var hámarksstyrkur afturlims mældur með gripmæli. Rotturnar voru settar á slétta palla, þannig að afturlimur þeirra grípur stöngina. Rotturnar munu ósjálfrátt grípa hvaða hlut sem er til að koma í veg fyrir að hreyfist afturábak þegar skottið er dregið þar til togkrafturinn fer yfir gripið. Þegar rottan missti tökin gat formagnarinn sjálfkrafa skráð hámarks gripkraftinn.

2.6.2. Ákvörðun á magni T, CRH, ACTH, CORT og kortisóls í sermi

Einni klukkustund eftir síðustu gjöf voru rotturnar svæfðar með inndælingu í kviðarholi af úretanlausn (20 gTh100 ml). Síðan var blóðsýnunum safnað, skilið í skilvindu við 3500 r í 15 mínútur til að fá sermi og geymt við -20 gráður. Styrkur T, CRH, ACTH, CORT og kortisóls var mældur með rottum ELISA settum samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.

2.6.3. Smásjáathuganir

Formfræðileg uppbygging nýrnahettuvefs sást með HE-litun. Nýrnahettuvefur var festur í 10% paraformaldehýði, þurrkaður í etanóli, gerður gegnsær með xýlenlausn, felldur inn með hefðbundnum aðferðum, skorinn í 4 μm þykkar sneiðar, afvaxaður með xýlenlausn, vökvaður með etanóli og síðan litaður með hematoxýlíni og eósíni litunarlausn. Eftir að hafa verið gerð gegnsæ með xýleni var platan innsigluð með hlutlausu gúmmíi og skoðað í smásjá.

2.6.4. Ónæmisvefjaefnafræðileg litun á Bax, Bcl-2, Caspase-3, Fas og FasL próteintjáningu í nýrnahettum

Formalín-fastir, paraffín-innfelldir hlutar af nýrnahettum úr rottum voru afparaffínaðir og endurvökvaðir eftir að hafa verið skornir í 4 μm þykkt. Til að hindra innræna peroxidasavirkni voru hlutarnir forræktaðir í vetnisperoxíðblokk í 10 mín. Hlutum var dýft í 0,01 M sítrat (pH 6,0) og hitað að suðu. Ferlið var endurtekið eftir 5-10 mín. Eftir kælingu voru hlutarnir þvegnir með PBS (pH 7,2–7,6) 1–2 sinnum, látnir standa við stofuhita í um það bil 5 mínútur og skolaðir með PBS (pH 7,2–7,6) 2–3 sinnum. 5% BSA blokkunarlausninni var bætt við við stofuhita og umframvökvi á hlutanum var hristur af 20 mínútum síðar. Þynntum aðalmótefnum sem eru sértæk fyrir FasTh FasL, Bcl-2ThBax og kaspasa-3 (1:100 þynnt með PBS) var bætt við og ræktað við 37 gráður í 1 klst eða 4 gráður yfir nótt. Hlutarnir voru þvegnir 2–3 sinnum með PBS (pH 7,2–7,6). Síðan var bíótínýleruðu geita-and-mús IgG bætt við og hlutarnir voru þurrkaðir við 20–37 gráður í 20 mínútur og skolaðir með PBS (pH 7,2–7,6) 4 sinnum í 5 mínútur. Eftir vandlega þvott í PBS voru hlutar ræktaðir með blöndu af hvarfefnum A og B í 30 mínútur, ræktaðir með PBS í 45 mínútur og loks þróaðar með DAB hvarfefni (DAKO) í 30 mínútur áður en þeir voru örlítið mótlitaðir með hematoxýlíni, þurrkaðir, og uppsettur.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA TIL AÐ auka kynferðislega tilfinningu PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7. Ákvörðun ónæmisaðgerða

2.7.1. Útreikningur á ónæmislíffæravísitölu

Einni klukkustund eftir síðustu gjöf voru rotturnar svæfðar með inndælingu úr kviðarholslausn (20 gTh100 ml) og síðan voru milta og hóstarkirtill fjarlægður og vigtaðar strax í dauðhreinsuðu hettu. Þyngdarstuðlar milta eða hóstarkirtils (%) � þyngd milta eða hóstarkirtils (mg) Líkamsþyngd (g).

2.7.2. Greining á undirhópum T eitilfrumna í útlægu blóði

Miltafrumur og blóðfrumur voru ræktaðar með einstofna mótefnum anti-CD4 (PE) og and-CD8 (FITC) í 30 mínútur í myrkri. 2 ml af rauðkornalýsi var bætt við og lausninni var blandað saman með hvirfli. Lausnin var látin liggja í myrkri í 10 mínútur og skilin í skilvindu í 5 mínútur. Vökvanum var hent og síðan var lausnin þvegin þrisvar sinnum með ísköldu PBS og endurleyst í PBS gegndræpilausn. Að minnsta kosti 10,000 frumur voru greindar með frumuflæðismælingu innan 1 klst. frá hverri Mab-litun.

2.7.3. Ákvörðun á stigi IL-10, IL-6, IL-2, TNF- og IFN-c í sermi

Klukkutíma eftir síðustu gjöf voru rotturnar svæfðar með inndælingu í kviðarholi af úretanlausn (20 gTh100 ml) og blóð tekið úr ósæð í kviðarholi. Blóðið var skilið í skilvindu við 3500 r í 15 mínútur til að fá sermi og geymt við -20 gráður. Styrkur IL-10, IL-6, IL-2, TNF- og IFN-c greindist með rottum ELISA settum samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.

