Magngreining á hrörnun taugafruma með aukinni nákvæmni og skilvirkni í in vitro líkani af Parkinsonsveiki Part 2

Niðurstöður

Koma á frumuræktunarlíkani af hrörnun taugafruma í tengslum við PD

Til að þróa aðferð til að rannsaka hrörnun taugafruma í frumuræktarlíkani af PD, notuðum við ræktaðar LUHMES frumur, stofn af skilyrt ódauðlegum, mönnum mesencephalic frumur. Við sérhæfingu verða LUHMES frumur postmitótískar, taka upp genatjáningarsnið sem einkennist af þroskuðum dópamínvirkum taugafrumum og þróa taugafrumuformgerð með taugafrumur sem ná allt að 500 mm að lengd (Mynd 1A; Lotharius o.fl., 2005; Scholz o.fl. , 2011; Kraemer o.fl., 2021).

Taugahrörnun, ástand þar sem taugafrumur stökkbreytast eða deyja, er nátengt minni. Í frumuræktunarlíkönum getum við stjórnað ræktunarskilyrðum til að draga úr tjáningu taugahrörnunar og þannig bætt afköst minni.

Rannsóknir hafa sýnt að samvægi taugafrumna gegnir mikilvægu hlutverki í lifun frumna og starfsemi kerfisins. Við getum bætt stöðugleika frumna með því að stjórna þáttum eins og næringarefnum og vaxtarþáttum í ræktunarmiðlinum. Á sama tíma skaltu fylgjast með því að viðhalda hreinleika og hitastýringu ræktunarumhverfisins til að koma í veg fyrir að frumur verði fyrir truflunum og skemmdum af umhverfinu.

Að auki, í frumuræktarlíkaninu, getum við einnig sprautað ákveðnum efnasamböndum eða lyfjum inn í frumurnar til að draga úr tjáningu taugamótunar og þar með bætt lifunartíðni og minnisgetu frumanna. Þessi tækni er einnig mikið notuð í rannsóknum á taugahrörnunarsjúkdómum.

Í stuttu máli hefur taugahrörnun mikilvæg áhrif á frumustöðugleika og kerfisvirkni og frumuræktunartækni er góð fyrirmyndarrannsóknaraðferð, sem getur stundað ítarlegar rannsóknir og rannsóknir á tengslum taugahrörnunar og minnis. Við getum dregið úr taugamótun frammistöðu með því að rækta umhverfisstjórnun, sprauta lyfjum inn í frumur osfrv., til að bæta frumulifun og minnisgetu og veita yfirgripsmeiri grunn fyrir rannsóknir á taugahrörnunarsjúkdómum. Það má sjá að við þurfum að bæta minni okkar. Cistanche getur bætt minni okkar verulega, því Cistanche getur einnig stjórnað jafnvægi taugaboðefna, svo sem aukið magn asetýlkólíns og vaxtarþátta, sem eru mjög mikilvægir fyrir minni og nám. Að auki getur kjöt einnig bætt blóðflæði og stuðlað að súrefnisgjöf, sem getur tryggt að heilinn fái næga næringu og orku og þar með bætt orku og úthald heilans.

Smelltu á vita bætiefni til að bæta minni

Vegna yfirburða ljósfræðilegra eiginleika glers samanborið við plast, voru ræktunin stofnuð á glerrennibrautum sem innihéldu átta miðlunarhólfa. Byggt á fyrri skýrslum (Lotharius o.fl., 2005; Scholz o.fl., 2011; Kurowska o.fl., 2014), reyndum við upphaflega að koma á ræktun á hólfagljáum húðuðum með PLO og fibronectin; Hins vegar sýndu slíkar ræktanir viðloðun viðloðun og litla lífvænleika. Fyrir vikið prófuðum við hvort húðun með viðbótar hvarfefnum myndi bæta lífvænleika LUHMES frumuræktunar sem komið var fyrir á glerflötum.

LUHMES frumuræktun var stofnuð á glærum sem voru annað hvort óhúðaðar eða húðaðar með PLO og fíbrónektíni, PDL og laminíni, eða samsetningu allra fjögurra hvarfefnanna. Greining á lífvænlegum kjarna með flúrljómunarsmásjá leiddi í ljós að glæruhúð hafði marktæk áhrif á lífvænleika ræktanna [Friedman x2 (3)=18, bls, 0.0001], með margfeldisgreiningum eftir tilvik sem leiddi í ljós að renna húðuð með blöndu af öllum fjórum áðurnefndum hvarfefnum gefa marktækt hærra hlutfall lífvænlegra frumna samanborið við glærur sem eru aðeins húðaðar með PLO og fíbrónektíni (p= 0.0437; mynd 1B, C).

Eftir að hafa borið kennsl á ákjósanlega húðunarhvarfefni til að rækta LUHMES frumur á glerskyggnum, metum við áhrif frumuþéttleika á hæfi ræktanna fyrir mælingar á hrörnun taugafruma. LUHMES frumur voru ræktaðar í aðgreiningarmiðli með 57.500 frumum í hverri holu, 115,000 frumur í hverri brunn, eða 230,000 frumur í hverri brunn, og á fimmta aðgreiningardegi þeirra, voru festir með 4% PFA og myndaðir með fasa-skilgreiningu smásjá.

Þéttleiki upp á 57.500 frumur í hverri holu leiddi til ræktunar með illa nettengdum taugafrumur og óreglulegri formgerð taugafruma, en ræktanir sem komið var á með 230,000 húðunarþéttleika frumur, þó þær væru lífvænlegar, innihéldu of háan taugafrumaþéttleika fyrir nákvæma taugafrumumælingu. Millifrumuþéttleiki 115,000 frumna í hverri holu veitti mikla lífvænleika og vel aðskilin axonsvæði sem stuðla að nákvæmum taugahrörnunarmælingum (mynd 1D).

