Fótfrumuáverka vegna víxlverkunar milli Tlr8 og innræna bindilsins MiR-21 í hindruðu nýru og fylginýru þess

Tengiliður:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

ristruflanir tengt nýrum

Þó að langvarandi nýrnasjúkdómur sé algengur hjá fullorðnum, hefur verið greint frá teppu nýrnakvilla (ON) hjá bæði ungum og gömlum sjúklingum. Í ON hafa tubulointerstitial lesions (TILs) verið rannsökuð mikið, en gauklaskemmdir (GLs) hafa verið að mestu vanræktar. Hér sýnum við nýjan fyrirkomulag sem liggur að baki GL þróun í ON hjá ungum og gömlum músum. TIL þróast fyrr en GLs vegna íferðar bólgufrumna í tubulointerstitium, en GLs myndast í kjölfar virkjunar á Toll-like viðtaka 8 (Tlr8) jafnvel þó að bólgufrumur séu ekki til í gauklanum. TLR8 og interleukin 1 beta (IL1b) prótein sameinast með afoxandi podocyte function markers (PFM), sem gefur til kynna virkjun TLR8 merkja í slösuðum fræfrumum. Ennfremur var gaukla- og sermismagn miR-21, innræns bindils fyrir Tlr8, hærra í ON músarlíkani en í sýndarstýringu. Gauklatjáning Tlr8 hefur jákvæða fylgni við miR-21 og niðurstreymis frumuboðin Il1b og Il6 og neikvæða fylgni við PFM (Nphs1 og Synpo). Við sýnum einnig samsetningu TLR8 og IL1b próteina með minnkandi PFM bæði í hindruðum ogtryggingarnýruaf ungum og gömlum músum. Ennfremur leiddu niðurstöður in vitro rannsókna í ljós meiri tjáningu á Tlr8 og cýtókínum þess aftast í gaukla frá hindruðumnýrueftir meðferð með miR- 21 herma en í viðmiðuninni. Að lokum, oftjáning Tlr8 getur þjónað sem trúverðugur búnaður sem liggur að baki GL þróun í ON í gegnum podocyte skaða.

Lykilorð: langvinnur nýrnasjúkdómur,teppandi nýrnakvilli, podocyte, TLR8, hindrun og hliðrunra

KYNNING

Langvinn nýrnasjúkdómur (CKD), sem er stórt lýðheilsuáhyggjuefni, er ríkjandi hjá 8 prósent –13 prósentum almennings (1). Það er algengt hjá eldra fólki vegna öldrunar samfélagsins. Hindrandi nýrnakvilli (ON) er mjög áhugavert fyrir lækna þar sem greint hefur verið frá honum hjá sjúklingum frá mismunandi aldurshópum. ON er hægt að meðhöndla og ganga til baka, ólíkt öðrum langvinnum langvinnum sjúkdómum (2, 3). Hjá börnum kemur það fram hjá einum af 1500 ungum einstaklingum og algengi þess er allt að 1 prósent –5 prósent í þróuðum löndum (4, 5). Hjá fullorðnum er algengi ON á bilinu 5 af hverjum 1000 til 5 af hverjum 10000 einstaklingum. Auk þess er algengi langvarandi einhliða ON um það bil 0,5 prósent, en bráða einhliða og langvarandi tvíhliða ON er um 0,1 prósent (4–7).

ON getur leitt til bráðs nýrnaskaða eða langvinnrar nýrnasjúkdóms, sem felur í sér versnandi skerðingu á nýrnastarfsemi og breytingum á nýrnabyggingu sem varir í meira en 3 mánuði (8, 9). Einhliða þvagrásarteppa (UUO) er mikið notuð aðferð til að rannsaka langvarandi ON. ON í UUO nýrum einkennist af ofstækkun, vatnsnýrnafrumur, nýliðun bólgufrumna á millivefssvæðinu, píplufrumudauða af völdum súrefnisskorts og kollagenútfellingu í millivefsblóðhimnu, fylgt eftir með þróun tubulointerstitial fifibrosis (TF) (10).

