Fyrri hræðslunám gerir kleift að samlaga nýjar hræðsluminningar hratt inn í heilaberki 3. hluti

Tilraunahönnun

Afritunarhæfni gagna var metin með mismunandi endurteknum (S1 tafla). Fyrstu CNQX óvirkjunartilraunirnar í Te2 (Mynd 1A-1C) voru gerðar í meiri fjölda endurtekna vegna þess að þær voru fyrstu tilraunirnar sem við gerðum og þjónuðu til að prófa helstu tilgátu rannsóknarinnar okkar. Dýrum var fyrirfram skipað í mismunandi hegðunarhópa með þyngdarjafnvægi. Karldýrum af sama ungviði var úthlutað af handahófi í hvern tilraunahóp. Við tókum fyrst á megintilgátu rannsóknarinnar okkar, þ.e. óvirkjun í heilaberki gæti haft mismunandi áhrif á styrkingu nýs óttaminnis í tilraunabarnsrottum og dýrum sem höfðu lært hræðsluatburð áður.

Karldýr hafa afar sterkar minningar vegna þess að þau hafa sterkara lifunareðli og löngun til að fjölga sér. Dýr sem lifa af í náttúrunni þurfa að muna mikið af landfræðilegum upplýsingum, fæðutegundum, rándýrasporum og staðsetningu hópmeðlima til að laga sig betur að umhverfinu og vernda líf.

Til dæmis þurfa karlljón að muna stöðu alls svæðisins, aðildartengsl og staðsetningu keppenda til að vernda landsvæðið og stöðu þeirra. Karlkyns sebrahestar þurfa að muna staðsetningu vatnslinda og fæðu á graslendi til að lifa af og fjölga sér. Gosdrykkur birti einu sinni auglýsingu sem sýndi að ísbjörn gæti munað kafara og einstaka lykt hans svo hann gæti borið kennsl á hann næst þegar þeir sáu hann.

Þess vegna þurfa karldýr að hafa sterkar minningar hvað varðar verndun yfirráðasvæðis síns, útvega næga fæðu og eignast afkvæmi. Þetta gerir þá einnig að mikilvægum viðfangsefnum í rannsóknum á mönnum, til dæmis til að kanna sjúkdóma eins og minnisskerðingu og Alzheimerssjúkdóm.

Í mannheiminum getum við líka sótt innblástur í minningu karldýra. Stöðug útsetning fyrir nýjum hlutum, stöðugt nám og hugsun getur aukið minni okkar og aðlögunarhæfni og bætt lífskjör okkar og vinnu skilvirkni. Þess vegna skulum við læra af karldýrum, halda áfram að safna þekkingu og reynslu, hafa sterka lifunareðli og æxlunarþrá og búa til betri framtíð. Það má sjá að við þurfum að bæta minni okkar. Cistanche deserticola getur bætt minnið verulega vegna þess að Cistanche deserticola er hefðbundið kínverskt lækningaefni með mörg einstök áhrif, ein þeirra er að bæta minni. Virkni hakkaðs kjöts kemur frá hinum ýmsu virku innihaldsefnum sem það inniheldur, þar á meðal sýru, fjölsykrur, flavonoids o.fl. Þessi innihaldsefni geta stuðlað að heilsu heilans á margvíslegan hátt.

Smelltu vita leiðir til að bæta heilastarfsemi

Ef um var að ræða tölfræðilegan mun á milli þessara hópa, gerðum við síðan viðbótarviðmiðunarhópa með því að sprauta saltvatni. Svipuð nálgun var beitt við sjónrænutilraunirnar, þar sem AAV-viðmiðunarhópurinn var aðeins gerður eftir að tölfræðilegur munur greindist á barnlausum og áður þjálfuðum rottum. Þessar tilraunaáætlanir gerðu okkur kleift að forðast óþarfa samanburðarhópa og notkun óþarfa dýra, lykilatriði í evrópskri og ítölskri löggjöf um dýratilraunir (3 Rs meginreglan).

Atferlisaðferðir

Allar tilraunirnar voru gerðar á ljósafasa dagsins (8:00 til 16:00). Dýr voru flutt einstök frá aðstöðunni í tilraunaherbergin í mismunandi litlum gagnsæjum fötum eftir tilraunakröfum.

Heyrnarþjálfun: Fyrsta atferlislotan. Dýr með heyrnarhræðslu (CS1-CS2). Í þessum hópi voru rottur teknar varlega úr búrinu heima og þær fluttar úr húsnæðinu í hljóðeinangraða herbergið. Þegar þangað var komið voru dýrum komið fyrir inni í hreinsunarbúnaðinum sem samanstóð af rétthyrndu svörtu búri (35 × 40 cm) sem búið var rist úr ryðfríu stáli (1 cm í þvermál, með 1,5 cm millibili) sem var tengt við höggafhendingaruppsetningu.

