Prótein fundust með amk 2 tíðni í hverju athuguðu ástandi

Vinsamlegast hafðu sambandoscar.xiao@wecistanche.comfyrir meiri upplýsingar

Ennfremur, eins og frá súluritunum á myndum 5B og 6B, er áberandi próteindreifing í samræmi við seytandi frumu fyrir súrefnisskorti áberandi. Í þessu tilviki, til að fá heildarupplýsingar, var einnig tilkynnt um prótein sem fara ekki yfir þröskuld DAve og DCI setts. Fóstur hefur seytingarniðurstöður auðgað með 60 kDa hitastuðpróteini (HSPD1, mynd 5B, vinstra spjaldið) í súrefnisskorti, á meðan hliðstæða burðarburðar tjáði mjög sléttvöðvafrumusamdráttarmýósín [52]létt fjölpeptíð 9 (MYL9, mynd). 5B, hægri spjaldið). Mikilvægur hluti af muninum á meðgöngustigum virðist ráðast meira af súrefnisskorti í hAFS. rafbílar; f-have-EVs sem fengust við frumun súrefnisfrumna fundust auðguð með þáttum þar á meðal Perlecan (HSPG2), Agrin (AGRN), Laminin Subunit -5 og -1(LAMA5 og LAMB1), Thrombospondin{{17 }} (THBS1, mynd 6B, vinstri spjaldið). P-hAFS-EV-sýkingarefni innihéldu Ferritin Heavy Chain (FTH1), vinnuprótein eins og Flotillin-1(FLOT1), Fascin (FSCN1), Annexin A6(ANXA6), Rab GDP dissociation inhibitor beta (GDI2), ásamt Thy -1 himnu glýkóprótein (THY1), Neuropilin-1(NRP1) og Matrix Metalloprotein 14 (MMP14, mynd 6B, hægra spjaldið).

Vinsamlegast smelltu hér til að vita meira

Prótein fundust með að minnsta kosti 2 tíðni í hverju athuguðu ástandi í f-hAFS. EVs og p-hAFS-EVs voru enn frekar borin saman við Vesciclepedia gagnagrunninn [53]. Eins og búist var við hefur meirihluta auðkenndu próteina (96 prósent) áður verið lýst í EVs og exosomes í viðmiðunargagnagrunninum (Mynd S3A).cistanche bæturÍ þessu sambandi var Gene Ontology (GO) auðgunargreining framkvæmd með FunRich [54]. Mikið GO hugtaka í gagnasafninu var borið saman við náttúrulegt magn þeirra í tilvísunargagnagrunninum til að finna tölfræðilega offulltrúa próteinhópa, í samræmi við þátttöku þeirra í líffræðilegum ferlum, sameindastarfsemi og frumuþáttum (fyrir þennan síðasta þátt eru gögn ekki sýnd, en fáanleg ef óskað er). Varðandi greiningu á sameindavirkni sem tengist auðkenndum próteinum bentu hAFS-CM hlutar til auðgunar í byggingarhluta utanfrumufylkis og frumubeina, bindingu frumubeinagrindar og sameindavirkni (mynd S2), en hAFS-EVs voru auðguð með burðarvirki. efnisþáttur umfrymis og ríbósóms, DNA og RNA bindingu og GTPase og chaperone bindandi þættir (Mynd S3C).

Auðgunargreining á líffræðilegum ferlum fyrir bæði hAFS-CM og hafa-EVs benti til þess að meirihluti próteina sem breytt er í hAFS seytihlutum fósturs og burðarburðar tilheyrir frumuvexti/viðhaldi og próteinumbrotum (myndir 5C og 6C). Innan hAFS-EVs tókum við eftir því að hugtakið "utanfrumu fylkisbyggingarefni" var eingöngu tengt við súrefnisskort f-hAF-EVs; hugtökin „kalsíumjónabinding“ og „bygging sameindavirkni“ voru aðallega auðguð í súrefnisskorti f-hAFS og p-hAFS sýnum (Mynd S3B).

Figure 6. Comparative proteomics analysis of fetal- and perinatal hAFS-EVs. (A)Venn diagram illustrating the distribution of proteins identified with a frequency of at least 2 within f-hAFS-EVSnormo (dark yellow),f-hAFS-EVSHypo (red), p-hAFS-EVSnormo (light green), and p-hAFS-EVShypo (dark green). (B)Differentially expressed proteins were identified in fetal hAFS-EVs (left panel) and perinatal hAFS-EVs (right panel) by label-free quantification with MAProMa software. Left panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between normoxic control (dark yellow bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (red bars and positive DAve values) of f-hAFS-EVs over p-hAFS-EVs. Right panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between control normoxic (light green bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (dark green bars and positive DAve values) of p-hAFS-EVs over f-hAFS-EVs. Proteins with DAve (ratio of protein expression)>10.4I og DCI (öryggi á mismunatjáningu) Stærri en eða jafnt og I5I stóðust síurnar og voru taldar misjafnlega tjáðar; sjá töflu S3 fyrir heildarlistann og ítarlegar breytur yfir tilkynnt prótein. (C)Auðgunargreining á líffræðilegum ferlum á próteinum sem eru auðkennd með að minnsta kosti 2 tíðni í f-hAFS-EVs (vinstri spjaldið) og p-hAFS-EVs (hægra spjaldið) eftir súrefnisskortsformeðferð. Byggt á FunRich tólinu eru genaverufræðihugtök sýnd á súluritum sem gefa upp hlutfall gena auðgað fyrir hvern flokk (dökkgular súlur fyrir f-hAFS-EVsnormo, rauðar súlur fyrir f-hAFS-EVShypo, ljósgrænar súlur fyrir p-hAFS -EVsnormo og dökkgrænar stikur fyrir p-hAFS-EVShypo). Aðeins erfðafræðihugtök með Bonferroni leiðrétt*bls<0.05 are="">

Cistanche getur gegn öldrun

2.6. Cýtókín- og kemokínprófun fósturs vs. Perinatal hefur-CM og hafa-EVs leitt í ljós mismunandi dreifingarmynstur

Við höfum áður staðfest endurnýjunargetu f-hAFS-CMhypo á slasuðum hjarta- og æðafrumum með paracrine áhrifum [34,35,49]. Hér bárum við saman cýtókín- og kemokíninnihald f-hAFS-CMHypo við samsvarandi p-hAFS hliðstæðu (Mynd 7A, Mynd S4A og Tafla S4) og fundum nokkra mismunandi þætti.