TF er mikilvægur eiginleiki nýrnasjúkdóms á lokastigi og stór áhrifaþáttur versnandi nýrnaskaða (11). TF hefur verið mikið rannsakað í ON líkanum, en gögn varðandi gauklaskaða, sérstaklega blóð-þvagþröskulda (BUB) frávik, eru af skornum skammti (8, 9, 12). Ennfremur hafa rannsóknir rannsakað tubulointerstitial lesions (TILs) í collateral kidney í unilateral ON, en gauklaskemmdir (GLs) hafa verið að mestu vanræktar (12). Nokkrar skýrslur hafa leitt í ljós þátttöku peritubular capillaries í framgangi TILs í tilrauna-ON (13, 14). Hins vegar renna glomerulus og glomerular capillary niður í pípulaga hluta nýrna- og peritubular capillaries, í sömu röð. Þess vegna leggjum við til að gauklabólga geti einnig haft áhrif á millifrumnafæð. Fyrri rannsóknir okkar hafa bent á framlag skaða á frumum gaukla, aðallega fræfrumna, til GL og síðari TIL-þróunar í sjálfsofnæmissjúkdóms múslíkani vegna oftjáningar mismunandi Toll-like viðtaka (TLR) (15-18).

Glomerular capillary endothel og podocytes eru mikilvægir hliðverðir sem samanstanda af BUBs. Milli þessara tveggja þekju eru fræfrumur stöðugt útsettar fyrir hættumerkjum, þar á meðal TLR bindlar eins og hættutengd sameindamynstur (DAMPs) eða sýklatengd sameindamynstur (PAMPs), vegna einstakrar staðsetningar þeirra í glomeruli (15). Þess vegna er talið að víxlverkun milli TLRs í fræfrumum og innrænum bindlum þeirra geti stuðlað að skaða á fræfrumum við ósmitandi aðstæður. Í þessari rannsókn lögðum við áherslu á GL-þroska bæði í stífluðum og hliðarnýrum ungra og gamalla músa, þar sem ON er oft að finna hjá bæði ungum og eldri mönnum. Við skýrðum að GL var þróað í ON vegna skaða á fræfrumum með oftjáningu Tlr8 í fræfrumum frá bæði stífluðum og hliðarnýrum ungra og gamalla músa.

EFNI OG AÐFERÐIR

Siðferðileg yfirlýsing og tilraunadýrahald Allar tilraunir með tilraunadýr voru samþykktar af dýraverndarnefnd dýralækningadeildar Hokkaido háskólans (samþykki nr. 16- 0124). Höfundarnir fylgdu samþykktum leiðbeiningum um umönnun og notkun tilraunadýra frá Hokkaido háskólanum, dýralæknadeild (samþykkt af Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International). Sex vikna gamlar C57BL/6N mýs voru keyptar frá Japan SLC Inc. (Hamamatsu, Japan) og þeim haldið við sérstakar sjúkdómsvaldarlausar aðstæður í 1:1 ljós-dökku umhverfi. Tilraunadýrum var útvegað mat og drykkjarvatn að vild.

Tilraunahönnun Við notuðum bæði ungar (9 vikna) og gamlar (12 mánaða) mýs. Mýs úr hverjum aldurshópi (n=4) voru gerðar annaðhvort í sýndaraðgerð (viðmiðunarhópur) eða UUO (2, 7, 11 og 21 dagur) til að koma á ON-líkan nýra, eins og lýst er í fyrri rannsókn okkar (13).

Sýnaundirbúningur Mýs voru djúpsvæfðar með blöndu af deyfilyfjum eins og áður hefur verið lýst (16) og aflífaðar með leghálsi. Blóðsýnum var safnað í gegnum lærleggsæð fyrir sermismerkisgreiningu. Bæði UUO og aukanýrum var safnað og skorið í þunnar sneiðar. Nýrnasneiðar voru festar með 10 prósent hlutlausu formalíni (NBF), 4 prósent paraformaldehýði (PFA) og 2,5 prósent glútaraldehýði (GTA) fyrir vefjameinafræðilegar, ónæmisvefjaefnafræðilegar og rafeindasmásjárrannsóknir, í sömu röð.

Ónæmisvefjaefnafræði og ónæmisflúrljómun NBF-fastir paraffínblokkir voru skornir í 2 mm þykkt og litaðir með periodic acid Schiff-hematoxylin (PAS-H) til að kanna vefjameinafræði nýrna. Ónæmisgreining á frumumerkjum var framkvæmd eins og áður hefur verið greint frá (16) fyrir B frumur (B220), T frumur (CD3), háræðaæðaþel (CD31), IL1b, átfrumur (Iba1), podocytes (podocin og synaptopodin) og TLR8. Litunarskilyrðin eru skráð í töflu 1.