Rottur voru látnar óáreittar í 1 mínútu. Eftir þennan tíma voru 7 skilyrt áreiti (CSs) sem samanstanda af hreinum tóni með 15 kHz tíðni (15 sekúndur lengd hvert, 80 dB, 36 s prufubil) gefið. Síðustu 1 sekúndu af hverjum tóni var parað við sársaukafullan US (0,5 mA, 1 s). Í lok meðferðarlotunnar voru rottur fluttar aftur í búrið sitt.

Dýr eingöngu fyrir lost (shock-CS2). Í þessum hópi voru rottur á sama hátt settar inn í sama ástandsbúnaðinn. Strax á eftir fékk hver rotta 7-fótlost (1 s, 0,5 mA) hvert á eftir öðru. Í lok örvunarinnar voru dýr færð aftur í búrið sitt. Tímavaranleiki í aðhaldsbúrinu var innan við 9 sekúndur. Fyrri rannsóknir sýndu að þessi aðferð gerir kleift að forðast tengslaferli milli sársaukafullra áreita og skynörvunar [29,30].

Lyktarhrædd dýr (lykt-CS2). Í þessum hópi voru rottur settar inn í sama rétthyrnda svarta búrið sem notað var í ofangreindum tilraunahópum og tengdar uppsetningu áfallsgjafa. Rottur voru látnar óáreittar í 2 mín. Eftir þennan tíma voru gefnar 7 CS sem samanstóð af vanillulykt (10 sekúndur af lengd hver, 24 s prufubil). Síðustu 1 sekúndu af hverri lykt var pöruð saman við sársaukafullan US (0,5 mA, 1 s). Aðstæðueiningunni var komið fyrir nálægt loftræstigjafa til að forðast viðvarandi áreiti sem afhent var eftir að þau hafa verið fjarlægð. Búrið var tryggt með efri rist. Lykt var sett fram með flæðiþynningarlyktarmæli. Hreint loft (1,5 l/mín.) var beint að segullokuloka, sem þegar hann var notaður, sendi loftið í 15 ml flösku sem innihélt 10 ml af vanillulykt.

Dýr eingöngu með tón (Tone-CS2). Rottur í þessum hópi voru settar inni í sama svarta búrinu og fengu 15-kHz tóninn (7 áreiti, 15 sekúndur, 36 sekúndur ITI) sendar í fjarveru Bandaríkjanna.

Forútsett dýr (Tone-CS1-CS2). Rottum var komið fyrir inni í búrinu og 1 mínútu síðar fengu þær 20 sinnum 15-kHz tóninn eingöngu og 24 klst. síðar var sami tónn paraður og Bandaríkin urðu CS1.

Dýr með hræðslu með hvítum hávaða (WN-CS2). Í þessum hópi voru rottur settar inni í rétthyrndu svarta búrinu og þær látnar óáreittar í 1 mínútu. Eftir þennan tíma voru gefnar 7 CS sem samanstóð af WN (15 sekúndur af lengd hver, 75 dB, 36 s á milli prófana). Síðustu 1 sekúndur hvers tóns voru paraðar við sársaukafullan US (0,5 mA, 1 s). Í lok meðferðarlotunnar voru rottur fluttar aftur í búrið sitt.

Heyrnarhræðslunám: Önnur atferlisþjálfun. Tveimur vikum eftir aðferðirnar sem lýst er í ofangreindri málsgrein voru dýr þjálfuð í öðru öðru verkefni sem þolir heyrnarhræðslu. Rottur voru settar í hefðbundið skinnkassa, eins og í fyrri verkum okkar [10], og þær látnar ótruflaðar í 2 mín. Eftir þennan tíma voru sendar 7 CSs sem samanstanda af hreinum tónum með 3 kHz tíðni (8 sekúndur lengd hver, 80 dB, 22 s milliprófabil). Síðustu 1 sekúndu af hverjum tóni var parað við sársaukafullan US (0,5 mA, 1 s). Í lok meðferðarlotunnar voru rottur fluttar aftur í búrið sitt.

Hræðsla minni varðveisla. Varðveisla á heyrnarhræðsluminni sem nýlega fékkst við CS2 (3 kHz) var prófuð 4 dögum síðar. Fyrir sjónrænafræðilega tilraunir var prófun á nýlegu minni framkvæmt með leysisgjöf 24 klst. eftir CS2-US námið á hliðstæðan hátt við það tímabil sem við gerðum óvirkjun á heilaberki með gjöf CNQX (þ.e. 24 klst. eftir þjálfun). Rottur voru vanar búnaði sem var öðruvísi en notaður var til að skilyrða og voru settar í annað herbergi til að forðast skilyrta óttahegðun við samhengisvísbendingar [10,62].