ANGIOGENIN, Extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer (EMMPRIN), Interleukin 8 (IL-8), og Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1) fundust eingöngu auðgað inf-hAFS-CMNypo og voru ekki greind í p-hAFS-CMhypo. Insulin-like Growth Factor Binding Protein 2 (IGFBP2) og Osteopontin (OPN) jukust marktækt í f-hAFS-CMhypo umfram p-hAFS-CMHypo um 3.5-og 3.8-falt (" bls<0.05 and=""><0.01 respectively,="" figure="" 5a).="" plasminogen="" activator="" inhibitor-1(pai-1)="" was="" strongly="" expressed="" in="" both="" f-hafs-cmhypo="" and="" p-hafs-cmnypo="" (figure7a).="" other="" cytokines="" were="" detectable="" at="" low="" levels,="" namely="" cystatin="" c(cst3),="" fibroblast="" growth="" factor="" 19="" (fgf-19)interleukin-17a="" (il-17a),="" macrophage="" migration="" inhibitor="" factor="" (mif),="" pentraxin="" 3="">

Þó að fóstur-á móti burðarmáli hafi-CM sýndi mismunandi tjáningu í cýtókín- og chemokine-sniði þeirra, voru samsvarandi fóstur- og burðarmáls-EV hliðstæður einsleitari, þó með lægri tjáningarsnið (Mynd 7B, Mynd S4B og Tafla S5). Engu að síður mætti ​​meta nokkurn mun: DiPeptidyl-Peptidase IV (DPPIV), Growth/differentiation factor 15 (GDF-15) og IL-8 voru aðeins gefnir upp með f-hAFS-EVSHypo, þó að þeir væru lágir stigum; ANGIOPOIETIN2, CD40 LIGAND og D-vítamín bindandi prótein (VDBP) fundust aðeins í p-hAFS-EVShypo, þrátt fyrir að hafa fundist enn og aftur í litlu magni. Önnur frumudrep eins og Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF)ENDOGLIN, FGF-19, Insulin-like Growth Factor Binding Protein 3 (IGFBP3), IL-17a, MIF OPN, PTX3, Stromal Derived Factor{ {23}} alfa (SDF-1a), fannst bæði í f-hAFS-EVShypo og p-hAFS-EVSHvpo, þar sem PAI-1 og EMMPRIN voru meira tjáð (Mynd 7B)

BDNF, ENDOGLIN, IGFBP3 og SDF-lo voru eingöngu auðguð í öllum súrefnisskorti sem hafa-EV samanborið við samsvarandi hAFS-CM, óháð meðgöngustigi. Þar að auki, á meðan EMMPRIN fannst ekki innan p-hAFS-CMhypo, fannst það auðgað í EV samsvarandi broti; öfugt, OPN var algengari í f-have-CMhypo en í f-have-EVShypo, á meðan það var sambærilegt meðal samsvarandi p-hAFS seytihluta. FGF-19,MIF og PTX3 komu fram á svipaðan hátt í bæði fóstur- og burðarmáls hefur-CM og í samsvarandi hAFS-EVs. PAI-1 var mjög auðgað í súrefnisskorti í seytingarhlutum.

Mynd 7. Cytokine og chemokine profiling innan fóstur- og burðarmáls hAFS seytisamsetninga. (A) Tjáning cýtókína og chemokines sem greindust innan súrefnisskorts fósturs á móti burðarmáls hafa-CM (f-hAFS-CMHypo vs p-hAFS-CMHypo) er greint frá í pixlaþéttleika eftir handahófskenndri einingu [AU]. Gildi eru gefin upp sem meðaltal ±sem óháðra tilrauna og greint frá í töflu S4;*p=0.0485;**p=0.006.(B)Cýtókín- og kemókíninnihald greint í súrefnisskorti fóstursins- á móti hAFS-EVs (f-hAFS-EVSHypo vs p-hAFS-EVSHypo) og gefið upp með pixlaþéttleika í handahófskenndum einingum [AU].cistanche kólesterólGildi eru gefin upp sem meðaltal±sem af n=3 óháðum tilraunum og greint frá í töflu S5. CST3: Cystatin C;EMMPRIN:Extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer;FCFF-19: Fibroblast Growth Factor-19;IGFBP2:Insulin-like Growth Factor(IGF)Binding Protein 2;IL-8:Interleukin -8;IL-17a:Interleukin-17a; MCP-1: Monocyte Chemoattractant Protein-1;MIF:Macrophage migration Inhibitory Factor; PTX3: Pentraxin 3; PAI-1: Plasminogen Activator Inhibitor-1; BDNF: Brain-Derived Neurotrophic Factor; DPPIV: Dipeptidyl Peptidase IV; GDF-15:Growth Differentiation Factor-15;IGFBP3:Insulin-like Growth Factor(IGF)Binding Protein 3;SDF-1a: Stromal Derived Factor-1 alfa; VDBP: D-vítamín bindandi prótein.

2.7.Fóstur- og burðarmálsbílar eru auðgaðir með RNA upplýsingum í farmi sínum

Þar sem lítil RNA sem ekki eru kóðað hafa verið talin meistarar sem stjórna EV paracrine áhrif á markfrumur [4,55], einbeitum við okkur aðallega að RNA raðgreiningu á microRNA (miRNA) innihald innan f-hAFS-EVs og p-hAFS-EVs. Lítil RNA prófílgreining sýndi auðgun miRNA í bæði fóstur- og burðarmálshAFS-EVs (um 35-36 prósent) samanborið við lítið heildarmagn RNA (Mynd 8A). miRNA hluti var örugglega meðal tveggja RNA tegunda sem mest voru fyrir í báðum EV samsetningum, ásamt rRNA(***p) p < 0.0001).="" eftirfarandi="" mirna="" voru="" mest="" auðguð="" í="" ev="" sýnunum="" sem="" greind="" voru:="" mir-31-5p;="" mir-196a-5p;="" mir-93-5p;="" mir-100-5p;="" mir-125a-5p;="" mir-27b-3p,let-7a-5p,let-7b-5p,let-7f{="" {27}}p,let-7i-5p,mir-16-5p,mir-21-5p,mir-29a-3p,="" mir30a-5p,="" mir-125b-5p,mir-155-5p,mir-191-5p="" og="" mir-221-3p.="" athygli="" vekur="" að="" fóstur-="" og="" burðarmáls="" ev="" deildu="" meirihluta="" slíkra="" mirna="" (þ.e.="" let-7a-5p,let-7b-5p,let{{47="" }}f-5p,="" let-7i-5p,="" mir-16-5p,="" mir-21-5p,="" mir-29a{{54="" }}p,mir30a-5p,="" mir-125b-5p,="" mir-155-5p,="" mir-191-5p="" og="" mir-221-3p,="" mynd="" 7b).="" 15="" auðguðust="" mirna="" tegundirnar="" náðu="" yfir="" meira="" en="" 60="" prósent="" af="" heildarmirna="" innihaldi="" í="" hverju="" sýni.="" á="" hinn="" bóginn="" fundust="" um="" 100="" mirna="" í="" hinum="" 30="" prósentum="" af="" mirna="" innihaldi="" bláæða="" (mynd="">

Til að einkenna miRNA innihaldið frekar innan hAFS-EVs, könnuðum við hvort hAFS meðgöngustigið eða in vitro súrefnisfrumuformeðferð gæti haft áhrif á auðgun sérstakra miRNA. Sterkasta mótunin fannst á milli meðgöngustiga, þar sem næstum öll mótuð miRNA voru auðguð í f-hAFS-EV umfram burðarmálshliðstæðuna (Mynd 9A og Tafla 1). Blóðoxunarformeðferð hafði vægari áhrif á miRNA farm, en í þessum samanburði var mótun í hvora áttina, þar sem sumt miRNA var auðgað á súrefnisskorti og annað við normoxískar eftirlitsaðstæður (Mynd 9A).