Vefjaplanimetri PAS-H og ónæmislituðum nýrnahlutum var breytt í sýndarskyggnur með Nano Zoomer 2.0 RS (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.; Hamamatsu, Japan). Jákvæðar frumur voru taldar af handahófi völdum 20 glomeruli eða 20 foci úr tubulointerstitium við 400x stækkun með NDP.view2 hugbúnaði (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.). Myndir af 20 glomeruli frá PAS-H-lituðum hlutum voru einnig teknar 400x frá hverri mús með því að nota All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 (Keyence, Osaka, Japan). Mesangial flatarmál og stærð gaukla voru mæld út frá teknum myndum með því að nota BZ-X Analyzer (Keyence).

Einangrun Glomerulus fyrir RNA útdrátt og ræktun Glomeruli frá sýndar- og UUO nýrum voru einangruð eins og áður hefur verið lýst (16). Í stuttu máli voru mýsnar djúpsvæfðar og þær látnar renna í gegnum vinstri slegil með 40 ml af Hank's balanced salt solution (HBSS) sem innihélt Dynabeads (8 × 107; Life Technologies, Carlsbad, CA, Bandaríkjunum). Nýrað var skorið út

og skorið í litla bita. Frumurnar voru síðan meltar með kollagenasa A (1 mg/ml; Roche, Basel, Sviss) og deoxýríbónúkleasa I (100 U/ml; Life Technologies) í HBSS við 37 gráður í 30 mínútur. Sviflausninni sem innihélt meltan vef var þrýst varlega í gegnum 100-mm frumusigi (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA) með því að nota flettan staup. Frumusviflausnin sem myndaðist var skilin í skilvindu við 200 xg í 5 mínútur og frumukillan var endurleyst í 2 ml af HBSS. Glomeruli sem innihélt Dynabeads var safnað með segulmagnuðum ögnum (Life Technologies) og notað til RNA einangrunar.

Öfug umritun og rauntíma PCRHeildar-RNA var einangrað úr glomeruli með því að nota RNeasy sett (Qiagen, Hilden, Þýskalandi). cDNA var myndað úr heildar-RNA með öfugri umritun með því að nota ReverTra Ace bakrita ensímið (Toyobo, Osaka, Japan) og handahófskenndum dT frumurum (Promega). cDNA var notað í rauntíma PCR með Brilliant III SYBR Green QPCR master mix og Mx3000P (Agilent Technologies, La Jolla, CA, Bandaríkjunum). Tjáning gauklagena var eðlileg í tjáningu Actb. Grunnpörin sem notuð eru eru sýnd í töflu 2.

Öfug umritun og TaqMan-undirstaða rauntíma PCRHeildar-RNA, þ.mt míkróRNA (miRNA) í einangruðum gaukla, var einangrað með því að nota miRNeasy kit (Qiagen). miRNA-sértækir stofnlykkja RT primers, öfug umritun, öfug umritunarbuffi, dNTPs og RNase hemill voru notaðir til að snúa við umritun heildar RNA samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Rauntíma PCR var framkvæmt með cDNA sem fékkst með því að nota miR-21- sérstaka TaqMan grunna og sértæka rannsaka (Applied Biosystems), TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) og Mx3000P (Agilent Technologies).

In Vitro meðferð á einangruðum glomeruli með hermumGlomeruli voru einangruð frá sýndarrekstri og UUOnýrueftir 11 daga hindrun. Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) miðli (Fujifilm Wako, Japan) sem innihélt 300 glomeruli var dreift í hvern brunn á 96-brunnsræktunarplötu (TPP, Trasadingen, Sviss) og meðhöndluð með PBS, neikvæðri stjórn og miR-21 hermi (UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A) (Bioneer, Daejeon, Suður-Kóreu) við 1 pmol/µL í 4 klst við 37 gráður í 5 prósent CO2. Tjáning Tlr8 og niðurstreymis cýtókína þess var mæld eins og lýst er í fyrri hlutanum.

