Nikótín í föðurætt eykur óttaminni, dregur úr nikótíngjöf og breytir erfða- og taugavirkni Hippocampus hjá afkvæmum

Tengiliður: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Netfang:audrey.hu@wecistanche.com

Lisa R. Goldberg1*|Dana Zeid1*|Munir Gunes Kutlu2|Robert D. Cole3|Valeria Lallai4|Aswathy Sebastian5|Istvan Albert5|Christie D. Fowler4|Vinay Parikh6|Thomas J. Gould1

1Department of Biobehavioral Health, Penn State University, University Park, Pennsylvania

2Department of Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine, Nashville, Tennessee

3College of Pharmacy, University of Kentucky, Lexington, Kentucky

4Department of Neurobiology and Behaviour, University of California Irvine, Irvine, California

5Lífupplýsingafræði, lífefnafræði og sameindalíffræði, Penn State University, University Park, PA

6Department of Psychology, Temple University, Philadelphia, Pennsylvania

Ágrip

Nikótínnotkun er enn mjög útbreidd með tóbaki og rafsígarettuvörum sem neytt er um allan heim. Hins vegar, vaxandi vísbendingar um erfðir milli kynslóða benda til þess að nikótínnotkun geti breytt hegðun og taugalíffræði í næstu kynslóðum. Við prófuðum áhrif langvarandi útsetningar fyrir nikótíni hjá föður í C57BL6/J músum á hræðsluskilyrði í F1 og F2 afkvæmum, sem og skilyrta óttaútrýmingu og sjálfsprottinn bata, sjálfsgjöf nikótíns, kólínvirka starfsemi hippocampus, RNA tjáningu og DNA metýleringu í F1 afkvæmi. Útsetning fyrir nikótíni hjá föður tengdist aukinni samhengis- og vísbendingum um hræðsluskilyrði og sjálfkrafa endurheimt slökktra óttaminninga. Ennfremur minnkaði styrking nikótíns hjá músum af músum af nikótínættum, eins og metið var í sjálfsstjórnarhugmynd. Þessar hegðunarsvipgerðir voru tengdar við breyttri svörun við nikótíni, stýrðri nikótínasetýlkólínviðtakabindingu hippocampus, minni framkölluðum hippocampal kólínvirkum straumum og breyttri metýleringu og tjáningu hippocampal gena sem tengjast taugaþroska og mýkt. Genatjáningargreining bendir til fjölkynslóðaáhrifa á breiðari genakerfi sem hugsanlega taka þátt í taugateygni og geðröskunum. Breytingarnar á hræðsluskilyrðum benda á svipaðan hátt til svipgerða sem eru hliðstæðar kvíðaröskunum sem líkjast áfallastreitu.

LYKILORÐ: kólínvirkur, hippocampus, nám, fjölkynslóð, nikótín, kynslóðaskipti

áhrif cistanche

1. INNGANGUR

Uppsafnaðar vísbendingar benda til þess að áhrif útsetningar fyrir misnotkunarlyfjum nái út fyrir einstaklinginn til að hafa áhrif á lífeðlisfræðilegar og hegðunarlegar svipgerðir hjá óútsettum afkvæmum.1-3 Lýsing á áhrifum nikótíns milli kynslóða er mikilvæg með tilliti til útbreiðslu tóbaksnotkunar4 og stóraukinnar aukningar rafsígarettunotkunar.5 Með áhrifum sínum á kólínvirk kerfi heilans veldur útsetning fyrir nikótíni verulegar breytingar á heilastarfsemi sem getur legið að baki nikótínfíkn og stuðlað að aukinni hættu á geðrænum kvillum, þar með talið þunglyndi6 og kvíða.7 Æfingafræðilegar breytingar eftir kólínvirka virkjun geta gera ráð fyrir viðvarandi áhrifum á frumu- og hringrásarvirkni.8,9 Þar til nýlega var talið að þessar epigenetic breytingar hafi verið þurrkaðar út við stofnun kímlínunnar og þannig bundnar frá síðari kynslóðum. Hins vegar geta erfðafræðilegar breytingar, þar með talið DNA-metýleringu, histón eftirþýðingarbreytingar og ókóðandi RNA, sem aflað er í einni kynslóð, erft í næstu kynslóð.10,11 Þessar erfðafræðilegu breytingar geta miðlað fjölkynslóða- og kynslóðaáhrifum af útsetningu foreldra nikótíns á hegðun afkvæma og taugalíffræði. .