Sem viðbótargreining lögðum við áherslu á að bera kennsl á rannsakað miRNA með minnsta breytileika milli mismunandi gjafa og forskilyrði ræktunar, fyrir rafbíla sem eru fengnir úr báðum rannsökuðum meðgöngustigum. miRNA sem leiddi af þessari greiningu spannaði frá háu til lágu tjáningarstigi (Mynd 9B). Innan stöðugasta miRNA kjarna hAFS-EVs farms, voru nokkur sameiginleg miRNA milli f-hAFS-EVs og p-hAFS-EVs auðkennd (miR-21-5p, miR-29a-3 p, miR-16-5p á háu stigi; miR-221-3p,miR-221-5p og miR-22-3p á dimmu stigi, tafla 2).

Mynd 9. Greining á mismunaauðgun miRNA í fóstur- og burðarmáls hAFS-EVs. (A) Eldfjallalóðir fyrir mismunaauðgun hAFS-EV miRNA farms í samræmi við meðgöngustigið (vinstra spjaldið) og in vitro súrefnisskortur forskilyrði seytandi frumna (hægra spjaldið). Fyrir miRNA upplýsingar, vinsamlegast skoðaðu töflu1. (B) Dreifingarmynd af fylgni milli breytileika (X ás) og auðgunarstigs (Y ás) stöðugra miRNAs innan fósturs hAFS-EVs (vinstra spjaldið) og burðarmáls hAFS-EVs (hægri spjaldið) samkvæmt háum (gulum punktum), dimm (grænir punktar) og lágir (dökkfjólubláir punktar) auðgun. Fyrir miRNA upplýsingar, vinsamlegast vísa til töflu 2. RPM: lestur á milljón.

3. Umræður

Afgangar af fleygðum sýnum af legvatni manna hafa verið auðkennd sem verðmæt uppspretta stromalfrumna með efnilega möguleika í endurnýjunarlækningum og vefjaverkfræði. Siðferðilegar áhyggjur tengdar einangrun þeirra eru í lágmarki, þar sem þær má fá annaðhvort úr afgangssýnum af hefðbundinni legvatnsskoðun fyrir fæðingu, á öðrum þriðjungi meðgöngu (hAFS fósturs), eða úr legvatni sem fleygt er sem klínískum úrgangi í áætlaðri keisarakafla á þriðja þriðjungi meðgöngu. verklagsreglur (hAFS í burðarmáli). Á undanförnum árum hefur hAFS verið lagt til sem hugsanleg lækningalyf fyrir viðgerðir og endurnýjun vefja í mönnum miðað við hvetjandi vísbendingar sem fengnar eru úr tilraunasjúkdómslíkönum. Athyglisvert er að þeir hafa einnig verið lagðir til fyrir í móðurkviði meðferð á fóstur- og nýbura taugasjúkdómum; Reyndar bentu forklínískar rannsóknir til þess að hAFS gefið með fæðingu með fæðingu í legvatni verndaði mænuna á meðgöngu með paracrine virkni í rottum líkani af myelomeningocele [56-58], og minnkaði skemmdir á óvarnum þörmum í tilraunasjúkdómi nagdýra[59] ]. Frá þýðingasjónarmiði mætti ​​skipta út ígræðslu hAFS í móðurkviði með því að gefa heppilegasta efnablönduna af seyti þeirra (hAFS-CM eða hAFS-EVs).cistanche deserticola aukaverkanirÞessi aðferð myndi leyfa skjóta og tímanlega íhlutun á meðgöngu með því að sigrast á takmörkunum á kanónískri frumumeðferð (þ.e. tímafreka in vitro frumuútþenslu) á sama tíma og framleiðsla er tilbúin og tilbúin til notkunar lyfjaform.

Nýleg þróun minna ífarandi greiningaraðferða fyrir fæðingu getur leitt til minnkunar á legvatnsástungu í náinni framtíð og er því talsmaður burðarmáls hAFS sem aðgengilegri valkostur. Engu að síður, þar sem hAFS fósturs eru óþroskaðri í þroska, geta þau haft áhrifaríkari paracrine möguleika. Innan þessarar atburðarásar, hér bárum við saman fóstur- og burðarmáls c-KITt hAFS og við einbeitum okkur að því að útskýra seytihluta þeirra. Við lögðum áherslu á viðeigandi greinarmun til að taka tillit til fyrir mögulega klíníska þýðingu á paracrine getu þeirra.

Í samræmi við fyrri óháðar rannsóknir sýnum við að meðgöngustigið hafði ekki áhrif á misleita hAFS formgerð og mesenchymal mótefnavakasnið þeirra [25,26]. Við metum síðan breytur sem eru líklegri til að hafa áhrif á frumuseytingu og paracrine virkni umfram kanóníska stromal ónæmisgerð. Sérstaklega hefur verið sýnt fram á að tilvist CD 146-jákvæðs, CD107a-hár undirhóps innan beinmergs mesenchymal forfeðra hefur nýlega fylgni við ótrúlega mótandi og lækningalega paracrine virkni [47]. Hér komum við í ljós að bæði fóstur- og burðarmáls hAFS einkennast sterklega af þessari sameindaundirskrift sem styður seytingargetu þeirra með viðeigandi þýðingaráhrifum. Þar að auki einkenndist hAFS fósturs af óhagkvæmum loftháðum umbrotum, á meðan þroskaðri burðarmálsfóstur sýndu meiri súrefnisneyslu og ATP nýmyndun. Þetta gæti bent til óþroskaðra efnaskiptasniðs hAFS II þriðjungs meðgöngu sem líkist naflastrengsfrumum fyrirbura, sem hafa sýnt sömu þróun [60].

Til þess að kveikja á paracrine-möguleikum, voru hAFS útsettir fyrir 24 klst. sermi-frjáls súrefnisskortur, aðferð sem við höfum áður þróað með góðum árangri [34,35,37] fyrir fósturfrumur og sem við könnuðum hér á burðarmálshlið þeirra í fyrsta skipti. Formeðferð fósturs og burðarmáls hAFS undir súrefnisskorti leiddi til jákvæðrar þróunar í aukningu á seytuþéttni þeirra og magni losaðra EVs, en meðgöngustigið hafði engin áhrif á frumuseytingarafkomu né á EV formgerð og stærðardreifingu.