Skanna rafeindasmásjáFyrir venjulega skönnun rafeindasmásjár (SEM), lítilnýru sneiðarvoru festir með 2,5 prósent GTA í 4 klst og eftirfixaðir með 1 prósent osmíumtetroxíði í 1 klst, fylgt eftir með meðferð með 1 prósent tannínsýru í 1 klst. Sýnin voru síðan fest með 1 prósent osmíumtetroxíði í 1 klst og meðhöndluð með 0,5 prósent og 1 prósent tannínsýru í 10 mínútur og 1 klst., í sömu röð.Nýrasneiðarvoru þurrkaðir með hækkandi alkóhóli, fluttir yfir í 3-metýlbútýl asetat og að lokum þurrkaðir með HCP-2 mikilvægum punktþurrkara (Hitachi, Tókýó, Japan). Sýnin voru sett í jónatúfun og síðan skoðuð undir S-4100 rafeindasmásjá við 12 kV hraðspennu.

TölfræðigreiningGildin eru gefin upp sem meðaltal ± staðalvillu (se). Niðurstöðurnar voru tölfræðilegar greindar með því að nota Mann–Whitney U-próf ​​sem ekki er parametrisk (P < 0.05).="" kruskal-wallis="" prófið="" var="" notað="" til="" að="" bera="" saman="" þrjá="" eða="" fleiri="" þýða="" og="" margfaldur="" samanburður="" var="" gerður="" með="" aðferð="" scheffe="" þegar="" marktækur="" munur="" sást="" (p="">< 0.05).="" fylgni="" milli="" breytanna="" tveggja="" var="" greind="" með="" spearman's="" rank="" fylgnistuðlaprófi="" (p=""><>

NIÐURSTÖÐUR

TIL og GL í hindruðum nýrum ungra músaVið skoðuðum fyrst TIL og GL í sýndaraðgerðum og UUO nýrum ungra músa sem urðu fyrir hindrun í mismunandi tímabil. Þó að nýrun sýndu eðlilegt tubulointerstitium (Mynd 1A), sýndu stífluðu nýrun eftir 2 daga UUO TILs og einkenndust af útvíkkun pípla; sumar píplar innihéldu einnig þvagkast. Slíkar skemmdir jukust með aukinni hindrun (Mynd 1A). GL, aðallega glomerulosclerosis, sást seint á 21 degi eftir UUO og einkenndist af útfellingu á periodic acid-Schiff (PAS) jákvæðum efnum. Uppbygging gaukla var eðlileg bæði í sham og snemma UUO nýrum (2, 7 og 11 dagar) (Mynd 1B). Fjöldi gauklafrumna hafði tilhneigingu til að aukast fram að degi-11 eftir hindrun og hafði tilhneigingu til að fækka á degi-21 í UUO nýrum (Mynd 1C). Uppsöfnun glomerular mesangial hafði tilhneigingu til að aukast frá 7 dögum eftir hindrun (mynd 1D).

var fjarverandi í miðju glomeruli í UUO nýrum 21 dögum eftir hindrun (Mynd 1F). Pólýmerasa keðjuverkun leiddi í ljós marktæka lækkun á PFMs (Nphs1 og Synpo) í UUO nýrum 21 dögum eftir hindrun (Mynd 1G). Ennfremur leiddi SEM greining í ljós eðlilega podocyte foot processes (PFPs) í sýndarstýrðum nýrum; Hins vegar var greint frá PFP-eyðingu og örvillulíkum byggingum í UUO nýrum 21 dögum eftir hindrun (Mynd 1H). Saman benda þessar niðurstöður til þess að áverka á frumufrumu í stífluðu nýra verði 21 degi eftir stíflu.

Innsíandi ónæmisfrumur eru ekki til í stíflaða nýranu. Við höfum áður sýnt fram á að áverka á fræfrumum tengist innsíandi ónæmisfrumum í gaukla (13, 16, 18). Þess vegna skoðuðum við íferð B- og T-frumna sem og átfrumna í TIL og GL í sýndaraðgerðum og UUO nýrum (Mynd 2). Fjölmargar íferðar B-, T-frumur og átfrumur sáust í TIL í UUO nýrum alla daga eftir hindrun, en þær voru nánast fjarverandi eða fáar í glomeruli bæði sýndar- og UUO nýrna (myndir 2A–E). Fjöldi B-, T-frumna og átfrumna var mjög fáur í gaukla (gögn ekki sýnd) en umtalsvert hærri í

tubulointerstitium af 2-, 7-, 11- og 21-dag nýrum samanborið við sýndarnýra (Mynd 2F). Þess vegna geta íferðar ónæmisfrumur stuðlað að myndun TIL í stífluðu nýrunum. Hins vegar geta aðrir þættir tengst þróun GL.