Nýja búnaðurinn samanstóð af gagnsæju plastbúri með svartmálaðri hlið sem var lokað í hljóðdempandi kassa með útblástursviftu, sem útilokaði lyktandi loft frá girðingunni og gaf bakgrunnshljóð upp á 60 dB. Dýrum var leyft að skoða búrið í 5 mínútur á dag meðan á vanatímanum stóð. Á degi hræðsluminnisprófsins, eftir 2 mín af frjálsri könnun, afhentum við 4 CS2 af 3 kHz (8 s—22 ITI) sem ekki var fylgt eftir af bandarískum.

Ef tilraunaþörfin krefst þess, voru rottur síðan prófaðar með tilliti til varðveislu á fjarhræðsluminninu, sem aflað var 2 vikum fyrir seinni heyrnarhræðslutilraunina. Í þessu markmiði, 7 dögum eftir hræðsluminnisprófun á 3-kHz tónnum, voru dýr sett í nýtt umhverfi (svart og hvítt röndótt búr) og síðan sett fyrir 15-kHz tóninn. Fjórir tónar voru sýndir með 36s millibili.

Samhengisþjálfun: Fyrsta atferlislotan. Samhengisbundinn óttaskilyrði hópur (CtxA-CtxB). Í þessum hópi voru rottur varlega teknar úr búrinu heima, settar í fötu og fluttar úr húsnæðinu í hljóðeinangraða herbergið. Þegar þangað var komið voru dýrum komið fyrir inni í hreinsunarbúnaðinum sem samanstóð af fyrrnefndu rétthyrndu svörtu búrinu, búið rist úr ryðfríu stáli sem var tengt við uppsetningu áfallsgjafa. Rottur voru látnar óáreittar í 1 mínútu. Eftir þennan tíma voru 5 US (0,5 mA, 1 s) gefin með 51 sekúndu millibili. Í lok fundarins voru dýrin færð aftur í búrið sitt.

Hópur eingöngu fyrir lost (shock-CtxB). Rottur, þegar þær voru settar inni í búnaðinn, fengu strax 5-fótstuð (1 s, 0,5 mA) hvert strax á eftir öðru. Tímavaranleiki í aðhaldsbúrinu var innan við 7 sekúndur. Fyrri rannsóknir sýndu að þessi aðferð gerir kleift að forðast tengslaferli milli sársaukafullra áreita og skynörvunar [29,30].

Hópur eingöngu fyrir lost (shock-CtxB). Rottur, þegar þær voru settar inni í búnaðinn, fengu strax 5-fótstuð (1 s, 0,5 mA) hvert strax á eftir öðru. Tímavaranleiki í aðhaldsbúrinu var innan við 7 sekúndur. Fyrri rannsóknir sýndu að þessi aðferð gerir kleift að forðast tengslaferli milli sársaukafullra áreita og skynörvunar [29,30].

Ný samhengisbundin hræðsluskilyrðing og nýleg hræðsluminni varðveisla. Tveimur vikum eftir aðgerðirnar sem lýst er í ofangreindri málsgrein voru allir hópar þjálfaðir í að tengja nýtt samhengisumhverfi (skinner box-einingin, sett í annað herbergi) við sársaukafullan US (0,5 mA, 1 s) . Hvert dýr var komið fyrir inni í nýja hólfinu og látið ótruflað í 2 mín. Síðan var það útsett fyrir 5 US aðskilið með 30 s millibili.

Varðveisla á samhengisminni var prófuð 4 dögum eftir hræðslumeðferð með því að setja rottur aftur í Skinner kassann í 3 mín. Fyrir sjónrænufræðilegar tilraunir var prófið á nýlegu minni framkvæmt með leysisgjöf 24 klst. eftir CtxB-US námið á hliðstæðan hátt við það tímabil sem við gerðum óvirkjun á heilaberki með gjöf CNQX (þ.e. 24 klst. eftir þjálfun). Ef tilraunaþörfin krefst þess, voru rottur síðan prófaðar til að varðveita fjarhræðsluminnið með því að setja dýr í samhengi sem parað var við Bandaríkin 2 vikum fyrir nýja samtökin.

Dýr voru flutt í 2 mismunandi fötum í aðbúnaðarklefana í samræmi við mismunandi samhengisaðferðir.

Frostráðstöfun. Í öllum tilraunaaðgerðum var mat á hræðsluminninu ákvarðað sem frostviðbrögð [10], greind sem algjör fjarvera líkamshreyfanleika nema fyrir öndunarhreyfingar. Fyrir hvert dýr var tíminn (í sekúndum) sem eytt var í frystingu mældur án nettengingar af 2 óháðum eftirlitsaðilum sem voru blindaðir á dýrahópana.