Til að móta PD-tengda hrörnun taugafruma in vitro, útsettum við aðgreindar LUHMES frumur fyrir 6-OHDA, mikið notað taugaeitur sem stuðlar að oxunarálagi og hrörnun katekólamínvirkra taugafrumna (Bové og Perier, 2012). Útsetning sérhæfðra LUHMES frumna fyrir 6-OHDA stuðlaði að skammtaháðri aukningu á hrörnun taugafruma, þar sem 5,0 mM 6-OHDA og 7,5 mM 6-OHDA olli meðallagi og alvarlegri hrörnun taugafruma, í sömu röð (mynd . 2F). Til að mæla hrörnun taugafruma í ræktun LUHMES-frumna sem verða fyrir 6-OHDA, notuðum við aðferð sem víða er vísað til þar sem fasa-andstæðumyndir af ræktun eru tvískiptar, frumuhlutir í myndunum eru fjarlægðir stafrænt og agnagreiningaralgrímið ImageJ er notað til að mæla flatarmál taugafrumabrota. Brotnu taugafrumusvæðin eru síðan tekin saman og deilt með heildarflatarmáli taugafruma til að ákvarða DI (Mynd 2A–E; Sasaki o.fl., 2009; Kraemer o.fl., 2014; Di Stefano o.fl., 2015; Hill o.fl. ., 2018; Geisler o.fl., 2019).

Eins og búist var við, olli útsetning sérhæfðra LUHMES frumna fyrir 6- OHDA skammtaháðri aukningu á DI (F(3,24)= 119.8, p=0.0001, R{ {8}}.9374; mynd 2G). Hins vegar, við greiningu á frumum sem verða fyrir 6-OHDA, sáum við nokkur atriði sem virtust hafa neikvæð áhrif á nákvæmni og skilvirkni DI mælinga. Þannig reyndum við að fínstilla þessa algengu aðferð til að framkvæma DI mælingar, sem við vísum héðan í frá sem hefðbundna DI aðferð, til að búa til siðareglur sem auðveldar skilvirkari mælingu á sundrun taugafruma.

Að draga úr gervi sundrungu í tengslum við tvígreiningu örmynda

Meðan við notum hefðbundna DI aðferðina, sáum við oft mál þar sem ósnortinn taugafrumur í fasa-andstæða myndum virtust sundurlaus í samsvarandi tvískipt mynd þeirra (mynd 3A). Þessi tilbúna sundrungi hafði fyrst og fremst áhrif á taugafrumur með lítið áberandi. Þannig könnuðum við hvort hægt væri að draga úr vandamálinu með aðferðum sem auka birtuskil myndarinnar. Til að bæta birtuskil myndanna tókum við fyrst myndir af taugafrumur með því að nota margs konar ljósstyrk til að ákvarða birtustig myndarinnar sem myndi gefa bestu birtuskil.

Myndir sem teknar voru með ákjósanlegum ljósstyrk voru síðan settar í frekari birtuskil með því að nota ImageJ til að beita LUT með lágmarks- og hámarksstyrkleikagildum 90 og 205, í sömu röð. Innleiðing þessara birtuaukningar veitti í meðallagi nákvæmari framsetningu á neurites í tvískipt myndum sem myndast úr fasa-andstæða myndum (mynd 3B). Engu að síður benti megindleg greining á tvísýnum myndum af heilbrigðum taugafrumur til þess að birtuaukningin dregur ekki marktækt úr gervi sundrungu (p=0.9999; mynd 3D). Þannig könnuðum við næst hvort notkun ónæmisflúrljómunar myndgreiningar myndi framleiða myndir með betri birtuskilum og þar með auðvelda framleiðslu á nákvæmari tvíliðamyndum með minni gervi sundrun.

Skyggnurnar sem lýst er á mynd 2, með föstum LUHMES frumum sem voru útsettar fyrir ýmsum styrkjum af 6- OHDA, voru ónæmislitaðar fyrir frumubeinagrind prótein b III-túbúlín, myndaðar með flúrljómunarsmásjá og greindar af blindum rannsakanda með tilliti til gervibrots (mynd 3C). Magngreining á tvísýnum myndum sem fengnar voru úr flúrljómunarsmámyndum og samsvarandi fasaskilamyndum leiddi í ljós að tegund smásjárskoðunar hafði áhrif á magn gervi sundrungar [Friedman x2 (3)=15.44, bls, 0.0001] . Nánar tiltekið framleiddu flúrljómunarsmámyndir tvísýndar myndir með marktækt minni gervi sundrungu samanborið við þær úr fasaskilamyndum (p=0.0016; mynd 3D).

Fyrir vikið gáfu myndir af heilbrigðum ræktun marktækt lægri DI stig þegar flúrljómunarsmámyndir voru notaðar frekar en fasaskilamyndir (F(1,8)= 131.4, p=0.{{12} }001, R2=0.1442; mynd 3E). Þar að auki er athyglisverð heildartilhneiging sú að breytingin á milli DI meðalgilda sem tengjast heilbrigðum (meðhöndluðum) ræktun og ræktun sem sýna taugafrumuhrörnun (5,0 eða 7,5 mM 6-OHDA-meðhöndluð) voru meiri þegar þau voru mæld með flúrljómunarmíkrómyndum en þegar fengin er úr fasaskilamyndum (mynd 3E). Þetta gerðist þrátt fyrir að flúrljómunarsmámyndir af ræktun með miðlungsmikla hrörnun taugafruma (framkallað af útsetningu fyrir 5 mM 6-OHDA) hefðu marktækt lægri DI stig en samsvarandi fasamyndir vegna minnkunar á gervi sundrun (p=0.0001 , d=0.6312).

Fínstillingarfæribreytur fyrir greiningu á sundurliðuðum taugafrumur og heildar taugafrumugreiningu
Hin hefðbundna aðferð til að framkvæma DI mælingar felur í sér notkun á Analyze Particles viðbótinni fyrir ImageJ með stærðarbreytum upp á 20 10,000 pixla til að greina taugafrumubrot. Hins vegar sáum við að stór hluti taugafrumabrota var ógreindur af agnagreiningartækinu þegar þessar breytur sem víða er vísað til voru notaðar (Shin o.fl., 2012; Di Stefano o.fl., 2015; Sasaki o.fl., 2016; Loreto o.fl. , 2020; Shin og Cho, 2020) til að mæla hrörnun taugafruma í fasaskilamyndum af LUHMES frumum sem verða fyrir 6-OHDA, mynduðu eins og lýst er á mynd 2.

