Seytt daufkyrninga gelatínasa-tengd lípokalín sýnir sterkari getu til að hamla blöðrustækkun ADPKD frumna samanborið við óseypt form Ⅳ

4. Umræður

Í þessari rannsókn sýndum við fram á að viðbót og/eða oftjáning á seyttu mNGALprótein minnkaði 2L3 frumufjölgunoghamlaði blöðruvexti in vitro með því að uppstilla frumudauðaog autophagy oglækka útbreiðslu-tengda merkjaleiðir. Til að bera kennsl á hvort hægt væri að nota M-1 frumur, stofnaðar frá svipuðum staði nýrnapípla í músum og 2L3 frumur, sem villigerðarviðmiðunarfrumur fyrir 2L3 frumur, lektín litun á M-1 og 2L3 frumum með LTL og DBA var framkvæmd (Mynd 1D). LTL og DBA voru notuð til að bera kennsl á aðgreindar nærpíplar og safnrásir músnýra, í sömu röð [45,46]. Niðurstöðurnar benda til þess að M-1 frumur hafi svipaða formgerð (Mynd 1C) og uppruna nýrnapípla (Mynd 1D) og 2L3 frumur; því var M-1 frumulínan valin sem villigerðarviðmiðun fyrir 2L3 frumur.

NÝJAR JURTUR FYRIRADPKD(NÝRASJÚDDI)

Í flestum klínískum tilfellum sýna ADPKD sjúklingar hærra magn af NGAL í þvagi en venjulegt fólk [19,47-49]. ADPKD músalíkanið sem notað var í þessari rannsókn hefur einnig hærra NGAL og NGAL-R tjáningarstig [31]. Bæði RT–qPCR og Western blot niðurstöður sýndu að 2L3 frumur tjáðu hærra magn af NGAL en M-1 villigerð frumulínunnar (Mynd 1F, H), en enginn marktækur munur á NGAL-R tjáningarstigi var auðkenndur á milli frumulínurnar tvær (Mynd 1G, H), sem er í ósamræmi við niðurstöðurnar in vivo [31]. Þessi munur gæti stafað af flóknu samspili innan músavefanna, sem ekki á sér stað í miklu einfaldara frumukerfi.

Western blot niðurstöður sýndu að bein gjöf og/eða erfðafræðileg oftjáning mNGAL í 2L3 hamlaði ERK ferlið. Eins og sýnt er á myndum 4A og 8A var merki p-ERK1 (44 kDa) veikara en p-ERK2 (42 kDa), en ERK1 (44 kDa) var sterkara en ERK2 (42 kDa), sem olli marktækri aukningu á p-ERK2/ERK2 borið saman við p-ERK1/ERK1 í öllum tilraunahópum. ERK1 og ERK2 eru tvö ísóform af ERK sem hefur verið talið hafa mismunandi áhrif á frumufjölgun [50]. ERK1 hefur verið auðkennt til að örva lifun og vöxt frumna; þó, ERK2 stuðlar að frumuaðgreiningu og hindrar frumuvöxt [51]. Í rannsókn okkar var hlutfall p-ERK2/ERK2 áberandi hærra en p-ERK1/ERK1 í öllum hópum, sem benti til þess að frumur hefðu tilhneigingu til að aðgreina sig og draga úr vexti. Hins vegar lækkaði bæði viðbót og oftjáning mNGAL verulega hlutfall bæði p-ERK1/ERK1 og p-ERK2/ERK2 samanborið við viðmiðunarhópinn og leiddi til marktækt lægra hlutfalls p-ERK/ERK, sem benti til mNGAL áhrifanna. við að hindra frumufjölgun.