Skurðaðgerðir

Til að gefa valin efni á marksvæðin voru rottur svæfðar með ísóflurani: Innleiðingin var framkvæmd við 4% [rúmmál/vold] í 2 L/mín. læknislofti og framlengt til stöðugrar útsetningar við 2% [vol/vol]) þegar rottum var komið fyrir í stereotaxic tækinu.

Skurður var á höfuðkúpu og boruð voru lítil göt til að hleypa innrennslisnáli 28- í gegn. 10-ul Hamilton sprauta fest á innrennslisdælu var notuð til að afhenda efni. Eftir innrennsli var nálin látin standa í 3 mínútur til viðbótar. Skurðinu var síðan lokað með ryðfríu stáli sáraklemmum og dýrinu var sprautað undir húð með verkjastillandi/bólgueyðandi ketoprofeni (2 mg/kg líkamsþyngdar) og dýrinu haldið heitu og undir eftirliti þar til hún náði sér eftir svæfingu.

Eins og í fyrri rannsóknum [10,32-34] var skurðaðgerð dýra óþörf, þar sem virku efnasamböndin voru gefin beint steríótaxískt. Þessi aðferð er hagstæð vegna þess að forðast er skurðaðgerð sem felst í varanlegu holræsiaðgerðinni og takmarkar þannig áverka við staka nál [10,32-34]. Reyndar hefur almenn svæfing ekki marktæk áhrif á styrkingu minnis [10,32-34]. Til að tryggja að tímasetning lyfjagjafar í tengslum við námsprófið væri nákvæm þannig að rottur fengu valin efnasambönd um það bil 1 klst. og um það bil 1 degi eftir þjálfun, var ísóflúrandeyfing framkölluð 5 mínútum fyrir tímasetningu fyrirhugaðrar inndælingar, td við 55. mín. hjá rottum sem fengu meðferð 60 mín eftir þjálfun og 23 klst. og 55 mín. hjá dýrum sem voru sprautaðar 24 klst. eftir þjálfun. Hver rotta var skilyrt og síðan aðgerð sérstaklega. Dýr sem tilheyra mismunandi hegðunarhópum voru meðhöndluð á fléttaðan hátt.

Sértæki hemill AMPA/kaínat glútamatviðtaka CNQX ({{0}}Sýanó-7-nítrókínoxalín-2,3-díón) (Tocris, 10 ng /ul) [20,21] var leyst upp í sæfðri saltlausn (NaCl, 0,9%) og stillt á pH 7,4 með HCl. Próteinmyndunarhemill anisomycin (Merck, 125 ug/ul) var leystur upp í jafnmólum HCl, þynnt með dauðhreinsuðu saltvatni og stillt á pH 7,4 með NaOH. Dauðhreinsað saltvatn (0,9% NaCl) var notað sem burðarefnisstýring. Þessum efnum var sprautað tvíhliða á hraðanum 0,1 ul/mín og rúmmáli 0,5 ul á stað á eftirfarandi steríótaxískum hnitum sem tekin voru úr Paxinos og Watson atlas [26], þar sem Te2 barkarsviðið var dæmt í Zilles atlas [25]:

Secondary auditory cortex (Te2): 1) AP: −5,8 L: ±7,2 DV: −6. 2) AP: -6,8 L: ±7,2 DV: −6.

Anterior cingulate cortex (ACC): 1) AP: +2,5 L: ±0,6 DV: −2,2. 2) AP: +3,7 L: ±0,6 DV: −2,2.

Inndælingarrúmmál (0,5 ul á stað) var valið á grundvelli fyrri rannsókna þar sem virkum efnasamböndum var sprautað í Te2 [10,34] og ACC [55,63] í fullorðnum rottum.

Til að óvirkja dorsal hippocampus voru virkum efnasamböndum sprautað í rúmmáli 0,6 ul á hverri stað með eftirfarandi steríótaxískum hnitum:

Dorsal Hippocampus: 1) AP: −2,8 L: ±1,6 DV: −3,3. 2) AP: −4,2 L: ±2,6 DV: −3.

Óafturkræfar meinsemdir í dorsal hippocampal voru framkallaðar með því að gefa NMDA (Tocris, 18 ug/ul, uppleyst í dauðhreinsuðu saltvatnslausn, 0,4 ul á stað) á hraðanum 0.1 ul/ mín á punktum á fyrrnefndum hnitum. Sömu hnit voru notuð fyrir saltvatnssprautað viðmið og sýndarrekin dýr.