Þannig endurgreindum við myndir úr því gagnasafni með því að nota mismunandi lágmarksstærðarmörk fyrir greiningu agna til að ákvarða bestu færibreytur fyrir auðkenningu taugafrumabrota. Frá eigindlegu mati á tvígreindum myndum sem voru búnar til úr fasaskilamyndum, bættu stærðarfæribreytur 5–10,000 pixlar greiningu taugafrumabrota, en tengdust einnig rangri greiningu á bakgrunnshljóði, myndgripum eða öðrum litlum efni sem ekki er taugafrumur sem taugafrumur. Samanborið við 20–10, 000 pixla, sem eru mikið notaðar, bættu færibreytur upp á 10-10, 000 pixlar hins vegar greiningu taugafrumabrota án merkjanlega mikillar aukningar á fölskum jákvæðum (mynd 4A) , vinstri).

Svipaðar greiningar voru einnig gerðar með tvígreindum myndum sem fengnar voru með flúrljómunarmíkrómyndum af LUHMES frumum sem eru ónæmismerktar fyrir b III-túbúlín. Kornastærðarfæribreytur 5–10,000 dílar auðvelduðu viðkvæmustu greiningu taugafrumabrota og þar sem flúrljómunarsmámyndirnar sýndu minna af smá rusl, jók slíkar breytur ekki áberandi ranggreiningu á efni sem ekki var taugafrumur sem taugafrumubrot. (Mynd 4A, hægri).

Hin hefðbundna aðferð til að framkvæma DI mælingar, með því að nota stærðarfæribreytur agnagreiningartækis upp á 20–10,000 pixla, útilokar hluti sem eru minni en 20 pixlar frá mælingum á taugafrumubrotum.

Hins vegar eru slíkir litlir hlutir venjulega ranglega teknir með í heildarmælingum taugafruma, þar sem hefðbundin DI mæliaðferð felur í sér að reikna út heildarflatarmál taugafruma með því að leggja saman alla svarta punkta í tvískiptu myndunum. Til að vinna bug á þessu vandamáli notuðum við Particle Remover viðbótina fyrir ImageJ, skrifuð af ImageJ þróunaraðilanum Wayne Rasband, til að fjarlægja litla hluti sem ekki eru taugafrumur úr tvískipuðum myndum. Notkun þessarar viðbótar á meðan DI mælingar voru framkvæmdar með því að nota fasaskilamyndir af LUHMES frumum sem verða fyrir 6-OHDA, mynduðu eins og lýst er á mynd 2, leiddi til marktækrar aukningar á DI mælingum í öllum styrkjum taugaeiturs útsetningar (F(1) ,8)=83.43, p=0.0001, R2=0.0416).
Ennfremur benti marktæk víxlverkun til þess að aukningin á DI af völdum notkunar agnahreinsans varð sterkari við hærri styrk (F(1.881,15.05)=59.97, p=0.0001, R{ {8}}.0094; mynd 4B, C). Við mynduðum einnig sömu glærur af frumum með flúrljómunarsmásjá og metum áhrif þess að fjarlægja smáagna á DI mælingar sem fengnar voru með flúrljómunarsmámyndum. Þó að fjarlæging lítilla agna veiti DI gildi sem eru fræðilega nákvæmari, voru slík gildi að meðaltali ekki marktækur frábrugðinn þeim sem fengust án notkunar agnahreinsunarviðbótarinnar þegar þau voru mæld með flúrljómunarmíkrómyndum (F(1,8)=2. 613, bls=0.1446, R2=0.0013; mynd 4D).

Sjálfvirkni DI mælinga úr flúrljómunarmíkrómyndum

Frammistaða DI-mælinga með hefðbundinni aðferð krefst leiðinlegrar og tímafrekrar myndvinnslu, notkunar á fríhendisverkfærinu til að fjarlægja einstaka frumulíkama á stafrænan hátt og mælingar á sundruðum taugafrumu- og heildar taugafrumusvæðum úr hverri mynd. Þannig var leitast við að auka skilvirkni aðferðarinnar með því að skrifa fjölvi sem gerir DI greiningar að fullu sjálfvirkan. Til að gera fjarlægingu sóma sjálfvirkan, framkvæmir makróið, sem ber titilinn ANDI, tvískiptingu mynda af frumukjörnum, merkt með kjarnalitun DAPI, fylgt eftir með breytingu á tvískiptu myndinni þannig að þröskuld kjarnasvæði eru stækkuð til að ná yfir allt svæði sómans. Slíkar myndir með tvískipt og stækkað kjarna eru síðan dregin frá samsvarandi flúrljómun smámynda af taugafrumum sem eru ónæmismerkt fyrir b III-túbúlín, sem myndar mynd sem eingöngu inniheldur taugafrumur (mynd 5A, B).

Til að aðlagast breytilegum kjarnastærðum af völdum kjarnarýrnunar eða sundrunar í tengslum við taugahrörnun, eru tvíliðamyndir af kjarna stækkaðar með blöndu af útvíkkunum og veðrun sem sameina kjarnabrot og stækka tvískipt svæði til að taka upp svæði sem er stærra en semas aðgreindra LUHMES frumna . Myndir sem eingöngu innihalda neurites eru síðan tvískipt og gerðar DI greiningu með röð af sjálfvirkum aðgerðum (mynd 5C, D). Til að meta nákvæmni makróaðgerða sem tengjast fjarlægingu sóma úr myndum, bárum við saman DI stigin sem fengust eftir handvirka fjarlægingu frumulíkama úr flúrljómunarmíkrómyndum með því að nota fríhendisverkfæri ImageJ (eins og áður hefur verið sýnt á mynd 4D), við DI stig búin til úr greiningum á eins myndum eftir sjálfvirkan flutning frumulíkamans með því að nota sóma-fjarlægingaraðgerðirnar sem sýndar eru í ANDI Macro. Greiningar okkar leiddu í ljós að DI-stig sem reiknað var með sjálfvirkri fjarlægingu frumulíkams tengdust næstum því eins og DI-mælingum sem fengnar voru úr myndum sem voru teknar handvirkt sema-fjarlægingu (r(34)=0.980, p, 0.0001; mynd. 5E).

Til að auka nákvæmni greininganna, felldum við nokkrar af áður lýstum leiðréttingum sem auka DI mælingar inn í ANDI. Fjölvamyndin býður upp á birtuaukaaðgerðir, notkun á Particle Remover viðbótinni til að fjarlægja efni sem ekki eru taugafrumur úr myndum af taugafrumu og efni sem ekki eru kjarnaefni úr myndum af kjarna og greiningu taugafrumabrota með stærðarbreytum 5–10,000 fyrir Analyze Particles viðbótina.