Til að koma á fót þrívíddarræktunarvettvangi fyrir lýsingu og meðferðarmat á blöðrumyndun í 2L3 frumum voru nokkrar aðstæður reynt. Sýnt hefur verið fram á að styrkur Matrigel fyrir 3D ræktun hefur áhrif á hlutfall burðarblaðra og pípla sem myndast in vitro [25,52,53]. Í rannsókn okkar komumst við að því að 40% Matrigel var besta formúlan til að sýna ákjósanlega myndun blöðrubyggingar 2L3 frumna. Það voru nokkrar aðstæður, þar á meðal innfelld mynstur og ofaná mynstur fyrir 3D menningu [54]. Við völdum ofanálagsaðferðina (samlokulíkt mynstur) fyrir betri og auðveldari leið til að greina blöðrurnar (mynd 6). Hins vegar sýndi reynsla okkar að blöðrur 2L3 frumna voru ekki nægilega stórar þegar þær voru ræktaðar án nokkurs örva í þrívíddarræktun fyrr en á degi 14. Forskólín er almennt notað til að örva blöðrumyndun með því að virkja adenýlýlsýklasa (AC) til að auka hringlaga adenósín mónófosfat (cAMP) [11,55]. Þess vegna, í rannsókn okkar, notuðum við forskólín (20 µM) til að framkalla blöðrumyndun í 2L3 frumum fyrir andlega meðferð.

Fyrri rannsókn okkar sýndi að oftjáning á nýrnasértækum NGAL í 2L3 músum gæti hægt á ADPKD framvindu með því að minnka blöðrur en ekki blöðrufjölda í 2L3 músum [31]. Í þessari rannsókn hamlaði viðbót andlegrar verulega stækkun blöðru 2L3 frumna með því að bæla blöðruþvermál, flatarmál og hlutfall stórra blaðra (Mynd 6F, G, I), á meðan enginn marktækur munur var á aukningu á heildarhlutfalli. blöðrunúmer (Mynd 6H). Niðurstöður 2L3 blöðruframvindu í þrívíddarræktun voru í samræmi við niðurstöður in vivo. Hins vegar hamlaði mNGAL meðferð blöðruvöxt 2L3 frumna í 3D ræktun, á meðan við notuðum hærri styrk af mNGAL (2 mg/mL) (Mynd 6) en í fyrri 2D tilraunum (600 µg/mL) fyrir MTT prófið til að kanna áhrif mNGAL á lífvænleika frumna (mynd 3). Við veltum því fyrir okkur að raðbrigða mNGAL hreinsað úr E. coli skorti breytingar eftir þýðingu [56,57] og leiddi til lítillar lífvirkni raðbrigða mNGAL. Oftjáning NGAL í 2L3 frumum með transfection pN + LS og pN - LS smíði gæti hjálpað til við að skýra þessa spurningu.

Til að ákvarða hvort hærri styrkur mNGAL (2 mg/ml) sem notaður var í þrívíddarræktun til að bæla blöðrustækkun 2L3 frumna (mynd 6) stafaði af skorti á breytingum á mNGAL eftir þýðingu og til að prófa hvort NGAL þyrfti að seytt og hafa samskipti við NGAL-R til að örva apoptosis og hamla frekar blöðruframvindu, pN + LS og pN - LS smíðar voru umbreyttar í 2L3 frumur til að oftjáa seytt og óseypt NGAL prótein (Mynd 7). Safnaðar transsýktar frumur voru safnaðar einni viku eftir val á blasticidíni og bæði pN + LS og pN - LS transfection jók mjög mRNA tjáningu Lcn2 (heildar, þ.mt bæði innræn og utanaðkomandi NGAL) og Lcn2-c-myc (utanaðkomandi NGAL) borið saman við samanburðarhópinn (Mynd 7F, G) og enginn marktækur munur var á Lcn2 og Lcn2-c-myc milli pN + LS og pN - LS hópa (Mynd 7F, G). Tjáning Lcn{{20}}myc í pN + LS og pN − LS hópum var um það bil 8500-falt meiri en í 2L3 frumum (Mynd 7G); hins vegar var tjáning Lcn2 í pN + LS og pN - LS um það bil 1.5-falt meiri en í 2L3 frumum (Mynd 7F). Fræðilega séð var Lcn2-myc ekki til staðar í 2L3 frumum, sem leiddi til lágs tjáningarstigs (bakgrunns) með RT–QPCR. Fyrir vikið var hlutfallslegt hlutfall Lcn2-myc í pN + LS og pN − LS frumum verulega hærra (u.þ.b. 8500 sinnum) en í 2L3 samanburðarhópnum, sem veldur miklum mun á hlutfallslegu hlutfalli Lcn2 og Lcn2-myc. Að auki var tjáningarhlutfall Lcn2 í pN + LS og pN − LS frumum (pN + LS var 0.91-föld það sem er í pN − LS) svipað og Lcn2-c-myc (pN + LS var 1.01-föld á við pN − LS) (Mynd 7F, G). Innanfrumu NGAL próteintjáning í pN + LS og pN - LS frumum var aukin samanborið við það í samanburðarhópnum (Mynd 7I), og enginn marktækur munur var á milli pN + LS og pN - LS hópanna. Western blot niðurstöður fyrir heildar NGAL prótein tjáningu í pN + LS og pN - LS hópunum (pN + LS var 0.92-föld á við pN - LS) (Mynd 7I) voru í samræmi við RT–qPCR niðurstöður (pN + LS var 0.91-föld á við pN − LS) (Mynd 7F). Samkvæmt þessum niðurstöðum var magn NGAL (bæði heildar- og utanaðkomandi) próteina í pN + LS og pN - LS frumum svipað, sem benti til þess að bera ætti saman hópana tvo í frekari tilraunum.