Tjáning mismunandi meðlima TLR fjölskyldunnar og niðurstraums frumufruma í sýndarvirkum og hindruðum nýrum ungra músa. Fyrri rannsóknir hafa leitt í ljós meiri tjáningu mismunandi TLRs í fræfrumum sjúkra nýrna (15, 16, 19, 20). Athyglisvert er að gögn okkar leiddu í ljós marktækt meiri tjáningu á Tlr8 og Tlr9 í gaukla sem voru einangraðir úr UUO 21-dagahópnum en í glomeruli sýndarhópsins (Mynd 3A). Ennfremur skoðuðum við tjáningu niðurstraums cýtókína TLR fjölskyldumeðlima í gaukla úr sýndar- og UUO 21-dagahópum og fundum marktæka uppstjórnun á tjáningu gena sem kóða bæði interleukin 1 beta (Il1b) og interleukin 6 (Il6) í UUO hópnum samanborið við það í sýndarhópnum (Mynd 3B).

TLR8 samstaðbundið með PFM Þar sem tjáning Tlr8 og Tlr9 var mikil í gaukla sem voru einangraðir frá stífluðu nýra, skoðuðum við staðsetningu þeirra með ónæmisflúrljómun litun. TLR8 prótein greindist ekki í sýndarreknum nýrum (Mynd 4A) en var samsett með PFM synaptopodin í UUO nýrum (Mynd 4B). Ennfremur tókst okkur ekki að greina TLR9 prótein tjáningu í nýrum frá annaðhvort sýndarreknum eða UUO músum (gögn ekki sýnd).

Framleiðsla IL1b úr fræfrumum í stífluðu nýra ungra músa Eins og sýnt er á mynd 3B, var tjáning gaukla Il1b (downstream cýtókín af TLR fjölskyldunni) marktækt meiri í UUO nýra eftir 21 dag en í sýndarnýra. Þess vegna skoðuðum við uppruna IL1b í glomeruli í UUO nýrum með ónæmisflúrljómun litun. Tjáning IL1b próteina greindist ekki í glomeruli í sýndarnýrum en sást í glomeruli í UUO nýrum (myndir 4C, D). Ennfremur, IL1b colocalized með PFM podocin (Mynd 4D).

í UUOnýruá 21 degi en það í shamnýru.Þess vegna skoðuðum við uppruna IL1b í glomeruli í UUO nýrum með ónæmisflúrljómun litun. Tjáning IL1b próteina greindist ekki í glomeruli í shamnýruen sást í glomeruli UUOnýru(Myndir 4C, D). Ennfremur, IL1b colocalized með PFM podocin (Mynd 4D).

Aukið magn af hugsanlegum innrænum Tlr8 bindli í ON líkan músum Fyrri rannsókn sýndi að miR-21 þjónar sem bindill fyrir TLR8 (21). Þess vegna bárum við saman bæði gaukla- og sermismagn miR-21 milli sýndar- og UUO 21-dagahópanna. Athyglisvert er að UUO 21-dagahópurinn sýndi marktækt hærra magn gaukla miR-21 en í sýndarhópnum (P < 0.05),="" hins="" vegar="" aukna="" tilhneigingu="" til="" mir="" í="" sermi{="" {10}}="" sást="" í="" fyrri="" hópnum="" en="" þeim="" síðarnefnda="" (p="0.06)" (mynd="">

Fylgni Tlr8 tjáningar við ligand þess miR-21 og PFM í hindruðuNýraEins og sýnt er í töflu 3, sáum við marktæka jákvæða fylgni milli gauklatjáningar Tlr8 mRNA og innrænna bindils þess (miR-21) sem og niðurstreymis frumuefna Il1b og Il6. Á hinn bóginn var neikvæð fylgni augljós á milli Tlr8 mRNA og PFMs Nphs1 og Synpo.