Við gerðum þá tilgátu að sameiginlega myndi notkun flúrljómunarsmásjár, birtuaukaaðgerðir, fjarlægja smáhluti með agnahreinsanum og fínstilltar breytur fyrir agnagreiningu stuðla að nákvæmari mælingum á hrörnun taugafruma. Til að prófa þessa tilgátu voru fasa-andstæða myndirnar af LUHMES frumum útsettar fyrir ýmsum styrkjum af 6-OHDA, sem myndast eins og lýst er á mynd 2, greindar með blindri og huglægri stigagjöf með því að nota gildisbilið á milli 0. 0 og 1.0, með gildi sem tákna sýnilegt hlutfall sundraðs taugafrumasvæðis. Við metum síðan fylgni á milli huglægra skora og DI mælinga sem fengust með hefðbundinni aðferð, sem og fylgni milli huglægra skora og DI mælinga sem fengust með ANDI Macro.

Þó að DI mælingar sem fengnar voru með hefðbundinni aðferð hafi fylgni við huglægar einkunnir (r {{0}}.7850, p,0.0001; mynd 5F), gaf ANDI Macro mælingar sem voru í mun sterkari fylgni við huglægar einkunnir (r 2=0.978, p, 0.0001; mynd 5G). Beinn tölfræðilegur samanburður leiddi í ljós að stig sem fengust með ANDI Macro voru marktækt sterkari fylgni við huglæga einkunn en stig sem fengust með hefðbundinni aðferð (z=6.626, bls, 0,0001; mynd 5F, G). Frekari greiningar leiddu í ljós að makróið auðveldar frammistöðu DI mælinga með öflugri og marktækri endurbót á tímaskilvirkni. DI greiningar sem framkvæmdar voru með ANDI Macro kröfðust að meðaltali 12,75 sekúndum á hverja mynd sem greind var samanborið við 5,27 mínútur að meðaltali á hverja mynd sem greind var með hefðbundinni aðferð [Friedman x2 (1)=9, bls {{22} }.0027]. Á heildina litið benda þessar niðurstöður til þess að ANDI skilar hraðri mynd af DI-mælingum sem, samanborið við stig sem fæst með hefðbundinni aðferð, ná betur saman hrörnuninni sem rannsakendur skynja út frá eigindlegri greiningu á myndum af taugafrumu.

Eftir að hafa ákvarðað nákvæmni og skilvirkni ANDI Macro til að mæla hrörnun taugafruma í aðgreindum LUHMES frumum sem verða fyrir 6-OHDA, metum við hæfi fjölva fyrir tilraunir sem tóku þátt í öðrum frumuræktarlíkönum. Tilraunarannsókn var fyrst gerð til að meta nákvæmni ANDI við framkvæmd DI mælinga með því að nota örmyndir af aðal sympatískum ræktun ónæmismerkt fyrir b III-túbúlín og DAPI. Athyglisvert er þó að frumulíkaminn í sympatískum taugafrumum eru stærri en aðgreindar LUHMES frumur, og þar af leiðandi fjarlægðu aðgerðirnar í ANDI sem tengjast sjálfvirkri fjarlægingu sóma ekki allan sóma (gögn ekki sýnd).

Til að vinna bug á þessu vandamáli, endurskoðuðum við ANDI til að vera með valmynd sem gerir notendum kleift að velja stærð sóma-fjarlægingar með því að stjórna fjölda skipta sem tvískiptur smámyndir af kjarna eru víkkaðar út. Þessi útgáfa af ANDI, útgáfa 1.1, var síðan notuð til að framkvæma DI mælingar úr smámyndum sem sýna heilbrigðar, meðhöndlaðar sympatískar taugafrumur eða úrkynjaðar sympatískar taugafrumur sem verða fyrir vetnisperoxíði. Myndir af taugafrumum sem voru útsettar fyrir vetnisperoxíði gáfu marktækt hærra DI stig samanborið við myndir af taugafrumum sem fengu burðarefni (F(1,3)=71.2, p=0.0035, R2=0 .9301; mynd 6A, C). Ennfremur bárum við saman þessar DI stig sem voru fengnar með því að nota ANDI til DI mælingar sem fengnar voru úr sama myndasetti eftir að frumulíkama voru fjarlægð handvirkt úr flúrljómunarsmámyndum með því að nota fríhendisverkfæri ImageJ. Enginn marktækur munur var á DI stigum sem reiknuð voru eftir handvirkt fjarlægingu sóma samanborið við stig sem fengust með því að nota ANDI (F(1,3)=0.1082, p=0.7639, R2=0. 0000; mynd 6A–C). Post hoc próf staðfestu einnig að DI stig sem fengust með ANDI voru ekki marktækt mismunandi bæði þegar um var að ræða ómeðhöndlaðar taugafrumur (p=0.0972) og þegar um var að ræða taugafrumur sem verða fyrir vetnisperoxíði (p=0). 9986).

Ennfremur voru DI-stig framleidd úr ANDI nánast eins fylgni við DI-stig sem fengust eftir að frumulíkama voru fjarlægð handvirkt úr samsvarandi smámyndum (r(34)=0.991, bls, 0.0001). Þessi gögn sýna að ANDI er hentugur til að mæla hrörnun taugafruma í ræktun frumtaugafruma, með aðgerðum til að fjarlægja sema sem notandinn getur sérsniðið til að passa við mismunandi tegundir taugafrumna. Að auki sýnir uppgötvun taugafrumabrota í ræktun sem verða fyrir vetnisperoxíði nothæfi makrósins til notkunar í tilraunum sem fela í sér hrörnun taugafruma af völdum annarra en 6-OHDA. Til að sannreyna frekar notkun ANDI við að greina hrörnun taugafruma sem tengist ýmsum orsökum, notuðum við einnig makróið til að mæla hrörnun taugafruma í smámyndum af heilbrigðum sympatískum ræktun eða ræktun sem hefur verið hætt með NGF. Eins og búist var við, gáfu myndir af ræktun sem var hætt með NGF marktækt hærri DI gildi samanborið við myndir af heilbrigðum ræktun (F(1,2)= 287, p= 0.0035, R2=0. 958; mynd 6D, E). Samanlagt sýna þessar niðurstöður fram á að hægt er að nota ANDI til að greina hrörnun taugafruma sem tengist ýmsum líffræðilegum samhengi.

