Pentraxín-3-miðlað viðbótarvirkjun í svínalíkani af blóðþurrð í nýrum/endurflæðisskaða

Tengiliður: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Netfang:audrey.hu@wecistanche.com

Chiara Divella o.fl

ÁSTANDUR

Pentraxín eru fjölskylda af þróunarfræðilega varðveittum mynsturþekkingarsameindum sem hafa lykilhlutverk í meðfæddu ónæmi og bólgu, svo sem mótun sýkla við bakteríu- og veirusýkingar. Sérstaklega hefur verið sýnt fram á að hið langa Pentraxin 3 (PTX3) stjórnar nokkrum þáttum æða- og vefjabólgu við líffæraígræðslu.

Rannsókn okkar kannaði hlutverk PTX3 sem mögulegs mótunartækis á komplementörvun í svínalíkani af nýrnablóðþurrð/endurflæðisskaða (I/R). Við sýndum fram á að I/R meiðsli olli snemma PTX3 útfellingum við peritubular og gaukla háræðastig. Confocal leysisskönnun smásjá leiddi í ljós að PTX3 útfellingar voru sambyggðar með CD31 plús æðaþelsfrumum. Að auki var PTX3 tengt íferðarátfrumum (CD163), dendritic frumum (SWC3a) og myofibroblasts (FSP1). Sérstaklega sýndum við fram á marktæka PTX3-miðlaða virkjun á klassískum (C1q miðluðum) og lektín (MBL miðluðum) ferlum Complement. Athyglisvert er að PTX3 útfellingar voru sambyggðar með virkjun lokakomplementfléttunnar (C5b-9) á æðaþelsfrumum, sem gefur til kynna að PTX3-miðluð komplementörvun hafi aðallega átt sér stað á æðastigi nýrna. Að lokum benda þessi gögn til þess að PTX3 gæti verið hugsanlegt meðferðarmarkmið til að koma í veg fyrir I/R skaða af völdum komplements.

Samskipti við:Giuseppe Castellano

Leitarorð:blóðþurrð/endurflæðisskaði, komplementkerfi, pentraxín 3,nýru, klassísk leið

Cistanche tubulosa kemur í veg fyrir nýrnasjúkdóm, smelltu hér til að fá sýnishornið

KYNNING

Blóðþurrð-endurflæði (I/R) skaði er aðal orsök bráðrarnýrumeiðslieftir ígræðslu og einkennist af marktækri virkjun á komplementkerfinu [1, 2]. Í þessari atburðarás gegna æðaþelsfrumur (EC) mikilvægu hlutverki í vanhæfðri viðgerð eftir I/R, sem leiðir til snemmbúins bandvefsmyndunar með æðaþels- til mesenchymal umskipti (EndMT) [3]. Á endurflæðisfasanum skipuleggur Complement ónæmis- og bólguferli, sem stuðlar að ýmsum ónæmis- og bólgusjúkdómum [2-5]. Aðrir nauðsynlegir þættir húmorarms meðfædda ónæmiskerfisins eru táknaðir með pentraxínum sem eru talin gegna lykilhlutverki í æðalíffræði [6].

Pentraxín eru fjölskylda margliða leysanlegra próteina [6] sem eru flokkuð í stuttar og langar fjölskyldur út frá uppbyggingu þeirra [7]. Þessi þróunarlega varðveittu prótein eru bráðfasa áhrifavaldar, sem þjóna sem skynjarar fyrir upphaf bólgu og hækka hratt í plasma við sýkingu [8]. Langa pentraxín 3 (PTX3) er leysanleg mynsturþekkingarsameind sem skiptir sköpum í meðfæddri ónæmisvörn og getur virkjað komplementkerfið [9-11].

Sérstaklega framkallaði PTX3 klassíska virkjun og lektínferil með því að bindast C1q, MBL, Ficolin -2 og getur haft áhrif á aðra leið í gegnum CFH [10-12].

Öfugt við önnur lifrarframleidd pentraxín í blóðrásinni (þ.e. CRP), getur PTX3 losnað af staðbundnum frumum á bólgusvæðinu, til dæmis frá einkjarna átfrumum, dendritic frumum, trefjakímfrumum og EC [9] sem verka á paracrine hátt [13]. PTX3 er einnig geymt í tilbúnu formi í daufkyrningum, staðbundið í sérstökum kyrnum og seytt sem svar við viðurkenningu á örveruhlutum [14]. Í EC er tjáning PTX3 auðveldlega framkölluð af TNF- og IL -1, sem gefur umskipti frá kyrrri, bólgueyðandi svipgerð, yfir í procoagulant og pro-inflammatory ástand, og stjórnar þar með mjög virkni öreinda [7, 8 ]. Af þeirri ástæðu hefur PTX3 stigum verið lýst semlangvarandinýrusjúkdómur, hækkun á próteinimagni PTX3 hefur verið í tengslum við lækkun GFR og fylgikvilla í hjarta- og æðakerfi, hins vegar er lítið enn vitað um hlutverk PTX3 í fyrstu stillingum sem I/R-framkallað bráðnýrumeiðsli [15, 16].