Rauðar retróperlur (Lumafluor, 1:2 þynning í saltvatni, 0.6 ul) voru sprautaðar í BLA samkvæmt eftirfarandi hnitum: AP: -2,8; L: ±5,4; DV: −8,3.

Í lok tilraunanna voru nálarsporin ef um var að ræða CNQX, anisomycin eða saltvatnssprautur eða framlenging sára þegar um NMDA inndælingar var að ræða, vefjafræðilega sannreynt. Rottur voru djúpsvæfðar og 4% formaldehýð í gegnum hjartað. Heili þeirra var sneiddur í 30 μm á frystistilli. Nissl-litaðir raðhlutar voru útbúnir með hefðbundinni aðferð og sneiðarnar voru vefjafræðilega sannreyndar í smásjá sem stækkaðar voru í 2,5×.

Optogenetic tilraunir

Veirusprauta. Adenó-tengda vírusinn AAV5:CaMKII ::eNpHR3.0-kirsuber og viðmiðunarferjan AAV5:CaMKII -kirsuber voru fengin frá University of North Carolina Vector Core (Chapel Hill, Norður-Karólína, Bandaríkin). SetninginViraltiter var 5:8 veirutitillinn var 5,8 × 10^12 vg/ml fyrir báðar vírusana. Notkun CaMKII hvata gerir kleift að tjá transgena sem styður pýramída taugafrumur. Veirur voru geymdar í −80˚C frysti. Veiruinnrennsli sem miða að Te2 eða ACC voru framkvæmd á ofangreindum steríótaxískum hnitum við rúmmálið 0,5 ul fyrir hvert gat. Veiran var sprautuð með hraðanum 0,1 ul/mín og nálin var látin sitja í 5 mínútur til viðbótar. Veirusprautur voru framkvæmdar 4 vikum fyrir augnerfðafræðilegar tilraunir.

Lýsing.

Ljósleiðararnir (Plexon, 200/230 μm kjarni; 10 mm lengd) voru græddir tvíhliða í BLA (AP=−2.8, L=± 5.4, V=−8.2 mm frá bregma). Optogenetic hömlun á Te2 vörpum til BLA eða ACC vörpum til BLA var fengin með því að nota PlexBright Optogenetic Stimulation System tengt við leysidíóða (Laserglow Technologies). Gult ljós (589 nm) myndast og fer í gegnum ljósleiðara. Aflþéttleiki áætlaður á toppi ljósleiðarans var 10 til 15 mW fyrir lýsingu á varpstöðum. Meðan á hræðslu minni varðveislu hófst ljósgeislun 4 sekúndum áður en tónn hófst, hélst allan tóninn og var stöðvuð 4 sekúndum eftir tónjafnvægið. Dýr sem tilheyra hópum sem tilheyra samhengishræðsluskilyrðum fengu ljósörvun meðan á samhengiskönnuninni stóð (3 mín.). Rottur voru kunnugar plástursnúrunni í 2 daga fyrir rannsókn á minnissöfnun.

Ónæmisvefjafræði. Að loknum sjónrænafræðilegum tilraunum voru rottur djúpsvæfðar og þær geymdar í hjartað með 4% PAF til að kanna útbreiðslu veirunnar. Heilinn var krufinn, geymdur yfir nótt við 4˚C og að lokum færður yfir í 30% súkrósa. Kórónuhlutar (30 μm) voru skornir á kryostat og safnað í PBS. Frjáls-fljótandi hlutar voru ræktaðir í blokkandi lausn í 1 klst við RT. Síðan voru þau ræktuð í frumeinstofna músa mótefnismótefni mCherry (1:500 þynning, Abcam) í blokkunarlausninni yfir nótt við RT. Í kjölfarið voru hlutar skolaðir með PBS og ræktaðir í 1 klst við RT með aukaflúrljómandi AlexaFluor-568 mótefni gegn músum (1:600, Invitrogen) þynnt í PBS. Hlutar voru þvegnir í PBS, settir upp með uppsetningarmiðli sem innihélt DAPI (Vector), og hlífðarglerið sett á.

Heila rotta sem gengust undir NMDA sprautur var safnað á sama hátt. Frjáls-fljótandi hlutar, eftir nokkra skolun, voru ræktaðir með frumeinstofna músa anti-Neun (1:1,000 þynningu, Merck) mótefni í blokkunarlausninni yfir nótt við stofuhita. Í kjölfarið voru hlutar þvegnir með PBS og ræktaðir í 1 klst við stofuhita með líftínýleruðu hestamótefni gegn músum (1:200 þynning, vektor). Avidin-bíótín flókið (ABC flókið 1:100, vektor, 2 klst og helmingur ræktunar) var tengt díamínóbensídíni (0,03%, Merck) til að lita Neun. Hlutar voru síðan skolaðir í PBS og færðir yfir á gelatínhúðaðar glærur, þurrkaðar og huldar með hylki.