Nagdýrarannsóknir frá mörgum, óháðum rannsóknarstofum hafa byrjað að bera kennsl á fjölkynslóða og kynslóðafjölda afleiðingar af útsetningu foreldra fyrir nikótín. Þessi vinna hefur hingað til greint áhrif af útsetningu foreldra fyrir nikótín á þunglyndis- og kvíðalíkar svipgerðir, 1 vitræna sveigjanleika, 2 athyglisbrest með ofvirkni (ADHD)-líka hegðun,3 og genatjáningu.1,2 Fjölkynslóða og kynslóðaskipti afleiðingar Útsetning fyrir nikótíni getur haft áhrif á innviðargerðir sem taka þátt í nikótínfíkn og geðheilbrigði. Til dæmis höfum við sýnt fram á að útsetning fyrir nikótíni breytir samhengislegri óttaskilyrðingu, líkan af hræðsluháðri hræðslunámi sem tengist viðkvæmni fyrir geðheilbrigðisröskunum eins og áfallastreituröskun (PTSD) og fíkn.12-14 Nikótín. áhrif á nám í samhengishræðslu eru mótuð af hippocampus.15,16 Við höfum komist að því að bráð nikótínútsetning eykur hippocampusháð óttanám,15,17 dregur úr útrýmingu samhengishræðslu,18,19 og eykur sjálfkrafa endurheimt samhengisótta í kjölfarið útrýming.18 Hins vegar hafa fjölkynslóða og kynslóðaskipti áhrif útsetningar föður fyrir nikótín á þessar svipgerðir ekki verið rannsökuð. Ennfremur hafa engar fyrri rannsóknir einkennt fjölkynslóðaáhrif nikótíns á kólínvirka virkni. Fjölkynslóðarerfðir vísar til svipgerða sem myndast í kynslóðinni sem kemur strax á eftir útsettum einstaklingum, en kynslóðaskipti samanstanda af kímlínumiðluðum erfðum epigenetic upplýsingar milli kynslóða í fjarveru bein umhverfisáhrifa sem leiða til svipgerða breytileika.11 Hér skoðuðum við bæði fjölkynslóða. og kynslóðaskiptaáhrif útsetningar föðurs nikótíns á samhengisbundið og áberandi óttanám í F1 og F2 kynslóðinni sem og á sjálfsgjöf nikótíns, nikótínasetýlkólínviðtaka (nAChR) bindingu hippocampus, kólínvirka starfsemi hippocampus, genatjáningu hippocampus og DNA metýleringu hippocampus. F1 kynslóðin. Við gerum tilgátu um að útsetning fyrir nikótíni hjá föður muni hafa áhrif á hræðsluskilyrði, tjáningu hippocampal gena og virkni hjá afkvæmum og afkvæmum.

áhrif cistanche þykkni

2 AÐFERÐIR OG EFNI

2.1 Viðfangsefni

Viðtakendur voru karl- og kvenkyns C57BL/6J mýs (8-20 vikna, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Að undanskildu húsnæði fyrir haremsrækt voru öll dýr í hóphýsi með 12 tíma ljós/myrkri hringrás og að vild aðgengi að mat og vatni. Við sjálfsgjöf voru einstaklingar takmarkaðir við 85% til 90% af líkamsþyngd þeirra sem þeir fengu að borða og vatn var gefið eftir frjálsum vilja. Allar hegðunarprófanir fóru fram á milli 9:00 AM og 6:00 PM. Allar aðgerðir voru gerðar í samræmi við NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals og samþykktar af Penn State University, Temple University eða University of California Irvine IACUC nefndum.

2.2 Útsetning fyrir nikótíni hjá föður

Karlar (8 vikur) fengu 0,9 prósent dauðhreinsað saltvatn eða nikótín vetnistartrat salt (12,6 mg/kg/dag, frjáls grunnþyngd—Fisher Scientific, Waltham, MA eða MP Biomedical, Santa Ana, CA) uppleyst í 0,9 prósent dauðhreinsað saltvatn, gefið undir húð með osmótískum smádælum (Alzet, Model 1004, Durect, Cupertino, CA) í 28 daga. Þessi skammtur framleiðir nikótín og kótínín í plasma sem er sambærilegt við það sem sést hjá meðal reykingamönnum.20,21

2.3 Myndun F1 og F2 músa

Helmingunartími nikótíns í músum er um það bil 6 mínútur.22 Það hefur áður verið sýnt fram á að áhrif nikótínfráhvarfs hverfa 4 dögum eftir að nikótín er fjarlægt.23-25 Þess vegna er 4 daga seinkun á milli nikótínmeðferðar og ræktun var innleidd til að tryggja kerfisbundið brotthvarf nikótíns fyrir ræktun. Karlkyns mýs voru settar í búr með tveimur barnalegum C57BL/6 J kvendýrum (8-20 vikna aldur) í 2 vikur til að mynda F1 afkvæmi. F2 mýs voru búnar til með því að para barnalegar karlkyns F1 mýs með barnlausum kvendýrum.

2.4 Hræðsluskilyrðing

Hræðsluskilyrði og útrýmingaraðferðum hefur verið lýst í smáatriðum áður.19 Í stuttu máli voru mýs þjálfaðar og prófaðar í hávaðadempandi hólfum (18,8 × 20 × 18,3 cm, 65 dB bakgrunnshljóð; MED Associates, St. Albans, VT). F1 og F2 mýs voru óttaskilyrtar með tveimur skilyrtum áreiti (CS, 30 s, 85-dB hvítum hávaða) – óskilyrtu áreiti (BNA, 2 s, 0,57-mA fótlost) pörun aðskilin með 120 sekúndum. Til að kanna bráð áhrif nikótíns á hræðsluskilyrði í F1 og F2 músum fengu afkvæmi bráð nikótín (0,09 mg/kg, NIC fríbasaþyngd, ip; nikótínvetnistartratsalt, Fisher Scientific) eða saltvatn (SAL) 2 til 4 mínútum áður til æfinga og prófunartíma. Tuttugu og fjórum tímum eftir þjálfun voru mýsnar settar aftur í þjálfunarsamhengið í 5 mínútur til að meta samhengisfrystingu. Eftir samhengisprófun voru mýsnar settar í aðskilin hólf til að meta vísbendingar um hræðslu. Tilraunamenn blindaðir fyrir aðstæðum sem metnar eru frost, skilgreindar sem fjarveru frjálsrar hreyfingar til hliðar við öndun, með óhlutdrægri tímasýnatökuaðferð.19 Til að kanna hugsanlega loftáhrif meðan á bendingaprófun stendur, fékk sérstakt árgangur af F1 músum sömu þjálfun með aðeins einni CS‐US pörun og útrýming hræðslu í samhengi og sjálfkrafa bata voru einnig skoðuð. Hræðsluútrýming átti sér stað á fimm samfelldum fundum sem hófust daginn eftir samhengis- og vísbendingahræðslupróf. Eftir lokaútrýmingarlotuna voru mýsnar látnar óáreittar í búrum sínum í heimahúsum í 7 daga og síðan endurprófaðar í þjálfunarsamhengi fyrir sjálfsprottinn bata. Til að ákvarða hvort einhver sá munur sem kom fram á hræðsluskilyrðum stafaði af mismunandi lostnæmi, kvíða eða víðtækari námsbrestum, voru karl- og kvendýr NIC- og SAL-Sired að auki prófuð á opnu sviði, lostnæmi, hækkuðu auk völundarhúss ( EPM), og ný hugmyndafræði um hlutþekkingar (sjá Stuðningsupplýsingar fyrir allar aðferðir og niðurstöður).

2.5 Sjálfsgjöf matar og nikótíns í bláæð

A separate cohort of adult SAL‐Sired and NIC‐Sired F1 mice were used for food and nicotine self‐administration studies. Beginning at 6 weeks of age, male F1 mice were weighed, mildly food‐restricted to 85% to 90% of their free‐feeding body weight, and then trained to press a lever in an operant chamber (Med Associates) for food chow pellets (20 mg; TestDiet, Richmond, IN) under a fixed‐ratio 5, time out 20 seconds (FR5TO20 sec) schedule of reinforcement (see Supporting Information for full methods). Once stable responding was achieved (>25 kögglar á hverri lotu í þremur síðari lotum), voru einstaklingar hálsbláæðar þræddir undir ísóflurani (1 prósent ‐3 prósent)/súrefnisgufudeyfingu, eins og áður hefur verið lýst.26 Mýs fengu meira en eða jafnt og 72 klukkustundir til að jafna sig eftir aðgerð áður en þær fengu aðgang að að svara aftur fyrir matarverðlaun. Endurreisn matarsvörunar tryggir að mýsnar hafi náð sér nægilega vel eftir skurðaðgerð í bláæð og sýni eðlilega aðgerðasvörun eftir seinkun á aðgangi að skurðhólfunum. Músunum var síðan leyft að fá sjálfsgjöf (IV) nikótín í bláæð á 1 klukkustundar daglegum lotum, 6 til 7 daga vikunnar (níkótínvetnistartratsalt uppleyst í 0.9 prósent dauðhreinsuðu saltvatni, {{1{ {12}}}}.03 mg/kg/innrennsli, frjáls grunnþyngd; MP Biomedical, Santa Ana, CA). IV nikótín var gefið með Razel sprautudælu (Med Associates). Hver lota hafði tvær inndraganlegar stangir (ein virk, önnur óvirk). Þegar svarviðmiðunum var lokið á virku stönginni var gefið nikótíninnrennsli í bláæð (0.{{20}}3 ml innrennslisrúmmál; FR5TO20 sek áætlun). Svör á óvirku lyftistönginni voru skráð en höfðu engar áætlaðar afleiðingar. Eftir átta meðferðarlotur við 0,03 mg/kg/innrennsli, skiptist innrennslisskammturinn yfir í 0,1 mg/kg/innrennsli í sex lotur. Fyrir hvern skammt var meðalinntaka síðustu þriggja lota notuð fyrir tölfræðilegar greiningar. Holleggirnir voru skolaðir daglega með lífeðlisfræðilegu dauðhreinsuðu saltvatni (0,9 prósent w/v) sem innihélt heparín (100 USP einingar/ml). Staðfesta var leynileiki leggsins með Brevital (metóhexítalnatríum, Eli Lilly, Indianapolis, IN) eftir sjálfsgjöf nikótíns. Til að meta bakslagstengda hegðun voru mýsnar prófaðar með tilliti til ræktunar þrá eftir lotuna strax eftir síðasta 0,1 mg/kg/innrennslisskammtinn af sjálfsgjöf nikótíns í bláæð; í þessari aðferð er músunum leyft að bregðast við virku stönginni en fá ekkert nikótíninnrennsli. Á fyrstu ræktunarlotunni í grunnlínu (dagur 1) voru mýs settar í aðgerðaklefa samkvæmt FR5TO20 sek áætluninni með ófyrirséðri vísbendingaljósvirkjun. Eftir það voru mýsnar geymdar í heimabúrum í 20 daga. Á 21. degi bindindis voru mýsnar skoðaðar með tilliti til ræktunar þrá, þar sem virka handfangsljósið var gefið samkvæmt FR5TO20 sek áætluninni. Rannsóknir voru gerðar af tilraunamönnum sem blindaðir voru fyrir hópaðstæðum og hegðunarviðbrögð voru sjálfkrafa skráð af MedAssociates hugbúnaði.

2.6 Nikótínasetýlkólínviðtakabinding

Geislabindindispróf16 var gert með því að nota hippocampi úr 8 vikna gömlum NIC-Sired (5 M og 10F) og SAL-Sired (9 M og 6F) F1 músum. Sýnin voru gerð einsleit með því að nota leysistuðpúða (5 mM Tris plús 5 mM EDTA plús 5 mM EGTA), skilin í skilvindu við 100 000 g í 30 mínútur við 4 gráður, endursviflaus í lýsisjafnalausn og skilin aftur. Kögglar voru endursviflausnir í Tris/10 prósent súkrósabuffi og ræktaðar með [3H] Epibatidine ([3H]EB) (~2 nM miðað við 27,28) (sértæk virkni 54,1 Ci/mmól, PerkinElmer, Boston, MA) í 1 klukkustund við stofuhita. [3 H]EB var valið fyrir nAChR-bindingu, þar sem fyrri niðurstöður sýndu að hippocampal heteromeric 4 2 nAChRs miðla áhrifum nikótíns á hræðsluskilyrðingu.17 Ósértæk binding var metin í nærveru 300 μM nikótíns (níkótínvetnistartratsalts). leyst upp í Tris Buffer, styrkur frjáls basa). [3H]EB-bundin nAChRs voru síuð (24-brunn frumuuppskerutæki, Brandel Co, Gaithersburg, MD), og vökvablómteljari (Tri-Carb 2810 TR, Perkin Elmer, Boston, MA) mældi síugeislavirkni. Sértæk binding, gefin upp sem fmól/mg vefja, var reiknuð út sem munurinn á heildarbindingu og ósértækri bindingu.16