Þar sem litun fyrir TH er almennt notuð til að sjá katekólamínvirkar taugafrumur, metum við einnig hæfi smámynda sem sýna TH litun til að mæla hrörnun taugafruma með því að nota ANDI. Menningar heilbrigðra sympatískra taugafrumna sem voru meðhöndlaðir með burðarefnislausn eða hrörnandi sympatískra taugafrumna sem verða fyrir vetnisperoxíði voru festar og settar í ónæmisflúrljómunarmerkingu fyrir TH og b III-túbúlín, auk mótlitunar fyrir DAPI. Neurite myndir sem sýna litun fyrir TH eða b III-túbúlín, og samsvarandi myndir af kjarna með DAPI merkingu, voru síðan teknar á svipuðum sjónsviðum. ANDI var framkvæmt og myndirnar með TH-litun eða b III-túbúlínlitun voru valdar sem taugafrumumyndir. Greiningar okkar leiddu í ljós að DI stig sem fengust með myndum af TH litun tengdust mjög sterkum fylgni við stig sem fengust úr myndum af b III-túbúlín litun (r(28)= 0.962, bls, 0.0001; mynd 6F, G). Þessi gögn benda til þess að hægt sé að fá nákvæmar DI mælingar með ANDI með því að nota aðrar litunaraðferðir sem merkja allt taugafrumur, svo sem ónæmismerkingu fyrir TH.

Til að sýna fram á notagildi endurbættrar aðferðar til að framkvæma DI mælingar í vísindalegri tilraun notuðum við nýju aðferðina til að meta hlutverk JNK í hrörnun taugafruma af völdum oxunarálags í mesencephalic frumum. Aðgreindar LUHMES frumur voru formeðhöndlaðar í 1 klst. með JNK hemlinum SP600125 eða burðarlausninni. Frumurnar voru síðan meðhöndlaðar í 24 klst með 6- OHDA til að framkalla oxunarálag eða með burðarefnislausn. Föst frumur voru settar í ónæmismerkingu fyrir b III-túbúlín og DAPI litun og ANDI var notað til að fá DI mælingar úr flúrljómunarsmámyndum. Þó að ræktanir sem skorti formeðferð með JNK hemlinum sýndu hrörnun taugafruma eftir útsetningu fyrir 6-OHDA, leiddi hömlun JNK til marktækrar og marktækrar lækkunar á 6- OHDA-örvuðu taugafrumuhrörnun (p= 0.0001 , d= 2.0209; mynd 7). Þessar niðurstöður styðja lykilhlutverk fyrir JNK merkjagjöf í hrörnun taugafruma af völdum oxunarálags í heilafrumum manna, og mikilvægur, sýna fram á notagildi nýju aðferðarinnar okkar til að búa til vísindalegar uppgötvanir með því að auðvelda hraða og nákvæma mælingu á hrörnun taugafruma.

Umræða

Hrörnun taugafruma tengist ýmsum taugasjúkdómafræðilegum aðstæðum, en samt er samt ófullkominn skilningur á sameindaaðferðum sem liggja að baki niðurbroti taugafruma. Aðferðir sem auðvelda nákvæma og skilvirka greiningu á hrörnun taugafruma eru nauðsynlegar fyrir árangursríka greiningu á nýjum þáttum sem stjórna þessum mikilvæga frumuatburði. Í þessari rannsókn afhjúpum við margar villulindir sem tengjast algengri aðferð til að mæla hrörnun taugafruma. Við tilkynnum tilraunagögn sem styðja verklagsbreytingar sem hægt er að útfæra til að draga úr DI greiningarvillum, og slíkar breytingar eru felldar inn í nýtt ImageJ fjölvi til að bjóða upp á tól fyrir hraðvirkar, nákvæmar og hlutlægar DI greiningar með því að nota opinn og frjálsan hugbúnað. Ennfremur sýnum við hvernig hægt er að beita bættu aðferðinni til að mæla hrörnun taugafruma í frumuræktunarlíkani af PD, röskun þar sem axonal sundrun í dópamínvirkum taugafrumum er atburður á frumstigi sem er á undan endanlegu tapi taugafrumna (Tagliaferro og Burke, 2016) .

Í þessari rannsókn sýnum við fram á notagildi ANDI Macro við að mæla hrörnun taugafruma í frumuræktarlíkani af PD sem samanstendur af aðgreindum LUHMES frumum sem verða fyrir 6-OHDA.

Við greinum frá tilraunarniðurstöðum sem styðja ákjósanlegt hvarfefni sem ræktunin ætti að vera stofnuð á, auk þess að sýna fram á húðunarþéttleika sem hentar best fyrir taugahrörnunargreiningar. Notkun þessa líkankerfis til að rannsaka hrörnun taugafruma hefur nokkra kosti. Frumurnar þróa taugafrumur sem eru vel tengdar og venjulega 0,500 mm að lengd, og ræktunin er næm fyrir taugahrörnun af völdum klassískra taugaeiturlíkana af PD eins og 6-OHDA, 1-metýl{{4 }}fenýlpýridínjón (MPP1) og rótenón (Lotharius o.fl., 2005; Zhang o.fl., 2014; Smirnova o.fl., 2016; Kraemer o.fl., 2021). Ennfremur eykur mannlegur uppruni LUHMES frumna þýðanleika niðurstaðna sem tengjast líkaninu og skilyrt ódauðleg gerð auðveldar hraða myndun og útbreiðslu ræktunar (Scholz o.fl., 2011). Þannig, ásamt sjálfvirkum greiningum sem gerðar eru með ANDI, er hægt að nota LUHMES frumur til að gera nýjar uppgötvanir sem tengjast PD-tengdri hrörnun taugafruma en auðvelda töluvert meiri afköst samanborið við ósjálfvirkar greiningar sem gerðar eru með frumtaugaræktun.

