Blóðflöguhömlun kemur í veg fyrir NLRP3 bólgueyðandi virkjun og nýrnaskaða af völdum blóðsýkingar

Tengiliður: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Netfang:audrey.hu@wecistanche.com

Marivee Borges-Rodriguez, o.fl

Ágrip:

Blóðflögur, frumumiðlarar segamyndunar, virkjast við blóðsýkingu og eru í auknum mæli viðurkenndar sem miðlarar ónæmissvörunar. Blóðflöguvirkjun er marktækt aukin hjá blóðsýkingarsjúklingum samanborið við samanburðarsjúklinga á gjörgæsludeild. Þrátt fyrir þessa fylgni er hlutverk virkjaðra blóðflagna í að stuðla að blóðsýkingarmeinafræði óljóst. Við sýndum áður NOD-eins viðtaka prótein 3 inflammasome (NLRP3) inflammasome virkjun í blóðsýkingu af völdum blóðflögum frá cecal-ligation puncture (CLP) rottum. Virkjaðar blóðflögur tengdust auknum lungnabjúg og gauklaskaða í CLP vs. SHAM viðmiðunarhópi. Í þessari rannsókn könnuðum við hvort hömlun á virkjun blóðflagna myndi draga úr NLRP3 virkjun og nýrna- og lungnaskaða sem svar við CLP. CLP var framkvæmt hjá karl- og kvenkyns Sprague Dawley (SD) rottum (n=10/hópur) til að framkalla blóðsýkingu í kviðarholi og SHAM rottur voru viðmiðunaraðferðir. Undirhópur CLPanimals var meðhöndlaður með Clopidogrel (10 mg/kg/dag, CLP plús CLOP) til að hamla blóðflöguvirkjun. 72 klst. eftir CLP voru blóðflöguvirkjun og NLRP3 bólgueyðandi samsetning metin, IL-1 og IL-18 voru mæld í plasma og vefir, nýrna- og lungnasjúkdómar og nýrnastarfsemi metin. Virkjaðar blóðflögur voru 7,8 ± 3,6 prósent í Sham, 22 ± 6 prósent í CLP og lækkuðu marktækt í 14,5 ± 0,6 prósent í CLP auk CLOP (n=8–10/hóp, p < 0,05)="" .="" nlrp3="" bólgueyðandi="" samsetning="" var="" hindrað="" í="" blóðflögum="" af="" clp="" plús="" clop="" dýrum="" samanborið="" við="" clp.="" veruleg="" aukning="" á="" plasma-="" og="" nýrna-il-1="" og="" il-18="" sem="" svar="" við="" clp="" minnkaði="" með="" clopidogrel="" meðferð.="" nýrnaskaðar,="" en="" ekki="" vefjafræði="" lungna="" eða="" nýrnastarfsemi,="" batnaði="" í="" clp="" plús="" clop="" samanborið="" við="" clp.="" þessar="" upplýsingar="" gefa="" vísbendingar="" um="" að="" virkjaðar="" blóðflögur="" geti="" stuðlað="" að="" nýrnaskaða="" af="" völdum="" blóðsýkingar,="" hugsanlega="" með="" nlrp3="" virkjun="" í="" blóðflögum.="" blóðflögur="" geta="" verið="" lækningalegt="" markmið="" til="" að="" draga="" úr="" nýrnaskaða="" hjá="">

Leitarorð:blóðsýking; NLRP3; blóðflögur; Clopidogrel; fjöllíffæraáverka; virkjun æðaþels;bólga

cistanche tubolosa þykkni: bólgueyðandi

1. Inngangur

Blóðsýking er lífshættuleg bólgusvörun hýsils við sýkingu [1] og er ein helsta dánarorsök í heiminum. Að minnsta kosti 1,7 milljónir fullorðinna í Ameríku fá blóðsýkingu og næstum 270,000 Bandaríkjamenn deyja árlega af blóðsýkingu [2]. Blóðsótt leiðir til truflunar á fjöllíffærum, þar með talið bráðum lungnaskaða (ALI) [3],bráðnýrumeiðsli(AKI) [4,5], truflun á blóðsjúkdómum og miðtaugakerfi, meðal annarra. Aukinn fjöldi líffæra sem taka þátt í blóðsýkingu tengist aukinni dánartíðni [6]. Núverandi meðferðaraðferðir leggja áherslu á stuðningsmeðferð; dánartíðni er þó enn há. Greint hefur verið frá því að um það bil 35 til 50 prósent dauðsfalla á sjúkrahúsum séu vegna blóðsýkingar [7]. Það er mikilvægt að finna meðferðarmarkmið sem getur bætt dánartíðni vegna blóðsýkingar.

Blóðflögur hafa verið viðurkenndar sem hlutverk í ónæmi [8,9], fyrir utan hlutverk þeirra í blóðmyndun og segamyndun. Blóðflagnafæð sést oft í blóðsýkingu og er talið að það komi fram vegna virkjunar og neyslu blóðflagna; hlutverk þess í sjúkdómsferlinu er þó enn óljóst. Blóðflagnafæð tengist þróun (fjöllíffærabilunar) MOF og aukinni 90-dagadauða [10–14]. Blóðflögur geta verið órjúfanlegur hluti af bólgusvörun við blóðsýkingu. Hugsanleg aðferð þar sem blóðflögur geta stuðlað að skaða á mörgum líffærum er með því að virkja NOD-líka viðtakaprótein 3 inflammasome (NLRP3). NLRP3 er frumubundinn ónæmisboðaviðtaki sem leiðir til kaspasa-1 miðlaðrar klofnings og virkjunar IL-1B og IL-18 og hefur verið bendlaður við meingerð bólgusjúkdómsferla eins og astma [15 ], Parkinsons [16], þarmabólgu [17] og blóðsýkingu [18]. Sýnt hefur verið fram á að hömlun á NLRP3 inflammasome samsetningu sé verndandi gegn blóðsýkingu af völdum líffæraskaða [19-23]. Við höfum áður sýnt fram á að NLRP3 inflammasome er virkjað í blóðflögum sem svar við cecal ligation-puncture (CLP) og tengist fjöllíffæraáverkum sem svar við fjölörveru blóðsýkingu í 72 klst. CLP rottulíkani. Í þessari rannsókn gerðum við tilgátu um að hindrun blóðflagnavirkjunar með Clopidogrel (CLOP) myndi draga úr NLRP3 bólgueyðandi virkjun, nýrna- og lungnaskaða sem svar við fjölörveru blóðsýkingu.