Sérstaklega leiddi lýsing á hAFS paracrine farminum í ljós ákveðinn mun, í samræmi við mismunandi aðstæður sem við metum. Próteingreining hAFS seyti fóstursins leiddi í ljós áberandi þáttadreifingu byggða á meðgöngustigi og frumu súrefnisskorti. Þetta gefur til kynna að hAFS paracrine möguleiki geti öðlast sérstaka sjálfsmynd meðan á þroska stendur frá Ⅱ til Ⅲ þriðjungi meðgöngu sem aftur er hægt að stilla með því að örva seytandi frumur in vitro. Auðgunargreining á líffræðilegum ferlum á hAFS-CM og hAFS-EVs benti til þess að flest mótuðu próteinanna gætu verið í samræmi við frumuvöxt/viðhald og umbrot próteina, sem styður þannig þau jákvæðu paracrine áhrif sem greint hefur verið frá. Sérstaklega fannst súrefnisskortur fósturs hAFS heildarseytingarefni auðgað með hitalostpróteininu HSPD1 (HSP60), sem sýnt var fram á að styður sársheilun í músahúðlíkani með sykursýki og stuðlar að því að átfrumur leysist upp í M2 svipgerð [61] . Sömuleiðis voru súrefnisskortur fósturs hAFS-EVs auðgaður fyrir þætti sem stuðla að taugamyndun (HSPG2[62], sjálfsendurnýjun frumna og heila- og hjarta- og æðaþroska (LAMA5[63]og LAMB1[64]og fólksflutninga (THBS1 [2]). AGRN fannst einnig í rafbílum í kjölfar súrefnisskorts á hAFS fósturs.cistanche skammtur redditNiðurstöður okkar eru í samræmi við fyrri vísbendingar um að AGRN hafi verið stýrt í próteómi mesenchymal stromal frumna undir bólgu- og súrefnisskorti á leiðbeinandi áreiti [65]. Einnig hefur verið sýnt fram á að AGRN tengist boðefnum ónæmis taugamóta [66] og er í samræmi við endurnýjun músahjarta nýbura [67], sem styður þannig áberandi tilhneigingu til þroska ungs fósturs hAFS til endurnýjandi paracrine áhrif. Ennfremur var staðfest að fóstur hAFS svarar betur fyrir súrefnisskorti eins og sýnt er með auðgun spáþátta um endurnýjun æða, svo sem ANGIOGENIN, EMMPRIM, IL-8 og MCP-1 frumu[68], í skilyrtan miðil þeirra. Þetta styður fyrri vísbendingar um paracrine virkni fósturs hAFS-CM til að efla innræna nýslagæðamyndun í forklínískum nagdýralíkönum af hjartadrepi, blóðþurrð í afturútlimum og blóðþurrð í hálshúð. heildarseyti fannst marktækt meira auðgað með IGFBP2 og OPN samanborið við burðarmálsseytið, sem bendir þannig til áberandi upplausnar og öldrunarmótandi prófíls[72-75]. Fæðingarorlofs-CM, þó að það væri minna aukið í paracrine þáttum, var á sama hátt bætt við taugatruflunum og ónæmisstýrandi þáttum, svo sem CST3 [76,77] og MIF [78].

Samanborið við heildar hAFS-CM, sýndu samsvarandi súrefnisskortur fóstur- og burðarmáls-EV hliðstæður minni tjáningu cýtókína og kemokína, að undanskildum æðauppbyggingarmiðlinum EMMPRIN [79], sem var að mestu auðgað í blöðruhólfinu. Áður greint frá hjarta- og endurnýjunarsniði hAFS-EVs fósturs[34,37] hefur verið staðfest hér með sönnunargögnum um eingöngu tjáningu þeirra á hjartaverndandi IL-8 [80] og GDF-15, lykill paracrine þáttur sem kallar fram innræna fullorðna hippocampus taugamyndun [81,82], auk þess að vinna gegn antracýklín völdum hjartaeitrun [78]. Bæði fóstur- og burðarmáls hAFS-EVs sýndu svipaða tjáningu fyrir stofnfrumna-/stofnfrumuskiptaeftirlitið SDF-1 [83-85]. Próteingreiningin greindi frá aukinni tjáningu próteina sem tengjast æðamyndun, eins og NRP1 [86] og MP14[87]í súrefnisskorti hAFS-EV í burðarmáli; slíkt örvandi snið gæti útskýrt fyrri niðurstöður um endurnýjandi eiginleika æðaþels Ⅲ þriðjungs hAFS í forklínísku múslíkani af blóðþurrðarskaða í beinagrindarvöðva [25], þrátt fyrir vísbendingar um að hAFS-CM þeirra sé minna æðamyndunarvaldandi en samsvarandi fóstur. Sérstaklega fannst taugavaxtarþátturinn BDNF í bæði fóstur- og burðarmáls EV farmi, þó í litlu magni, sem bendir þannig til hugsanlegrar taugakerfisvirkni fyrir hAFS-EVs í taugafrumum og taugaþroskaferlum, eins og einnig sést fyrir utanfrumublöðrur sem seytast eru af mannabeini merg- og naflastrengsblóð-MSC[8889]. Bæði seytisamsetningar frá fóstur- og burðarmáls hAFS, sem gangast undir súrefnisörvun, sýndu að vera auðguð með PAI-1, sem auðveldar virkjun æðaþels [90] sem hefur einnig tekið þátt í skautun M2 átfrumna í hjarta og búið hjartavörn. og trefjaeyðandi möguleika [91].

MicroRNAs (miRNAs) hefur í stórum dráttum verið fjallað um sem mikilvæga eftirlitsaðila á stofnfrumu- og mesenchymal stromal cell-EV paracrine virkni [92,93]. Hér komumst við að því að 15 auðguðustu miRNA tegundirnar innan hAFS-EVs ná yfir meira en 60 prósent af heildarmiRNA innihaldi hvers sýnis. Tilkynnt hefur verið um að þessi miRNA einkenni sameindafarm mesenchymal stromal cell-EVs (let-7a-5p [4,95]), vernda gegn blóðþurrð í hjartavöðva með því að hafa áhrif á endurnýjun æða og hamla bandvefsmyndun (læt -7b-5p, let-7f-5p, miR-21-5p and miR-155-5p [96,97]), kynna sáragræðslu með því að stjórna starfsemi keratínfrumna (miR-16-5p [98]) og vinna gegn taugadauða eftir blóðþurrð í framheila (miR-29a-3p [99,100]). Á hinn bóginn fundust um 1000 miRNA í hinum 30 prósentum af miRNA innihaldi bláæða. Slík ójafnvægi dreifingarinnar er í samræmi við fyrri rannsóknir [4] og dregur fram að mestu auðguð miRNAs sem hugsanlega ábyrgð á helstu líffræðilegu virkni hAFS-EVs. Athyglisvert er að fóstur- og burðarmáls hAFS-EVs deildu meirihluta 15 miRNA. Athygli vekur að við tókum líka eftir því að bæði fóstur hAFS-EVs og burðarmálsfóstur innihéldu mengi mjög stöðugra miRNAs yfir mismunandi auðgunarstig. Slíkar vísbendingar gætu bent til margvíslegra „húshalds“ umsækjenda til að nota sem innra viðmiðunareftirlit í qPCR tilraunum á hAFS-EVs. Þar að auki er stöðugt undirmengi slíkra stöðugra miRNA (miR-16-5p,miR-21-5p,miR-22-3p,miR-29a-3p,miR{ {40}}y miR-221-5p) er deilt á milli meðgöngustiganna tveggja og skarast við þau 15 sem eru aðallega auðguð, sem bendir til enn stöðugri hegðunar og áreiðanlegrar sameindaundirskriftar ([96,{{45 }}]). Athygli vekur að nýlega hefur verið greint frá nokkrum umsækjendum innan slíks áberandi kjarna sem viðmiðunarmiRNA innan taugaverndar EVs sem fengnar eru úr legvatnsfrumum sem eru fengnar af legvatnsfrumum frá II þriðjungi meðgöngu (miR-29a-3p og miR{{ 49}}bls [95]). Engu að síður tókum við einnig eftir því að meðgöngulengd getur stýrt miRNA farminum meira en súrefnisskortur. Þroskunarlega voru fleiri ungir EVs, sem fengust úr hAFS fósturs á þriðja þriðjungi meðgöngu, auðgaðir með miRNA sem áður hefur verið sýnt fram á að styðja lífvænleika fósturstofnfrumna (miR-302-3p [101]), frumufjölgun og beinmergssérhæfingu strómfrumna (miR) -217 [102]), en hefur einnig möguleika á æxlisbælingu (miR-302-3p[103,104]);miR-383-5p[105,106]).