Fjölmargir rannsóknarhópar hafa framkvæmt DI greiningar með því að nota fasaskilamyndir til að fá innsýn í þætti sem stjórna hrörnun taugafruma (Press og Milbrandt, 20{{10}}9; Kraemer o.fl., 2014 ; Di Stefano o.fl., 2015; Hill o.fl., 2018; Geisler o.fl., 2019). Hér greinum við frá mikilvægum galla sem tengist þessari mikið notaðu aðferð til að mæla hrörnun taugafruma: tvískipting fasa-andstæða mynda veldur því að verulegur hluti ósnortinna taugafruma virðist sundurlaus. Þótt birtustig sem hægt er að ná við töku smámynda sé breytilegt eftir smásjáakerfinu sem rannsakendur standa til boða, er þetta mál útbreidd meðal ýmissa rannsóknarhópa, þar sem DI upp á 0,2 er almennt viðurkennt sem þröskuldur yfir því að ræktun er talin hafa hrörnað axons, og flestar vísindalegar skýrslur sem innihalda DI mælingar úr fasa-skilamyndum hafa greint frá DI skorum fyrir heilbrigðar taugafrumum á milli 0,1 og 0,3 (Sasaki o.fl., 2009, 2016; Di Stefano o.fl., 2015; Hill o.fl., 2018; Loreto o.fl., 2020). DI greiningar okkar sem fengnar voru úr flúrljómunarmíkrómyndum, sem og huglægar einkunnir frá blinduðum rannsakendum, benda til þess að 10-20% sundrun taugafruma sé ekki algeng í heilbrigðum taugafrumum. Slík menning sýnir fremur aðeins 2,5% sundrun taugafruma að meðaltali. Þannig undirstrika niðurstöður okkar þörfina fyrir aðferðir sem bæta nákvæmni greininga á hrörnun taugafruma með því að draga úr þessari algengu og mikilvægu uppsprettu mæliskekkju.

Þó að meirihluti rannsókna sem fela í sér DI mælingar hafi notað fasa-andstæða myndir til að framkvæma taugafrumuhrörnunargreiningar, hafa nokkrir rannsóknarhópar nýlega framkvæmt DI mælingar með myndum af taugafrumum sem eru ónæmismerktar fyrir frumubeinagrind eins og taugaþráða miðlungs fjölpeptíð eða b-b-túbúlín (Wakatsuki) o.fl., 2011; Li o.fl., 2017; Pease-Raissi o.fl., 2017; Hernandez o.fl., 2018; Sundaramoorthy o.fl., 2020). Hins vegar hefur verið óljóst hvaða form smásjárskoðunar hentar best fyrir mælingar á hrörnun taugafruma, þar sem rannsóknir hafa verið nauðsynlegar til að skilja hvort breytingar á staðsetningu þessara frumubeinagrindapróteina við hrörnun taugafruma líkja á viðeigandi hátt heildarbreytingum á formgerð taugafruma, sem og til að meta að hve miklu leyti DI mælingar sem fengnar eru með flúrljómunarmíkrómyndum eru í fylgni við svipaðar mælingar sem fengnar eru úr fasaskilamyndum. Hér sýnum við fram á að flúrljómunarsmámyndir sem sýna b III-túbúlín litun tákna ekki aðeins sundurliðun taugafruma, heldur auðvelda einnig nákvæmari DI mælingar vegna betri andstæða þeirra og minnkaðs næmis fyrir gervi sundrun við tvískiptingu. Þannig benda niðurstöður okkar á gagnsemi þess að nota b III-túbúlín litun til að mæla hrörnun taugafruma.

Meðal útgefinna rannsókna sem fela í sér DI greiningar til að mæla hrörnun taugafruma hafa þær stærðar- og hringbreytur sem greint hefur verið frá sem notaðar eru til að greina taugafrumubrot verið töluvert mismunandi. Til dæmis notaði nýleg rannsókn sem fól í sér mat á hrörnun taugafruma í ræktuðum hippocampus taugafrumum stærðarbreytur upp á 4–900 pixla (Li o.fl., 2017), en rannsókn sem tók þátt í ræktuðum DRG-taugafrumum notaði greiningarfæribreytur af 0–10,000 pixlar (Wakatsuki o.fl., 2011). Ein hugsanleg ástæða fyrir slíkum breytileika er að virkni kornagreiningarstærðarbreyta við að greina taugafrumubrot er breytileg eftir upplausn myndarinnar þar sem stærðarbreytur fyrir greiningu agna eru tengdar pixlaeiningum. Því miður innihalda flestar birtar rannsóknir sem fela í sér DI greiningar ekki lýsingu á myndupplausninni sem notuð er við greiningarnar. Þannig hefur þurft að koma á stöðluðum greiningarbreytum með samskiptareglum sem birtir að fullu mikilvægar upplýsingar eins og ráðlagða myndupplausn. Hér greinum við frá því að algengustu færibreyturnar fyrir greiningu taugafrumabrota, 20–10,000 pixlar (Shin o.fl., 2012; Di Stefano o.fl., 2015; Sasaki o.fl., 2016; Loreto o.fl. al., 2020; Shin og Cho, 2020), leiða til þess að stór hluti taugafrumubrota er ógreindur. Með því að draga úr lágmarksstærðarviðmiðun fyrir greiningu taugafrumabrota eykur það næmni brotagreiningar, en á sama tíma eykst fjöldi myndgripa og rusl sem ekki eru taugafrumur sem eru ranglega greind sem taugafrumabrot. Í leit að færibreytum sem myndu koma best á móti greiningarnæmni og fölskum jákvæðni, greindum við greiningarfæribreytur upp á 10–10,000 sem veita nákvæmustu greiningu á taugafrumubrotum í tvígreindum myndum sem fengnar eru úr fasaskilamyndum, á meðan færibreytur 5– 10,000 auðvelda nákvæmustu greiningu taugafrumabrota í tvísýnum myndum sem fengnar eru úr flúrljómunarmíkrómyndum. Þó að þessar ákvarðanir hafi verið gerðar með því að nota myndupplausnina 1280 1024, ættu slíkar færibreytur einnig að gera nákvæma greiningu á taugafrumubrotum í myndum sem teknar eru með öðrum upplausnum með lóðréttri stærð 1024 pixla, eins og algengri fullskjáupplausn {{ 27}}, þar sem taugafrumur sem sýndar eru á slíkum myndum væru af svipaðri pixlastærð.