cistanche flavonoids: bólgueyðandi

2. Úrslit

2.1. Plate Activation og NLRP3 Inflflammasome Assembly

Með því að nota frumuflæðismælingu ákváðum við prósentu blóðflagnavirkjunar meðal hópa. Við komumst að því að blóðflöguvirkjun jókst í CLP rottum um 22 ± 6 prósent samanborið við SHAM 7,8 ± 3,6 prósent (p < 0.{{10}}5),="" og="" veiktist="" í="" clp="" plús="" clop="" rottum="" um="" 14,5="" ±="" 0,6="" prósent="" (p="">< 0,05,="" mynd="" 1).="" nlrp3="" bólgueyðandi="" samsetning="" í="" blóðflögum="" var="" metin="" með="" því="" að="" sjá="" fyrir="" samstaðsetningu="" nlrp3="" með="" apoptosis-associated="" speck-like="" prótein="" (asc)="" með="" því="" að="" nota="" ónæmisfrumuefnafræði="" (mynd="" 2).="" samstaðsetning="" bólgueyðandi="" þátta="" í="" clp="" blóðflögum="" var="" 83="" sinnum="" meiri="" samanborið="" við="" sham="" blóðflögur="" (mynd="" 2c).="" ennfremur="" minnkaði="" samsetning="" inflammasomes="" í="" blóðflögum="" clp="" ásamt="" clop="" samanborið="" við="">

2.2. Inflflammasome-associated cytokins

NLRP3 virkjun leiðir til losunar bólgueyðandi frumuvaka IL-1 og IL-18 í virku form þeirra. Við mældum bæði cýtókínin í plasma,lunga, ognýrueinsleitaraf SHAM, CLP og CLP auk CLOP með ELISA. Plasma IL{{0}} jókst marktækt úr 9 ± 21 pg/mL í Sham í 77 ± 31 pg/mL í CLP (p < {{10}}.0="" 5,="" mynd="" 3a).="" gjöf="" klópídógrels="" sýndi="" lækkun="" á="" il="" -1="" 48="" í="" plasma="" ±="" 38="" pg/ml;="" lækkunin="" var="" hins="" vegar="" ekki="" tölfræðilega="" marktæk="" í="" samanburði="" við="" clp="" (p="">< 0.05="" á="" móti="" sham).="" á="" sama="" hátt="" var="" nýrna="" il-1="" hækkað="" í="" clp="" 4="" ±="" 3="" pg/mg,="" samanborið="" við="" sham="" 2,5="" ±="" 0,9="" pg/mg="" (p="">< 0,05,="" mynd="" 3b).="" meðferð="" með="" clopidogrel="" lækkaði="" marktækt="" il-1="" í="" nýrum="" í="" 1,8="" ±="" 0,8="" pg/mg="" (p="">< 0,05).="" í="" lungum="" jókst="" il-1="" marktækt="" úr="" 70="" ±="" 16="" pg/mg="" í="" sham="" í="" 106="" ±="" 36="" pg/mg="" í="" clp="" (p="">< 0,05)="" og="" var="" ekki="" marktækur="" munur="" hjá="" dýrum="" sem="" fengu="" clopidogrel="" (80="" ±="" 23="" pg)="" g,="" mynd="">

Plasma IL{{0}} var ekki greinanlegt í SHAM rottum; hins vegar var meðalplasma IL-18 26 ± 6 pg/ml í CLP. Mikilvægt er að gjöf klópídógrels leiddi til lægra magns IL-18 í plasma (12 ± 9 pg/mL; p < 0.{{20}}5,="" mynd="" 3d).="" á="" sama="" hátt="" var="" nýrna-il{{10}}="" hækkað="" í="" clp="" (396="" ±="" 65="" pg/mg)="" samanborið="" við="" sham="" (317="" ±="" 73="" pg/mg;="" p="">< 0,05).="" meðferð="" með="" klópídógrel="" lækkaði="" il-18="" í="" nýrum="" í="" 214="" ±="" 70="" pg/mg="" (p="">< 0,05,="" mynd="" 3e).="" í="" lungum="" jókst="" il-18="" marktækt="" úr="" 704="" ±="" 219="" pg/mg="" í="" sham="" í="" 999="" ±="" 158="" pg/mg="" í="" clp="" (p="">< 0,05)="" og="" hélst="" hækkað="" hjá="" dýrum="" sem="" fengu="" clopidogrel="" 1014="" ±="" 235="" pg/mg="" (pg/mg)="" p="">< 0,05="" á="" móti="" sham,="" mynd="">

2.3. Endothelial Activation

Við mældum plasmaþéttni angíópóetíns {{0}} og endókans sem merki um æðaþelsvirkjun í Sham, CLP og CLP plús CLOP hópum með ELISA. Plasma endókan var marktækt aukið úr 1234 ± 327 pg/mL í Sham í 1978 ± 306 pg/ml í CLP (p < {{20}}.05="" á="" móti="" sham).="" endocan="" minnkaði="" marktækt="" niður="" í="" 1521="" ±="" 283="" pg/ml="" hjá="" clp="" rottum="" sem="" fengu="" clopidogrel="" (p="">< 0,05="" á="" móti="" clp,="" mynd="" 4a).="" svipaðar="" niðurstöður="" fundust="" fyrir="" angiopoietin-2.="" angiopoietin-2="" jókst="" marktækt="" úr="" 5603="" ±="" 2142="" pg/ml="" í="" sham="" í="" 56.767="" ±="" 40,000="" pg/ml="" í="" clp="" (p="">< 0,05="" á="" móti="" sham)="" og="" var="" marktæk="" minnkun="" hjá="" rottum="" sem="" fengu="" clopidogrel="" til="" 22.486="" ±="" 13.616="" pg/ml="" (p="">< 0,05="" á="" móti="" clp,="" mynd="">