Byggt á niðurstöðum okkar, hér staðfestum við að fóstur- og burðarmáls hAFS gæti táknað aðlaðandi paracrine uppsprettur til að nýta fyrir endurnýjunarlyf. Þó að svipgerð þeirra og seytingarvirkni hafi verið svipuð, höfum við bent á nokkra sérkennilega þætti í seytingarsamsetningum þeirra sem gagnlegar innsýn fyrir lækningalega þýðingar þeirra í framtíðinni.

4. Efni og aðferðir

4.1.Einangrun stofnfrumna í legvatni manna og in vitro ræktun

Manna legvatnsstofnfrumur (hAFS) voru einangraðar úr afgangssýnum af legvatni (AF) sem safnað var með hefðbundinni fæðingarskimun með legvatnsástungu á Ⅱ þriðjungi meðgöngu (fóstur hAFS, f-hAFS), eða sem klínísk úrgangur við áætlaða fæðingu með keisaraskurði á Ⅲ þriðjungi meðgöngu. (barnatal hAFS,p-hAFS) á fæðingargreiningar- og burðarmálslækningadeild, IRCCS San Martino sjúkrahúsinu, á fóstur- og burðarmálslækninga- og skurðlækningadeild og mannerfðafræðirannsóknarstofu á IRCCS Istituto Gaslini sjúkrahúsinu (Genova, Ítalíu). Upplýst skriflegt samþykki var fengið frá öllum gjöfum samkvæmt heimildum siðanefndar (samskiptareglur PR428REG2015) og í samræmi við leiðbeiningar Helsinki-yfirlýsingarinnar. AF sýni af fóstri á öðrum þriðjungi meðgöngu voru fengin frá kvenkyns gjöfum með meðalaldur um 37,42±0,32 ára (n=15 á bilinu 36-allt að 41 árs); kvenkyns gjafar með meðalaldur 34,25±1,31 ára (n=10 á bilinu 26- upp í 42 ára). Fóstur- og burðarmáls hAFS voru fengin úr sýnum sem voru staðfest fyrir eðlilega karyotype og einangruð með ónæmissegulfræðilegri flokkun fyrir c-KIT tjáningu (CD117 MicroBead Kit, Miltenyi Biotechnology, Bologna, Ítalíu) frá viðloðandi AF mesenchymal stromal frumum [16].cistanche þykkni kostirc-KIT* hAFS voru ræktuð í Minimal Essential Medium (MEM)-alfa með 15 prósent FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Ítalíu), 18 prósent Chang B og 2 prósent Chang C Medium (Irvine Scientific) , Santa Ana, CA, Bandaríkjunum) með 1 prósent L-glútamíni og 1 prósent penicillín/streptomycin (Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Ítalíu), í hitakassa við 37 gráður með 5 prósent CO2 og 20 prósent Oz andrúmslofti og ræktað upp í 5 göng in vitro áður en þau eru notuð til að einangra seytingarefni þeirra.

4.2.Lífefnafræðilegt mat á hAFS efnaskiptum

Cell aerobic metabolism was evaluated in terms of oxygen consumption and ATP synthesis through the FI-Fo ATP synthase. Oxygen consumption rate (OCR) was measured at 37 ℃ in a closed chamber magnetically stirred using an amperometric electrode (Unisense-Microrespiration, Unisense A/S, Denmark). One hundred thousand (10>) frumur voru notaðar fyrir hverja tilraun. Til að meta grunnöndun var hAFS gegndrætt með 0.03 mg/ml digitóníni í 10 mínútur og dreift í fosfatjafnalausn (PBS). -leiðir samsettar af fléttum I, II og IV eða fléttum Ⅱ og IV, í sömu röð [60].

Til að meta hlutfallslegt framlag til öndunar glútamíns, langkeðju fitusýruoxunar og glúkósa, eftir digitónín gegndræpi, voru frumur sviflausnar í vaxtarmiðli og 4 uM af BPTES, 4 uM Etomoxir og 4 uM UK5{{22} }99 var bætt við til að hindra glútamínasa, karnitínpalmitóýl-transferasa 1A(CPT1A), eða hvatberapýrúvatbera (MPC), í sömu röð. Virkni Fi-F.ATP synthasa (ATP synthase) var greind með því að mæla ATP framleiðslu með mjög næmri luciferin/luciferasa aðferð. Mælingarnar voru gerðar við 37 gráður, í 2 mínútur, og gögnum var safnað á 30 s fresti. Í fyrsta setti tilrauna voru 10 gráðu frumur ræktaðar í 10 mín. í miðli sem innihélt 50mM KCl,1mMEGTA,2mMEDTA,5mMKH2PO4,2mMMgC12,0.6mMouabain,1mM P1P5-Di (adenósín-5')pentafosfat, 0,040 mg/ml ampicillín og 10mM Tris-HCl pH7,4. Síðan var ATP myndun framkölluð með því að bæta við hvarfefnum öndunarfæranna (10 mM pýruvat auk 5 mM malat eða 20 mM súksínat) og 0,1 mM ADP. Hvarfið var mælt með því að nota luciferin/luciferasa ATP lífljómunargreiningarsettið CLSII (Roche, Basel, Sviss) í Luminometer (GloMax 20/20 Luminometer, Promega, Mílanó, Ítalíu)ATP staðallausnum (Roche, Basel, Sviss) á bilinu {{ 42}}/M voru notuð til kvörðunar. Í öðru setti tilrauna var ATP nýmyndun metin í viðurvist 4 uM BPTES, 4 uM Etomoxir eða 4 uM UK5099. Í þessu tilviki voru 10 frumur ræktaðar í 10 mínútur í vaxtarmiðli í fjarveru eða viðveru efnaskiptahemli, og ATP nýmyndun var framkölluð með 0,1 mM ADP. OxPhos (oxandi fosfórun) skilvirkni (P/O hlutfall) var reiknuð út sem hlutfallið milli styrks framleitts ATP og magns súrefnis sem neytt er í nærveru öndunarhvarfefnis og ADP. Þegar súrefnisnotkun er algjörlega helguð orkuframleiðslu ætti P/O hlutfallið að vera um það bil 2,5 og 1,5 eftir pýrúvat plús malat eða súksínati í sömu röð [48]Til að meta framlag loftfirrrar glýkólýsu til hAFS umbrota, var styrkur glúkósa og laktats metinn. í vaxtarmiðlinum. Glúkósaneysla var metin með hexókínasa (HK) og glúkósa-6-fosfat dehýdrógenasa(G6PD) tengikerfi, eftir minnkun NADP við 340 nm. Greiningarmiðillinn innihélt 100mM Tris-HCl, pH 7.4,2mM ATP,10mMNADP,2mMMgC12,2IU af hexókínasa og 2IU af glúkósa-6-fosfat dehýdrógenasa. Laktatlosun var mæld í kjölfar lækkunar á NAD plús við 340 nm. Greiningarefnið innihélt 100 mM Tris-HCl (pH8), 5 mM NAD plús og 1 ae/ml af laktat dehýdrógenasa. Sýni voru greind fyrir og eftir að 4 ug af hreinsuðu laktat dehýdrógenasa var bætt við. Í báðum tilfellum voru gögn staðlað að frumufjölda og gefin upp sem mM glúkósa/10 gráðu frumur eða mM laktat losaðar/10 gráður frumur, í sömu röð [107].