Fjölmargir rannsóknarhópar hafa notað lágmarksstærðarviðmið þegar þeir stilla færibreytur agnagreiningar til að koma í veg fyrir að lítið rusl sem ekki er taugafruma sé tekið með í mælingum á taugafrumubrotum (Shin o.fl., 2012; Cosker o.fl., 2013; Di Stefano o.fl., 2015; Sasaki o.fl., 2016; Li o.fl., 2017; Loreto o.fl., 2020; Shin og Cho, 2020; Sundaramoorthy o.fl., 2020). Hins vegar hafa slíkar rannsóknir ranglega tekið lítið, óbrotið efni inn í mælingar á heildarflatarmáli taugafruma, þar sem slíkar mælingar eru fengnar með því að leggja saman flatarmál allra svartra punkta á myndinni. Hér sýnum við fram á notagildi Particle Remover viðbótarinnar til að fjarlægja lítið, óbrotið rusl úr myndinni fyrir DI greiningu. Notkun viðbótarinnar jók verulega næmni mælinga á hrörnun taugafruma sem fengust úr myndum með fasaskilum. Þannig sýna niðurstöður okkar gildi Particle Remover viðbótarinnar fyrir rannsakendur sem framkvæma DI greiningar með því að nota fasa-skilamyndir. Athyglisvert er að flúrljómunarsmámyndir innihéldu minna lítið rusl sem ekki var taugafrumur og því var hægt að nota lægri stærðarviðmiðun, fimm pixla, til að greina brot. Þó að fjarlæging agna á rusli sem ekki er taugafrumur sem er minna en fimm pixlar að stærð hafi ekki marktæk áhrif á DI mælingar sem fengnar voru úr flúrljómunarmíkrómyndum, gefa slíkar aðgerðir gildi sem eru fræðilega nákvæmari og voru því tekin með í ANDI.

Þar sem DI greiningar verða að fara fram með því að nota myndir sem eingöngu innihalda taugafrumur, hefur beiting greiningaraðferðarinnar fyrst og fremst verið takmörkuð við notkun með ræktunarkerfum sem eru hæf til að fjarlægja frumulíkama, svo sem útgræðsluræktun þar sem frumulíkama er hægt að fjarlægja líkamlega (Catenaccio o.fl. , 2017; Shin og Cho, 2020) eða ræktun í örvökvabúnaði sem auðveldar aðskilnað sóma- og axonhólfa (Cosker o.fl., 2013; Pease-Raissi o.fl., 2017; Tan o.fl., 2018). Að öðrum kosti er hægt að framkvæma DI greiningar með aðgreindum ræktun með leiðinlegri og tímafrekri vinnu sem tengist stafrænni fjarlægingu frumulíkama úr smámyndum (Kraemer o.fl., 2014). Í þessari rannsókn afhjúpum við að ANDI gerir kleift að framkvæma DI mælingar úr smámyndum með LUHMES frumum sem eru aðgreindar og mósaíkdreifðar um tvívíddar ræktunarkerfi. Niðurstöður okkar sýna einnig fram á að ANDI auðveldar 24-földun á tíma sem þarf til að framkvæma greiningarnar og aðgerðir í ANDI sem tengjast sóma-fjarlægingu skila niðurstöðum DI-greiningar sem tengjast 98% sambærilegum greiningum sem gerðar eru í kjölfar handvirkrar sóma-fjarlægingar með því að nota fríhendisverkfæri ImageJ. Þannig eykur makróið verulega skilvirkni greininganna með því að framkvæma sjálfvirka fjarlægingu sóma með ferli sem fórnar ekki nákvæmni, og slíkar aðgerðir auka hæfi aðferðarinnar til að greina aðgreindar ræktanir með mósaíkdreifðum frumulíkama.

Auk þess að auðvelda sjálfvirka fjarlægingu frumulíkama úr myndum, býður ANDI upp á nokkrar endurskoðanir á hefðbundinni aðferð til að framkvæma DI greiningu, þar á meðal notkun flúrljómunar smámynda, endurskoðaðar agnagreiningarfæribreytur og notkun agnahreinsans til að fjarlægja lítið rusl sem ekki er taugafrumur. úr myndum. Niðurstöður okkar benda til þess að þessar hagræðingar skili sameiginlega DI-gildum sem ná betur saman gildum sem fengin eru með blindri og undirlagðri stigagjöf. Þannig, auk þess að draga verulega úr þeim tíma sem þarf til að framkvæma greiningarnar, auðveldar ANDI DI mælingar sem, samanborið við hefðbundna aðferð, endurspegla betur þá hrörnun taugafruma sem rannsakendur hafa að sögn fylgjast með út frá eigindlegri myndgreiningu.

Einn galli hefðbundinnar aðferðar til að framkvæma DI greiningar er að slíkar greiningar krefjast þjálfunar í notkun ImageJ þannig að notandinn þekki leiðinlegar myndir af ImageJ aðgerðum. Þar að auki, til að framkvæma greiningarnar á skilvirkan hátt, þarf frekari þjálfun fyrir notandann til að framkvæma lotugreiningar eða til að skrifa forskriftir til að hálfsjálfvirka framkvæmd ákveðinna skrefa. Með því að gera greininguna fullkomlega sjálfvirka auðveldar ANDI DI mælingar í aðeins nokkrum skrefum sem tengjast niðurhali og framkvæmd fjölvi. Til að auka notendavænni inniheldur fjölvi kóða til að bjóða upp á viðmót til að velja möppur sem innihalda myndir sem á að greina, sem og til að auðvelda úttak á niðurstöðumyndum og gagnatöflum í möppu að eigin vali. Þar að auki inniheldur handritið fjölmarga eiginleika sem ætlað er að koma í veg fyrir ónákvæmni í mælingum eða mistökum notenda, þar á meðal sjálfvirk hreinsun fyrri ImageJ niðurstöður; fjarlægja upplýsingar um stærð myndar til að tryggja að mælingar séu nákvæmlega gerðar með því að nota pixlaeiningar; viðeigandi uppsetningu á ImageJ litastillingum, mælistillingum og breytum agnagreiningartækis; villuskilaboð ef notendur velja ranglega möppur sem innihalda ójafnan fjölda mynda sem sýna b III-túbúlín litun og DAPI litun; log lýsingar sem gefa til kynna framvindu greiningar; og kóðun til að koma í veg fyrir villur sem tengjast sjálfvirkri .ini skráagerð með Windows 10. Samanlagt gera þessir eiginleikar DI greiningar notendavænni, sem gæti ýtt undir áhuga á rannsóknum sem tengjast taugafrumuhrörnun.