2.4. Lungnaskemmdir

Vefjafræðileg greining á lungum úr hverjum hópi sýndi marktæka aukningu á íferð daufkyrninga með meðaleinkunnina {{0}}.6 ± 0.2 í CLP rottum samanborið við einkunnina {{6} }.10 ± {{10}}.10 í sýndarrottum (p < 0.05).="" við="" sáum="" einnig="" að="" gjöf="" klópídógrels="" hjá="" clp="" rottum="" breytti="" ekki="" íferð="" daufkyrninga="" (stig="" 0,5="" ±="" 0,4,="" mynd="" 5a).="" svipaðar="" niðurstöður="" fundust="" í="" veggþykkt="" lungnablöðru="" með="" marktækri="" aukningu="" á="" clp="" með="" meðalþykkt="" 1,2="" ±="" 0,1="" µm="" samanborið="" við="" 0,8="" ±="" 0,3="" µm="" í="" sýndarrottum="" (p="">< 0,05).="" gjöf="" klópídógrels="" handa="" clp="" rottum="" bætti="" ekki="" veggþykkt="" lungnablöðru="" (mynd="">

2.5. Nýrnaskaðar

Eins og við höfum áður birt lækkaði GFR marktækt úr 2,1 ± 0,8 ml/mín/100 g en hjá sýndarrottum í {{10}} 0,7 ± 0,2 ml/mín/100 g en hjá CLP rottum (p < 0,05).="" gjöf="" klópídógrels="" sýndi="" bættan="" gfr="" í="" 1,3="" ±="" 0,5="" ml/mín/100="" g="" en="" í="" samanburði="" við="" clp,="" þó="" ekki="" tölfræðilega="" marktækt="" (mynd="" 6a).="" vefjafræðileg="" greining="" sýndi="" fram="" á="" aukinn="" gauklaskaða="" í="" clp="" hópnum="" samanborið="" við="" sham.="" meðferð="" með="" klópídógrel="" bætti="" marktækt="" gauklaskaða="" hjá="" clp="" dýrum="" (mynd="">

cistanche heilsuhagur: betri nýrnastarfsemi

3. Umræður

Blóðsýking er reglubundið ónæmissvörun við smitefni, oft tengt fjöllíffærabilun og vitað er að dánartíðni er há. Það er þörf á að finna nýja meðferð sem getur stillt bólgusvörun og dregið úr dánartíðni. Talið er að blóðflögur hafi hlutverk í ónæmisstjórnun. Auðvitað hefur storkufallið og virkjun blóðflagna verið áberandi í rannsókninni. Gjöf próteins C, segavarnandi innrænt ensíms, hefur verið tengd bættri lifun hjá sjúklingum með alvarlega blóðsýkingu [24]. Í Japan felur í sér leiðbeiningar um blóðsýkingu notkun tímasettrar andtrombíngjafar hjá rotþróarsjúklingum með DIC og hafa þær sýnt betri árangur [25]. Þetta bendir til þess að hindrun blóðflagnavirkjunar geti bætt niðurstöður í blóðsýkingu. Bólgusvörun við blóðsýkingu er örugglega flókin og getur falið í sér fleiri en eina leið. Við birtum áður að blóðflögur úr CLP fjölörveru blóðsýkingarlíkaninu hafa aukið NLRP3 samsetningu/virkjun blóðflagna og tengdust lungna- og nýrnaskaða [26]. Í þessari rannsókn ákváðum við að ákvarða hlutverk hömlunar blóðflagna í bólgusvörun í sama líkani með því að nota P2Y12 hemlann, Clopidogrel.

Eins og áður hefur verið birt var virkjun blóðflagna aukin til að bregðast við blóðsýkingu af fjölörverum í CLP líkaninu samanborið við sýndarrottur. Við komumst að því að gjöf klópídógrels dró úr virkjun blóðflagna í CLP rottum og athyglisvert var að minnkun á samsetningu NLRP3 inflammasomes í blóðflögum sást einnig. Við fundum einnig tilhneigingu til minnkandi IL-1B og IL-18 í blóðvökva dýra sem fengu Clopidogrel í samanburði við CLP hópinn. Í áður birtri rannsókn greindum við frá því að bein hömlun á NLRP3 inflammasome með MCC950 leiddi til lækkunar IL-1B og IL-18 í plasma [27]. Þetta bendir til þess að hömlun á virkjun blóðflagna með klópídógrel og minnkun bólgusýtókína í þessu blóðsýkingarmódeli sé að hluta til miðlað af NLRP3 aðferðum. Þess vegna þarf að gera frekari rannsóknir til að skilgreina betur bólguferli sem NLRP3 miðlar í blóðflögum.

Multi-organ failure (MOF) occurs frequently in sepsis. Previously published studies reported that in mice, the CLP model caused significant pulmonary damage; and depletion of platelets reduced CLP-induced edema and neutrophil recruitment in the bronchoalveolar space by >60 prósent [28]. Við höfum áður birt að aukin blóðflöguvirkjun tengdist truflun á mörgum líffærum og meiðslum í CLP rottum líkaninu [26]. Gögnin okkar sýna verulega lækkun á IL-1 og IL-18 ínýrudýra sem fengu klópídógrel. Samsetning bráðrar nýrnabilunar og blóðsýkingar tengist 70 prósent dánartíðni samanborið við 45 prósent dánartíðni meðal sjúklinga með bráða nýrnabilun eingöngu [29]. Glomerular filtration rate (GFR) er vísbending umnýruvirkaog minnkar með auknum nýrnaskemmdum. Meðferð með klópídógrel bætti nýrnaskaða hjá CLP rottum, sem bendir til þess að virkjun blóðflagna geti gegnt hlutverki í þróun blóðsýkingar af völdum blóðsýkingar.