Hlutverk PTX3 í nýrnabólgusjúkdómum er tvígilt, frá hlið getur próteinið virkjað klassískar og lektínferlar sem stuðla að fyrstu bólgu og meiðslum [10-12]. Á hinni hliðinni dregur N-enda lén PTX3 mótaðrar komplementörvunar úr nýliðun hvítkorna og hamlaði millivefsvefjamyndun í bráðum nýrnaskaða sem stuðlaði að viðgerð vefja [17-20].

Komplement gegnir lykilhlutverki í meinalífeðlisfræði bráðs af völdum I/R áverkanýrumeiðsli[21, 22]. Í svínum líkani af nýrna I / R skaða, sýndum við lykilhlutverk virkjunar komplementkerfisins við að framkalla EndMT og snemma bandvefsmyndun, með þátttöku bæði klassískra og lektínferla [23]. Þar að auki sýndum við fram á að meðferðarhömlun á þessum komplementferlum með raðbrigða C1-INH (rhC1INH) framkallaði marktæka lækkun á útfellingu komplements, með minni nýliðun á íferðar bólgufrumum og pípluskemmdum [23]. Þessar niðurstöður voru einnig staðfestar af Delpech PO et al [24]; veruleg mótun á C1q, MASP og C4d gaukla- og pípluútfellingu var metin eftir 30 mínútur eftir endurflæði sem gefur til kynna aðalhlutverk C1-INH til að vinna gegn klassískum og lektínferlum.

Í þessari rannsókn könnuðum við mögulega þátttöku PTX3 í að miðla snemmbúinn komplement virkjun í nýrna I/R skaða, sem einkennir mismunandi frumuuppsprettur PTX3.

NIÐURSTÖÐUR

PTX3 er tjáð af æðaþelsfrumum og ónæmisíferðarfrumum í svínalíkani af I/R skaða

Í fyrsta lagi könnuðum við tilvist PTX3 í svínalíkani af heitum I/R-völdum nýrnaskaða. Við sáum mjög takmarkaða PTX3 útfellingar í venjulegum vef (Mynd 1A). I/R meiðsli olli dreifðri útfellingu PTX3 þegar 15 mín eftir endurflæði (Mynd 1B, 1C) á millifrumnasvæðinu (Mynd 1E), við peritubular háræðar (Mynd 1D; ör) og á gauklastigi (Mynd 1D). PTX3 útfellingar voru enn greinanlegar 1 klukkustund eftir endurflæði á stigi peritubular capillaries (Mynd 1G). Í fyrri verkum okkar [23] sýndum við fram á að helstu eiginleikar I/R skaða eru pípulaga þekjufrumna apoptosis og nýliðun íferðar bólgufrumna eins og einfrumur, dendritic frumur og eitilfrumur. Engu að síður, með venjubundnu vefjafræðilegu mati (aukamynd 1), sýndum við fram á að 30 mínútur af heitri blóðþurrð fylgt eftir af 15 mínútum af endurflæðisskemmdum snemma á millifrumum í píplum, sem einkennist af stærri háræðstíflu og staðbundinni umfrymistæmingu nýrnapípla þekju, samanborið við basal. ástandi.

Til að einkenna frumustaðsetningu PTX3 útfellinga frekar og meta hugsanleg áhrif þess á mótun bólgusvörunar og meiðsla, gerðum við tvöfalda ónæmislitun og confocal smásjárgreiningu. PTX3 próteintjáning greindist í flestum EC við peritubular (Mynd 2A) og gaukla (Mynd 2B) háræðastig, 15 mínútum eftir endurflæði.

Það er vel þekkt að I/R meiðsli einkennist af aukinni virkjun á meðfæddum og aðlögunarhæfum ónæmissvörunum, þar með talið flutningi á bólgufrumum inn í sjúkt líffæri sem eykur skaða enn frekar í gegnum ónæmisfrumur og komplementkerfið [25]. Í svínalíkani okkar sáum við líka, þegar 15 mínútum eftir endurflæði, þéttan bólguíferð sem samanstendur að mestu af átfrumum og dendritic frumum á píplum-millivefssvæðinu. Við komumst að því að báðar þessar frumur sem sýna mótefnavaka einkenndust af aukinni PTX3 tjáningu samanborið við T0 þar sem við sáum aukinn fjölda CD163 plús /PTX3 plús (Mynd 2E, 2F, 2K) og SWC3a plús /PTX3 plús (Mynd 2G, 2H, 2L) frumur við millivefsstig pípla við T15.

PTX3 tjáning getur stuðlað að EndMT í I/R meiðslum

Í fyrri athugunum sýndum við fram á að I/R meiðsli væri ábyrgur fyrir EndMT [26, 27], sem einkennist af töku á mesenchymal svipgerð með EC með tapi á sérstökum æðaþelsmerkjum og aukningu á mesenchymal merkjum, svo sem trefjakímsértækum. prótein 1 (FSP-1), taugafrumukadherín (N-cadherin) og alfa-slétt vöðvaaktín (alfa-SMA). Þannig könnuðum við hvort PTX3 tjáning með EC gæti haft áhrif á þetta ferli. Eins og búist var við, þegar við rannsökuðum alfa-SMA tjáningu, sem merki um virkjað vöðvafíbróblast, fundum við enga samstaðsetningu milli alfa-SMA og PTX3 (Mynd 2C, 2D). Þvert á móti sáum við aukningu á tubulointerstitial FSP1 plús /PTX3 plús myofibroblasts allt athugunartímabilið (Mynd 2K–2M).

PTX3 útfellingar tengjast virkjun komplement kerfisins

Að lokum könnuðum við hvort PTX3 útfellingar tengdust komplementörvun. Reyndar, eins og með aðra hluti af pentraxín fjölskyldunni, getur PTX3 stjórnað virkjun klassískrar komplementferilsins [7]. Til að skilgreina tengslin milli PTX3 og Complement virkjunar gerðum við tvímerkt ónæmisflúrljómun til að meta tjáningu PTX3 og endastöðina. Viðbótarkomplex, C5b-9, með því að nota mótefni sem beinist gegn C9-neoepitope. Við sáum marktæka samstaðsetningu PTX3 og C5b-9 útfellinga (Mynd 3A, 3B). Complement terminal complexið var staðbundið á peritubular stigi sem og innan peritubular capillaries ásamt æðaþelsfrumulaginu, eins og við sýndum áður [23, 28]. Þar sem PTX3 getur virkjað Complement kerfið í gegnum klassískan og lectin ferilinn, metum við útfellingu C1q og MBL í nýrnahlífum. Athyglisvert er að C1q (Mynd 3E, 3F) og MBL (Mynd 3C, 3D) fundust aðallega á millivefs- og háræðastigi (Mynd 3C til 3F), eins og áður hefur verið lýst [23] og sambyggðar með PTX3 útfellingum.

C1-hemill truflar PTX3-bindingu á æðaþelsfrumur

Í fyrri verkum okkar [23] sýndum við fram á að gjöf C1-hemla leiddi til marktækrar minnkunar á útfellingu komplements, með minnkaðri nýliðun á íferðar bólgufrumum og skaða á millifrumum í píplum. Þess vegna skoðuðum við magn PTX3 tjáningar í dýrum sem fengu rhC1-INH. Við komumst að því að innrennsli C1-hemils minnkaði PTX3 útfellingar við háræðar í kviðarholi og millivefsstig eftir 15 mínútur eftir endurflæði (Mynd 4A).

Þar að auki, til að styðja þá tilgátu að minnkun PTX3 útfellinga í rhC1-INH meðhöndluðum dýrum tengdist hömlun á æðaþelsskemmdum, gerðum við in vitro tilraunir og við metum rhC1-INH og PTX3 bindingu á ræktað EC við venjulegar aðstæður eða í viðurvist frumuálags (Mynd 4B). FACS greining sýndi að EC við eðlilegar aðstæður bindi ekki bæði rhC1-INH og PTX3. Í samræmi við fyrri rannsókn okkar [26] sáum við aukna frumubindingu rhC1-INH á H2O2-örvuðum EC samanborið við grunnskilyrði. Þar að auki, í fjarveru rhC1-INH, gæti PTX3 bundið virkjað EC. Athyglisvert er að þegar H2O2-virkjað EC var ræktuð með PTX3 og rhC1-INH, sáum við að C1INH gat verndað EC við að hindra PTX3 bindingu.

UMRÆÐA

Í þessari rannsókn sýndum við fram á útfellingu PTX3 á fyrstu stigum I/R nýrnaskaða og hugsanlegt framlag þess til þróunar EndMT. Athyglisvert er að við komumst að því að PTX3-miðluð Complement virkjun á sér stað aðallega á æðastigi, samstaða við C1q og MBL, viðurkenningarsameindir klassískra og lektínferla í Complement kaskadenum.

I/R meiðsli kallar fram áberandi bólgusvörun sem einkennist af Komplementvirkjun, súrefnislausum stakeindum og bólgueyðandi frumumyndun, sem leiðir til virkjunar æðaþels og útlægra hvítfrumna [29, 30]. Meðan á I/R meiðsli stendur, leiðir Complement virkjun til útfellingar komplementþátta á yfirborðshimnu skemmda og óvirkra EC, með samtímis myndun bráðaofnæmis og mögnunar á bólguferlinu [31]. Meðan á bólgu stendur eykst PTX3 hratt og gæti gegnt aðalhlutverki í að stilla æðaþelssvar. Reyndar hefur PTX3 verið gefið til kynna sem hugsanlegt lífmerki fyrir truflun á starfsemi æðaþels í nokkrum sjúkdómum, þar á meðal langvinnumnýrusjúkdómur, meðgöngueitrun og nokkrir æðasjúkdómar [7, 16, 17, 32]. Við sýndum einnig fram á að PTX3 tekur þátt í öðrum fylgikvillum í æðum eins og bilun í slagæðafistli hjá blóðskilunarsjúklingum [33]. Þessar athuganir benda til þess að PTX3 gæti verið brú á milli bólgusvörunar og truflunar á æðaþels [34]. Í samræmi við þessar rannsóknir sáum við PTX3 útfellingar á æðaþelsstigi þegar eftir 15 mínútur eftir endurflæði (Mynd 2A, 2B). Niðurstöður okkar sýndu einnig fram á að í upphafi I/R meiðsla kom PTX3 í stað með myofibroblast merkinu, FSP-1 (Mynd 2I, 2J) en ekki með alfa-SMA, merki sem tjáð er af virkjaðri myofibroblast (Myofibroblast, Mynd 2C, 2D). Samanlagt gætu þessi gögn bent til þess að truflun á starfsemi æðaþels og EndMT ferli [35], sem sést í I/R dýrum [26], hafi fyrst átt sér stað í EC sem tjáir PTX3.

Tengslin milli PTX3 og bólgufrumna eru víða viðurkennd. Í þessari grein beinum við okkur sérstaklega að eðlislægum áhrifum PTX3 í millivefsíferð hvítfrumna sem eru aðal uppspretta PTX3 [36]. Sérstaklega fundum við átfrumur og dendritic frumur, eftir 15 mínútur eftir endurflæði, sem tjáðu hærra magn af PTX3 (Mynd 2E til 2H). Þessi gögn eru í samræmi við aukinn fjölda sönnunargagna sem benda til mikilvægs hlutverks fyrir meðfædda friðhelgi við að miðla snemmbúinn skaða í I/R meiðslum [23]. Snemma virkjun Complement í nýrnavef eftir I/R skaða leiðir til myndunar nokkurra bólgumiðla sem auka nýliðun ónæmisfrumna [21, 23, 37, 38]. Nýlegar rannsóknir hafa bent á PTX3 sem einn af meginþáttum netsins sem skipuleggur bólgusvörun af völdum I/R meiðsla [39]. Í mismunandi tilraunalíkönum af I / R meiðslum getur PTX3 gegnt tvöföldum andstæðum hlutverkum á tilteknum vefjum [40, 41]. Snemma framleiðsla á PTX3 tengist nýrnaskemmdum þar sem það framkallar snemma tjáningu æðaþelsviðloðunarsameinda og efnafræðilegra efna sem flýta fyrir staðbundinni vanaðlagandi bólgusvörun.

Þvert á móti kemur langvarandi staðbundin framleiðsla PTX3 í veg fyrir of mikla líffærabólgu og vanstarfsemi [41].

PTX3 er Complement Cascade modulator [9, 42]; þetta er í samræmi við pleiotropic eiginleika PTX3 sem gefur til kynna tvöfalt hlutverk PTX3 sem mótunartæki eða magnari fyrir meðfædda ónæmissvörun [39]. Upphaflega virkjar PTX3 Complement með því að binda C1q og MBL [43]; þó þarf að takmarka snemma aukna bólgu við marksvæðið. Þess vegna gæti PTX3, með því að fá þátt H eða hamla æðamyndun, einnig dregið úr bólgusvörun og viðbót virkjun sem varðveitir nýrnakúlu frá bólguskemmdum [43]. Þrátt fyrir að komplement virkjun í I/R í nagdýrum sé aðallega staðbundin á pípulaga stigi [44], meðan á endurflæðisfasa stendur, er æðaþelið aðalmarkmið mismunandi bólgueyðandi efna, þar á meðal complement miðlara [2]. Við sýndum áður fram á að í svínalíkaninu af I/R meiðsli sem og hjá DGF sjúklingum, gerist virkjun Complement kerfisins í upphafi fasa, á peritubular capillaries, innan millivefsins og á gauklaæðaþeli [23]. Gögnin okkar sýndu skýra samstaðsetningu C5b-9 útfellinga á PTX3 plús EC eftir 15 mínútur eftir endurflæði (Mynd 3A, 3B). Þess vegna virðist nýrnaæðaþel vera ríkjandi staður PTX3-miðlaðrar komplementörvunar á fyrstu stigum I/R skaða bæði í forklínískum og klínískum aðstæðum.