Við spáðum því að oftjáning á NGAL án merkapeptíðs myndi ekki auka NGAL seytingu þrátt fyrir mikla innanfrumu NGAL tjáningu. Hins vegar sýndu ELISA niðurstöður með því að nota flotið úr ræktuninni að bæði pN + LS og pN - LS frumur höfðu marktækt hærra magn af seyttum NGAL en 2L3 viðmiðunarfrumurnar (Mynd 7J), en magn NGAL sem pN - LS frumur seyta. var marktækt lægra en í pN + LS frumum (Mynd 7J). Þessar niðurstöður leiddu í ljós að oftjáning á NGAL án merkapeptíðs (pN - LS) takmarkaði seytingu NGAL, þó að mikið magn af innanfrumu NGAL mRNA og próteini greindist innan frumanna (Mynd 7F, I). Niðurstöður BrdU innlimunar sýndu marktækt meiri útbreiðslu pN - LS frumna en pN + LS frumur (Mynd 7K).

Innanfrumu- og seytingarmagn NGAL var um það bil 1.6-falt og 2.2-falt hærra í pN + LS en í 2L3 frumum, í sömu röð (Mynd 7I, J), sem gæti leitt til hömlunarinnar af pN + LS samanborið við 2L3 frumufjölgun (Mynd 7K). Hins vegar var innanfrumu og útskilið magn af NGAL í 2L3 frumum um það bil 4-falt og 5.3-falt hærra en í M-1 frumum, í sömu röð (Mynd 1H, I), en hærra frumufjölgun sást í 2L3 en í M-1 frumum (Mynd 2C). Okkur grunar að aukin NGAL tjáning og seyting, sem gegna verndandi hlutverki í 2L3 frumum, sé ófullnægjandi til að hamla frumufjölgun sem stafar af Pkd1 útsláttur, en aukin NGAL tjáning og seyting í pN + LS veitir viðbótar NGAL til að ná útbreiðslu bælingu. Í fyrri rannsókn okkar höfðu Pkd1L3/L3 mýs marktækt meira magn af NGAL próteini í nýrum og frumukjarnamótefnavaka (PCNA) í nýrum en Pkd1+/+ mýs [31]. Engu að síður var nýrnamagn NGAL próteins í Pkd1L3/L3 × NGALTg/Tg músum u.þ.b. 2-föld á við Pkd1L3/L3 × NGAL+/+ músum og oftjáning NGAL leiddi til verulega lægra magns PCNA í Pkd1L3 /L3 × NGALTg/Tg en í Pkd1L3/L3 × NGAL+/+ músum og hamlaði frekar vöxt blöðru og lengdu lifunardaga [31]. NGAL virðist gegna verndandi hlutverki við að hindra aukna útbreiðslu í ADPKD módelum, á meðan innræn NGAL tjáning er ófullnægjandi og viðbótar utanaðkomandi NGAL getur hjálpað.