Ávinningur af cistanche þykkni: bætir nýrnastarfsemi

Í samræmi við hlutverk þess í að valda MOF, er þróun ALI og bráðrar öndunarerfiðleikaheilkennis (ARDS) algeng hjá blóðsýkingarsjúklingum og leiðir oft til þörf á vélrænni öndun hjá þessum sjúklingahópi. Vísbendingar benda til þess að virkjun blóðflagna gegni mikilvægu hlutverki í þróun MOF hjá rotþróasjúklingum [8,30]. Fyrri rannsóknir hafa stutt þetta með því að sýna minni daufkyrningaíferð í lungum CLP-framkallaðra rotþróamúsa eftir blóðflögueyðingu [28]. Ennfremur, Liverani o.fl. greint frá því að mýs sem voru formeðhöndlaðar með Clopidogrel væru ónæmar fyrir blóðsýkingu af völdum ALI [31]. Hins vegar tókst núverandi rannsókn ekki að sýna fram á neinar marktækar vísbendingar um minnkandi IL- 1, íferð daufkyrninga eða veggþykkt lungnablöðru í lungum. Þetta getur stafað af notkun annarrar dýrategundar, skammts af Clopidogrel og öðrum mismun á tilraunahönnun.

Háræðaleki er áberandi einkenni blóðsýkingar. Vitað er að prótein eins og æðavaxtarþátturinn angíópóetín-2 stuðlar að bólgu, truflun á starfsemi æðaþels og tengist aukinni sjúkrahúsdauða hjá sjúklingum með blóðsýkingu [32]. Endocan er annað merki um vanstarfsemi æðaþelsfrumna og hefur verið tengt alvarleika veikinda og útkomu rotþrósjúklinga [33]. Við komumst einnig að því að þessi merki um virkjun æðaþels og truflun á starfsemi æðaþels voru hækkuð í CLP líkaninu og lækkuðu í Clopidogrel meðferðarhópnum. Á sama hátt sáum við lítilsháttar en óverulega aukningu á GFR í hópnum sem fékk klópídógrel. Þetta bendir til þess að virkjun blóðflagna hafi einhver mótandi áhrif á bólgusvörun við blóðsýkingu.

Í þessari rannsókn skilaði hömlun á virkjun blóðflagna ekki marktækum framförum á líffærastarfsemi. Hugsanlegt er að valinn skammtur, 10 mg/kg/sólarhring, hafi verið nægjanlegur til að draga úr virkjun blóðflagna, NLRP3 virkjun, cýtókínum og vísbendingum um æðaþelsvirkjun, en þýddi ekki til að draga úr lungnaskaða eða bættri nýrnastarfsemi. Liverani, o.fl. áður notaður upphafsskammtur 30/mg/kg/dag í villigerð og P2Y12 útsláttarmúsum, sem þýddi hömlun á lungnaskaða af völdum blóðsýkingar [31]. Í sömu rannsókn var Clopidogrel gefið áður en blóðsýking var framkölluð. Þessi mikli munur gæti skýrt skort á marktækum framförum á lungna- eða nýrnastarfsemi sem kom fram í rannsókn okkar.

Þó að núverandi rannsókn bendir til hlutverks fyrir virkjun blóðflagna í að stuðla að bólgu og æðaþelsvirkjun sem svar við blóðsýkingu, þá eru takmarkanir sem ætti að hafa í huga. Í fyrsta lagi, á meðan merki um virkjun æðaþels voru mæld, eru frekari tilraunir til að meta starfsemi æðaþels nauðsynlegar. Þar að auki var ekki stjórnað fyrir framlagi annarra þátta sem eru afleiddir af blóðflögum í þessari rannsókn. Því er enn ósvarað spurningum um hvernig blóðflögur stuðla að meinafræði og líffærabilun af völdum blóðsýkingar.

Hlutverk klópídógrels við að draga úr dánartíðni í blóðsýkingu hefur verið umdeilt með skýrslum um minnkandi tíðni ARDS og vélrænni loftræstingu, en enga lækkun á dánartíðni [34]. Gera þarf frekari rannsóknir til að ákvarða nákvæmlega hvernig blóðflögur stuðla að líffæraskaða og truflun á blóðsýkingu. Þessi rannsókn styður frekari könnun á blóðflögum sem lækningamarkmið hjá rotþróasjúklingum.

cistanche tubolosa heilsufar: bætir nýrnastarfsemi

4. Efni og aðferðir

4.1. Dýr

Kvenkyns og karlkyns Sprague Dawley rottur sem keyptar voru frá Envigo (Indianapolis, IN, Bandaríkjunum) voru notaðar. Allar tilraunaaðgerðir sem framkvæmdar voru í þessari rannsókn voru í samræmi við leiðbeiningar Heilbrigðisstofnunarinnar um notkun og umhirðu dýra. Allar samskiptareglur voru samþykktar af dýraverndar- og notkunarnefndinni við háskólann í Mississippi læknastöðinni. Umhirða og meðhöndlun dýranna var í samræmi við leiðbeiningar Heilbrigðisstofnunar ríkisins um siðferðilega meðferð dýra.

4.2. Cecal Ligation og gata

Allar in vivo tilraunir okkar voru gerðar á 12- á 13-vikugamlar karl- og kvenrottur sem vógu um það bil 225–325 g. Dýrunum var skipt af handahófi í tvo hópa: sýndaraðgerðahópinn (SHAM, n=10) og hópinn fyrir hálsbindandi stungu (CLP, n=10). Undir ísóflúran svæfingu var CLP skurðaðgerðin gerð á undirhópi rotta til að framkalla fjölörveru blóðsýkingu í kvið eins og við höfum áður lýst [26,27]. Forhitað saltvatn (20 ml/kg, 37 ◦C) var sprautað undir húð strax eftir aðgerðina til endurlífgunar. Dýr sem voru rekin í sýndarverkun gengust undir sömu skurðaðgerð án bindingar eða stungu. Rotturnar voru settar aftur í búr sínar eftir aðgerð og matur og vatn var útvegað að vild. 24 klst. eftir CLP var fyrri skurðurinn opnaður aftur og necrotic cecum var skorið vandlega út. Kviðarholið var þvegið með 10 ml af heitri sæfðri saltlausn. Kviðskurðinum var aftur lokað í lögum. Dýrum var gefið breiðvirkt sýklalyf daglega (Naxcel 5 mg/kg) og verkjastillandi var náð með búprenorfíni SR (1,2 mg/kg) á 72 klst. tilraunatímabilinu. Blóðflagnasamsöfnun var læst með daglegri gjöf Clopidogrels (10 mg/kg/dag) í 3 daga í undirhópi CLP rotta (CLP plús CLOP; n=12) með vélindaslöngu í 3 daga. Í lok bókunar var dýrunum fórnað í djúpri svæfingu. Blóði og vefjum var safnað til frekari greiningar.

4.3. Einangrun blóðflagna

Slagæðablóð var dregið inn í sýru-sítrat-dextrósa rör og skilið í skilvindu við 200× g í 20 mínútur til að fá blóðflagnaríkt plasma. Blóðflöguríkt plasma (PRP) var blandað saman við jafnt rúmmál af HEP jafnalausn (140 mmól/L NaCl, 2,7 mmól/L KCl, 3,8 mmól/L HEPES, 5 mmól/L EGTA, pH 7,4) sem innihélt 1 µM PGE1. Þessi blanda var síðan skilin í skilvindu við 100 x g í 20 mínútur til að pilla afganginn af rauðum blóðkornum og hvítum blóðkornum þar sem 40 µL af flotinu var notað til að telja blóðflögur. PRP var síðan skilið í skilvindu við 800× g í 20 mínútur, flotinu var hent og kögglan var endurleyst í Tyrode's jafnalausn (134 mmól/L NaCl, 12 mmól/L NaHCO3, 2,9 mmól/L KCl, 0,34 mmól/L Na2HPO4,1 mmól/L MgCl2, 10 mmól/L HEPES) sem inniheldur 5 mmól/L glúkósa og 3 mg/ml BSA.

4.4. Flæðisfrumumæling

Nýeinangraðar blóðflögur (106) voru endursviflausnar í 50 µL af Tyrode's jafnalausn. Blóðflögur voru ræktaðar (RT í 30 mínútur) með fluorescein ísóþíósýanati (FITC)-samengdu and-mús CD41 (Clone MWReg30, BioLegend, San Diego, CA, USA) og Allophycocyanin (APC) samtengdu and-mús/rottu CD62P (Clone RMP{) {9}}, Biolegend). Að lágmarki 10,000 atburðir í hvert hlið voru aflað með MACsQuant Analyzer 10 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, Bandaríkjunum) og greind með FlowLogic hugbúnaði (Innovation, Sydney, Ástralía). Blóðflögur voru aðgreindar með sértækri bindingu and-CD41 og einkennandi fram- og hliðardreifingu. Blóðflögur sem lituðust jákvæðar fyrir CD41 og CD62P voru kallaðar virkjaðar blóðflögur.

4.5. Confocal og ljóssmásjá

Blóðflögur (107) úr sýndar- eða CLP-rottum eða örvaðar með eða án LPS fengu að festast við permanox-skyggnur (Lab-Tek, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Bandaríkjunum). Viðloðnar frumur voru festar í 10 prósent formalíni í 30 mínútur, þvegnar 3x með PBS í 10 mínútur við RT og gegndræpi með ísköldu 100 prósent metanóli í 10 mínútur. Skyggnurnar voru lokaðar í PBS með 10 prósenta geita- og kanínusermi í 1 klst, þvegnar og ræktaðar með kanínum and-NLRP3 mótefni (NBP2-12446, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) í 2 klst við RT. Gler voru síðan þvegin og ræktuð með anti-kanínu Alexa Fluor 488 (A11070, Thermo FisherScientifific) í 1 klst við RT. Glerurnar voru þvegnar aftur og ræktaðar með Alexa Fluor647-conjugated kanínu and-ASC mótefni (NBP1-78977AF647, Novus Biologicals) í 1 klst. við stofuhita. Viðmið voru unnin á sama hátt, nema aðal mótefnin voru sleppt. Undirbúningur var settur í Cytoseal 60 (Thermo Fisher Scientific) og greindur á Nikon C1 (Nikon Inc., Melville, NY, Bandaríkjunum) confocal skanna smásjá. Myndirnar voru teknar með Nikon Eclipse 55i smásjá búin Nikon-Fi1 litamyndavél (Nikon) og greindar með NIS-Elements D 3.0 hugbúnaði.

4.6. Magngreining lífmerkja æðaþelsvirkjunar og frumuefna

Plasmaþéttni angíópóíetíns-2 (MANG20, R&D Systems, Minneapolis, MN, Bandaríkjunum) og Endocan-1 (MBS039900, MyBioSource, San Diego, CA, Bandaríkjunum) voru mæld sem merki um vanstarfsemi æðaþels með ELISA skv. við samskiptareglur framleiðanda. Plasma,nýru, og lungna IL-1 (RLB00, R&D Systems) og IL-18 (ab213909, Abcam, Boston, MA, Bandaríkjunum) voru magngreind með ELISA samkvæmt samskiptareglum framleiðanda.Nýruog lungnalýsi voru útbúin með BioPlex Cell Lysis Kit (171304011, BioRad, Hercules, CA, USA) í samræmi við siðareglur framleiðanda.

4.7. Mat á lungnaskaða

Histological evaluation was performed on the lungs via hematoxylin and eosin (H&E)staining. A lung lobe was formalin-fixed. The tissue was subsequently paraffin-embedded and 5-µm sections were stained with (H&E). Sections were evaluated for neutrophil infiltration into the alveolar space. Five sections were scored in a blinded fashion on a scale of0–2 with 0 representing o neutrophils in the alveolar space, 1 representing 1–5 neutrophils in the alveolar space, and 2 representing >5 daufkyrninga í alveolar space. Myndir voru teknar með Nikon Eclipse 55i smásjá með Nikon DS-Fi1 litamyndavél (Nikon Inc.) við 40X með NIS-Elements D 3.0 hugbúnaði. Alveolar veggþykkt var mæld með NIS-Elements D 3.0 hugbúnaði. Gögnin voru stöðluð í sýndargildi.

4.8. Mat á nýrnahimnuskaða

Nýruwere collected, weighed, and fixed in a 10% buffered formalin solution. Paraffin sections (3 µm) were prepared and stained with Periodic acid-Schiff to assess the degree of glomerular injury on approximately 30 images per section, per rat. Thirtyglomeruli per section were scored in a blinded fashion on a 0–4 scale with 0 representing a normal glomerulus, 1 representing a 25% loss, 2 representing a 50% loss, 3 representing a 75% loss, and 4 representing >75 prósent tap á háræðum í tóftinni. Myndir voru teknar með sömu smásjá, myndavél og hugbúnaði eins og áður hefur komið fram.

4.9. Mæling á nýrnastarfsemi

Meðan á CLP aðgerðinni stóð var legg sett í hálsbláæð og hann færður út undir húð aftan á hálsinum. Holleggurinn var skolaður með heparínblanduðu saltvatni á hverjum degi þar til þriggja daga áætluninni lauk. Á síðasta degi samskiptareglunnar fóru rottur í stutta ísóflúrandeyfingu til að setja saman NIC-Nýra tækið (MediBeacon; Mannheim, Þýskalandi) úr tveimur ljósdíóðum sem örva FITC sinistrín við 480 nm, ljósdíóða sem gefur frá sér ljós kl. 531 nm, örgjörvi og rafhlaða. Þetta tæki var fest við bakið á rottunni með því að nota tvíhliða límplástur (MediBeacon) og fest með nagdýrajakka við rakað svæði aftan á rottunni. Rottum var leyft að jafna sig í aðskildum búrum í 15 mínútur og grunnlínumæling var skráð. Eftir grunnlínumælingar var bolusinndæling af FITC-sinistríni (5 mg/100 g líkamsþyngd; FTC-FS001, MediBeacon) gefin um hálsbláæð og fylgt eftir með bolussprautu af dauðhreinsuðu saltvatni. Á tveimur klukkustundum eftir bolus inndælingu var útskilnaðarhvörf FITC-sinistríns mæld í gegnum húð og voru þau notuð til að reikna út helmingunartíma brotthvarfs (t1/2) FITC-sinistríns með því að nota eins hólfa líkan með MDPLab matshugbúnaðinum. (MediBeacon) til að reikna út GFR út frá viðurkenndum reynslustuðli [35,36].

cistanche endurskoðun: bætir nýrnastarfsemi

4.10. Tölfræðigreining

Kraftagreining ákvarðar að n af 10–12 dýrum/hópi myndi ná krafti(1-) upp á 0.80 og líkur á tegund 1 villu ( ) upp á 0,05 til að greina að minnsta kosti 5–10 prósent mun á blóðflöguvirkjun á milli Sham og CLP rottanna. Öll gögn eru gefin upp sem meðaltal± SD. Öll gögn voru skoðuð til að vera í samræmi við Gaussdreifingu með D'Agostino-Pearson eðlilega prófinu. Tölfræðilegar greiningar voru gerðar með einstefnu ANOVA með Tukey's margfeldi samanburðarprófi sem post hoc greiningu. Gildi p < 0,05="" var="" talið="" tölfræðilega="">

Framlög höfunda:

Hugmyndafræði, CAS, JMW og DCC; aðferðafræði, JMW ogD.CC; löggilding, OKT, JMW og DCC; formleg greining, MB-R., CAS, OKT, JMW ogD.CC; rannsókn, MB-R., CAS, OKT, RWT, CHB, CAG, GAT, JMW og DCC; auðlindir, JMW og DCC; gagnaöflun, MB-R., CAS og DCC; ritun—undirbúningur upphaflegs drögs, MB-R. og CAS; skrif - endurskoðun og klipping, MB-R., CAS, OKT, RWT, CHB, CAG, GAT, JMW og DCC; visualization, MB-R., CAS, JMW og DCC; eftirlit, OKT og DCC; verkefnastjórnun, DCC; fjármögnunaröflun, DCC Allir höfundar hafa lesið og samþykkt útgefna útgáfu handritsins.

Fjármögnun:

Rannsóknir sem greint er frá í þessari útgáfu voru studdar af National Institute of General Medical Sciences of the National Institute of Health undir verðlaunanúmerinu P20GM104357 og P30GM103328. Þessi rannsókn var styrkt af National Heart Lung and Blood Institute of the National Institutes of Health undir verðlaunanúmerum F31HL149257 (OKT), R00HL130456 (DCC) og R01HL151407 (DCC), og National Institute of Diabetes and Digestive ogNýraSjúkdómarfrá National Institute of Health undir verðlaunanúmeri R01DK109133 (JMW) Innihaldið er eingöngu á ábyrgð höfunda og er ekki endilega fulltrúi opinberra viðhorfa National Institute of Health.

Yfirlýsing endurskoðunarnefndar stofnana:

Allar tilraunaaðgerðir sem framkvæmdar voru í þessari rannsókn voru gerðar í samræmi við leiðbeiningar Heilbrigðisstofnunarinnar um notkun og umönnun dýra. Allar samskiptareglur voru samþykktar af dýraumönnunar- og notkunarnefndinni við háskólann í Mississippi læknastöðinni (bókun 1487A, samþykkt 07/02/2019). Umhirða og meðhöndlun dýranna var í samræmi við leiðbeiningar Heilbrigðisstofnunar ríkisins um siðferðilega meðferð dýra.

Yfirlýsing um framboð gagna:

Öll gögn til stuðnings þeim niðurstöðum sem greint hefur verið frá eru settar fram í handritinu og eru frjálst aðgengilegar.

Hagsmunaárekstrar:

Höfundar lýsa engum hagsmunaárekstrum.

Heimildir

1. Greco, E.; Lupia, E.; Bosco, O.; Vizio, B.; Montrucchio, G. Blóðflögur og fjöllíffærabilun í blóðsýkingu. Alþj. J. Mol. Sci. 2017, 18, 2200.
2. Rhee, C.; Dantes, R.; Epstein, L.; Murphy, DJ; Seymour, CW; Iwashyna, TJ; Kadri, SS; Angus, DC; Danner, RL; Fiore, AE; o.fl. Tíðni og tilhneiging blóðsýkingar á sjúkrahúsum í Bandaríkjunum með klínískum gögnum á móti kröfum, 2009–2014. JAMA 2017, 318, 1241–1249.
3. Kim, WY; Hong, SB blóðsýking og bráð öndunarerfiðleikaheilkenni: Nýleg uppfærsla. Tuberc. Öndun. Dis. (Seúl) 2016, 79, 53–57.
4. Alobaidi, R.; Basu, RK; Goldstein, SL; Bagshaw, SM Bráður nýrnaskaði tengdur blóðsýkingu. Semin. Nephrol. 2015, 35, 2–11.
5. Umbro, I.; heiðingi, G.; Tinti, F.; Muresan, P.; Mitterhofer, AP Nýlegar framfarir í meinalífeðlisfræði og lífmerkjum um bráða nýrnaskaða af völdum blóðsýkingar. J. Infect. 2016, 72, 131–142.
6. Bilevicius, E.; Dragosavac, D.; Dragosavac, S.; Araujo, S.; Falcao, AL; Terzi, RG Fjöllíffærabilun hjá rotþróasjúklingum. Braz. J. Infect. Dis. 2001, 5, 103–110.
7. Liu, V.; Escobar, GJ; Greene, JD; Soule, J.; Whippy, A.; Angus, DC; Iwashyna, TJ Dauðsföll á sjúkrahúsi hjá sjúklingum með blóðsýkingu frá 2 sjálfstæðum hópum. JAMA 2014, 312, 90–92.
8. Katz, JN; Kolappa, KP; Becker, RC Beyond segamyndun: Fjölhæfur blóðflögur í alvarlegum veikindum. Kista 2011, 139, 658–668.
9. Smyth, SS; McEver, RP; Weyrich, AS; Morrell, CN; Hoffman, MR; Arepally, GM; franska, PA; Dauerman, HL; Becker, RC; Blóðflögur Colloquium, P. Blóðflögur virka umfram blæðingu. J. Thromb. Haemost. 2009, 7, 1759–1766.
10. de Stoppelar, SF; van 't Veer, C.; van der Poll, T. Hlutverk blóðflagna í blóðsýkingu. Thromb. Haemost. 2014, 112, 666–677.
11. Nawaz, M.; Dickfeld, T.; Bogner, C.; Fateh-Moghadam, S.; Neumann, FJ Blóðflöguvirkni í blóðsýkingarsjúkdómum í mörgum líffærum. Gjörgæslu Med. 1997, 23, 379–385.
12. Layios, N.; Delierneux, C.; Hego, A.; Huart, J.; Gosset, C.; Lecut, C.; Maes, N.; Geurts, P.; Joly, A.; Lancellotti, P.; o.fl. Spá um blóðsýkingu hjá alvarlega veikum sjúklingum með blóðflöguvirkjunarmerkjum við innlögn á gjörgæsludeild: Framsýn frumrannsókn. Gjörgæslu Med. Exp. 2017, 5, 32.
13. Russwurm, S.; Vickers, J.; Meier-Hellmann, A.; Spangenberg, P.; Bredle, D.; Reinhart, K.; Losche, W. Virkjun blóðflagna og hvítkorna tengist alvarleika truflunar á rotþróalíffærum. Shock 2002, 17, 263–268.
14. Vanderschueren, S.; De Weerdt, A.; Malbrain, M.; Vankersschaever, D.; Frans, E.; Wilmer, A.; Bobbaers, H. Blóðflagnafæð og horfur á gjörgæslu. Crit. Care Med. 2000, 28, 1871–1876.
15. Theofanis, E.; Semitekolou, M.; Morianos, I.; Sanitas, K.; Xanthou, G. Markmið NLRP3 bólgueyðandi virkjun í alvarlegum astma. J. Clin. Med. 2019, 8, 1615.
16. Haque, ME; Akther, M.; Jakaria, M.; Kim, IS; Azam, S.; Choi, DK Miðað við smáglía NLRP3 bólgusjúkdóminn og hlutverk þess í Parkinsonsveiki. MOV. Óreglu. 2020, 35, 20–33.
17. Liu, L.; Dong, Y.; Já, M.; Jin, S.; Yang, J.; Joosse, ME; Sun, Y.; Zhang, J.; Lazarev, M.; Brant, SR; o.fl. Sjúkdómsvaldandi hlutverk NLRP3 bólgueyðandi virkjunar í bólgusjúkdómum í þörmum bæði músa og manna. J. Crohns ristilbólga 2017, 11, 737–750.
18. Danielski, LG; Giustina, AD; Bonfante, S.; Barichello, T.; Petronilho, F. NLRP3 bólgusjúkdómurinn og hlutverk þess í þróun blóðsýkingar. Bólga 2020, 43, 24–31.
19. Luo, YP; Jiang, L.; Kang, K.; Fei, DS; Meng, XL; Nan, CC; Pan, SH; Zhao, MR; Zhao, MY Hemin hindrar NLRP3 bólgueyðandi virkjun í bráðum lungnaskaða af völdum blóðsýkingar, sem felur í sér hem súrefnisasa -1. Alþj. Immunopharmacol. 2014, 20, 24–32.