Te2 hlutar af rottum sem sprautar voru með retróperlum fóru í ræktun með aðal fjölstofna kanínu and-Fos mótefni (1:2,000, frumumerki) í blokkunarlausninni yfir nótt við RT. Í kjölfarið voru sneiðar þvegnar með PBS og ræktaðar í 1 klst við RT með anti-kanínu Alexa 488 (1:1,000, Invitrogen, í PBS). Að lokum voru ónæmismerktir hlutar þvegnir í PBS, settir á gelatínhúðaðar glærur og huldar með DAPI-bættu festingarefni.

Smásjárskoðun

mCherry merking var skoðuð með Zeiss Airyscan confocal smásjá: Tveir leysir voru notaðir (405 og 561 nm), hver samsvaraði hámarks losunarróf fyrir DAPI (Nissl litur fyrir frumukjarna) og Alexa 568 (mCherry) ), í sömu röð. Til að greina útbreiðslu veirunnar á stungustöðum voru teknar smámyndir af Te2 og ACC sem mósaíkmyndir (hver eintak var tekin með því að nota 10× hlutlægt). Axon-enda í BLA voru greind með því að nota 40× hlutlæg sem z-stafla af 10 hlutum, með 1 μm millibili (159 μm ferningur; aðdráttarhluti, 1,0).

Fyrir dýr sem sprautuð voru afturperlur sem gengust undir cFos ónæmismerkingu voru myndir teknar með 40× stækkun (159 μm ferningur; aðdráttarhluti, 1.0) með 3 mismunandi leysigeislum, sem samsvara hámarks losunarrófinu fyrir DAPI (Nissl litur fyrir frumukjarna), AlexaFluor 488 (cFos) og Texas Red (Retrobeads), í sömu röð. Hlutar af 0,7 μm voru teknir meðfram 10-μm z-stafla. Fjöldi kjarna sem tjáir cFos, perlurmerktar og tví-jákvæðar (cFos+ perlur merktar) var magngreindur fyrir hvert dýr á Te2 svæðinu á framhliðarhnitunum frá 6,7 til 7,3 mm frá bregma [10]. Gögn voru síðan tekin að meðaltali til að gefa meðaltal hvers dýrs og niðurstöðurnar bornar saman tölfræðilega. Myndir af köflum með DAB litun á Neun voru greindar með Neurolucida hugbúnaði sem tengdur var við smásjá í gegnum CCD litamyndavél [10].

Gagnagreining og útilokunarviðmið

n fyrir hvern hóp var ákveðið fyrirfram samkvæmt fyrri rannsóknum okkar [10,16,17], áður birtum verkum á þessu sviði (sjá sem tilvísanir fyrir ACC [6,22,55] og Te2 [10,59]), og í gegnum mat á G-krafti, samkvæmt eftirfarandi töflu (tafla 1):

Fyrir hverja greiningu áætluðum við endanlega meðalfjölda 8 til 10 dýra fyrir hvern hóp. Hópar voru keyrðir með innra eftirliti í sömu tilraunalotu (S1 tafla). Í ljósi breytileika skurðaðgerða og hegðunaraðgerða, tókum við með fyrirfram meiri fjölda tilrauna einstaklinga (allt að 15% fleiri) sem í sumum tilfellum uppfylltu tilraunaviðmiðin og voru tekin með, þannig að forðast handahófskennda útilokun. Þegar um er að ræða rannsóknir á hippocampus, til að meta áhrif NMDA og CNQX inndælinga með mismunandi millibili, jöfnuðum við heildarfjölda samanburðardýra á milli burðar- og sýndarrekinna rotta meðal mismunandi hópa.

Atferlisgreining, vefjafræðilegar skoðanir og frumutalning voru gerðar í blindni. Dýr með ófullnægjandi staðsetningu á nálarbrautinni eða meinsemdinni þegar um var að ræða NMDA-óafturkræf sár voru útilokuð frá gagnagreiningu (S1 tafla). Í lyfjafræðilegum rannsóknum útilokuðum við 57 dýr yfir samtals 465 dýr vegna rangrar nálarsetningar (22/255 fyrir Te2, 31/179 fyrir ACC og 4/31 fyrir hippocampus). Í rekjarannsóknum, á 21 dýri, eyddum við 3 einstaklingum út þar sem inndælingin á retroperlum missti BLA. Í Te2 sjónrænum rannsóknum, yfir samtals 30 dýr, útilokuðum við 1 rottu vegna þess að staðsetning ljósleiðaranna var ekki fyrir ofan marksvæðið, 1 rotta. Þegar öllu er á botninn hvolft var veiran fjarverandi í Te2 og 2 rottum vegna þess að veirudreifing var minni en 4,7% og 5,3% af Te2 svæði á stungustöðum í sömu röð. Hjá rottum sem teknar voru með í tölfræðigreiningunni var lágmarksdreifing vírusa 39,6% við fremra staðalítaxíska hnitið og 50,2% á aftara hnitinu.