4.3.Flæðisfrumumælingar Einkenni hAFS

Hundrað þúsund (105)fóstur- og p-hAFS frumur voru losaðar og ræktaðar með músa-CD107a-Alexa flúor 647-og and-manneskju CD146-FITC- samtengd mótefni (eBioscience, Thermo Fisher Scientific, Monza, Ítalía). Frumufrumumyndun var metin með því að nota FITC Annexin V apoptosis Detection Kit (BD Pharmingen, Becton Dickinson, Mi-lan, Ítalíu) eftir leiðbeiningum framleiðanda. Viðburðir voru aflað á BD Bioscience FACS Aria II flokkara og greiningartæki, búin FACS Diva hugbúnaði (BD Bioscience, Bec-ton Dickinson, Mílanó, Ítalía). Gögnin voru greind með FlowJo V9.0 hugbúnaði (BD Bioscience, Becton Dickinson, Mílanó). , Ítalíu). 4.4.Senescence litun

Eldunarsvipgerð hAFS ræktuð upp að leið 5 í stöðluðum in vitro skilyrðum var metin með Senescence -Galactosidase Staining Kit (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA): f-hand p-hAFS var fest með 1x Fixative lausn við 70 prósent samrennsli og lituð fyrir SA- -gal við 37 gráður yfir nótt, samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Aldrunarviðburðir voru fengnir á Leica DMil smásjá (útbúin með Leica Acquire hugbúnaði V3.4.4, Leica Microsystems, Mílanó, Ítalíu) og metin sem hlutfall af SA- -gal-jákvæðum frumum yfir heildarfrumur á hverju sviði.

4.5. Aðskilnaður og styrkur hAFS seytihlutanna

f-hAFS og p-hAFS voru ræktuð í 24 klst. í sermi-fríum miðli (SF) í 1 prósent O2 súrefnisskorti á móti 20 prósent O2 normoxíu (viðmiðun), en hið síðarnefnda var notað sem grunnviðmiðun. Þessi forskilyrði var notuð til að auka losun lífvirkra paracrine þátta, eins og við áður greint frá [34,35,37,49]. hAFS voru ræktuð í 24 klst í sermifríum (SF) miðli (háglúkósa Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM, með 1 prósent L-glútamíni og 1 prósent penicillíni/streptomycini, allt frá Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Ítalíu), undir normoxic (20 prósent O2 og 5 prósent CO2 við 37 gráður) eða súrefnisskortur (1 prósent O2 og 5 prósent CO2 við 37 gráður í CellXpert C170i og Galaxy 48R CO2 útungunarvélum, frá Eppendorf, Mílanó, Ítalíu) aðstæður.

f-hAFS-CM og p-hAFS-CM var safnað og skilið í skilvindu við 4 gráður við 300x g í 10 mínútur og 2000× g í 20 mínútur til að fjarlægja frumurusl; hAFS-CM var þétt með ofsíunarhimnum með 3kDa sértækri skerðingu (Amicon Ultra-15, Merck Millipore Darmstadt, Þýskalandi) við 4 gráður við 3000× g í 90 mínútur og síðan frekar þétt við 4 gráðu við 3000× g í 30 mín. hAFS-EVs voru aðskilin og samþjappuð með raðúrskilvindu frá hAFS-CM. Í stuttu máli var hAFS-CM safnað og skilið í skilvindu við 4 gráður við 300 x g í 10 mínútur og 2000x g í 20 mínútur til að fjarlægja frumurusl. Flotið var síðan unnið við 10.000 x g í 40 mín. Kúlunni var hent og flotið var unnið frekar með ofurskilvindu í Optima L-90K (Beckmann Coulter, Mílanó, Ítalíu) við 10.000×g í 120 mínútur með því að nota Beckman Coulter SW55Ti skilvindu snúninga með sveiflufötu. Kögglan sem innihélt ólík hAFS-EVs var þvegin í PBS með lokaskilvindu við 100.000× g í 120 mínútur og síðan endursviflaus í PBS sem var síuð með 0,22 um hola síuhimnu. Próteinstyrkur í hAFS-CM og á yfirborði hAFS-EVs var mældur með BiCinchoninic Acid (BCA) prófinu (Thermo Fisher Scientific, Monza, Ítalía). Sýni voru tekin á Gen5 Microplate Reader við 570 nm til að meta afrakstur hAFS-CM og hAFS-EVs með tilliti til ug af lausn/10 gráðu framleiðandi frumum.

4.6. Einkenni hAFS-EVs með rafeindasmásjá og nanóagnagreiningu

Sendingarrafeindasmásjárgreining (TEM) var gerð á Hitachi TEM smásjá (HT7800 röð, Hitachi High Technologies, Monza, Ítalíu). Stafrænar myndir voru teknar með Mega view 3 myndavél og Radius hugbúnaði (EMSIS, Muenster, Þýskalandi). f-hAFS og p-hAFS voru fest í 3,7 prósent paraformaldehýð (PA) lausn þynnt 1:1 með hAFS fullkomnum miðli, þvegin í 0.1 M cacodylate jafnalausn og síðan ræktuð strax í 1 klst. við stofuhita í 0,1 M kakódýlatbuffi sem inniheldur 2,5 prósent glútaraldehýð (Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA). Frumukorn voru fest í osmíumtetroxíði í 1 klst. og í 1 prósent úranýl asetatlausn í 1 klst. Sýni voru þurrkuð í 24 klst við 42 gráður og 48 klst við 60 gráður í gegnum flokkaða etanól röð og felld inn í epoxý plastefni (Poly-Bed; Polysciences Europe GmbH, Minneapolis, Þýskalandi). Ofurþunnir hlutar (50 nm) voru skornir með Leica Ultracut microtome (Leica Microsystems, Mílanó, Ítalíu) og mótlitaðir með 5 prósent úranýl asetati í 50 prósent etanóllausn. f-hAFS-EVs og p-hAFS-EVs voru endurblönduð í 20 uL PBS lausn og fest með því að bæta við jöfnu rúmmáli af 2 prósent paraformaldehýði í 0,1 M fosfatbuffalausn (pH7,4). EVs voru síðan aðsoguð í 10 mínútur á formvar-kolefnishúðuð koparrist með því að láta ristina fljóta á 5 μL dropum á parafilm. Í kjölfarið voru rist með viðloðandi rafbílum skoluð í PBS og neikvæð lituð með 2 prósent úranýl asetatlausn í 5 mínútur við stofuhita. Litaðar rist voru felldar inn í 2,5 prósent metýlsellulósa til að bæta varðveislu og loftþurrkað fyrir skoðun. Formgreiningargreining hAFS-EVs var mæld á 10 handahófskenndum smámyndum við 40.000× g stækkun. Stærðin var reiknuð út með því að nota handahófskennda línufallið sem var fellt inn í mæligluggann í Radius hugbúnaðinum (EMSIS, Muenster Þýskalandi). Til að sjá stærðardreifingu hAFS-EVs voru niðurstöður teiknaðar sem dreifingarpunktur og sem tíðni dreifing þar sem hver stærð er táknuð sem punktur ásamt línum fyrir miðgildi og bil.