Samkvæmt niðurstöðum þrívíddarræktunar (Mynd 10) hamluðu bæði pN + LS og pN - LS hóparnir blöðruvöxt með því að minnka þvermál (Mynd 10C), flatarmál (Mynd 10D) og hlutfall stórra blaðra (þvermál > 100 µm) (Mynd 10F), en ekki tölurnar (Mynd 10E). Þessi niðurstaða er í ósamræmi við þann grun okkar að aðeins pN + LS en ekki pN - LS hamli blöðrustækkun vegna þess að seyting mNGAL frá 2L3 frumum er nauðsynleg til að hindra frumufjölgun. Hins vegar var hömlun á blöðrustækkun af völdum pN - LS lakari en pN + LS (Mynd 10B–D), sem leiddi í ljós að oftjáning á seyttu mNGAL hafði betri getu til að hindra blöðrustækkun 2L3 frumna í þrívíddarrækt en óútskilin mNGAL. . Þó að við sjáum sterkari bælingu á stækkun blöðru í pN + LS hópnum samanborið við pN - LS hópinn í 3D ræktun, er erfitt að sjá betri áhrif pN + LS en pN - LS í p-AKT / AKT (Mynd 8B ), p-CREB/CREB (Mynd 8C) og p62 (Mynd 9D). Sýnt hefur verið fram á að NGAL og NGAL-R tenging getur bundið innanfrumujárn og framkallað frekar frumudauða [29], sem tengist járneyðingarstefnu meðfædda ónæmiskerfisins gegn bakteríusýkingu [30]. Við lögðum til að seytt mNGAL framkallaði apoptosis í 2L3 frumum með því að hafa samskipti við NGAL-R, en óseytt mNGAL gæti ekki haft samskipti við NGAL-R til að framkalla apoptosis (Mynd 9A, B). Sýnt hefur verið fram á að Ras/B-Raf/MEK/ERK [10,11] og AKT/mTOR [38] ferlar eru uppstýrðir í ADPKD frumum, sem leiðir til aukinnar frumufjölgunar og blöðrustækkunar. Niðurstöður okkar sýndu að seytt mNGAL hamlaði ERK (Mynd 8A) og AKT (Mynd 8B) brautir og óseytt mNGAL óvirkjað ERK braut (Mynd 8A). Það bendir til þess að andleg óvirkjun ERK leiðin gæti ekki verið nauðsynleg í gegnum NGAL-R. Útsláttur á NGAL-R í 2L3 frumum verður framkvæmdur til að kanna spurninguna

Að auki hamlaði oftjáning mNGAL í 2L3 frumum stækkun frumublöðru (Mynd 10) og átti sér stað með tiltölulega minni seytingu NGAL (2,27 ng/ml) (Mynd 7J) samanborið við áhrif með háum styrk mNGAL (2 mg/mL) mL) notað í fyrri þrívíddarræktunartilraunum (mynd 6). Þessi niðurstaða gæti stafað af skorti á breytingum á mNGAL frá E. coli eftir þýðingu sem var notað í fyrri tilraunum, sem þurfti stóran skammt af mNGAL til að hindra stækkun blöðru (Mynd 6). Til að kanna frekar hvort breyting á mNGAL eftir þýðingu sé þátturinn sem ber ábyrgð á þörfinni fyrir meira raðbrigða mNGAL frá E. coli, verður skilyrt miðill þar á meðal mNGAL sem er seytt úr músafrumulínu notaður í frekari rannsóknum.

Í þessari rannsókn voru pN + LS og pN - LS frumur notaðar fyrir RT–qPCR, western blotting, ELISA, BrdU innlimun og 3D rækt fengnar úr blönduðum fjölstofna hópi, sem hafði mismunandi tjáningarstig transgena í blönduðu þýðinu. Að bera kennsl á gangverk mNGAL í ADPKD 2L3 frumum með ofangreindum aðferðum með því að nota klónafrumur ætti að hjálpa til við að finna aðferðir fyrir framtíðar klíníska meðferð á ADPKD.