Samspili pentraxína við C1q og hlutverki þess í virkjun klassískrar komplementferils er vel lýst [45-47]. Í samhengi við meðfædda ónæmissvörun getur PTX3 bundið mismunandi Complement íhluti og mótað Complement virkjun [43, 48]. PTX3 virkjar Complement með C1q bindingu [49]. Niðurstöður okkar í dýralíkaninu sýndu greinilega fram á að PTX3 gæti miðlað klassískri leiðarvirkjun með því að hafa samskipti við C1q (Mynd 3E, 3F). Þar að auki mótar PTX3 einnig lektínferil viðbótarinnar, eins og sýnt er á mynd 3C, 3D. MBL binst PTX3 í gegnum kollagenlíka lénið sitt [45] og MBL/PTX3 fléttur fá C1q og kalla fram C3 og C4 útfellingu á yfirborði markfrumna.

Alls benda þessar niðurstöður til aðalhlutverks PTX3 í miðlunnýruskaða í innri/r skaða, sem gæti haft mikilvægar afleiðingar fyrir complement-stýrða meðferð við nýrnaskaða.

Í fyrri rannsókn okkar [26] rannsökuðum við þátttöku komplements í að miðla EC virkjun með því að nota raðbrigðaform af C1-INH, öflugum hemli próteasa í klassískum og lektínkomplementferlum (C1r, C1 s, og MASP2). Í sama dýralíkani sýndum við (Mynd 4A) að meðferðarhömlun á báðum leiðum með rhC1INH dró úr PTX3 útfellingum við háræðar í kviðarholi og millivefsstigi eftir 15 mínútur eftir endurflæði. Þessi gögn staðfest með in vitro niðurstöðum á EC (Mynd 4B), leiddu til þess að við gerðum tilgátu um að rhC1INH gæti verndað skemmd EC við að hindra PTX3 bindingu. Í bókmenntum eru vísbendingar um bindingu C1-INH við æðaþelsviðloðunsameindir, tjáðar á virkjaðri æðaþeli, sem kallast selektín, einkum P og E-selektín [50, 51]. Þessi binding á EC getur truflað æðaþels-hvítfrumna samskipti meðan á bólgu stendur og hún táknar annan mikilvægan bólgueyðandi verkun [50, 51]. Þess vegna settum við fram tilgátu um að rh-C1INH geti bundið virkjað EC og miðlað staðbundinni stjórnun á komplementörvun og bólguferli. Í fyrri rannsóknum okkar höfum við sýnt fram á þátttöku komplements í I/R skaða og öðrum ónæmismiðluðum nýrnasjúkdómum [38, 52-54]. Aðferðir við viðbót virkjun í þessu dýralíkani gætu haft mikilvægar afleiðingar fyrir túlkun gagna sem búist er við í mannlegu umhverfi. Til að þróa með góðum árangri meðferðarúrræði sem miða að viðbót-virkjun [36, 54], er nauðsynlegt að staðfesta réttmæti svínagagna miðað við það sem gerist við klínískar aðstæður. Þar sem þessi rannsókn er takmörkuð við athugunarrannsóknir, er þörf á frekari tilraunum til að afmarka samtengda aðferðir milli PTX3 og Complement sem gætu varpa ljósi á nýjar meðferðaraðferðir. Út frá niðurstöðunum hér að ofan styðja gögn okkar þá tilgátu að PTX3 gæti stjórnað mörgum hliðum á komplementmiðluðum I/R meiðslum og þar með táknað hugsanlegt meðferðarmarkmið.

EFNI OG AÐFERÐIR

Nýrna I/R áverka svín líkan

Dýralíkanið af I/R nýrnaskaða var þróað eins og áður hefur verið lýst [23]. Eftir samþykki siðanefndar heilbrigðisráðuneytisins fóru 4-mánaðargamlar kvenkyns Stór hvít svín (n=8, n=4 fyrir hóp, 20 kg) í tilraunaaðgerð með opinni skurðaðgerð undir svæfingu. Dýrin föstuðu í 24 klukkustundir áður en svæfing var framkölluð. Stöðugt var fylgst með hjartalínuritinu, hjartsláttartíðni, blóðrauða súrefnismettun, öndunargassamsetningu, öndunartíðni, sjávarfallarúmmál, þrýsting í öndunarvegi, slagbilsslagæðaþrýstingi og miðbláæðaþrýstingi og skráð sjálfkrafa (Ohmeda Modulus CD; DatexOhmeda, Helsinki, Finnland) . Vinstri nýrnaslagæð og bláæð voru einangruð og æðalykkja sett utan um nýrnaslagæðina með rétthyrndri klemmu. Nýrnasýni var tekið fyrir blóðþurrð (T0). Síðan var blóðþurrðarfasinn framkallaður (30 mín) með því að toga í æðalykkjuna. Margar vefjasýni voru síðan gerðar 15, 30 og 60 mín eftir endurflæði; dýrum var fórnað 24 klukkustundum eftir skurðaðgerðina. Hluti af hverju vefjasýnissýni var strax snöggfrystur í ákjósanlegu skurðhitastigi (Tissuetek, Pittsburgh, PA) miðli og geymdur í fljótandi köfnunarefni. Annar skammtur var festur í jafnaðri formalíni (4 prósent) í 12 klukkustundir og felldur inn í paraffín með stöðluðum aðferðum.

Smásjárrannsókn

Parafín-innfelld nýrnasýni úr nýrnasýnum voru notuð til hefðbundinnar vefjalitunar (H&E, periodic acid-Schiff). Myndir voru teknar af Aperio ScanScope CS2 tæki (Aperio Technologies, Vista, CA, Bandaríkjunum). Tubulus-millivefsskemmdir og gauklaskemmdir voru metnar með eigindlegri greiningu tveggja áheyrnarfulltrúa (CD, MR) sem vissu ekki um upprunann

Mótefni

Aðal mótefnin sem notuð voru í þessari rannsókn þekktu eftirfarandi mótefnavaka: PTX3 (MNB4: beint gegn PTX3 N-enda léni, Exira Life Sciences In., Larsen, Sviss); CD163 (einfrumur/átfrumur, US Biological, Swampscott, MA); SWC3a (dendritic frumur, [55] 74-22-15A, BD Biosciences); FSP1 (fibroblast specific protein 1, Abcam, Cambridge, Bretlandi); alfa-slétt vöðva aktín (Santa Cruz Biotechnology Inc.; Santa Cruz, CA, Bandaríkjunum); C1q (R9/2, AbDSerotec; Kidlington, Bretlandi); MBL (3E7: beint gegn MBL kolvetnaþekkingarsviði, Hycult líftækni, Uden, Hollandi) og C9 nýantigen (aE11, Hycult líftækni). Krosshvarfsemin var staðfest með því að forrækta sértæku mótefnin, fyrir notkun þeirra, með peptíðum úr mönnum sem notuð voru til að ala þau upp. Forræktunin afnam sérstaka litun á vefjum svína.

Ónæmisflúrljómun vefja og confocal laserskönnun smásjá

Lýsing og staðsetning PTX3 merkja var rannsökuð á frosnum vef sem var innifalinn í OCT miðli (Tissue-Tek). Glerurnar voru ræktaðar með 5 prósenta kanínusermi í 1 klukkustund við 37 gráður C. Glerurnar voru síðan ræktaðar í 1 klukkustund við stofuhita með sérstökum mótefnum. Eftir þrjá þvotta í PBS voru skyggnur síðan ræktaðar með viðeigandi aukamótefnum (Alexa Flour 488 og 555, Molecular Probes, Eugene, OR). Allir hlutar voru mótlitaðir með TO-PRO-3 (sameindarannsóknum). Neikvæð viðmið voru útbúin með óviðkomandi mótefnum. Hlutarnir voru greindir með Leica TCS SP2 (Leica, Wetzlar, Þýskalandi) confocal leysisskanna smásjá. Fjöldi íferðarfrumna var mældur í að minnsta kosti 10 hástyrk (x630) sviðum/hluta af tveimur óháðum athugunum sem blindaðir voru á uppruna glæranna. Lokatalningar voru meðaltal þessara tveggja mælikvarða. Í engu tilviki var breytileiki milli áhorfenda meiri en 20 prósent.

Frumuræktun og frumuflæðisgreining

Innþelsfrumur úr naflabláæð úr mönnum (HUVEC, EC) voru keyptar frá American Type Culture Collection (ATCC-LGC Standards, Sesto San Giovanni, Ítalíu). EC var ræktað í þeim miðli sem mælt er með, EndoGro (Merck Millipore, Darmstadt, Þýskalandi). EC var húðað með þéttleikanum 1{{10}},000frumur/cm2 og var örvað með H2O2 meðferð (3 prósent, 1 klukkustund). Síðan voru grunn- og örvuð EC þvegin tvisvar með PBS og fjarlægð með PBS-EDTA 2mM og trypsíni 0.001×. Síðan voru frumur endursviflausnar í PBS og ræktaðar með PTX3 (raðbrigða PTX3 úr mönnum, Sigma-Aldrich, Merck, Þýskalandi) (1 ug/ml) eða/og með rhC1-INH (Ruconest®, Pharming) (2,5 grömm) /ml) í 60 mín. Eftir þvott þrisvar með PBS 1X, voru frumur endursviflausnar í flæðisfrumumælingar (FACS) jafnalausn (fosfatbuffað saltvatn, pH 7,2, 0,2 prósent nautgripasermisalbúmíns og 0,02 prósent natríumazíð) og ræktaðar með FCR blokkandi hvarfefni (Miltenyi Biotec) fyrir 10 mín við stofuhita. Eftir blokkun voru ECs ræktuð með kanínu and-manneskju C1-INH (útvegað af prófessor M. Daha, University of Leiden, 1//100 þynningu) eða/og með rottu and-PTX3 (MNB4, Exira Life) Sciences In., 1/20 þynning) við stofuhita í 30 mínútur og þvegið með FACS jafnalausn. Síðan voru frumur ræktaðar með geita-anti-kanínu IgG PE (Molecular Probes, 1/100 þynning) eða/með and-rottu IgG FITC (Molecular Probes, 1/100 þynning) við stofuhita í 30 mínútur og þvegnar þrisvar sinnum. Frumur voru greindar með FC500 (Beckman Coulter, Brea, CA, Bandaríkjunum) og Kaluza hugbúnaði. Jákvæðnisvæðið var ákvarðað með því að nota ísótýpusamsvörun mAb og alls fengust 104 atburðir fyrir hvert sýni. Gerðar voru þrjár sjálfstæðar tilraunir.