f-hAFS-EVs og p-hAFS-EVs voru einnig greind með Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) til að meta agnir sem 10 gráður frumur gefa út. hAFS-EVs voru þynnt 1:100 í PBS lausn og fengin á NanoSight LM10 (Malvern Instruments, Malvern, Bretlandi) sem skráði að minnsta kosti 3 mismunandi ramma á 60 s hver. Þrjár mismunandi öflun hvers sýnis voru greindar með því að nota Batch Process valkostinn í hugbúnaðinum. 4.7.LC-MS/MS Greining á hAFS-CM og hAFS-EVs 4.7.1.In-Solution Digestion

Próteingreining var gerð á 3 líffræðilegum endurteknum hAFS-CM og hAFS. EVs frá f-hAFS og p-hAFS eftir normoxic eða hypoxic forconditioning (n=24 mismunandi aðstæður). hAFS-CM og hAFS-EVs sýni voru stöðvuð í 0.1M NHCO3 pH 7,9 og meðhöndluð með RapigestIM SF hvarfefni (Waters Co, Milford, MA, Bandaríkjunum) við lokastyrk 0,25 prósent (w/v). Sviflausnirnar sem fengust voru ræktaðar á meðan hrært var við 100 gráðu í 2{{40}} mín. Meltingin var framkvæmd á hverju sýni með því að bæta við Sequencing Grade Modified Trypsin (Promega Inc, Madison, WI, USA) í ensím/hvarfefnishlutfallinu 1:50 (w/w) yfir nótt við 37 gráður í 0,1 M NH4HCO3 pH7,9 stuðpúði með 10 prósent CHSCN. Viðbótardeilingu af trypsíni (1:100 w/w) var bætt við á morgnana og meltingin hélt áfram í 4 klst. Ennfremur stöðvaði viðbótin á 0,5 prósent Trifluoroediksýru (TFA) Gigma-Aldrich Inc., St Louis, MO, Bandaríkjunum) ensímhvarfið og síðari ræktun við 37 gráður í 45 mínútur lauk RapiGest sýruvatnsrofi [108]. Vatnsóblandanleg niðurbrotsefni voru fjarlægð með skilvindu við 13.000 snúninga á mínútu í 10 mín. Að lokum voru tryptic meltingarblöndurnar afsöltaðar með PierceTM C-18 snúningssúlum (Thermo Fisher Scientific, Monza, Ítalíu), í samræmi við samskiptareglur framleiðandans, og voru endurblandaðar í 0,1 prósent maurasýru (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, Bandaríkjunum) í vatni (LC-MS Ultra CHROMASOLVTM, Honeywell Riedel-de HaenTM, Muskegon, MI, Bandaríkjunum) í styrkleikanum 0,1 ug/μL.

4.7.2.Vökvaskiljun

Trypsín melt blöndur voru greindar með vettvangi sem samanstóð af nanó-vökvaskiljunarkerfi, Eksigent nanoLC-Ultra[2]2D System (Eksigent, hluti af AB SCIEX Dublin, Dublin, CA, Bandaríkjunum) stillt í gildru-skolunarham, ásamt massarófsmæli með mikilli upplausn. Í stuttu máli voru sýni (0,8 ug sprautuð) fyrst hlaðið á peptíðgildru (200 um × 500 um ChromXP C18- CL,3 um,120 A) og þvegin með hleðsludælunni í gangi í jafnþrýstiham með 0,1 prósent maurasýru í vatni í 10 mínútur með 3 μL/mín. Sjálfvirk skipting á tíu-porta loku skolaði síðan föstu blönduna á nanó-snúinn fasasúlu (75 um × 15 cm ChromXP C18-CL,3 um, 120 A) í gegnum 150 mínútna halla af skolefni B (skolunarefni A, 0,1 prósent maurasýru í vatni; skolefni B, 0,1 prósent maurasýru í asetónítríl) við flæðihraða 300 nL/mín. Í dýpt, hallinn var: frá 5-10 prósenti hólf 3mín,10-40 prósent hólf 130mín,40-95 prósent hólf 10 mín og haldið á 95 prósentum B í 7 mín. 4.7.3.Massrófsmæling

MS/MS greiningar voru gerðar á LTQ-OrbitrapXL massarófsmæli (Thermo Fisher Scientific, Monza, Ítalíu) búinn nanospray jónagjafa. Spray capillary spennan var stillt á 1,7 kV og jónaflutnings háræðahitastiginu var haldið við 220 gráður. Fullt MS litróf voru skráð á 400-1600 m/z sviði í jákvæðri jónaham, með upplausnarkrafti upp á 60000 (full breidd við hálft hámark) og skannahraða 2 litróf/s. Þessu skrefi var fylgt eftir af fimm MS/MS-tilvikum í lágri upplausn sem voru mynduð í röð á gagnaháðan hátt á efstu fimm jónunum sem voru valdar úr öllu MS-rófinu (við 35 prósent árekstraorku), með kraftmikilli útilokun 0,5 mín fyrir MS/MS greining. Skannaaðgerðir massarófsmælis og afkastamikil vökvaskiljun leysiefnahalla var stjórnað af Xcalibur gagnakerfi útgáfu 1.4 (Thermo Fisher Scientific, Monza, Ítalíu).

4.7.4.Proteomic Data Processing and Data Mining

Leitað var í öllum mynduðum gögnum með því að nota Sequest HT leitarvélina sem er í Thermo Scientific Proteome Discoverer hugbúnaðinum, útgáfu 2.1. Tilrauna MS/MS litróf voru tengd við tryptic peptíð raðir með samanburði við fræðilega massa litróf sem fengust með kísilmeltingu á Uniprot Homo Sapiens prótein gagnagrunninum (74600 færslur), niðurhalað 2. janúar 020 (www.uniprot.org, skoðað 10 2. mars021). Eftirfarandi viðmið voru notuð til að bera kennsl á peptíðraðir og skyld prótein: trypsín sem ensím, þrjár misstu klofningar á hvert peptíð, massaþol ±50 ppm fyrir forverajónir og ±0,8 Da fyrir brotajónir. Percolator hnútur var notaður með tálbeitingarstefnu til að gefa endanlegt rangt uppgötvunarhlutfall (FDR) á Peptide Spectrum Match (PSM) stigi 0,01 (strangt) byggt á q-gildum, miðað við hámarks deltaCN upp á 0,05 [109]. Einungis peptíð með lágmarks peptíðlengd sex amínósýrur og rank1 voru tekin til greina. Beitt var próteinflokkun og ströngum reglum um sparsemi. MS gögnin hafa verið afhent ProteomeXchange Consortium í gegnum PRIDE [10]samstarfsgeymsluna (ftp://massive.ucsd.edu/MSV000087013/, nálgast þann 10. mars 2021) Próteinin 48 sem fengust úr SEQUEST reikniritinu voru samræmd, eðlileg , og án merkimiða borið saman. Innanhúss reiknirit, þ.e. Multidimensional Algorithm Protein Map (MAProMa) var notað í þessu markmiði, með því að nota meðalpeptíð litrófssamsvörun (aPSM) [111,112] sem samsvarar meðaltali allra litrófsins sem auðkennt er fyrir prótein og þar af leiðandi , að hlutfallslegu gnægð þess, í hverju greindu ástandi. Ítarlega, til að velja mismunandi tjáð prótein, voru undirhópar (fyrir bæði fóstur- vs burðarmáls-hAFS-CM og hAFS-EVs, með tilliti til örvunar fyrir súrefnisskortsfrumur), bornir saman saman með því að nota þröskuld 0,4 og 5 á MAProMa tveimur vísitölur DAve (differential Average) og DCI (Differential Confidence Index), í sömu röð. DAve, sem metur breytingar á tjáningu próteina, var skilgreint sem (XY)/(X＋Y)/0,5, en DCI, sem metur öryggi mismunatjáningar, var skilgreint sem (X plús Y)×(XY)/2 X og Y hugtök tákna PSM tiltekins próteins í tveimur samanburðarsýnum. Að auki voru meðalpróteinlistar, fengnir úr hverju könnuðu ástandi, látnir fara í línulega greiningu (LDA) og prótein með stærsta F hlutfallið (Stærra en eða jafnt og 4,5) og minnsta p-gildið (Minna en eða jafnt og 0.001) var haldið eftir og unnið með stigveldisþyrpingum, með því að beita Ward aðferð og fjarlægðarmælingu Euclidean með því að nota JMP 15.2 hugbúnað. Nánar tiltekið táknaði F-hlutfallið meðaltalsferning líkansins deilt með skekkjumeðalferningnum, en p-gildið gaf til kynna líkurnar á að fá F-gildi sem er stærra en það sem reiknað var út ef í raun og veru væri enginn munur á meðaltölum þýðishópsins. 4.8. Cytokine og Chemokine Profiling hAFS-CM og have-EVs