2.8. Tjáning CaM í undirstúku og undirstúkuvefjum

Heildar-RNA var dregið úr undirstúku og undirstúku vefjum með TRIzol. Öfug umritun var framkvæmd á 10 μL af heildar-RNA samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Jafnt magn af cDNA var greint með qPCR í viðurvist dsDNA-bindandi litarefnis (Promega, Bandaríkjunum) og CFX 96 rauntíma PCR kerfisins (Bio-Rad, Bandaríkjunum) til að skoða mismunandi gen við upphafsvirkjun kl. 95 gráður í 10 mínútur, 40 lotur af eðlisbreytingu við 95 gráður í 15 sekúndur, og glæðingarlenging við 60 gráður í 1 mín.

Grunnur fyrir CaM og -aktín eru gefnir upp í töflu 1 og -aktín var notað sem innra eftirlit. Hvert sýni var staðlað með því að nota mismuninn á mikilvægum þröskuldum (Ct) milli markgensins og -aktíns. Eftirfarandi jafna var notuð til að lýsa niðurstöðunni: ΔΔCt � (Ct target gen − Ct -actin gen) tilraunahópur − (Ct target gen − Ct -actin gen) samanburðarhópur. MRNA gildi hvers sýnis voru síðan borin saman með því að nota tjáningu 2- ΔΔCt markgenið. Niðurstöður hvers hóps voru meðaltal (tafla 3).

2.9. Tölfræðileg greining

Öll gögn voru greind með SPSS hugbúnaði (útgáfa 19.0, SPSS Institute Inc., Chicago, IL). Mismunur á milli hópa var greindur með einstefnu endurteknum mælingum á dreifigreiningu (ANOVA). Niðurstöðurnar voru gefnar upp sem meðaltal ± staðalfrávik (SD) með GraphPad Prism hugbúnaði (útgáfa 6.0, San Diego, CA, Bandaríkjunum). Mismunur með P gildi minna en 0.05 var talinn tölfræðilega marktækur.

3. Tilraunaniðurstöður

3.1. UPLC-QqQ-MSAgreining

Til að ná sem bestum aðskilnaði, hámarksformi og stuttum greiningartíma, voru litskiljunarskilyrði, þar á meðal súlu, hreyfanlegur fasi og hallaforrit, rannsökuð í fortilraun okkar. Dæmigerð litskiljun með MRM ham eru sýnd á mynd 1.

Í töflu 4 má sjá að innihald fenýletanóíð glýkósíða í WCD jókst samanborið við CD, sérstaklega fyrir echinacoside og acteoside, en innihald iridoids minnkaði í WCD.

3.2. Reglugerð um HPA-ásvirkni

3.2.1. Þyngd, hitastig og þolpróf

Rottur MC hópsins og tilraunahópa sýndu nýrna-yang skortseinkenni smám saman eftir að þeim var gefið kortikósterón. Einkennin, eins og þyngdartap, ofkæling, tap á hárgljáa, slenjandi anda, seinkun á svörun og marktæk minnkun á vatnsnotkun og virkni, batnaði mjög í CD og WCD hópunum. Mynd 2(a) sýnir þyngdarbreytingarnar. Vægi hvers lyfjahópa jókst, sérstaklega í CDHD og WCD-HD hópunum. Þyngdaraukningin í MC hópnum var minnst. Mynd 2(b) sýnir hitabreytingarnar, sem voru minnstar í MC hópnum, og hitastigið hækkaði í WCD-HD, WCD-MD og WCD-LD hópunum.

Mynd 2(c) sýnir að þolgæði jókst fyrir BC hópinn og hvern tilraunahópa, og WCD-MD hópurinn var hæstur, sem sýndi fram á að veikleikamerki af völdum nýrna-yang skorts batnaði eftir gjöf.

3.2.2. Stig T, CRH, ACTH, CORT og kortisóls

Mynd 3 sýnir að miðað við BC hópinn lækkaði magn T, CRH, ACTH og CORT í rottu sermi (P < 0.01) og kortisólmagn lækkaði (P < 0.05) í MC hópnum. Í samanburði við MC hópinn jókst magn T í WCD-HD og WCD-MD hópunum (P < 0.01), magn CRH í WCD-LD, WCD-MD og WC hópar batnaði (P < 0.01), innihald ACTH jókst í CD-HD, WCD-MD og WCD-HD hópum (P < 0.01), CORT stig uppfært í CD-MD, WCD-MD og WCD-HD hópar (P < 0,01) og aukin í CDHD og WCD-LD hópum (P < 0,05), og kortisólmagn jókst í hverjum lyfjahópa.

3.2.3. Niðurstöður smásjáathugunar

Nýrnahettuvef má skipta í cortical lag og medulla lag. Barkarlögin innihalda kúlulaga, búntlaga og netlaga lög. Frumurnar innihalda fleiri lípíð og merglagið samanstendur að mestu af pheochromocytoma frumum og lítið magn af trefjavef. Eins og sést á mynd 4 komumst við að því að allt var eðlilegt í BC hópnum, en í MC hópnum var nýrnahettuberki með augljósa ofvöxt, frumurýrnun og vaxandi þéttleika. Kúlulaga ræman þykknaðist og hálfgagnsær töfrasvæði, þröngt zona reticularis og smærri frumur sýndu ójafna litun og háræðastíflu. Í PC hópnum voru barkar- og mergmörk sýnileg. Frumum kúlu- og búntabandanna var raðað jafnt og formgerðin hafði verið endurreist. Sama betri endurheimt sást í WCD hópunum og áhrifin í WCD-MD hópnum voru betri en hjá WCD-HD og WCD-LD hópunum. Formgerð nýrnahettunnar í CD hópunum var ekki eins góð og í WCD hópunum.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA TIL AÐ BÆTTA KYNFERÐ PHGS75% ECH 30% ACT 12%