tölfræðigreining

Gögnin eru sett fram sem meðaltal ± staðalfrávik (SD) og eru borin saman með dreifnigreiningu eða pöruðu t-prófi nemenda, eftir því sem við á. Mismunur var talinn tölfræðilega marktækur þegar p gildi voru minni en 0.05. Gögnin voru greind með Statview hugbúnaðarpakka (5.0 útgáfa) (SAS Inc. Co., Cary, NC, Bandaríkjunum). Línurit voru sýnd með GraphPad Prism Software 5.

Skammstafanir

I/R: blóðþurrð/endurflæði; EC: æðaþelsfrumur; PTX3: pentraxín 3; FSP-1: fibroblast-sértækt prótein 1; N-kadherín: taugafrumukadherín; alfa-SMA: alfa-slétt vöðva aktín.

HÖFUNDARFRAMLAG

CD samræmdi rannsóknina, tók þátt í ónæmismerkingu og confocal smásjárskoðun á nýrnaskurðum og samdi handritið. AS og RF tóku þátt í hönnun rannsóknarinnar, lögðu sitt af mörkum við gagnagreiningu, framkvæmdu in vitro tilraunir og endurskoðuðu handritið á gagnrýninn hátt. MR og GSN gerðu vefjameinafræðilega myndgreiningu. LL, FS, AMC framkvæmdu dýralíkanið af Blóðþurrð-endurflæðisskaða og hjálpuðu til við að endurskoða handritið. GL, PD og MB framkvæmdu allar skurðaðgerðir á svínlíkaninu og hjálpuðu til við að endurskoða handritið. MRD, P.vdP., C.vK. og FS endurskoðuðu handritið.

PP, ER, GG, GS og LG endurskoðuðu handritið á gagnrýninn hátt. GC útvegaði ný greiningartæki, hannaði og hafði umsjón með rannsókninni. CD, AS og RF áttu jafnt þátt í þessari rannsókn. Allir höfundar lögðu sitt af mörkum við greinina og samþykktu innsenda útgáfu.

VIÐTAKNINGAR

Við þökkum Claudiu Curci frá nýrna-, skilunar- og ígræðsludeild, neyðar- og líffæraígræðsludeild,

Háskólinn í Bari fyrir framúrskarandi tækniaðstoð.

Hagsmunaárekstrar

Höfundar lýsa því yfir að þeir hafi enga hagsmunaárekstra.

FJÁRMÁLUN

Þessi rannsókn var studd af háskólanum í Bari „Aldo Moro“, ítalska heilbrigðisráðuneytinu (GR 2016- 02362239 „A transcriptomics – based approach for the identity of predictive factors and therapeutic targets for seinked intact function in the transplantation).nýrutransplant recipients", Bando di Ricerca Finalizzata 2016, CD fékk námsstyrk fyrir þetta verkefni) og Fondo Sociale Europeo, Azione I.2 "Attrazione e Mobilità Internazionale dei Ricercatori"- AIM-1810057-virkni 2 veitt AS

HEIMILDIR

1. Bonventre JV, Yang L. Cellular pathophysiology of ischemic acutenýrumeiðsli. J Clin Invest. 2011; 121:4210–21.

2. Jang HR, Rabb H. Meðfædda ónæmissvörun við bráða blóðþurrðnýrumeiðsli. Clin Immunol. 2009; 130:41–50.

3. Ricklin D, Hajishengallis G, Yang K, Lambris JD. Viðbót: lykilkerfi fyrir ónæmiseftirlit og samvægi. Nat Immunol. 2010; 11:785–97.

4. Thurman JM, Holers VM. Aðalhlutverk hinnar óhefðbundnu viðbótarleiðar í sjúkdómum í mönnum. J Immunol. 2006; 176:1305–10. PMID: 16424154

5. Franzin R, Stasi A, Fiorentino M, Stallone G, Cantaluppi V, Gesualdo L, Castellano G. Bólgueyðandi og viðbótarkerfi: hlekkur á milli bráðaNýraMeiðsli og langvarandi ígræðsluskemmdir. Framan Immunol.

2020; 11:734.PMID:32457738

6. Deban L, Jaillon S, Garlanda C, Bottazzi B, Mantovani A. Pentraxín í meðfæddu ónæmi: lærdómur frá PTX3. Cell Tissue Res. 2011; 343:237–49.PMID:20683616

7. Cieślik P, Hrycek A. Long pentraxin 3 (PTX3) í ljósi uppbyggingar þess, verkunarmáta og klínískra afleiðinga. Sjálfsofnæmi. 2012; 45:119–28.PMID:21988562

8. Kunes P, Holubcova Z, Kolackova M, Krejsek J. Pentraxin 3(PTX 3): innræn mótandi bólgusvörunar. Mediators Inflamm. 2012; 2012:920517.PMID:22577258

9. Garlanda C, Bottazzi B, Bastone A, Mantovani A. Pentraxín á krossgötum milli meðfædds ónæmis, bólgu, fylkisútfellingar og frjósemi kvenna. Annu Rev Immunol. 2005; 23:337–66.115756PMID:15771574

10. Bottazzi B, Garlanda C, Cotena A, Moalli F, Jaillon S, Deban L, Mantovani A. Langa pentraxín PTX3 sem frumgerð húmoral mynstur viðurkenningarviðtaka: samspil við frumu meðfædd ónæmi. Immunol Rev. 2009; 227:9–18.PMID:19120471

11. Ma YJ, Doni A, Hummelshøj T, Honoré C, Bastone A, Mantovani A, Thielens NM, Garred P. Samvirkni milli fíkólíns-2 og pentraxíns 3 eykur meðfædda ónæmisþekkingu og bætiefnaútfellingu. J Biol Chem. 2009; 284:28263–75.PMID:19632990

12. Netti GS, Lucarelli G, Spadaccino F, Castellano G, Gigante M, Divella C, Rocchetti MT, Rascio F, Mancini V, Stallone G, Carrieri G, Gesualdo L, Battaglia M, Ranieri E. PTX3 mótar ónæmislogósu í æxli microenvironment og er forspárþáttur fyrir sjúklinga með tært nýrnafrumukrabbamein. Öldrun (Albany NY). 2020; 12:7585–602.PMID:32345771

13. Souza DG, Amaral FA, Fagundes CT, Coelho FM, Arantes RM, Sousa LP, Matzuk MM, Garlanda C, Mantovani A, Dias AA, Teixeira MM. Langa pentraxín PTX3 er mikilvægt fyrir vefjabólgu eftir

blóðþurrð í þörmum og endurflæði í músum. Am J Pathol. 2009; 174:1309–18.PMID:19286566

14. Jaillon S, Peri G, Delneste Y, Frémaux I, Doni A, Moalli F, Garlanda C, Romani L, Gascan H, Bellocchio S, Bozza S, Cassatella MA, Jeannin P, Mantovani A. Húmarmynsturviðtakinn PTX3 er geymt í daufkyrningakyrnum og staðsetur sig í utanfrumugildrum. J Exp Med. 2007; 204:793–804.PMID:17389238

15. Tong M, Carrero JJ, Qureshi AR, Anderstam B, Heimbürger O, Bárány P, Axelsson J, Alvestrand A, Stenvinkel P, Lindholm B, Suliman ME. Plasma pentraxín 3 hjá sjúklingum með langvinnanýrusjúkdómur: tengsl við nýrnastarfsemi, próteinorku, sóun, hjarta- og æðasjúkdóma og dánartíðni. Clin J Am Soc Nephrol. 2007; 2:889–97.PMID:17702732

16. Witasp A, Rydén M, Carrero JJ, Qureshi AR, Nordfors L, Näslund E, Hammarqvist F, Arefin S, Kublickiene K, Stenvinkel P. Hækkuð blóðrásarmagn og vefjatjáning pentraxíns 3 í þvagþvagi: endurspeglun á vanstarfsemi æðaþels. PLoS One. 2013; 8: e63493.PMID:23658833

17. Presta M, Camozzi M, Salvatori G, Rusnati M. Hlutverk leysanlega mynsturþekkingarviðtakans PTX3 í æðalíffræði. J Cell Mol Med. 2007; 11:723–38.PMID:17760835

18. Bottazzi B, Inforzato A, Messa M, Barbagallo M, Magrini E, Garlanda C, Mantovani A. Pentraxínin PTX3 og SAP í meðfæddu ónæmi, stjórnun bólgu og endurgerð vefja. J Hepatol. 2016; 64:1416–27.

19. Xiao Y, Yang N, Zhang Q, Wang Y, Yang S, Liu Z. Pentraxin 3 hindrar bráða nýrnaskaða af völdum millivefs bandvefs með bælingu á IL-6/Stat3 ferli. Bólga. 2014; 37:1895–901.PMID:24854162

20. Inforzato A, Reading PC, Barbati E, Bottazzi B, Garlanda C, Mantovani A. "Sætta" hliðin á löngu pentraxíni: hvernig glýkósýlering hefur áhrif á PTX3 virkni í meðfæddu ónæmi og bólgu. Framan Immunol. 2013; 3:407. PMID: 23316195