Cytokine og chemokine profiling hAFS-CM og have-EVs fengin með f-hAFS og p-hAFS eftir súrefnisskortsmeðferð var metin með Proteome ProfilerTM Human XL Cytokine Array Kit (R&D System, Minneapolis, MN, USA) skv. leiðbeiningum framleiðanda. Tuttugu ug af hAFS-CM og hAFS-EVs sýnunum voru notuð. Himnumyndir voru teknar með Chemidoc Mini HD9 Auto (Uvitec Cambridge, Bretlandi) Sérstakt cýtókín/kemókín innihald var metið með magngreiningu á jákvæðum pixlastyrk (með handahófskenndu einingunni) fyrir hvert greinanlegt frumuefni með ImageJ hugbúnaði (fáanlegt á https: //imagej.nih.gov/ij/,sótt 10. mars 2021 [13]). 4.9.RNA útdráttur úr hAFS-EV og Next

Kynslóðaröðun

RNA var einangrað úr f-hAFS-EVs og p-have-EVs með miRNeasy Micro Kit (Qiagen, Mílanó, Ítalíu) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Heilleiki RNA og stærðardreifing voru metin með því að nota Agilent Small RNA Kit með litlu RNA-flögunni sem ekki er kóðað til að meta innihald lítilla RNA á bilinu 6 til 150 núkleótíð (nt). Qubit microRNA prófunarsettið (Thermo Fisher Scientific, Monza, Ítalía) var notað til að mæla innihald microRNA (miRNAs) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. miRNA raðasöfn voru útbúin og mögnuð með því að nota QIAseq miRNA Library Kit (Qiagen, Mílanó, Ítalía) með því að nota 18,5 ng af einangruðum miRNA sem inntak og fylgja leiðbeiningum framleiðanda. Bókasöfn voru sameinuð eftir gæðaskoðun og magngreining TapeStation (Agilent Technologies, Foster City, CA, Bandaríkjunum) var framkvæmd með því að nota Agilent High Sensitivity D1000 ScreenTape. Sameinuð bókasöfn voru metin með tilliti til gæðaeftirlits með rauntíma qPCR í samræmi við "Sequencing Library qPCR Quantification" leiðbeiningar (Illumina Inc, San Diego, CA, USA) og raðgreind af Illumina NextSeq vettvangi með High Output Hit v2.5 (75 lotur) ( Illumina Inc, San Diego, CA, Bandaríkjunum). Grunnsímtöl voru framkvæmd með sjálfgefna Illumina NextSeq500 verkflæðinu.

4.10.Lífupplýsingafræðileg gagnagreining á miRNA raðgreiningu

Fastq skrár voru fyrst unnar með því að klippa af 3' millistykkinu og lággæða grunni með Cutadapt [114]. Eftir klippingu voru innsetningarraðirnar og UMI raðirnar auðkenndar. Lesum án millistykkis, lesum með minna en 16 bp innskotsröð og lestum með minna en 10 bp UMI röð var hent. Til að gera athugasemdir við innskotsröðina var lesið stillt saman við GRCh38 erfðamengissamsetningu mannsins með því að nota Bowtie [15] Fyrir hvert sýni voru allar lestur sem úthlutað var tilteknu miRNA, taldar og tengdar UMIs voru teknar saman til að telja einstakar sameindir. Aukagreining var framkvæmd með sérsniðnum R forskriftum sem voru fáanlegar ef sanngjarnt er óskað. Mismunaauðgunargreining var gerð með Limma [116] og EdgeR Bioconductor pakkningum [117].

4.11. Tölfræðigreiningar

Niðurstöður eru settar fram sem meðaltal ±sem af að minnsta kosti þremur(n{0}}) óháðum tilraunum. Samanburður var gerður með einhliða ANOVA og síðan fylgt eftir með margfeldissamanburðarprófi Tukey eða með t-prófi nemenda. Greiningar voru gerðar með því að nota Graph-Pad Prism útgáfu 8.0.2 (GraphPad hugbúnaður, https://www.graphpad.com, skoðaður 10. mars 2021) með tölfræðilega marktekt sem var stillt á* p<0.05. for="" proteomics="" analysis,="" the="" distribution="" of="" proteins="" in="" the="" examined="" conditions,="" functional="" enrichment="" analysis,="" and="" comparison="" of="" data="" versus="" the="" vesiclepedia="" database="" (http:/microvesicles.org,="" accessed="" on="" 10="" march="" 2021)="" were="" achieved="" using="" funrich="" (version="" 3.1.3,http://www.funrich.org,accessed="" on="" 10="" march="" 2021[54]),="" that="" uses="" hypergeometric="" test="" and="" bonferroni="" for="" statistics="" and="" allows="" the="" graphical="" visualization="" of="" data="" with="" venn="" and="" bar="" charts="" [118].="" 5.="">

Niðurstaðan er sú að hAFS fósturs og burðarmáls fundust svipgerðarlega jafngild með sambærilegum seytingarstyrk og EV auðgun í stærð og dreifingu; samt mátti meta nokkur greinarmun á seytiprófíl þeirra. Nánar tiltekið getur þroskafræðilega óþroskað snið hAFS fósturs verið rifjað upp með seytisamsetningum þeirra sem eru búnar meira áberandi for-æðamyndandi, for-endurnýjandi og endurnærandi seyti. Hins vegar heldur hAFS í burðarmáli enn viðeigandi paracrine prófíl með tjáningu þátta sem tengjast flutningi æðaþelsfrumna, ónæmisstýrandi, bólgueyðandi og taugakerfismöguleika svipað og fósturs hAFS. Þessar niðurstöður geta veitt gagnlega innsýn sem styður framtíðar paracrine meðferð á áverkatengdum og bólgu-/blóðþurrðarsjúkdómum. Þess vegna ætti að meta val á annaðhvort fóstur- eða burðarmálshAFS sem ákjósanlegasta frumugjafa með hliðsjón af tilteknu klínísku atburðarásinni.

Þessi grein er dregin út úr Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms