Phenylethanoid Glycosides Of Cistanche Deserticola: Mechanism of the neuroprotective effects

Maiquan Li, o.fl

Ágrip:Nuclear factor erythroid 2-tengdur þáttur 2 (Nrf2) er lykilumritunarþáttur gegn oxunarálagi og taugahrörnunarsjúkdómum.Fenýletanóíð glýkósíð(PhGs; salidroside,akteósíð, ísóakteósíð ogechinacoside) sýna andoxunarefni ogtaugaverndandilífvirkni. Þessi rannsókn var gerð til að kannataugaverndandiáhrif og sameindakerfi afPhG. PhGformeðferð bældi verulega H2O2-framkallaða frumueiturhrif í PC12 frumum með því að kveikja á kjarnaflutningi Nrf2 og snúa við niðurstýrðri próteintjáningu heme oxygenase 1 (HO-1), NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 (NQO1) ), glútamat-sýstein lígasa-hvata undireiningu (GCLC) og glútamat-sýstein lígasa modifier undireining (GCLM). Nrf2 siRNA eða HO-1 hemill sinkprótóporfýrín (ZnPP) minnkaðitaugaverndandiáhrif. PhGs sýndu hugsanlega víxlverkun við Nrf2 bindisæti í Kelch-líku ECH-sambandspróteini 1 (Keap1). Þessi niðurstaða gæti stutt þá tilgátu að PhGs séu virkjar Nrf2. Við sýndum fram á hugsanlega bindingu milli PhGs og Keapl-virkjaðs Nrf2/ARE ferilsins og að PhGs með fleiri glýkósíðum höfðu aukin áhrif.

Leitarorð:Halda1; Nrf2;Taugaverndandi; PC12 frumur;PhG(NQO1), meðal annarra [5-7]. Þetta ferli er lykilskref til að vernda frumur gegn oxunarálagi og er að koma fram sem efnilegt meðferðarmarkmið fyrir taugavernd [8]. Gaia greindi frá því að Nrf2 dregur úr LRRK2- og taugahrörnun af völdum a-synúkleíns með því að efla sterklega samstöðu taugapróteina á frumusjálfráðan og tímaháðan hátt [9].

Fenýletanóíð glýkósíð (PhG) einkennast af kanilsýru og hýdroxýlfenýletýlhlutum tengdum ap-glúkópýranósa í gegnum ester- og glýkósíðtengingar, í sömu röð. Þessar sameindir tilheyra hópi vatnsleysanlegra náttúruafurða sem eru víða í jurtaríkinu [10]. In vitro og in vivo rannsóknir hafa sýnt að þessi efnasambönd hafa andoxunarefni [11],taugaverndandi[12], bakteríudrepandi,

Tengiliður:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Cistanche hefur taugaverndandi eiginleika, smelltu hér til að læra meira

1. Inngangur

Oxunarálag, sem er ójafnvægi andoxunarjafnvægis, veldur lípíðperoxun, skaða á próteini og DNA, öldrun frumna og frumudauða. Þetta ferli stuðlar líklega að nokkrum taugahrörnunarsjúkdómum, svo sem Alzheimerssjúkdómi (AD), Parkinsonsveiki (PD) og blóðþurrð/endurflæði [1]. Vetnisperoxíð (H2O2), sem er ein helsta hvarfgjarna súrefnistegundin (ROS), er þekkt fyrir að valda lípíðperoxun og DNA skemmdum [2]. Þar að auki er H2O2 innræn uppspretta hýdroxýl sindurefna sem stuðlar að bakgrunnsstigi oxunarálags frumna [3,4]. Þess vegna geta meðferðaraðferðir til að koma í veg fyrir oxunarálag af völdum apoptosis haft möguleika í meðferð taugahrörnunarsjúkdóma.

Nuclear factor erythroid 2-tengdur þáttur 2 (Nrf2), er umritunarþáttur sem er sterklega tengdur oxunarálagi. Virkjun Nrf2 örvar umritun fjölmargra andoxunar- og afeitrunargena, þar á meðal hem súrefnisasa-1 (HO-1), NAD(P)H kínónoxídóreduktasa 1

bólgueyðandi [13] og ónæmisbælandi [14] lífvirkni. Osmanthusfragrans er algengt innihaldsefni í nokkrum asískum matvælum og hefur lengi verið neytt. Við sýndum áður að O.fragrans blómaþykkni jók staðbundið nám og minni, hamlaði oxunarskemmdum og sýndi taugaverndandi virkni í öldrun af völdum d-galaktósa í ICR músarlíkani [15]. Salidroside, acteoside og isoacteoside eru helstu viðbrögð PhGs fyrir andoxunarvirkni O.fragrans blómaþykkni [16].

Rannsóknir á taugaverndandi áhrifum PhGs hafa náð æskilegum árangri. Salidroside dró verulega úr frumudreifingu PC12 frumna sem voru útsettar í MPP plús [17,18]. Acteoside létti einnig MPP plús-framkallaða frumudauða og oxunarálag í PC12 frumum [19] og A p25-35-völdum SH-SY5Y frumuskaða [20].Echinacosidevar rannsakað á æxlisdrep-a (TNFa)-framkallaðri apoptosis í SH-SY5Y frumum [21], MPTP-völdum dópamínvirkum eiturverkunum í músum [22], glútamat-slösuðum frumræktum rottubarkarfrumna [23] og {{ 9}} OHDA af völdum skaða í PC12 frumum [24]. Niðurstöðurnar bentu til þess að PhGs sýndu frumuverndandi áhrif og eru hugsanleg lyf til að meðhöndla taugahrörnunarsjúkdóma. Rannsóknir hafa sýnt andoxunareiginleika PhGs sem liggja að baki mörgum öðrum lífvirkni fyrir þessi efnasambönd [25]. Hins vegar hafa fáar rannsóknir rannsakað sameindakerfi PhGs gegn oxunareitrun.