20. Tungl, JS; Lee, S.; Park, MA; Siempos, II; Haslip, M.; Lee, PJ; Yun, M.; Kim, CK; Howrylak, J.; Ryter, SV; o.fl. UCP2-framkallaður fitusýrusyntasi stuðlar að NLRP3 bólgueyðandi virkjun við blóðsýkingu. J. Clin. Rannsaka. 2015, 125, 665–680.

[PubMed]21. Gong, Z.; Zhou, J.; Li, H.; Gao, Y.; Xu, C.; Zhao, S.; Chen, Y.; Cai, W.; Wu, J. Curcumin bælir NLRP3 inflammasome virkjun og verndar gegn LPS-völdum rotþróalosi. Mol. Nutr. Food Res. 2015, 59, 2132–2142.
22. Wang, P.; Huang, J.; Li, Y.; Chang, R.; Wu, H.; Lin, J.; Huang, Z. utanaðkomandi kolmónoxíð dregur úr blóðsýkingu af völdum bráða nýrnaskaða og hindrar NLRP3 bólgueyðandi virkjun í rottum. Alþj. J. Mol. Sci. 2015, 16, 20595–20608.
23. Kalbitz, M.; Fattahi, F.; Eftirvagn, JJ; Jajou, L.; Malan, EA; Steinn, FS; Huber-Lang, M.; Russell, MW; Ward, PA Viðbótarörvun á NLRP3 hjartabólgu í blóðsýkingu. FASEB J. 2016, 30, 3997–4006.
24. Bernard, GR; Vincent, JL; Laterre, PF; LaRosa, SP; Dhainaut, JF; Lopez-Rodriguez, A.; Steingrub, JS; Garber, GE; Helterbrand, JD; Ely, EW; o.fl. og raðbrigða mannaprótein CWEiSSsg. Verkun og öryggi raðbrigða virkjaðs próteins C fyrir alvarlega blóðsýkingu. N. Engl. J. Med. 2001, 344, 699–709.
25. Iba, T.; Thachil, J. Nútíð og framtíð segavarnarlyfjameðferðar með því að nota andtrombín og thrombomodulin fyrir blóðsýkingartengda dreifða blóðstorknun: Sjónarhorn frá Japan. Alþj. J. Hematol. 2016, 103, 253–261.
26. Cornelius, DC; Baik, CH; Travis, allt í lagi; Hvítur, DL; Young, CM; Austin Pierce, W.; Shields, CA; Poudel, B.; Williams, JM NLRP3 bólgueyðandi virkjun í blóðflögum sem svar við blóðsýkingu. Physiol. Rep. 2019, 7, e14073.
27. Cornelius, DC; Travis, allt í lagi; Tramel, RW; Borges-Rodriguez, M.; Baik, CH; Greer, M.; Giachelli, CA; Tardo, GA; Williams, JM NLRP3 bólgueyðandi hömlun dregur úr blóðsýkingu af völdum blóðflöguvirkjunar og kemur í veg fyrir fjöllíffæraskaða í hálsbindandi stungu. PLoS ONE 2020, 15, e0234039.
28. Asaduzzaman, M.; Lavasani, S.; Rahman, M.; Zhang, S.; Braun, OO; Jeppsson, B.; Thorlacius, H. Blóðflögur styðja við nýliðun daufkyrninga í lungum við blóðsýkingu í kviðarholi. Crit. Care Med. 2009, 37, 1389–1396.
29. Schrier, RW; Wang, W. Bráð nýrnabilun og blóðsýking. N. Engl. J. Med. 2004, 351, 159–169.
30. Vincent, JL; Yagushi, A.; Pradier, O. Blóðflöguvirkni í blóðsýkingu. Crit. Care Med. 2002, 30, S313–S317.
31. Liverani, E.; Rico, MC; Tsygankov, AY; Kilpatrick, LE; Kunapuli, SP P2Y12 viðtaki mótar blóðsýkingu af völdum bólgu. Arter. Thromb. Vasc. Biol. 2016, 36, 961–971. [Krossvísun]
32. Siner, JM; Bhandari, V.; Engle, KM; Elias, JA; Siegel, MD Hækkuð sermisþéttni angíópóetíns 2 tengist aukinni
dánartíðni í blóðsýkingu. Áfall 2009, 31, 348–353.
33. Scherpereel, A.; Depontieu, F.; Grigoriu, B.; Cavestri, B.; Tsicopoulos, A.; heiðingi, T.; Jourdain, M.; Pugin, J.; Tonnel, AB; Lassalle, P. Endocan, nýtt æðaþelsmerki í blóðsýkingu manna. Crit Care Med. 2006, 34, 532–537.
34. Valerio-Rojas, JC; Jaffer, IJ; Kor, DJ; Gajic, O.; Cartin-Ceba, R. Niðurstöður sjúklinga með alvarlega blóðsýkingu og blóðsýkingarlost á langvarandi blóðflöguhemjandi meðferð: Söguleg hóprannsókn. Crit. Care Res. Æfðu þig. 2013, 2013, 782573.
35. Pilla, J.; Issaeva, O.; Wonderer, S.; Sadick, M.; Kranzlin, B.; Fiedler, F.; Klotzer, HM; Kramer, U.; Gretz, N. Lyfjafræðileg snið og eiturverkanir flúorskínmerkts sinistríns, nýtt merki fyrir GFR mælingar. Bogi Naunyn-Schmiedeberg. Pharmacol. 2006, 373, 204–211.
36. Pilla, J.; Kraenzlin, B.; Jander, J.; Sattelkau, T.; Sadick, M.; Kloetzer, HM; Deus, C.; Kraemer, U.; Gretz, N. Fluorescein-merkt sinistrín sem merki um gaukulsíunarhraða. Eur. J. Med. Chem. 2005, 40, 1056–1061.