Á sama hátt, í ACC sjónrænum tilraunum, yfir samtals 32 dýr, var 2 rottum eytt vegna þess að staðsetning ljósleiðara var ekki fyrir ofan marksvæðið. Tvær rottur voru útilokaðar vegna þess að veiran í ACC var fjarverandi, 1 dýr vegna þess að vírusinn var í aðliggjandi aukahreyfilberki og 1 rotta vegna þess að veirudreifing var minni en 2,3% af ACC svæði á stungustöðum. Hjá rottunum sem eftir voru var lágmarksdreifing vírusa 33,3% við fremri steríótaxísk hnit og 42,2% við aftari hnit.

Í NMDA meinsemdarannsóknum beittu meinsemd sér aðallega á CA1 svæðinu í dorsal hippocampus. Lágmarks (rauð) og hámarks framlenging (bleikur) á skemmdum á hippocampus yfir öllu svæði bakhippócampuss var 23,2% og 53,5% við fremra steríótaxíska hnitið og 28,3% og 62,3% við aftara hnitið. Yfir alls 73 dýrum var 4 rottum eytt vegna þess að meinið var fjarverandi, en 3 dýrum til viðbótar var hent vegna þess að lenging sáranna var minni en 5,0% (þ.e. 4,8%, 4,3%, 3,1 %) varðandi hippocampus svæðið á 2 hnitunum.

Svæðislínugreining var framkvæmd með sjónrænni skoðun og handvirkri magngreiningu með því að nota svæðisútlínur tól ZEN 3.0 hugbúnaðarins. Svæðisgildi voru síðan staðlað á heildarflatarmál svæðisins. Stereotaxic hnit Te2, ACC og hippocampus voru byggð á Paxinos atlas [26] og, þegar um Te2 er að ræða, með barkasviði sem dæmd var til Zilles atlas [25].

tölfræðigreining

Öll gögn eru sett fram sem meðaltal ± SEM. Öll gögn stóðust Levene's próf fyrir jafnræði. Þannig var tölfræðileg tölfræði notuð í öllum tilraununum. Gögn frá 2 hópum voru borin saman með því að nota 2-halað ópöruð t-próf ​​nemenda. Samanburður á mörgum hópum var metinn með því að nota 1-leið ANOVA próf með Tukey's post hoc prófi. Til að takast á við muninn á milli og innan hópa, reiknuðum við 3 × 2 ANOVA líkan með blandaðri hönnun með hóp (CS1-CS2, Tone-CS1-CS2, WN-CS2) sem milli- viðfangsbreyta og ástand (fyrir og eftir nýlega skilyrðingu +innspýtingu) sem innanviðfangsbreyta. Þar sem víxlverkun hóps × ástands var marktæk, gerðum við einfalda aðaláhrifagreiningu og við stilltum hvert p-gildi með Bonferroni leiðréttingunni. Fyrir hvert blandað ANOVA líkan, metum við kúluforsenduna með Mauchly's Test of Sphericity.

Tölfræðilegar breytur (þ.e. nákvæmt gildi n fyrir hvern hóp, SEM, tölfræðilega prófið, áhrifastærð og nákvæmt p-gildi) eru tilgreindar í þjóðsögunum. Fyrir jafnar úrtaksstærðir voru áhrifastærðir fyrir ópöruð t-próf ​​ákvörðuð með því að reikna Cohen's d eða Glass's d í samræmi við líkindi SDs á meðan, fyrir mismunandi úrtaksstærðir, Hedges'g. Fylgni milli frumufjölda og frystingar var reiknuð út með Pearson-stuðlinum. Til að ákvarða hvort gögnin uppfylltu forsendur tölfræðiaðferðarinnar höfnuðum við núlltilgátunni á P < 0.05 stigi. Allar tölfræðilegar greiningar voru gerðar með SPSS Statistics 22 (IBM).