In Vitro örvun á glomeruli með miR{{0}} Hermir virkjar tjáningu Tlr8 og niðurstraums frumufruma þess. Tjáning Tlr8 hafði tilhneigingu til að aukast (P=0.06) en cýtókín þess aftanstraums (Ifng og Il1b) voru marktæk (P < 0,05 og 0,01) aukin í glomeruli sýndarmúsa eftir

meðferð með miR-21 líkingu samanborið við það í gaukla músa sem fengu PBS og neikvæða samanburðarlíkingu (Mynd 5A). Hins vegar sást engin marktæk fylgni milli tjáningar Tlr8 og niðurstreymis frumuefna þess í glomeruli sýndarmúsa eftir meðferð með hermi (tafla 4). Tjáning Tlr8 og niðurstreymis cýtókína þess var marktækt meiri í gaukla á UUOnýru, í kjölfar meðferðar með miR-21 líkingu en þeim sem eru í glomeruli UUOnýrumeðhöndluð með PBS og neikvæðri samanburðarlíkingu (Mynd 5B). Marktæk fylgni greindist á milli tjáningar Tlr8 og niðurstreymis frumuefna þess í gaukla í UUO nýrum í kjölfar meðferðar með eftirlíkingum, sem gefur til kynna meiri virkjun Tlr8-miðlaðrar kjarnaþáttar kappa B (NF-kB) ferilsins og seyting bólgueyðandi frumuvaka í stífluðu nýra (tafla 4).

TLR8 staðsetning og skaðleg frumufrumu í nýrum ungra músaSýndarnýrun sýndu eðlilegan gauklahnoð en hliðnýrin voru með gauklastækkun, aukinn fjölda gauklafruma og útvíkkun gauklaháræða (mynd 6A). Hnoðhnoðrarnir frá sýndarknúnum nýrum voru jákvæðir fyrir tjáningu synaptopodin og skorti TLR8 tjáningu (Mynd 6B). Á hinn bóginn misstu hliðarnýrun synaptopodin tjáningu í miðju gaukla en sýndu TLR8 tjáningu meðfram gauklahraðanum (Mynd 6C). Þar að auki var TLR8 prótein samstaðsett með synaptópódíni (Mynd 6C). Skjáknúin nýru sýndu eðlilega tjáningu podósíns en enga tjáningu á IL1b í glomeruli (mynd 6D). Hins vegar misstu gaukla innan hliðarnýra tjáningu podókíns í miðjunni en höfðu IL1b tjáningu meðfram gauklahraðanum (Mynd 6E). Ennfremur var IL1b próteinið samsett með podocin (mynd 6E). SEM greining leiddi í ljós eðlilega PFPs í sýndarstýrðum músarnýrum, en PFP-eyðing og örvillulík uppbygging voru sýnileg í hliðnýrum (Mynd 6F).

TLR8 staðsetning og frumufrumuáverka í stífluðum og hliðarnýrum aldraðra músaSkjáknúin nýru sýndu eðlilega tjáningu synaptópódíns en sýndu enga litun fyrir TLR8 prótein innan glomeruli þeirra (Mynd 7A). Athyglisvert er að bæði hliðar- og UUO nýru sýndu tap á synaptopodin tjáningu í miðju glomeruli en héldu TLR8 tjáningu meðfram gaukla rete (myndir 7B, C). TLR8 prótein var samsett með synaptópódíni í hliðar- og UUO nýrum (myndir 7B, C). Skjáknúin nýru sýndu á sama hátt eðlilega tjáningu podósíns en höfðu enga IL1b tjáningu í glomeruli þeirra (Mynd 7D). Á hinn bóginn misstu bæði collateral og UUO nýru tjáningu podocin í miðju gaukla en sýndu IL1b tjáningu meðfram gaukla rete (myndir 7E, F). Jákvæð litun reyndist vera samsett með podósíni í glomeruli á tryggingunni og UUO nýrum (myndir 7E, F). SEM skoðun leiddi í ljós eðlilega PFP í sýndarstýrðum músarnýrum, PFP-eyðingu og örvillulíkum byggingum í bæði hliðar- og UUO nýrum gamalla músa (Mynd 7G).