Í rannsókn okkar völdum við fjóra dæmigerða PhG sem hér segir: salidroside (fenýletanóíð einsykrur), akteósíð (fenýletanóíð tvísykrur), ísóakteósíð (fenýletanóíð tvísykrur) ogechinacoside(fenýletanóíð þrísykrur). Við notuðum líkan af taugafrumudauða með því að nota sérhæfðar PC12 frumur [26] til að rannsaka verndandi áhrif og sameindakerfi PhGs á H2O2-framkallað PC12 frumulíkan. Við sýndum fram á að PhGs virkjaði Nrf2/ARE ferlið með því að bindast Kelch-líku ECH-tengdu próteini 1 (Keap1). Þetta ferli hækkaði andoxunarensímin og jók viðnám PC12 frumna gegn oxunarálagi.

2. Úrslit

2.1. PhGs bælt H2O2-Valdu frumueiturhrif í PC12 frumum

Frumueiturhrif H2O2 og PhGs (0.1,1,5 og 10 卩g/ml) á PC12 frumur voru prófuð. Niðurstöðurnar sýndu að H2O2 olli tapi á lífvænleika PC12 frumna á þéttniháða og tímaháða hátt (Mynd 1A). Útsetning PC12 frumna fyrir 200 H2O2 í 2 klst leiddi til lífvænleika frumna upp á 57,4 prósent. Formeðferð frumna með PhG við 0,1, 1, 5 og 10 -/ml hafði engin áhrif á lífvænleika frumna (Mynd 1B) og verulega verndaðar PC12 frumur fyrir H2O2- olli skemmdum með því að bæta lífvænleika frumna þar sem 9.549-22.141 prósent , 12.092-25.289 prósent , 1.470-9.289 prósent og 3.411-11.441 prósent , í sömu röð (Mynd 1C) . Hins vegar, salídrosíð (0,1 ^g/ml), ísóakteósíð (0,1, 1, 5 og 10 ^g/mL),echinacoside(0.1,1, og 5 ^g/mL) formeðferð sýndi engan marktækan mun á HzOz-völdum frumuskaða. Formeðferð frumna með PhG bætti einnig formfræðilega eiginleika sem H2O2 framkallaði (mynd 1D).

Mynd 1. PhGs bældu H2O2-framkallað frumueiturhrif í PC12 frumum. Lífvænleiki frumna var greindur með MTT prófi. Frumueyðandi áhrif H2O2 (A) og PhGs (B) við mismunandi styrk á PC12 frumur. (C) PhGs veiklað H2O2-örvaði minnkun á lífvænleika frumna. PC12 frumur voru ræktaðar með PhGs ({{10}}.1, og 10 wg/mL) í 24 klst og síðan ræktaðar með 200 pM H2O2 í annan tíma 2 klst. eftir að PhGs voru fjarlægð. (D) Formfræðileg athugun. Frumur eftir meðferð sáust með fasa-skilamótasmásjá (x100), CK: eðlilegur hópur, H2O2: H2O2 meðhöndlaður hópur, HL: salidroside lágskammtameðhöndlaður hópur, HH: salidroside háskammtameðhöndlaður hópur, ML: acteoside lágskammtameðhöndlaður hópur, MH: hópur sem fékk háskammta meðhöndluðum akteósíðum, IL: hópur sem fékk ísóakteósíð í lágum skömmtum, IH: hópur sem fékk háskammta meðhöndlun með ísóakteósíði, SL: hópur meðhöndlaður í lágum skömmtum með echinakósíði, SH: hópur sem fékk háskammta meðhöndlun með echinakósíði. ** p < 0,01="" miðað="" við="" ómeðhöndlaðan="" hóp;="" #="" p="">< 0,05,="" á="" móti="" h2o2="" meðhöndluðum="" hópi;="" ##="" p="">< 0,01,="" á="" móti="" h2o2="" meðhöndluðum="">

2.2. PhGs bældu H2O2-Innanfrumuuppsöfnun ROS, lípíðperoxunar (MDA) og aukinnar Superoxide Dismutase (SOD) virkni í PC12 frumum

Útsetning PC12 frumna fyrir 200 pM H2O2 í 2 klst. jók ROS gildi, MDA innihald og minnkaði SOD virkni (Mynd 2). PhGs formeðferð dró úr ROS stigi, salidroside og acteoside og stórir skammtar af ísóakteósíði og echinacoside formeðferð dró verulega úr ROS stigi (p < 0,01).="" salidroside="" formeðferð="" sýndi="" engin="" áhrif="" á="" mda="" innihald,="">akteósíðformeðferð dró verulega úr MDA efni (p < 0.05).="" ísóacteoside="" og="" echinacoside="" formeðferð="" dró="" verulega="" úr="" mda="" innihaldi="" í="">

Mynd 2. PhGs lokuðu ROS og MDA uppsöfnun og juku virkni SOD í PC12 frumum. PC12 frumur voru ræktaðar með PhGs (0.1 og 10 4g/mL) í 24 klst og síðan ræktaðar með 200 |^M H2O2 í annað 2 klst. eftir að PhGs voru fjarlægð. (A) PhGs lokuðu ROS og MDA uppsöfnun. (B) PhGs lokuðu MDA uppsöfnun. (C) PhGs juku starfsemi SOD. CK: eðlilegur hópur, Gerð: H2O2 meðhöndlaður hópur, Salidroside: salidroside meðhöndlaður hópur, Acteoside: Acteoside meðhöndlaður hópur, Ísóacteoside: ísóacteoside meðhöndlaður hópur, Echinacoside: echinacoside meðhöndlaður hópur. ** p < 0.01="" á="" móti="" ómeðhöndluðum="" hópi;="" #="" p="">< 0,05,="" á="" móti="" h2o2="" meðhöndluðum="" hópi,="" ##="" p="">< 0,01,="" á="" móti="" h2o2="" meðhöndluðum="">

2.3.PhGs Reversed H2O2-Induced Apoptosis í PC12 frumum

H2O2 meðferð (200 |1M) í 2 klst. jók marktækt frumudauða í PC12 frumum, með heildarflóðafæðingartíðni allt að 16,02 prósent (mynd 3). Hins vegar, formeðferð með PhGs (0,1 og 10 卩g/ml) í 24 klst. minnkaði apoptosis hraða á styrkleikaháðan hátt (p < 0,01).="">akteósíð, ísóakteósíð ogechinacosidelækkaði verulega hlutfall frumudauða um 4.750-6.627 prósent, 4.413-5.800 prósent, 6.593-10.047 prósent og 1.530-7. 510 prósent, í sömu röð.

Mynd 3. PhGs sneru við H2O2-framkallaðri frumufrumu í PC12 frumum. PC12 frumur voru ræktaðar með PhGs (0.1, og 10 卩g/mL) í 24 klst, og síðan ræktaðar með 200 pM H2O2 í aðrar 2 klst. eftir að PhGs voru fjarlægðar. Síðan var frumudauði mæld með frumuflæðismælingu með PI/FITC flúrljómun.

CK: eðlilegur hópur, Gerð: H2O2 meðhöndlaður hópur, Salidroside: salidroside meðhöndlaður hópur, Acteoside: Acteoside meðhöndluð hópur, Ísóacteoside: isoacteoside meðhöndlaður hópur,Echinacoside: echinacosidemeðhöndlaður hópur. ** p < {{0}}.01="" á="" móti="" ómeðhöndluðum="" hópi;="" ##="" p="">< 0,01,="" á="" móti="" h2o2="" meðhöndluðum="">

2.4. PhGs létt af H2O2-Völdum vanstjórnun á Nrf2-ERU leiðum í PC12 frumum

Nrf{{0}}ARE leiðin, sem ein helsta andoxunarferlið í flestum frumugerðum, er mikilvæg til að stjórna frumuvexti og frumudauða. Þess vegna könnuðum við hvort Nrf2-ARE-ferillinn sé þátttakandi í H2O2-framkallaðri frumufrumu með ónæmisflúrljómun og Western blot-greiningu með því að nota sértæk mótefni. Ónæmisflúrljómunargreiningin sýndi að PhGs (0,1 og 10 pg/mL) olli kjarnaflutningi Nrf2 (Mynd 4). Eftir meðferð á PhGs, isoacteoside, ogechinacosideleiddi til bata að hluta til eðlilegrar formgerðar frumunnar. Niðurstöður úr Western blotting og gráum þéttleikagreiningum sýndu að PhG ({{0}}}.1 og 10 pg/mL) höfðu engin marktæk áhrif á tjáningu Nrf2 í umfrymi (Mynd 5A, B) (p > {{20}}.05) en uppstýrt Nrf2 tjáning í kjarnanum (Mynd 5C,D) (p < 0.01).="" síðan="" rannsökuðum="" við="" hlutverk="" nrf2="" í="" h2o2-framkallaðri="" frumufrumu="" með="" því="" að="" flytja="" inn="" nrf2="" sirna.="" prótein="" og="" mrna="" tjáningu="" nrf2="" var="" marktækt="" lækkað="" í="" öllum="" nrf2="" sirna="" meðhöndluðum="" hópum="" (mynd="" 5e-h).="" phgs="" (0,1="" og="" 10="" pg/ml)="" komu="" í="" veg="" fyrir="" h2o2-framkallað="" frumueiturhrif="" í="" hópum="" án="" nrf2="" sirna="" meðferðar="" (p="">< 0,01),="" en="" slíkri="" vörn="" var="" snúið="" við="" með="" nrf2="" sirna.="" eftir="" nrf2="" sirna="" meðferð="" minnkaði="" lífvænleiki="" frumna="" verulega="" jafnvel="" með="" phgs="" meðferð="" (mynd="">

Mynd 5. Verndaráhrif PhGs á Nrf2 í H2O2-meðhöndluðum PC12 frumum. (A) Tjáning Nrf2 próteins í umfryminu var greind með ónæmisblettingu með því að nota sérstakt mótefni. p-Actin var notað sem hleðslustýring. (B) Magnþéttnigreining á Nrf2 próteini í umfrymi. (C) Tjáning Nrf2 próteins í kjarnanum var greind með ónæmisblettingu með því að nota tiltekið mótefni. Histon H3 voru notuð sem hleðslustýring. (D) Magnþéttnigreining á Nrf2 próteini í kjarnanum. (E, F) PC12 frumur voru forræktaðar án (E) eða með (F) Nrf2 siRNA í 24 klst, síðan ræktaðar með eða án PhGs (0.1 og 10 昭/ml) í 24 klst og ræktað með H2O2 í aðrar 2 klst eftir að PhGs voru fjarlægðar. Heildartjáning Nrf2 próteins var greind með ónæmisblettingu með því að nota sérstakt mótefni og p-aktín var notað sem hleðslustýring. (G) Magnþéttnigreining á heildar Nrf2 próteini. (H) Magngreining á Nrf2 mRNA. (I) PC12 frumur voru forræktaðar með eða án siRNA í 24 klst, síðan ræktaðar með eða án PhGs (0,1 og 10 -/mL) í 24 klst. og ræktaðar með H2O2 í aðrar 2 klst. eftir að PhGs voru fjarlægðar. Eftir meðferð voru lifunarfrumur ákvarðaðar með MTT prófi. CK: eðlilegur hópur, Gerð: H2O2 meðhöndlaður hópur, viðmiðunar-Si: viðmiðunarhópur meðhöndluð með siRNA, SiRNA Neikvætt: án siRNA meðhöndlaðs hóps, SiRNA jákvætt: SiRNA meðhöndlaður hópur, Salidroside: salidroside meðhöndlaður hópur, Acteoside: Acteoside meðhöndluð hópur, Ísóakteósíð: ísóakteósíð meðhöndluð hópur,Echinacoside: hópur meðhöndlaður með echinacoside. ** p < {{0}}.01="" á="" móti="" ómeðhöndluðum="" hópi;="" #="" p="">< 0.05,="" á="" móti="" h2o2="" meðhöndluðum="" hópi="" (án="" nrf2="" sirna="" meðhöndlaðs),="" ##="" p="">< 0,01,="" á="" móti="" h2o2="" meðhöndluðum="" hópi="" (án="" nrf2="" sirna="" meðhöndluð);="" &="" p="">< 0,05="" á="" móti="" h2o2="" meðhöndluðum="" hópi="" (með="" nrf2="" sirna="" meðhöndlaður),="" og="" p="">< 0,01,="" á="" móti="" h2o2="" meðhöndluðum="" hópi="" (með="" nrf2="" sirna="">

2.4. PhGs sneru við H2O2-Valdi niðurstýringu próteintjáningar HO-1, NQO1, GCLC og GCLM

HO{{0}}, NQO1 og glútamat-cystein lígasi (GCL) eru mikilvæg frumu andoxunarensím og HO-1, NQO1 og hvata eða breyta undireiningar GCL (GCLC eða GCLM) eru Nrf2-stýrðu genum á eftir [27]. Próteintjáning HO-1, NQO1, GCLC og GCLM sást eftir meðferð. Augljós munur fannst á próteintjáningu HO-1 og NQO1 með eða án H2O2 (Mynd 6A-C) (p < 0.01).="" phgs="" (0.1="" og="" 10="" p^g/ml)="" sneru="" við="" h2o2-framkallaðri="" niðurstýringu="" próteintjáningar="" ho-1="" (nema="" salidroside="" við="" {{32}="" },1="" pg/ml),="" nqo1="" (nema="" akteósíð="" við="" 0,1="" pg/ml)="" (p="">< 0,01).="" h2o2="" minnkaði="" einnig="" gclc="" og="" gclm="" prótein="" tjáningu="" (p="">< 0,05)="" (mynd="" 6a,d,e).="" phgs="" (0,1="" og="" 10="" pg/ml)="" sneru="" við="" h2o2-örvaði="" niðurstýringu="" próteintjáningar="" gclc="">echinacosidevið {{0}}.1 pg/mL) (p < 0.01)="" og="" gclm="" (nema="" salidroside="" við="" 0.1="" pg/ml)="" (="" p="">< 0.01).="" síðan="" voru="" efnahemlar="" fyrir="" ho-1="" notaðir="" til="" að="" meta="" frekar="" hlutverk="" andoxunarensímanna="" við="" að="" stjórna="" vernd="" phgs="" gegn="" h2o2-framkallaðri="" frumueiturhrifum.="" phgs="" (0,1="" og="" 10="" pg/ml)="" komu="" í="" veg="" fyrir="" h2o2-framkallað="" frumueiturhrif,="" en="" slíkum="" verndaráhrifum="" var="" snúið="" við="" með="" ho-1="" hemli="" znpp="" (p="">< 0,01)="" við="" 20="" pm="" (mynd="" 6f,="" p="">< 0,01)="">

2.5. Keap1 tjáning og sameindatengingargreining

Við lífeðlisfræðilegar aðstæður virkar Keap1 sem bælingaprótein Nrf2 með því að bindast Neh2 léninu í Nrf2 og miða Nrf2 á Cul3-byggðan E3 ubiquitin ligasa fyrir ubiquitination og síðari niðurbrot af 26S próteasómi [28]. Bindingageta við Keap1 af PhGs var metin með sameindatengingargreiningu til að kanna gangverkið undir andoxunaráhrifum þeirra.

3. Umræður

Við könnuðum taugavernd PhGs á H2O2 framkölluðum frumueiturhrifum í PC12 frumum. Niðurstöðurnar sýna að PhGs formeðferð bældi marktækt HzOz framkallaða frumueiturhrif, dró úr innanfrumu ROS stigi, bætti magn innanfrumu andoxunarensíma og sneri að lokum við H2O2-framkallað frumueiturhrif í PC12 frumum. Þar að auki jók PhGs umritunarvirkjun Nrf2, sneru við HzOz-framkallaðri niðurstýringu próteintjáningar HO-1, NQO1, GCLC og GCLM. Að auki sýndu PhG hugsanlega milliverkun við Nrf2 bindisæti í Keap1 próteininu.

Í H2O2-völdum skaða á PC12 frumum jók lípíðperoxun, sem vísar til oxunar niðurbrots lípíðs, gegndræpi himnanna, sem leiddi til frumuskemmda [29]. Myndun MDA er mikið notuð sem vísitala lípíðperoxunar [30]. H2O2 jók framleiðslu á ROS og tæmd andoxunarvarnarensím, svo sem SOD, katalasa og GPx. Þetta ferli leiðir til oxunarálags [31], sem gegnir lykilhlutverki í orsökum og framvindu meirihluta taugahrörnunarsjúkdóma. Í samræmi við fyrri rannsóknir sáum við aukið magn ROS, minnkuð innanfrumu andoxunarensím og aukið frumudauða PC12 frumna eftir H2O2 meðferð. PhGs formeðferð dró verulega úr HzOz völdum aukningu á innanfrumu ROS, bætti innanfrumu andoxunarensím og sneri að lokum við HzOz völdum frumueiturhrifum í PC12 frumum.

Kuang o.fl. [32] greindi frá þvíechinacosidesýndi marktæk taugaverndandi áhrif á H2O2-framkallað frumueiturhrif í PC12 frumum í gegnum hvatbera apoptotic ferli. Í þessari rannsókn komumst við að því að echinacoside, salidroside, acteoside og isoacteoside sýndu taugaverndandi áhrif með því að auka andoxunarvirkni PC12 frumna vegna þess að þau juku umritunarvirkjun Nrf2 og stýrðu niðurstreymis próteintjáningu HO-1, NQO1, GCLC og GCLM. Fjölmargar rannsóknir hafa greinilega sýnt fram á að virkjun Nrf2 markgena, einkum HO-1, í stjarnfrumum og taugafrumum verndar sterklega gegn bólgu, oxunarskemmdum og frumudauða. Greint hefur verið frá því að HO-1 kerfið sé mjög virkt í miðtaugakerfinu og mótun þess virðist gegna mikilvægu hlutverki í meingerð taugahrörnunarsjúkdóma [33]. Nýlegar rannsóknir skýrðu einnig hlutverk Nrf2 í framvindu og hættu á PD [9] og Keap1 sem skilvirkt markmið fyrir endurvirkjun Nrf2 í AD [34]. Niðurstöðurnar styðja nýjar vísbendingar um Nrf2 sem meðferðarmarkmið í taugahrörnunarsjúkdómum.

Sameindatengingargreining sýndi að PhGs gætu tengst Keap1, með eftirfarandi bindingargetu:echinacoside>isoacteoside > acteoside > salidroside. Í samræmi við þessar niðurstöður leiddi formeðferð PhGs til Nrf2 kjarnaflutnings, með eftirfarandi Nrf2 tjáningu í kjarnanum:echinacoside>isoacteoside * acteoside > salidroside. Við gerðum ráð fyrir að fjöldi glýkósíða hefði áhrif á mögulega bindiaðferð PhGs og Keap1, og bindihamurinn olli enn frekar losun Nrf2 frá Keap1. Þetta ferli leiddi til virkjunar á Nrf2 og genum í aftanstreymi og verndar að lokum PC12 frumur gegn H2 O 2 -framkallað oxunarálag.

4. Efni og aðferðir

4.1. Efnasambönd og hvarfefni

Salidroside (CAS nr. 10338-51-9), akteósíð (CAS nr. 61276-17-3), ísóakteósíð (CAS nr. 61303-13-7) ogechinacoside(CAS nr. {{0}}) voru keyptir frá YYuanye Biotechnology Company (Shanghai, Kína). PhGs voru leyst upp í PBS til að framleiða 10 mg/ml stofnlausn, sem var geymd við -20 gráðu. H2O2 var keypt frá Aladdin® (Shanghai, Kína). RPMI-1640 miðlungs og nautgripasermi var keypt frá Hyclone (Logan, UT, Bandaríkjunum) og 0,5 prósent trypsín EDTA, penicillín og streptómýsín voru keypt frá Keyi (Hangzhou, Kína). MDA, SOD greiningarsett, MTT og DCFH-DA voru keypt frá Beyotime Institute of Biotechnology (Nanjing, Jiangsu, Kína). Annexin V-FITC/PI tvöfalt litunarsett var keypt frá Solarbio Life Sciences (Beijing, Kína). Mótefni gegn Nrf2, Histon H3, Keap1, HO-1, NQO1, GCLC, GCLM og p-aktíni, and-mús-piparrótarperoxíði (HRP) IgG og and-kanínu-HRP-IgG voru keypt frá Abcam (London, Bretland). Hemlar á HO-1 og ZnPP voru keyptir frá Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, Bandaríkjunum). RNAiso Plus, PrimeScript™RT hvarfefnissett með gDNA Eraser og SYBR® Premix Ex Taq™ II voru keypt frá Takara (Shiga, Japan). Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent var keypt frá Thermo Fisher Scientific (Waltham, Bretlandi). Nrf2 siRNA raðirnar voru sem hér segir: áfram, CCGAAUUACAGUGUCUUAA; og afturábak, UUAAGACACUGUAAUUCGG. Á sama tíma voru viðmiðunarraðir siRNA sem hér segir: áfram, UUCUCCGAACGUGUCACGU; og afturábak, ACGUGACACGUUCGGAGAA.

4.2. Frumumenning

Nýrnahettufrumukrabbameinslína (PC12 frumur) var fengin frá Institute of Biochemistry and Cell Biology, SIBS, (CAS, Shanghai, Kína). Frumunum var haldið í RPMI-1640 (Hyclone) sem innihélt 10 prósent nautgripafóstursermi (Hyclone), 100 U/mL penicillín og 0,1 mg/mL streptomycin við 37 gráður með 5 prósent CO2. Skipt var um miðil annan hvern dag.

4.3. Cell Viability Assay

PC12 frumum var sáð í 96-brunnsplötur með 2 x 104 frumum/brunn. Eftir viðhengi voru frumur forræktaðar með eða án hemils í 20 mínútur, ræktaðar með eða án PhGs í 24 klukkustundir og síðan ræktaðar með H2O2 í aðrar 2 klukkustundir eftir að PhGs voru fjarlægðar. Eftir ræktun voru frumurnar meðhöndlaðar með 5 mg/ml MTT í 4 klst við 37 gráður og miðillinn fjarlægður varlega. Formazan kristallarnir sem höfðu myndast af eftirlifandi frumum voru leystir upp í 150 rL af DMSO til að mynda bláan lit [35] og gleypni var mæld við 570 nm á plötulesara. Viðmið notuðu sama styrk miðils með DMSO einu sér. Frumulífvænleiki var staðlaður sem hlutfall viðmiðunar.

Styrkur PhGs (0.1,1,5 og 10 Rg/mL) var valinn eftir frumeiturhrifagreiningu PhGs og tilkynnt um frumuverndandi áhrif echinacosides [32]. Samkvæmt skýrslunni voru engin frumudrepandi áhrif sýnd undir 10 Rg/ml, og echinacoside sýndi frumuverndandi áhrif í HzOz-slösuðu frumulíkani.

4.4. Apoptosis próf

Apoptosis greindist með Annexin V-FITC/PI tvöföldu litunarsetti (Solarbio). PC12 frumum var sáð í 6-brunnsplötur með 2 x 105 frumum/brunn. Eftir viðhengi voru frumur meðhöndlaðar með PhGs (0,1 og 10 Rg/ml) í 24 klst og ræktaðar með H2O2 í aðrar 2 klst eftir að PhGs voru fjarlægðar. Eftir ræktun voru frumurnar þvegnar í köldu PBS, skilið í skilvindu tvisvar við 1500 snúninga á mínútu í 10 mínútur og endursviflausnar í 500 rL af bindijafnalausn. FITC-merkt Annexin V (5 rL) og própidíumjoðíð.

4.5. Mæling á innanfrumu ROS, MDA framleiðslu og SOD

Innanfrumu ROS-stigið var ákvarðað með því að nota ROS-næma flúrljómandi rannsaka, þ.e. 2,7-díklórdíhýdró flúrljómandi díasetat (DCFH-DA). PC12 frumum var sáð í 6-brunnsplötur með 2 x 105 frumum/holu. Eftir viðhengi voru frumur meðhöndlaðar með PhGs (0,1 og 10 卩g/ml) í 24 klst og ræktaðar með H2O2 í aðrar 2 klst eftir að PhGs voru fjarlægðar. Eftir ræktun voru frumurnar þvegnar með PBS þrisvar sinnum og síðan ræktaðar með 10 µM DCFH-DA. Eftir ræktun við 37 gráður í 20 mínútur voru frumurnar þvegnar með PBS og þeim safnað með varlegri skilvindu. Innanfrumu ROS var mæld með Gallios™ flæðifrumumæli (Beckman Coulter, Brea, CA, Bandaríkjunum).

MDA og SOD voru mæld með prófunarsettum (Beyotime líftækni, Nanjing, Jiangsu, Kína). Allar aðferðir voru algjörlega í samræmi við leiðbeiningar framleiðenda. Innihald MDA og SOD var staðlað með samsvarandi heildarpróteininnihaldi.

4.6. Nrf2 Nuclear Translocation Immunofluorescence

PC12 frumunum var sáð í 6-brunn glerglas með þéttleikanum 2 x 105 í hverri brunn. Eftir viðhengi voru frumurnar meðhöndlaðar með PhGs (0.1 og 10 卩g/mL) í 24 klst og ræktaðar með H2O2 í aðrar 2 klst eftir að PhGs voru fjarlægðar. Eftir ræktun voru frumurnar þvegnar í köldu PBS og festar í 4 prósent paraformaldehýð í 15 mínútur við stofuhita, fylgt eftir með himnugegndræpi með því að nota 0,5 prósent Triton X-100 í PBS í 5 mínútur. Frumurnar voru ræktaðar með and-Nrf2 Rabbit IgG (Abcam) með 5 prósent FBS yfir nótt við 4 gráður. Síðan voru efri and-kanínumótefnin tengd við FITC sett á frumurnar í 20 mínútur við stofuhita. Kjarnarnir voru litaðir með 4z,6-diamidino-2-fenýlindóli (DAPI) í síðasta undirbúningsþrepinu. Glerurnar voru skolaðar í stutta stund með PBS, loftþurrkaðar og settar í and-flúrljómun í dofandi miðli. Glærurnar voru sýndar undir leysisfókus smásjá (LMS780, Zeiss, Þýskalandi).

4.7. Próteinútdráttur

PC12 frumunum var sáð í 100 mm diska með 1 x 107 frumum/skál. Eftir viðhengi voru frumurnar meðhöndlaðar með PhGs (0,1 og 10 卩g/mL) í 24 klst og síðan ræktaðar með H2O2 í aðrar 2 klst með fjarlægingu PhGs. Eftir ræktun voru frumurnar þvegnar tvisvar með köldu PBS og skafnar úr diskunum með 1000 µL af PBS. Frumujafnefni voru skilin í skilvindu við 1500 rpm í 10 mín. Eftir meðhöndlun voru frumuprótein dregin út með því að nota Beyotime RIPA frumulýsubuff með 1 mM PMSF samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Að auki voru umfrymis- og kjarnaprótein einangruð eins og lýst er í Beyotime kjarna- og umfrymisútdráttarsettinu. Próteinstyrkur sýnanna var greindur með Beyotime BCA próteingreiningarsetti og öll sýni voru geymd við -80 gráðu fyrir Western blot greiningu.

4.8. Western BlotAnalysis

Western blot greining var gerð með stöðluðum aðferðum. Í stuttu máli voru próteinsýni (20 eða 30 卩g) aðskilin með SDS-PAGE og flutt yfir á PVDF himnur. Himnur voru stíflaðar í 5 prósent mjólk-TBST og ræktaðar yfir nótt við 4 gráður í frummótefni. Meðal mótefna sem notuð voru voru Nrf2 (Abcam), Keap1 (Abcam), HO-1 (Abcam), NQO-1 (Abcam), GCLC (Abcam), GCLM (Abcam), Histone H3 (Abcam) og p-aktín (Abcam). Peroxidasa-tengd and-mús IgG (Abcam) eða anti-kanínu IgG (Abcam) var notað sem auka mótefni. Próteinböndin voru sýnd með því að nota ChemiScope röðina (Clinx Science Instruments, Shanghai, Kína). Grágildi próteinbanda var magnmælt með ImageJ (National Institute of Health, Bethesda, MD, Bandaríkjunum).

4.9. Magnbundin rauntíma PCR

Heildar-RNA var dregið út með því að nota RNAiso Plus (Takara, Shiga, Japan), eftir leiðbeiningum framleiðanda. Heildar RNA sýni voru öfug umrituð með PrimeScript™RT hvarfefnissetti með gDNA Eraser (Takara, Shiga, Japan) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Magntíma PCR var framkvæmd með því að nota SYBR® Premix Ex Taq™ II (Takara, Shiga, Japan) í Applied Biosystems ViiA™ 7 rauntíma PCR kerfi. Hlutfallsleg tjáning markgena var staðlað í p-Actin og greind með 2-AACt aðferðinni. Grunnraðir fyrir Nrf2 voru sem hér segir: áfram, ACAGTGCTCCTATGCGTGAA og afturábak, TCTGGGCGGCGACTTTAT. Grunnraðir fyrir p-aktín voru sem hér segir: áfram, GCTGTCCCTGTATGCCTCT; og afturábak, TTGATGTCACGCACGATTT.

4.10. siRNA Transfection

PC12 frumur voru ræktaðar í 6-brunn glerskyggnum með þéttleika 2 x 105 í hverri brunn (fyrir Western blot greiningu) eða í 96-brunn glerglas með þéttleika 2 x 104 í hverri brunn (fyrir frumu) hagkvæmnigreining). Viðmiðunar siRNA og Nrf2 siRNA voru færð inn í frumur með því að nota Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Eftir 24 klst ræktun voru frumurnar meðhöndlaðar með eða án PhGs og H2O2 í tilgreinda tíma og síðan notaðar í Western blot greiningu, qRT-PCR eða frumulífvænleikagreiningu eins og lýst er hér að ofan.

4.11. Sameindatengingargreining

Molecular docking analysis was performed to investigate the possible binding mode of PhGs to Keap1. The 3D structure of ligands was obtained from NCBI. The crystallized structure of Keap1 (PDB Code: 4L7B) was prepared using correcting structure issues (such as break bond and miss loop) using SYBYL-X 2.0. In this software simulation, crash represents the inadequate penetration between the protein and the ligand. Polar represents the hydrogen bonding and electrostatic interactions between the protein and the ligand. G-score [36] represents the hydrogen bonding, complex (ligand-protein), and internal (ligand-ligand) energies between the protein and the ligand. PMF-score [37] represents the Helmholtz free energy between the protein and the ligand. D-score [38] represents the charge and van der Waals interactions between the protein and the ligand. Chem-score [39] represents the hydrogen bonding, metal-ligand interaction, lipophilic contact, and rotational entropy, along with an intercept term between the protein and the ligand. C score represents the consensus score between the protein and the ligand, comprehensively reflecting the G, PMF, D, and Chem-scores. Tota-score reflects the binding capacity of the ligand to the protein. The best modes were generated and evaluated using the Total-score (>6) and C-score (>4).

4.12. Tölfræðigreining

Gögn voru greind með einstefnu ANOVA með LSD greiningu með SPSS. Allar niðurstöður voru staðfestar úr þremur sjálfstæðum tilraunum. Gögnin voru gefin upp sem meðaltal 土 SD. Tölfræðilega marktækur munur var talinn við p <>

Viðurkenningar: Þessi rannsókn var studd af National Major R & D Program í Kína (nr. 2017YFD0400200), Zhejiang Provincial Natural Science Foundation í Kína (nr. R15C200002), og sérverkefninu um áhættumat landbúnaðarafurðagæða (nr. GJFP2018015), landbúnaðar- og dreifbýlisráðuneyti Kína.

Framlög höfunda:Baiyi Lu og Maiquan Li hönnuðu rannsóknina. Maiquan Li vann rannsóknarstofuvinnuna, gagnagreininguna og skrifaði greinina. Maiquan Li, Tao Xu, Fei Zhou, Mengmeng Wang, Huaxin Song, Xing Xiao og Baiyi Lu endurskoðuðu handritið.

1 Landsverkfræðirannsóknarstofa í greindri matvælatækni og búnaði,

Lykilrannsóknarstofa fyrir landbúnaðarvörur Eftir uppskeru Meðhöndlun landbúnaðar- og dreifbýlisráðuneytisins, Lykilrannsóknarstofa fyrir landbúnaðarafurðir næringarmat landbúnaðar- og dreifbýlisráðuneytisins, Zhejiang lykilrannsóknarstofa fyrir landbúnaðar- og matvælavinnslu, Fuli Institute of Food Science, College of Biosystems Verkfræði og matvælafræði, Zhejiang University, Hangzhou 310058, Kína;

2 College of the First Clinical Medical, Guangzhou University of Chinese Medicine,

Heimildir

1. Sun, AY; Chen, YM Oxunarálag og taugahrörnunarsjúkdómar. J. Biomed. Sci. 1998, 5, 401-414.

2. Maheshwari, A.; Misro, MM; Aggarwal, A.; Sharma, RK; Nandan, D. Leiðir sem taka þátt í kímfrumumyndun í eistum framkallað af H2O2 in vitro. FEBS J. 2009,276, 870-881.

3. Halliwell, B. Hvarfgjarnar súrefnistegundir og miðtaugakerfið. J. Neurochem. 1992, 59,1609-1623.

4. Richardson, JS; Subbarao, KV; Ang, LC Um hugsanlegt hlutverk járn-framkallaðrar peroxunar í taugahrörnun í Alzheimerssjúkdómi. Ann. NY Acad. Sci. 1992, 648, 326-327.

5. Zhang, DD Vélrænar rannsóknir á Nrf2-Keap1 merkjaleiðinni. Drug Metab. Rev. 2006, 38, 769-789.

6. Itoh, K.; Tong, KI; Yamamoto, M. Sameindakerfi sem virkjar Nrf2-Keap1 feril í stjórnun á aðlögunarsvörun við raffílingum. Free Radic. Biol. Med. 2004, 36,1208-1213.

7. Kong, AN; Owuor, E.; Yu, R.; Hebbar, V.; Chen, C.; Hu, R.; Mandlekar, S. Framleiðslu útlendingafræðilegra ensíma með korta-kínasaferlinu og andoxunarefninu eða rafsækna svörunarþáttinum (ARE/EpRE). Drug Metab. Rev. 2001, 33, 255-271.

8. Buendia, I.; Michalska, P.; Navarro, E.; Gameiro, I.; Egea, J.; Leon, R. Nrf2-ARE ferill: Nýtt skotmark gegn oxunarálagi og taugabólgu í taugahrörnunarsjúkdómum. Pharmacol. Þr. 2016, 157, 84-104. [CrossRef] [PubMed]

9. Skibinski, G.; Hwang, V; Ando, ​​DM; Daub, A.; Lee, AK; Ravisankar, A.; Modan, S.; Finucane, MM; Shabby, BA; Finkbeiner, S. Nrf2 dregur úr LRRK2- og taugahrörnun af völdum a-synúkleíns með því að móta prótein. Frv. Natl. Acad. Sci. Bandaríkin 2016, 114, 1165-1170.

10. Jimenez, C.; Riguera, R. Fenýletanóíð glýkósíð í plöntum: Uppbygging og líffræðileg virkni. Nat. Framl. Rep. 1994, 11, 591-606.

11. Georgiev, M.; Alipieva, K.; Orhan, I.; Abrashev, R.; Denev, P.; Angelova, M. Andoxunarefni og kólínesterasa hamlandi virkni Verbascum xanthophoeniceum Griseb. og fenýletanóíð glýkósíð þess. Food Chem. 2011, 128, 100-105.

12. Li, N.; Wang, J.; Ma, J.; Gu, Z.; Jiang, C.; Yu, L.; Fu, X. Taugaverndandi áhrif Cistanches Herba Therapy á sjúklinga með miðlungs Alzheimer/s sjúkdóm. Evid.-Based Supplement. Varamaður. Med. 2015, 2015, 103985.

13. Liu, YL; Hann, WJ; Mo, L.; Shi, MF; Zhu, YY; Pan, S.; Li, XR; Xu, QM; Yang, SL Örverueyðandi, bólgueyðandi virkni og eiturefnafræði fenýletanóíð glýkósíða frá Monochasma savatieri Franch. fyrrverandi Maxim. J. Ethnopharmacol. 2013.149, 431-437.

14. Dong, Q.; Yao, J.; Fang, JN; Ding, K. Byggingareinkenni og ónæmisfræðileg virkni tveggja útdráttarhæfra fjölsykra úr köldu vatni frá Cistanche deserticola YC Ma. Kolvetni. Res. 2007, 342,1343-1349.

15. Xiong, L.; Maó, S.; Lu, B.; Yang, J.; Zhou, F.; Hu, Y.; Jiang, Y.; Shen, C.; Zhao, Y. Osmanthusfragrans blómaútdráttur og akteósíð vernda gegn d-galaktósa völdum öldrun í ICR músarlíkani. J. Med. Matur 2016, 19, 54-61.

16. Jiang, Y.; Maó, S.; Huang, W.; Lu, B.; Cai, Z.; Zhou, F.; Li, M.; Lou, T.; Zhao, Y. Phenylethanoid Glycoside Profiles og andoxunarvirkni Osmanthusfragrans Lour. Blóm eftir UPLC/PDA/MS og Simulated Digestion Model. J. Agric. Food Chem. 2016, 64, 2459-2466.

17. Li, X.; Já, X.; Li, X.; Sun, X.; Liang, Q.; Tao, L.; Kang, X.; Chen, J. Salidroside verndar gegn MPP plús af völdum frumudauða í PC12 frumum með því að hindra NO ferlið. Brain Res. 2011,1382, 9-18.

18. Zhang, L.; Ding, W.; Sun, H.; Zhou, Q.; Huang, J.; Li, X.; Xie, Y.; Chen, J. Salidroside verndar PC12 frumur gegn MPP plús-framkallaðri frumudauða með virkjun PI3K/Akt ferlisins. Food Chem. Toxicol. 2012, 50, 2591-2597.

19. Sheng, GQ; Zhang, JR; Pu, XP; Ma, J.; Li, CL Verndaráhrif verbaskósíðs á 1-metýl-4- fenýlpýridíníumjónavöldum taugaeitrun í PC12 frumum. Eur. J. Pharmacol. 2002, 451,119-124.

20. Wang, H.; Xu, Y.; Yan, J.; Zhao, X.; Sun, X.; Zhang, Y.; Guo, J.; Zhu, C. Acteoside verndar SH-SY5Y frumur taugafrumukrabbameins úr mönnum gegn beta-amyloid-völdum frumuskaða. Brain Res. 2009, 1283, 139-147.