Til að sýna fram á notagildi þess í tilraun notuðum við ANDI til að meta framlag JNK til hrörnunar taugafruma í LUHMES frumuræktum sem verða fyrir 6-OHDA. JNK er streituvirkjaður kínasi sem hefur verið greint frá sem lykill að hrörnun taugafruma í útlægum taugafrumum af nonprimate uppruna (Shin o.fl., 2012), en frekari rannsókna er þörf til að skilja hlutverk kínasa í hrörnun taugafruma í mesencephalic mannafrumum . Hér sýnum við fram á að hömlun á JNK verndar markfrumur manna í heilahimnu gegn hrörnun taugafruma í tengslum við oxunarálag. Slíkar niðurstöður sýna ekki aðeins mikilvægu hlutverki fyrir JNK í hrörnun taugafruma sem tengist líkani af sjúkdómum í mönnum heldur eru þær einnig til fyrirmyndar gagnsemi ANDI til að framkvæma sjálfvirka og hlutlæga myndgreiningu til að gera nýjar vísindalegar uppgötvanir.

Þó að ANDI hafi upphaflega verið hannað til að auðvelda hraða og nákvæma mælingu á hrörnun taugafruma í ræktun sérhæfðra LUHMES frumna sem verða fyrir 6-OHDA, benda niðurstöður okkar einnig til þess að hægt sé að nota fjölva til að greina hrörnun taugafruma af völdum annarra orsaka, ss. útsetning fyrir vetnisperoxíði eða fráhvarf frá taugatrópíni. Að auki er útgáfa 1.1 af fjölvi með valmynd sem gerir rannsakendum kleift að sérsníða aðgerðir til að fjarlægja sóma fyrir taugafrumur af ákveðinni stærð. Gögnin okkar styðja einnig að hægt sé að nota aðrar litunaraðferðir en ónæmismerkingu fyrir b III-túbúlín til nákvæmrar mælingar á hrörnun taugafruma. Þrátt fyrir að við mælum með því að nota tilraunarannsóknir til að sannreyna nákvæmni DI mælinga þegar ANDI er notað með frumugerðum eða litunaraðferðum sem ekki hafa áður verið prófaðar, styðja þessar niðurstöður að makróið er almennt fjölhæft tæki til að mæla hrörnun taugafruma í ræktuðum taugafrumum. Þar sem ANDI hefur ekki verið fínstillt til að mæla hrörnun taugafruma í vefjum, mælum við sem stendur eingöngu með notkun þess til að greina hrörnun taugafruma sem tengjast ræktuðum frumum. Hins vegar er kóðinn fyrir ANDI aðgengilegur almenningi og gæti því einnig verið gagnlegur fyrir rannsakendur sem hafa áhuga á að breyta handritinu til að henta in vivo rannsóknum eða öðrum forritum.

Að lokum kynnir þessi grein gögn sem sýna algengar villuuppsprettur í tengslum við mikið notaða aðferð til að mæla hrörnun taugafruma. Tilraunaaðferðir voru notaðar til að bæta aðferðina og slíkar aukabætur voru felldar inn í ókeypis og opinn ImageJ fjölva sem hægt er að nota til að framkvæma hraðvirka, nákvæma og hlutlæga greiningu á flúrljómunarmíkrómyndum fyrir hrörnun taugafruma. Niðurstöður okkar sýna virkni ANDI til að mæla hrörnun taugafruma í smámyndum sem sýna frumuræktarlíkan af PD, auk þess að gefa sönnun fyrir meginreglunni um að fjölvi geti greint hrörnun taugafruma sem tengist öðru líffræðilegu samhengi. Notendavæna fjölvi mun draga úr þeim tíma sem rannsakendur þurfa að læra að mæla sundurliðun taugafruma á sama tíma og auka afköst og nákvæmni rannsókna sem meta þætti sem liggja að baki hrörnun taugafruma. ANDI Macro er fáanlegt á eftirfarandi vefslóð: https://github.com/kraemerb/kraemerlab.

Heimildir

1. Aarsland D, Creese B, Politis M, Chaudhuri KR, Ffytche DH, Weintraub D, Ballard C (2017) Vitsmunaleg hnignun í Parkinsonsveiki. Nat Rev Neurol 13:217–231.

2. Adalbert R, Coleman MP (2013) Review: axon meinafræði í aldurstengdum taugahrörnunarsjúkdómum. Neuropathol Appl Neurobiol 39:90–108.

3. Bové J, Perier C (2012) Taugatoxín-undirstaða líkön af Parkinsonsveiki. Taugavísindi 211:51–76.

4. Catenaccio A, Llavero Hurtado M, Diaz P, Lamont DJ, Wishart TM, Court FA (2017) Sameindagreining á axonal-innri og glial-tengdri samstjórnun á axon hrörnun. Cell Death Dis 8: e3166.

5. Cosker KE, Pazyra-Murphy MF, Fenstermacher SJ, Segal RA (2013) Target-afleidd taugatrópín samræma umritun.

6. Di Stefano M, Nascimento-Ferreira I, Orsomando G, Mori V, Gilley J, Brown R, Janeckova L, Vargas ME, Worrell LA, Loreto A, Tickle J, Patrick J, Webster JRM, Marangoni M, Carpi FM, Pucciarelli S, Rossi F, Meng W, Sagasti A, Ribchester RR, et al. (2015) Aukning á NAD forvera nikótínamíð einkirningi (NMN) eftir meiðsli stuðlar að hrörnun axons. Cell Death Differ 22:731–742.

7. Fukui K (2016) Hvarfgjarnar súrefnistegundir valda hrörnun taugafruma áður en frumudauði er framkallaður. J Clin Biochem Nutr 59:155–159.

8. Geden MJ, Deshmukh M (2016) Axon hrörnun: samhengi skilgreinir mismunandi leiðir. Curr Opin Neurobiol 39:108–115.

9. Geisler S, Doan RA, Cheng GC, Cetinkaya-Fisgin A, Huang SX, Höke A, Milbrandt J, DiAntonio A (2019) Vincristine og bortezomib nota mismunandi uppstreymisaðferðir til að virkja algenga SARM1-háða axon hrörnun forrit. JCI Insight 4:e129920.

10. Hernandez DE, Salvadores NA, Moya-Alvarado G, Catalan RJ, Bronfman FC, Court FA (2018) Axonal hrörnun af völdum glutamats örvandi eiturverkana er miðlað af drepi. J Cell Sci 131:jcs214684.

For more information:1950477648nn@gmail.com