UMRÆÐAON

Algengi er algengt hjá ungbörnum sem og hjá öldruðum einstaklingum (4-7). Þess vegna lögðum við ungar og gamlar mýs fyrir UUO til að líkja eftir ON ástandi einstaklinga á mismunandi aldurshópum og skoðuðum TIL og GL. Í stífluðu nýrinu var framgangur TILs áberandi á fyrri stigum hindrunar (2 dagar); hins vegar sást framgangur GLs ásamt áverka á fræfrumum á síðari stigum. Samhliða nýrun sýndu GLs og podocyte áverka á sama tíma. Þessi athugun bendir til þess að áverka á fræfrumum eigi sér stað bæði í stífluðum nýrum og hliðnýrum, þó að upphafssköstin geti verið mismunandi. Fyrri rannsóknir okkar hafa sýnt fram á fylgni milli skaða á fræfrumum og íferð ónæmisfrumna í glomerulus (13, 16, 18). Hins vegar sást ekki íferð ónæmisfrumna inn í glomeruli annaðhvort sýndar eða stíflaðra nýrna í þessari rannsókn. Þess vegna íhuguðum við þátttöku annarra þátta í skaða á fræfrumum í stífluðu nýra. Við gerðum þá tilgátu að hættumerki (DAMPs eða PAMPs), annaðhvort af blóðrásaruppruna eða stafað af skemmdum pípulaga þekju, gætu stuðlað að skaða á fræfrumum í ON, vegna einstakrar staðsetningu þeirra í gaukla. Mikilvægt er að sýnt hefur verið fram á að víxlverkun milli DAMPs og TLRs gegnir mikilvægu hlutverki í meingerð ósmitsjúkdóma (15). Mismunandi meðlimir TLR fjölskyldunnar eru tjáðir á frumuplasmahimnu eða innanfrumublöðrum (22) og einkennast sem meðfæddir ónæmisskynjarar sem þekkja DAMP eða PAMP á skilvirkan hátt. Við virkjun með samsvarandi DAMPs eða PAMPs, TLRs aukið tjáningu downstream cýtókína í gegnum NF-kB leiðina og framkallaði varnarkerfið hýsilsins (22). Þar að auki, DAMPs miðla tilvist vefjaskaða á ónæmisfrumum eða staðbundnum innri frumum, og þar af leiðandi auka vefjaskemmdir (23-26). Mikilvægt er að öll TLRs virkja NF-kB ferilinn sem stjórnar tjáningu fjölda bólgueyðandi frumuefnagena (27). Að auki gefur virkjun TLR merki um niðurstreymisleiðir þeirra til að virkja NF-kB, sem er ábyrgt fyrir bólgu og tengist meingerð skemmdra vefja (28). Shichita o.fl. leiddi í ljós meinafræðilegar milliverkanir milli innrænna bindla og TLR2 eða TLR4, sem stuðla að blóðþurrðarheilaskaða (25). Fyrri rannsóknir hafa einnig sýnt fram á getu meðlima TLR fjölskyldunnar til að framkalla TIL í nýrum (TLR2, 4, 5, 7 og 11) og GLs (TLR1–6, 8 og 9) (17, 29–33) ). Í þessari rannsókn fundum við áverka á frumufrumu í stífluðum nýrum og nýrum og skýrðum

hlutverk mismunandi meðlima TLR fjölskyldunnar sem geta stuðlað að skaða á fræfrumum (15, 16, 19, 20). Eins og við gerðum tilgátu um, var gauklatjáning Tlr8 og Tlr9 hærri í gaukla sem voru einangraðir frá UUO nýrum en í þeim frá sýndaraðgerðum músum. Þar að auki var gauklatjáning bólgusýtókína sem tengjast NF-kB ferlinum, þar á meðal Il1b og Il6, hærri í UUO nýrum 21 dögum eftir hindrun. Þess vegna komumst við að þeirri niðurstöðu að TLR-miðluð NF-kB ferillinn gegnir mikilvægu hlutverki í meingerð GL í teppandi nýrum. Ólíkt öðrum meðlimum TLR fjölskyldunnar eru TLR8 og TLR9 greind í innkirtlum frumna. TLR8 þekkir einþátta RNA og stutt tvíþátta RNA úr örverum og virkjar framleiðslu nokkurra NF-kB miðlaðra frumuefna (22). Á hinn bóginn þekkir TLR9 tvíþátta DNA og virkjar NF-kB ferilinn til að framleiða niðurstreymis cýtókín (16, 34). Í þessari rannsókn viðurkenndum við aðeins samsetningu TLR8 próteins ásamt PFM synaptopodin í glomeruli. Fyrri rannsóknir okkar hafa einnig sýnt að bæði TLR8 og TLR9 sameinast með PFM og virkja NF-kB-miðlaða bólgueyðandi cýtókínframleiðslu til að framkalla podocyte skaða (15, 16). Þar að auki hafa aðrar rannsóknir sýnt meinafræðilega fylgni milli TLR-miðlaðra ferla og fræfrumuáverka in vitro (34, 35). Banas o.fl. leiddi í ljós víxlverkun TLR4 í fræfrumum við ónæmiskerfið við þróun GL (35). Þannig geta fræfrumur stuðlað að ónæmiseftirliti með TLR-miðluðum leiðum. Í þessari rannsókn sýndum við bæði TLR8 genatjáningu og próteinstaðsetningu í fræfrumum stíflaðs nýrna sem og hærri tjáningu niðurstreymis frumudrepanna í glomerulus. Þess vegna komumst við að þeirri niðurstöðu að TLR8-miðlaðir leiðir stuðli að GL-þroska með skaða á fræfrumum í stífluðu nýra.

Fyrri rannsókn sýndi að miR-21, innræn bindill TLR8, getur náð til og tengst TLR8 í frumu innkirtlum, þar sem það getur framkallað TLR8-miðlaða virkjun NFkB leiðarinnar og seytingu bólgueyðandi frumuefna. (21). Í þessari rannsókn fundum við marktækt hærra magn gaukla miR-21 sem og hækkað magn miR-21 í sermi í UUO nýrum en í sýndarviðmiðum og sýndum fram á fylgni þess við gauklatjáningu Tlr8 . Athyglisvert er að glomeruli frá UUO nýrum sem voru meðhöndluð með miR-21 hermi sýndu meiri tjáningu á Tlr8 og niðurstreymis cýtókínum þess samanborið við þær í glomeruli frá sýndarmúsum sem voru meðhöndlaðar með miR-21 hermi, sem gefur til kynna aukið framboð á innrænu miR -21 frá skemmdum vefjum í stífluðu nýra og virkjun á oftjáningu á Tlr8 í UUO nýrum samanborið við sham. Saman komumst við að þeirri niðurstöðu að hærra rúmmál miR-21 í stífluðu nýrinu nái til innkirtla í kjarnafrumum og framkalli Tlr8-miðlaða virkjun NF-kB ferilsins og seytingu bólgueyðandi frumuefna. Þessi cýtókín taka aftur þátt í þróun GL með skaða á fræfrumum.

IL1b er eitt af mikilvægu cýtókínum NF-kB-ferilsins, aðallega framleitt af fræfrumum í gaukla við sjúkdómsaðstæður. Fyrri rannsóknir hafa sýnt að IL1b veldur skaða á fræfrumum með því að draga úr PFM (36, 37). Í þessari rannsókn sýndum við hærri gauklatjáningu á Il1b og samsetningu þess með PFM, sem sýndi minni tjáningu. Þar að auki var gauklatjáning Il1b fylgni við Tlr8 og hafði tilhneigingu til að tengjast tjáningu PFMs (Nphs1 og Synpo). Þess vegna benda þessar niðurstöður til þess að þættir aftan við Tlr8, þar á meðal Il1b og Il6, geti valdið skaða á fræfrumum í stífluðu nýrna með því að draga úr tjáningu PFM.

Hliðnýru ungra músa sýndu einnig GL og tap á PFM. Þessi niðurstaða var staðfest af SEM, sem leiddi í ljós áverka á frumufrumu í hliðarnýra. Við fundum einnig hærra magn af sermi miR-21 í ON músarlíkaninu. Ennfremur, IL1b prótein samstaðsetur með PFM. Þessar niðurstöður benda til þess að miR-21 í sermi hafi víxlverkun við TLR8 í fræfrumum hliðnýra og virkjar framleiðslu á cýtókínum í neðri straumnum, sem aftur dregur úr virkni fræfrumna og skaða á fræfrumum. Fylgifrumuáverka kom einnig fram í stífluðum og hliðrænum nýrum gamalla músa með svipuðum aðferðum og sást hjá ungum músum.

Að lokum (Mynd 8) er tjáning miR-21 í gaukla hækkuð í kjölfar einhliða þvagrásarstíflu, þar sem hún hefur samskipti við TLR8 í fræfrumum og framkallar framleiðslu á cýtókínum niðurstreymis (Il1b og Il6) sem bendir til virkjunar á NF-kB ferli. Hærra magn cýtókína dregur úr PFM, sem leiðir til skaða á fræfrumum og síðari þróun GLs. Hækkuð magn miR-21 í sermi virkjar TLR8 í fræfrumum hliðnýra og framkallar GLs með skaða á fræfrumum. Þess vegna sýnir þessi rannsókn greinilega GL-þroska í stífluðum nýrum og hliðrunrum með skaða á fræfrumum í kjölfar Tlr8 oftjáningar.