Fenýletanóíð glýkósíð framkalla apoptosis í Eca-109 frumum í gegnum hvatberaháða brautina

Inngangur

Krabbamein í vélinda er ein af algengustu krabbameinstegundunum með 11. hæstu dánartíðni og 6. hæstu dánartíðni á heimsvísu og olli ~439,000 dauðsföllum árið 2015. Tíðni vélindakrabbameins er sérstaklega mismunandi eftir mismunandi svæðum, með austurhluta Asía og austur og suður Afríka sýna hæsta tíðni nýgengis og vestur Afríka með lægsta tíðni árið 2012. Í Kína voru áætlaðar vélindakrabbameinstilfelli og dánartíðni í vélinda 477,000 og 375,000, í sömu röð. , árið 2015. Þrátt fyrir að dánartíðni krabbameins í vélinda hafi minnkað í löndum með miðlungs- og há-miðja þjóðfélagsfræðilega vísitölu milli 2005 og 2015, er dánartíðnin enn há vegna slæmra horfa. Samsetning skurðaðgerðar með krabbameinslyfja- eða geislameðferð hefur verið notuð til að meðhöndla krabbamein í vélinda, hins vegar hefur verið greint frá því að á milli 2003 og 2014 hélst lifun 5-ára<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studysýndi fram á þaðCistanche tubulosa phenylethanoid glýkósíð(CTPG) gæti bælt vöxt sortuæxla B16-F10 frumna in vitro og in vivo (24). Hins vegar takmarkar lélegur vatnsleysni CTPG sem áður var notaður lyfjaþróun. Þess vegna var vatnsleysanlegt CTPG (CTPG-W) notað og æxlishemjandi áhrif á vélindakrabbameinsfrumur (Eca-109) rannsökuð. Það var ákvarðað að CTPG-W gæti hamlað lífvænleika Eca-109 frumna skammtaháð með því að framkalla frumudauða í gegnum hvatberaháða feril.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA TIL AÐ BÆTTA KYNFERÐ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Efniviður og aðferðir

Dýr.

Kvenkyns C57BL/6 mýs (6-8 vikur, ~25 g) voru keyptar frá Beijing Laboratory Animal Research Center (Beijing, Kína) og vistaðar í hitastýrðum (25˚C), ljóshringum (12/ 12) Dýraaðstaða Xinjiang háskólans (Urumqi, Kína). Öll dýr fengu sýklalaust vatn og mat.

Frumulína og ræktun.

Vélindafrumulína í mönnum (Eca-109) var varðveitt af Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering (College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, Kína) og ræktuð í RPMI{{1} } miðlungs (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, Bandaríkjunum) bætt við 10% hitaóvirkjuð nautgripasermi (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, Kína), 1% L -glútamín (100 mM), 100 U/ml penicillín og 100 µg/ml streptomycin við 37˚C í rakaðri andrúmslofti sem inniheldur 5% CO2.

High-performance vökvaskiljun (HPLC).

CTPG-W (cat. nr. SGJG20170410) var keypt frá Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Shanghai, Kína). Helstu efnasambönd CTPG voru hæf og magngreind með HPLC samkvæmt fyrri rannsókn okkar (24). Í stuttu máli, HPLC var framkvæmt á ZORBAX SB-C18 súlu (250x4,6 mm; 5 µm) við 30˚C og skolað með 0,2% maurasýrulausn og metanóli sem byrjaði á 23%, þar sem 1 ml var bætt við á mín. í 45 mínútur þar til 31% er náð. Alls var 10 µl sýni sprautað og greindist við 330 nm. Echinacoside staðallinn var keyptur frá Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Kína) og acteoside staðallinn var keyptur frá Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Þýskalandi). Staðlarnir voru notaðir til að greina íhluti CTPG-W.

MTT próf.

Frumufjölgun var mæld með MTT prófi. Eca{0}} frumur voru sáðar inn í 96-brunnplötur með þéttleikanum 5x103 frumur í 100 µl RPMI{{5 }} miðill/brunnur og ræktaður við 37˚C í 24 klst., síðan meðhöndlaður með mismunandi styrkleika (0, 200, 400, 600 og 800 µg/ml) af CTPG-W eða 0,4% dímetýlsúlfoxíði (DMSO) í 24, 48 og 72 klst. DMSO var notað sem leysistýring (800 µg/ml CTPG-W sem inniheldur 0,4% DMSO). Cisplatín (20 µg/ml) var notað sem jákvæður samanburður. Í kjölfarið var flotinu hent eftir skilvindu við 225 xg í 5 mínútur við stofuhita og 100 µl MTT lausn (0,5 mg/ml í RPMI-1640 miðli án FBS) var bætt við hvern brunn og ræktuð við 37˚C í 3 h. Formazan kristallarnir sem mynduðust voru leystir upp í 200 µl DMSO. Optical density (OD) gildin voru mæld við bylgjulengd 490 nm með 96-brunnum örplötulesara (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, Bandaríkjunum). Hlutfallsleg lífvænleiki frumna var reiknaður út samkvæmt formúlunni: Frumulífvænleiki (%)=(ODmeðhöndluð/ODunmeðhöndluð)x100%. Formgerð Eca-109 frumna var skoðuð með öfugum flúrljómunarsmásjá (stækkun, x200) (Nikon Eclipse Ti-E; Nikon Corporation, Tókýó, Japan).

Fyrir fjölgun miltafruma voru C57BL/6 mýs aflífaðar með leghálsi og milta einangruð. Einfrumu sviflausnin var gerð og miltisfrumur sáð í 96-brunnsplötur með þéttleikanum 1x105 frumur/brunn í 100 µl RPMI-1640 miðli og síðan meðhöndlaðir með mismunandi styrk (0, 200, 400, 600 og 800 µg/ml) af CTPG-W í 24, 48 og 72 klst. við 37˚C með 5% CO2. Fjölgun miltisfrumna var mæld með MTT prófi, samkvæmt áðurnefndri siðareglur. Örvandi stuðull=Ómeðhöndlað/Ómeðhöndlað.

Mæling á apoptosis og frumuhringnum. Eca{{0}} frumur voru ræktaðar í 60 mm diskum með þéttleikanum 2,5x105 frumur/skál í 24 klst. og meðhöndlaðar með mismunandi styrk ({{31} }, 200, 400, 600 og 800 µg/ml) af CTPG-W eða 0,4% DMSO í 24 klst við 37˚C með 5% CO2. Frumum var safnað og litað með Annexin V-fluorescein ísóþíósýanati (FITC)/própíumjoðíði (PI) apoptosis Detection Kit (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Kína), samkvæmt samskiptareglum framleiðandans. Sýnum var safnað með frumuflæðismælingu (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, Bandaríkjunum) og greind með FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, Bandaríkjunum). Til að greina áhrif CTPG-W á frumuhringinn voru 2,5x105 Eca-109 frumur sáð í 60 mm ræktunardiskum og meðhöndlaðar með CTPG-W (0, 100, 200 og 400 µg/ml) eða 0,4 % DMSO í 24 klst við 37˚C með 5% CO2. Allar frumur voru teknar og skolaðar tvisvar með ísköldu PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), síðan festar í 70% ísköldu etanóli við 4˚C í 30 mín. Eftir þvott tvisvar með ísköldu PBS, voru frumur endursviflausnar í 300 µl PI/RNase litunarbuffi (BD Biosciences, San Jose, CA, Bandaríkjunum) í 10 mínútur við stofuhita. Frumuhringsdreifingin var greind með ModFit LT 3.0 hugbúnaðinum með frumuflæðismælingu (BD FACSCalibur).

NÁTTÚRLEGT CISTANCHE TUBULOSAAnti þreytuVernda lifur PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Greining á hvatberahimnugetu (Δψm) og hvarfefna súrefnistegundum (ROS).Til að greina Δψm voru Eca{{0}} frumur meðhöndlaðar með CTPG-W (0, 400, 600 og 800 µg/ml) eða 0,4% DMSO fyrir 24 klst. við 37˚C með 5% CO2, og litað með hvatberahimnugreiningarsettinu með JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, Kína), samkvæmt samskiptareglum framleiðanda, í 20 mínútur við 37˚ C. Eftir þvott tvisvar með JC-1 þvottabuffi (Beyotime Institute of Biotechnology), voru sýni endurleyst með 300 µl JC-1 þvottajafna og greind með frumuflæðismælingu (BD FACSCalibur). Flúrljómun JC‑1 litarefnis í Eca‑109 frumum sást einnig með öfugum flúrljómunarsmásjá (stækkun, x200; Nikon Eclipse Ti‑E). Til greiningar á ROS voru Eca-109 frumur meðhöndlaðar með CTPG-W (0, 400, 600 og 800 µg/ml) í 2, 4, 6, 12 og 24 klst. og litaðar með Reactive Oxygen Species Assay sett (Beyotime Institute of Biotechnology), samkvæmt samskiptareglum framleiðanda, í 20 mínútur við 37˚C. Eftir þvott þrisvar með ísköldu PBS var sýnum safnað með frumuflæðismælingu (BD FACSCalibur) og greind með FlowJo 7.6 hugbúnaði.

Mynd 1. Hæfnt eftirlit með CTPG-W. Íhlutir CTPG-W voru eigindlega og megindlega greindir með hágæða vökvaskiljun og bornir saman við staðla echinacoside og acteoside. CTPG-W, vatnsleysanleg phenylethanoid glýkósíð afC. tubulosa.

2,2-dífenýl-1-píkrýlhýdrasýl (DPPH) radical virkni. Sindurefnahreinsandi virkni CTPG-W var ákvörðuð með DPPH sindurefnaprófi í samræmi við birtar samskiptareglur með minniháttar breytingu, þar sem metanóli var skipt út fyrir etanól til að leysa upp DPPH (25,26). Fyrir jafnvægismælingar var 150 µl DPPH (100 mmól/l) í etanóli blandað saman við mismunandi styrkleika CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 og 600 µg/ml) í 50 µl PBS, og ræktað í myrkri í 30 mínútur við stofuhita. Gleypið við 517 nm greindist í nærveru og fjarveru CTPG-W. Alls var 50 µl C-vítamín notað sem jákvæður samanburður. DPPH radical scavenging virkni var reiknuð út með formúlunni: Scavenging (%)=[1-(Asample-Ablank)/A0] x100, þar sem Ablank er gleypni viðmiðunar (án DPPH), Asample er gleypni sýnisins og A0 er gleypni PBS með DPPH.

Western blot greining. Eca{{0}} frumur voru meðhöndlaðar með CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) eða 0,4% DMSO í 24 klst við 37˚C með 5% CO2. Eftirfarandi þvott tvisvar með PBS, frumur 

Mynd 2. Áhrif CTPG-W á vöxt Eca-109 frumna og miltisfrumna. (A) Eca-109 frumur voru meðhöndlaðar með mismunandi styrk af CTPG-W í 24, 48 og 72 klst, og síðan var lífvænleiki frumna greindur með MTT prófi. (B) Formfræðilegar breytingar á Eca-109 frumum við CTPG-W meðferð eftir 24 klst. (C) Miltfrumur C57BL/6 músa voru meðhöndlaðar með mismunandi styrk af CTPG-W í 24, 48 og 72 klst., og síðan var fjölgunin greind með MTT prófi.**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

voru greind í Radioimmunoprecipitation Assay Lysis buffer (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Peking, Kína) í 20 mínútur á ís. Eftir skilvindu við 10,000 xg í 10 mínútur við 4˚C, var flotinu safnað og próteinstyrkur greindist með bicinchoninsýrusetti (Thermo Fisher Scientific, Inc.) samkvæmt samskiptareglum framleiðanda. Western blot greining var gerð samkvæmt fyrri lýsingu okkar (24). Mótefnin gegn caspasa-7 (cat. nr. D120077), caspase-8 (cat. nr. D155240), caspase-9 (cat. nr. D220078), B-frumu eitilæxli{ {13}} (Bcl-2) tengdur X (Bax) (cat. nr. D220073) og Bcl-2 (cat. no. D260117), og and-mús IgG-piparrótarperoxíðasa (HRP) ) (cat. nr. D111050) og anti-kanínu IgG-HRP (cat. no. D110058) voru keyptir frá BBI Life Sciences (Shanghai, Kína). Mótefnin gegn kaspasa-3 (cat. nr. E-AB-10050) og virka caspasa-3 (cat. no. E-AB-22115) voru keypt frá Elabscience ( Wuhan, Kína). Önnur mótefni gegn kaspasa-7 (cat. nr. 9492), poly (ADP-ríbósa) pólýmerasa (PARP) (cat. nr. 9542), cýtókróm c (cat. nr. AC909), c-Jun NH{ {37}}endakínasi (JNK) (cat. nr. 9252S) og -actin (cat. no. 58169) voru fengin frá Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, Bandaríkjunum). Öll frum- og aukamótefni voru þynnt í 1:1,000. Aðalmótefnin voru ræktuð við 4˚C yfir nótt og efri mótefnin ræktuð við 37˚C í 1 klst.

Mynd 3. Frumufrumumyndun Eca-109 frumna framkölluð af CTPG-W. Frumur voru meðhöndlaðar með mismunandi styrk af CTPG-W í 24 klst. (A) Æfðu og drepandi Eca-109 frumurnar voru greindar með frumuflæðismælingu. Efri spjaldið sýnir einstaka punktaplott og neðri spjaldið sýnir samantektargögnin. *P<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

Markpróteinin voru greind með því að nota aukið efnaljómunargreiningarsett (Beyotime Institute of Biotechnology), samkvæmt samskiptareglum framleiðandans.

Tölfræðileg greining. Tölfræðileg marktækni var reiknuð út með einhliða dreifnigreiningu með Tukey's post hoc prófi og niðurstöður voru greindar með GraphPad Prism 5.0 hugbúnaði (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) meðal meðferðar- og samanburðarhópa. Öll gögn voru sett fram sem meðaltal ± staðalfrávik. P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

CISTANCHE TUBULOSA ÚTDRÆT TIL AÐ BÆTTA NÝRAVERK PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Niðurstöður

CTPG-W bælir vöxt Eca-109 frumna.

Íhlutir CTPG-W voru hæfir og magngreindir með HPLC (mynd 1), sem voru bornir saman við staðla echinacoside og acteoside. Samkvæmt hámarksvistunartímanum og toppsvæðunum innihélt CTPG-W 39,16% af echinacoside og 2,44% af acteoside. Í fyrsta lagi voru áhrif CTPG-W á lífvænleika Eca-109 frumna ákvörðuð með MTT prófi. CTPG-W var leyst upp í DMSO við 200 mg/ml og þynnt með RPMI-1640 miðli sem innihélt 10% hitaóvirkjað FBS í tilgreindan styrk. Eca-109 frumur voru meðhöndlaðar með CTPG-W og lífvænleiki frumna var greind með MTT prófun á tilgreindum tímapunktum. CTPG-W meðferð dró verulega úr lífvænleika Eca-109 frumna á skammta- og tímaháðan hátt (P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

Mynd 4. Áhrif CTPG-W á frumuhringsdreifingu í Eca-109 frumum. Mismunandi styrkur CTPG-W var notaður til að meðhöndla Eca-109 frumur í 24 klst og frumuhringsdreifing var greind með frumuflæðismælingu. *P<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

CTPG-W framkallar frumudauða í Eca-109 frumum. Til að kanna hvort CTPG-W bæli vöxt Eca-109 frumna með framköllun frumudauða eða dreps, voru frumur meðhöndlaðar með mismunandi styrk af CTPG-W. Eftir 24 klst. greindust frumufrumur og drep Eca-109 frumna með Annexin V/PI litun. Eins og sýnt er á mynd 3A voru Annexin V-/PI+ frumur hliðaðar sem drepfrumur og Annexin V+/PI+ og Annexin V+/PI- frumur voru hliðaðar sem apoptotic frumur. CTPG-W framkallaði fyrst og fremst frumuddrun Eca-109 frumna á skammtaháðan hátt, þó að drepandi Eca-109 frumur hafi einnig aukist verulega við meðferð með 600 og 800 µg/ml CTPG-W (P<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

CTPG-W framkallar frumuhringsstopp í S fasa í Eca-109 frumum. Truflun á krabbameinsfrumuhringnum mun bæla frumuvöxt og stuðla að frumudauða (27). Dreifing frumuhringsins í Eca-109 frumum greindist með PI litun eftir CTPG-W meðferð í 24 klst. Í ljós kom að frumum í S fasa fjölgaði og frumum í G0/G1 fasa bentu til marktækrar minnkunar í heild við CTPG-W meðferð (P<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG-W minnkar Δψm og framkallar losun cýtókróm c. Apoptosis er hægt að framkalla með hvatberaháðum ferli (28,29). Pro- og and-apoptotic meðlimir BCL-2 próteinfjölskyldunnar gegna mikilvægu hlutverki í stjórnun á heilleika hvatberahimnu (30,31). Eftir CTPG-W meðferð í 24 klst. var Δψm metið með JC‑1 litun. JC‑1 safnefni (rauð flúrljómun greinist í FL‑2) mun sundrast í einliða (græn flúrljómun greind í FL-1) þegar Δψm er að minnka (32). Eins og sýnt er á mynd 5A, jókst tíðni FL-1+ FL-2-/+ frumna verulega á skammtaháðan hátt, sem gefur til kynna að Δψm Eca-109 frumna hafi minnkað. Flúrljómunarbreytingar í Eca-109 frumum sáust einnig með öfugum flúrljómunarsmásjá (mynd 5B). Með auknum styrk CTPG-W minnkaði rauða flúrljómunin og græna flúrljómunin jókst, sem er í samræmi við gögn úr frumuflæðismælingum. Það kom einnig fram að magn cýtókróm c í umfrymi var sérstaklega aukið (mynd 5C), sem er afleiðing af lækkun á Δψm. Þetta styrkir þá ályktun sem dregin er af aukinni fjölda FL-1+ FL-2-/+ frumna að Δψm hafi minnkað vegna CTPG-W meðferðar. Greint hefur verið frá því að JNK geti stjórnað virkjun BCL-2 próteinfjölskyldunnar sem veldur losun cýtókróm c (33-35). Það var einnig ákvarðað að magn JNK var sérstaklega hækkað eftir CTPG-W meðferð (mynd 5C). Niðurstöðurnar bentu til þess að CTPG-W gæti framkallað frumuddrun Eca-109 frumna í gegnum hvatberaháða feril.

Mynd 5. Lækkun Δψm og uppstjórnun cýtókróm c og JNK. Eca-109 frumur voru meðhöndlaðar með mismunandi styrk af CTPG-W í 24 klst. (A) Δψm greindist með JC‑1 litun og sýni voru greind með frumuflæðismælingu. Einstaklingspunktalínurnar sýna breytingar á JC-1 flúrljómun. Tíðni FL-1+ FL-2-/+ frumna er sýnd á neðri spjaldinu. ***P<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

Mynd 6. Magn ROS í Eca-109 frumum við CTPG-W meðferð og andoxunarvirkni CTPG-W. (A) Eca-109 frumur voru meðhöndlaðar með mismunandi styrk af CTPG-W og magn ROS var greint með frumuflæðismælingu á tilgreindum tímapunktum. *P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

Áhrif CTPG-W á innanfrumu ROS myndun.ROS gæti dregið úr Δψm til að framkalla apoptosis (36). Til að kanna hvort CTPG-W geti aukið ROS framleiðslu, voru Eca-109 frumur meðhöndlaðar með mismunandi styrk af CTPG-W. Frumum var safnað á tilgreindum tímapunktum og litaðar með DCFH-DA. Framleiðsla á innanfrumu ROS í Eca-109 frumum var ákvörðuð með frumuflæðismælingu. Eins og sýnt er á mynd 6A, jók 800 µg/ml CTPG-W marktækt ROS framleiðslu frá 2-6 klst. og minnkaði úr 12-24 klst. Að auki jók 400 µg/ml CTPG-W ROS framleiðslu verulega frá 12-24 klst. Ennfremur breytti 200 µg/ml CTPG-W ekki sérstaklega ROS framleiðslu. Dýnamískar breytingar á ROS-framleiðslu gætu tengst Eca-109 frumudreifingu. Það var einnig ákvarðað að CTPG-W hafði sindurefnahreinsandi virkni (mynd 6B), sem gæti tengst minni ROS framleiðslu í Eca-109 frumum sem voru meðhöndlaðar með 800 µg/ml CTPG-W eftir 12 klst.

Mynd 7. Magn klofna-kaspasa og klofins-PARP eftir CTPG-W meðferð. Prótein voru einangruð úr Eca-109 frumum sem voru meðhöndlaðar með CTPG-W í 24 klst og magn klofna-kaspasa og klofnaðs-PARP greindist með Western blot-greiningu. DMSO, dímetýl súlfoxíð; CTPG-W, vatnsleysanleg phenylethanoid glýkósíð afC. tubulosa; PARP, pólý (ADP-ríbósi) pólýmerasi.

CTPG-W hækkar virkni caspase-3, caspase-7, caspase-9 og PARP. Losun cýtókróm c vegna Δψm lækkunar gæti virkjað kaspasapróteasana til að framkalla frumudauða (29,30,37). Eftir CTPG-W meðferð í 24 klst. greindist virkjun kaspasa-3, 7, 8, 9 og PARP með Western blot greiningu. Samanborið við viðmiðunina, magn af klofnum-kaspasa-9, klofnu-kaspasa-7, klofnu-kaspasa-3 og klofnu-PARP, en ekki magn klofins-kaspasa{{20 }}, var stýrt upp með CTPG meðferð á skammtaháðan hátt (mynd 7). Þessar niðurstöður bentu til þess að CTPG-W minnkaði Δψm og stuðlaði að losun cýtókróm c til að virkja kaspasa sem framkalla frumufrumu Eca-109 frumna.

Umræða

Hefðbundin CHM gæti framkallað apoptosis krabbameinsfrumna í vélinda í gegnum mismunandi leiðir, þar á meðal ytri dauðaviðtaka, og innri streituferli í hvatberum og endoplasmic reticulum (29). Fyrri rannsókn okkar sýndi fram á að CTPG, sem aðalþáttur C. tubulosa, hindraði vöxt sortuæxla B16-F10 frumna með því að framkalla frumudauða í gegnum hvatberaháða feril (24). Í þessari rannsókn voru æxlishemjandi áhrif CTPG-W á Eca-109 frumur rannsökuð og komist var að því að CTPG-W bæli vöxt Eca-109 frumna, framkallaði apoptosis og frumuhringsstopp, minnkaði Δψm, jók losun cýtókróm c og virkjað kaspasa. CTPG og CTPG-W gætu framkallað apoptosis og frumuhringsstopp í krabbameinsfrumum. Hins vegar eru nákvæmar aðferðir mismunandi vegna mismunandi þátta CTPG (26,64% echinacoside, 10,19% acteoside og 1,71% isoacteoside) og CTPG-W (39,16% echinacoside og 2,44% acteoside). CTPG stöðvaði B16-F10 frumur í G0/G1 fasa, en CTPG-W stöðvaði Eca-109 frumur í S fasa (24). ROS framleiðsla jókst skammtaháð með CTPG, en hún gaf til kynna breytingu á tímaháðan hátt með háum skammti af CTPG-W, sem jókst verulega í upphafi CTPG-W meðferðar (2-6 klst.) og minnkaði marktækt eftir 12 klst, samanborið við samanburðarhópinn. Hugsanleg ástæða er sú að meginþáttur CTPG-W er echinacoside. Nokkrar rannsóknir greindu frá því að echinacoside gæti hamlað ROS-framleiðslu og ROS-framkallaða frumudauða til að beita taugaverndar- og öldrunaráhrifum sínum (38-40). Á sama hátt sást virkni sindurefnahreinsunar í þessari rannsókn. Þess vegna var getgátur um að sumir efnisþættir, þar á meðal verbascoside, iso-verbascoside og salidroside í stórum skömmtum af CTPG-W gætu tafarlaust valdið því að ROS myndun myndi valda frumuddreifingu Eca-109 frumna (41,42), og síðan ROS var hreinsað af echinacoside. Önnur möguleg ástæða fyrir muninum á ROS framleiðslu með CTPG og CTPG-W er að mismunandi frumulínur voru notaðar í þessari rannsókn og fyrri rannsókninni (24). Dong et al (43) greindu frá því að echinacoside gæti framkallað frumuddrun SW480 ristilkrabbameinsfrumna úr mönnum með því að mynda oxandi DNA skemmdir án þess að auka ROS gildi.

CTPG-W meðferð minnkaði Δψm og olli losun cýtókróm c, sem stuðlar að klofningu kaspasa-9 (28). Í samræmi við það var magn klofnaðs kaspasa-9 hækkað með CTPG-W meðferð. Í kjölfarið getur virki kaspasinn-9 virkjað kaspasann-3 til að framkalla frumudauða (44). Magn klofnaðs kaspasa-3 var einnig hækkað með CTPG-W meðferð. Hins vegar var kaspasi-8 ekki virkjaður af CTPG-W, sem gefur til kynna að ytri dauðaviðtakaferillinn hafi ekki tekið þátt í frumudauða sem CTPG-W framkallar. Þessar athuganir benda til þess að CTPG-W framkalli frumudauða Eca-109 frumna með því að virkja hvatberaháðan feril.

PARP gegnir mikilvægu hlutverki í erfðafræðilegum stöðugleika og hægt er að klofna það af virku kaspasunum, sérstaklega kaspasa-3 og -7 (45). Það var ákvarðað að CTPG-W meðferð virkjaði caspasa-3 og -7, sem gæti klofið PARP til að hamla DNA viðgerð og valdið frumudauða.

CTPG-W bælir einnig skammta- og tímaháð vöxt BEL-7404 frumna af lifrarfrumukrabbameini úr mönnum (óbirt gögn). Þó CTPG-W hamli vöxt Eca-109 og BEL-7404 frumna, stuðlar það að fjölgun miltisfrumna, sem gæti stafað af innihaldi fjölsykra (~50%) í CTPG-W (46) ). Á sama hátt hafa nokkrar rannsóknir greint frá því að fjölsykrur geti stuðlað að fjölgun miltisfrumna (46-49). Í músamódelinu var komist að því að CTPG-W jók miltavísitöluna marktækt, samanborið við samanburðarhópinn, en hafði ekki áhrif á líkamsþyngd og önnur líffærastuðul, þar á meðal hjarta, lifur, nýru og lungu (óbirt gögn), sem gefur til kynna að CTPG-W hafi engin frumudrepandi áhrif á eðlilegar frumur.

Samanlagt bentu gögnin til þess að CTPG-W hamli vexti Eca-109 frumna með því að framkalla frumufrumu í gegnum hvatberaháða feril

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA TIL AÐ BÆTTA KYNFERÐ PHGS75% ECH 30% ACT 12%