Stuðningsupplýsingar

S1 Mynd Stækkun nálarspora Te2 (A) og ACC heilaberki (B) sem sprautað er með CNQX, valið sem dæmi. (C) Þegar þau voru sýnd með sama samhengi 2 vikum eftir aðgerðina sýndu dýr sem eingöngu voru á losti lágt óttasvörun, sem sýnir að aðferðin framkallaði ekki skilyrta frystingu í samhenginu þar sem lostið var gefið. (D) Svipaðar niðurstöður og á mynd 1 fengust með því að vega upp á móti 2 tónum sem notaðir eru sem CSs (CS1, 3 kHz og CS2, 15 kHz) (T próf nemenda, t(14)=3.44, p {{ 13}}.0040, Glass's d=4.14). (E) Hjá lykt-CS skilyrtu rottum sem frjósa við lyktina, 2 vikum eftir ástand, var hátt, jafnvel þótt prófað væri í öðru umhverfi varðandi skilyrðingarsamhengið, og sýndi þar með að ótti var sérstaklega tengdur þessari vísbendingu. Kvarðastangir, 300 μm. ��P < 0,01. Öll gögn eru meðaltal og SEM. Samantektargögnin fyrir S1 mynd má finna í stuðningsupplýsingum í skránni sem heitir S1 Stuðningsmyndagögn. (TIF)

S2 Mynd. CNQX inndæling skert varðveislu nýlegra heyrnarhræðsluminninga hjá rottum þar sem alhæfing ótta var lækkuð með tóni eingöngu fyrir útsetningu eða með því að nota hvítan hávaða tón sem CS1. 3 × 2 ANOVA með blandaðri hönnun (aðaláhrif hóps: F(2,42)=6.478, p {{10}}.00 4, η2=0. 236, aðaláhrif ástands: F(1,42)=0.161, p=0.691, η2=0.004, hópur × skilyrðisvíxlverkun F(2,42)=3.942, p=0.027, η2=0.158) sýndi að frysting niður í 3 kHz tóninn áður en tenging þess við Bandaríkin var minni hjá dýrum sem fengu 15 kHz tón fyrir lýsingu fyrir 15 kHz-US pörun (n=10, p=0.001) eða í rottum sem eru skilyrtar við hvítan hávaða (n=13 , p=0.008) samanborið við CS1-CS2 dýr (n=22) sem sýndu breytilegt ótta alhæfingarsvar. Hins vegar, eftir CS-US nám og cnqx sprautur í Te2 heilaberki, var nýlegt óttaminni skert í öllum hópum (p > 0,05). Einföld aðaláhrif innan hópa (fyrir og eftir CS-US nám fylgt eftir með cnqx innspýtingu): CS1-CS2, p=0.025; Tone-CS1-CS2, bls=0.189; WN-CS2, p=0.347) �P < 0.05, ��P < 0.01. Öll gögn eru meðaltal og SEM. Samantektargögnin fyrir S2 Fig er að finna í Stuðningsupplýsingum í skránni sem heitir S1 Stuðningsmyndagögn. (TIF)

S3 Mynd. (A) Tilviljunarkennd dæmi um innspýtingu með retroperlum sem miðar að BLA. (B og C) Dæmi um staðsetningar ljósleiðara fyrir ofan BLA dýra sem sprautað var með AAV ferjum í Te2 (B) og ACC heilaberki (C). Kvarðastangir, 500 μm.

Viðurkenningar

Við þökkum Dr. E. Manassero fyrir stöðugan stuðning og ráðgjöf.

Framlög höfunda

Hugmyndafræði: Giulia Concina, Annamaria Renna, Benedetto Sacchetti.

Gagnavörslu: Giulia Concina, Luisella Milano, Benedetto Sacchetti.

Formleg greining: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Fjármögnunaröflun: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Rannsókn: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Aðferðafræði: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Umsjón: Benedetto Sacchetti.

Löggilding: Benedetto Sacchetti.

Ritun – frumuppkast: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Ritun – umsögn og klipping: Annamaria Renna, Luisella Milano.

Heimildir
1. Frankland PW, Bontempi B. Skipulag nýlegra og fjarlægra minninga. Nat Rev Neurosci. 2005; 6:119–130. https://doi.org/10.1038/nrn1607 PMID: 15685217

2. Dudai Y. Taugalíffræði samþjöppunar, eða hversu stöðugt er engramið? Annu Rev Psychol. 2004; 55:51–86. https://doi.org/10.1146/annurev.psych.55.090902.142050 PMID: 14744210

3. Squire LR, Genzel L, Wixted JT, Morris RG. Minni samþjöppun. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015; 3:7. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021766 PMID: 26238360

4. Alvarez P, Squire LR. Minni samþjöppun og miðlungs tímablað: einfalt net líkan. Proc Natl Acad Sci US A. 1994; 91:7041–7045. https://doi.org/10.1073/pnas.91.15.7041 PMID: 8041742

5. McClelland JL, McNaughton BL, O'Reilly RC. Hvers vegna það eru viðbótarnámskerfi í hippocampus og nýberki: innsýn frá árangri og mistökum tengimódela um nám og minni. Psychol Rev. 1995; 102:419–457.

For more information:1950477648nn@gmail.com