5. Ályktanir

Í þessari rannsókn könnuðum við undirliggjandi fyrirkomulag minnkaðrar blöðruframvindu í viðurvist NGAL með því að nota ódauðlega ADPKD frumulínu. Viðbót á raðbrigða mNGAL hamlaði frumufjölgun í ADPKD frumum. Meinafræðileg greining sýndi að mNGAL dró úr fjölgun og framkallaði frumudauða og sjálfsátsferla í ADPKD frumum. Að auki var komið á þrívíddar frumuræktunarvettvangi til að bera kennsl á framvindu blöðru og sýndi að viðbót raðbrigða mNGAL hamlaði stækkun blöðru. Ennfremur hafði oftjáning á seyttu mNGAL (pN + LS) sterkari áhrif á að hindra stækkun blöðrur á ADPKD frumum en á óútskilinni mNGAL (pN - LS), þó að bæði formin lækkuðu þvermál blöðrunnar, flatarmál og hlutfall stórra blaðra, sem og áhrif þeirra á útbreiðslu, frumudauða og sjálfsáfall. Við komumst að þeirri niðurstöðu að seytt mNGAL hafi áberandi og stöðugri hæfni til að hindra stækkun blöðru en óútskilnað mNGAL í ADPKD frumum. Vinna okkar gæti hjálpað til við að bera kennsl á aðferðir fyrir framtíðar klíníska meðferð á ADPKD.

Viðbótarefni: Viðbótarmyndbönd við þessa grein er að finna á netinu (1) Myndband S1: Bygging blöðru í þrívíddarmenningu: https://reurl.cc/Kjy8rq (sótt á opnað 26. nóvember 2021); (2) Myndband S2: Z-stafla hlutar af blöðru í þrívíddarmenningu: https://reurl.cc/VXGY5y (sótt á aðgang 26. nóvember 2021). Viðbótarlínurit: Neikvætt viðmið fyrir mynd 1D (sleppt LTL og DBA litun) er að finna á netinu á https://reurl.cc/LpMmje (sótt á 26. nóvember 2021). Framlög höfundar: Conceptualization, W.-YJ, HMH-L. og Y.-YC; gagnaöflun, H.-YC; formleg greining, H.-YC; fjármögnunaröflun, HMH-L. og Y.-YC; aðferðafræði, H.-YC, W.-YJ, EW, C.-MH, HMH-L. og Y.-YC; verkefnastjórn, H.-YC og HMH-L.; auðlindir, W.-YJ, S.-TJ og Y.-YC; umsjón, HMH-L.; visualization, H.-YC; rit-frumrit, H.-YC og HMH-L.; ritrýni og ritstjórn, H.-YC og HMH-L. Allir höfundar hafa lesið og samþykkt útgáfu handritsins. Fjármögnun: Þessi rannsókn var fjármögnuð með styrkjum 107-2622-B-006-005-CC2 og 108-2622-B-006-002- CC2 frá vísinda- og tækniráðuneytinu (MOST) og höfuðstöðvum háskólaframfara frá National Cheng Kung University, Tainan, Taiwan (Yuan-Yow Chiou). Yfirlýsing endurskoðunarnefndar stofnana: Á ekki við. Yfirlýsing um upplýst samþykki: Á ekki við. Yfirlýsing um aðgengi gagna: Gögnin sem myndast við rannsóknina eru fáanleg hjá samsvarandi höfundi sé þess óskað. Þakkir: Höfundarnir eru þakklátir fyrir aðstoð sameindamyndagerðarkjarna við National Taiwan Normal University undir merkjum MOST. Við þökkum National RNAi Core Facility í Academia Sinica í Taívan fyrir að veita vírusagnir, plasmíð og tengda þjónustu. Við þökkum Shu-Wen Lo fyrir aðstoðina við grafíska klippingu. Hagsmunaárekstrar: Höfundar lýsa ekki yfir hagsmunaárekstrum.

Heimildir

1. Bergmann, C.; Guay-Woodford, LM; Harris, PC; Horie, S.; Peters, DJ; Torres, VE Fjölblöðrunýrnasjúkdómur. Nat. Séra Dis. Primers 2018, 4, 50. [CrossRef] [PubMed]

2. Grantham, JJ Klínísk framkvæmd. Sjálfhverf ríkjandi fjölblöðru nýrnasjúkdómur. N. Engl. J. Med. 2008, 359, 1477–1485. [CrossRef] [PubMed]

3. Chapman, AB; Devuyst, O.; Eckardt, K.-U.; Gansevoort, RT; Harris, T.; Horie, S.; Kasiske, BL; Óðland, D.; Pei, Y.; Perrone, RD; o.fl. Autosomal-dominant polycystic kidney disease (ADPKD): Samantekt frá nýrnasjúkdómi: Improving Global Outcomes (KDIGO) Controversies ráðstefnu. Nýra Int. 2015, 88, 17–27. [CrossRef] [PubMed]

4. Grantham, JJ; Mulamalla, S.; Swenson-Fields, KI Hvers vegna nýrun bila í sjálfsfrumna ríkjandi fjölblöðrunýrnasjúkdómi. Nat. Séra Nephrol. 2011, 7, 556–566. [CrossRef] [PubMed]

5. Harris, PC; Torres, VE Erfðafræðilegir aðferðir og merkjaleiðir í sjálfsfrumum ríkjandi fjölblöðru nýrnasjúkdómi. J. Clin. Rannsaka. 2014, 124, 2315–2324. [CrossRef] [PubMed]

6. Ong, AC; Harris, PC Pólýcystínmiðuð sýn á blöðrumyndun og sjúkdóma: Fjölblöðrurnar endurskoðaðar. Nýra Int. 2015, 88, 699–710. [Krossvísun]

7. Weimbs, T. Third-Hit Signaling in Renal Cyst Formation. J. Am. Soc. Nephrol. 2011, 22, 793–795. [Krossvísun]

8. Hanaoka, K.; Guggino, WB cAMP stjórnar frumufjölgun og blöðrumyndun í sjálfhverfum fjölblöðru nýrnasjúkdómsfrumum. J. Am. Soc. Nephrol. 2000, 11, 1179–1187. [Krossvísun]

9. Starremans, P.; Li, X.; Finnerty, P.; Guo, L.; Takakura, A.; Neilson, E.; Zhou, J. Músarlíkan fyrir fjölblöðrunýrnasjúkdóm með líkamseyðingu innan ramma í 5' enda Pkd1. Nýra Int. 2008, 73, 1394–1405. [Krossvísun]

10. Yamaguchi, T.; Nagao, S.; Wallace, DP; Belibi, FA; Cowley, BD; Pelling, JC; Grantham, JJ Cyclic AMP virkjar B-Raf og ERK í blöðruþekjufrumum frá fjölblöðrunýrum sem eru ríkjandi í sjálfsfrumum. Nýra Int. 2003, 63, 1983–1994. [Krossvísun]

11. YamaguchiJill, T.; Pelling, JC; Ramaswamy, NT; Eppler, JW; Wallace, DP; Nagao, S.; Róm, LA; Sullivan, LP; Grantham, JJ cAMP örvar in vitro fjölgun nýrnablöðruþekjufrumna með því að virkja utanfrumumerkjastýrða kínasaferilinn. Nýra Int. 2000, 57, 1460–1471. [CrossRef] [PubMed]

12. Zhu, P.; Sieben, CJ; Xu, X.; Harris, PC; Lin, X. Autophagy virkjunar bæla blöðrumyndun í sjálfsfrumna ríkjandi fjölblöðru nýrnasjúkdómslíkani. Humm. Mol. Genet. 2016, 26, 158–172. [CrossRef] [PubMed]

13. Belibi, F.; Zafar, I.; Ravichandran, K.; Segvic, AB; Jani, A.; Ljubanovic, DG; Edelstein, CL Súrefnisvaldandi þáttur-1 (HIF-1) og sjálfsát í fjölblöðru nýrnasjúkdómi (PKD). Am. J. Physiol.-Ren. Physiol. 2011, 300, F1235–F1243. [CrossRef] [PubMed]

14. Chun, Y.; Kim, J. Autophagy: An Essential Degradation Program for Cellular Homeostasis and Life. Cells 2018, 7, 278. [CrossRef]

15. Rubinsztein, DC; Shpilka, T.; Elazar, Z. Mechanisms of Autophagosome Biogenesis. Curr. Biol. 2012, 22, R29–R34. [Krossvísun]

16. Mukhopadhyay, S.; Panda, PK; Sinha, N.; Das, DN; Bhutia, SK Autophagy og apoptosis: Hvar hittast þau? Apoptosis 2014, 19, 555–566. [Krossvísun]