2.7 In vivo amperómetrískar kólínvirkar upptökur

Sérstakur hópur barnalegra 10- til 20 vikna gamalla NIC-Sired og SAL-Sired F1 músa var notaður til að meta breytingar á kólínvirkri sendingu hippocampus með því að nota straummæli. Keramik-undirstaða örrafskaut (Center for Microelectrode Technology, Lexington, KY), með 4 (15 × 333 μm) platínuupptökustöðum raðað í pör (efri og neðri), voru húðuð með kólínoxíðasa (EB-númer 1.1.3.17; Sigma‐ Aldrich, St. Louis, MO), eins og áður hefur verið greint frá.29 Rafskaut voru raffjölliðuð með meta-fenýlendiamíni (m-PD; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) til að auka valhæfni til að greina kólínstrauma. Örrafskaut með næmi meira en eða jafnt og 3pA/μM og greiningarmörk sem eru minni en eða jöfn og 400 nM fyrir kólín voru notuð til að gefa næman stuðul fyrir losun asetýlkólíns (ACh).30 Dýr voru svæfð með úretani (1,2–1,5). g/kg, ip), og ensímhúðaðar örrafskautar voru settar niður í dorsal (A/P −1,7 mm, M/L ± 1,5 mm, D/V −2,3 mm) eða ventral (A/P −3,1 mm, M) /L ± 3,0 mm, D/V −4,3 mm) hippocampus. Ventral hippocampus og dorsal hippocampus voru metnir sérstaklega, þar sem þeir stuðla á mismunandi hátt að samhengis-hræðsluskilyrðum: Ventral hippocampus (vHPC) hefur meira áberandi hlutverk í óttasambandi og tjáningu, en dorsal hippocampus (DHCP) er mikilvægt fyrir samhengisminni.31 Ag/ AgCl viðmiðunarrafskaut voru grædd í andstæða rostra heilaberki.

Amperometric upptökur voru gerðar við 2 Hz með því að beita föstum styrkleika plús 0.7 V, og gögn voru stafræn (FAST-16 potentiostat, Quainton, Nicholasville, KY). Bakgrunnsstraumar voru stöðugir í 60 mínútur, síðan voru lyf sett á hippocampus með því að nota glerháræð (oddþvermál: 15 μm) sem var fest við rafskautið. ACh losun sem vakti afskautun var mæld með því að beita annað hvort stuttum púlsum af kalíum (KCl 70 mM; 100 NL) eða NIC (1 mM fríbasa, nikótíntartrat; 100 NL) við 2 til 10 psi á 2 mínútna fresti. Upptökur voru mótvægar fyrir hippocampus svæði (bak eða kvið) og lyf (kalíum eða NIC). Kólínmerkjaamplituda var mæld með breytingu á straumi á ensímhúðuðu rásinni frá grunnlínustraumi og umreiknað í μM jafngildi kólíns byggt á in vitro kvörðun. Sjálfsvísun var tekin upp til að útrýma gripum með því að draga strauma frá sentinel rásum.29 Staðsetning örrafskauta var sannreynd með Nissl-litun á kransæðaflóðheilsuhluta (Mynd S1). Tvö svörun að meðaltali fyrir hverja lyfjameðferð fyrir hvert dýr voru notuð til tölfræðilegrar greiningar.

2.8 Tölfræðigreining

Tölfræðilegur samanburður var gerður með SPSS (IBM, Armonk, NY) eða GraphPad Prism (La Jolla, CA, Bandaríkjunum). Frávik voru ákvörðuð með gildum 2 staðalfrávikum yfir meðaltali. Ef frávik fannst eru upplýsingarnar innifaldar í niðurstöðuhlutanum. Viðmiðunin fyrir mikilvægi var sett á=.05. Tölfræðileg greining var upphaflega gerð með kynlífi sem þáttur fyrir allar tilraunir þar sem bæði karlkyns og kvenkyns afkvæmi voru prófuð. Greiningar voru hrunnar yfir kyni þegar þríhliða eða tvíhliða samskipti við kynlíf fundust ekki (P > 0,05). Gögnin voru greind með t-prófi, 1-way, eða 2-way ANOVA, eftir því sem við á. Marktækum aðal- eða milliverkunaráhrifum var fylgt eftir með LSD post hoc samanburði. Endurteknum mælingum ANOVA var fylgt eftir með Bonferroni post hoc samanburði með leiðréttingu fyrir margfeldis samanburð. Ef ójöfn dreifni greindust var t-próf ​​Welchs fyrir ójöfn dreifni notað og frelsisgráður sléttaðar niður.

2.9 RNA/DNA einangrun

Fullorðnar F1 mýs (8 vikna gamlar; n=3 M og 3 F í hverjum hópi) voru aflífaðar með leghálsi. Hippocampi voru krufinn í kvið- og bakhluta (í 1:1 hlutfalli), safnað saman frá vinstri og hægri hlið og fryst á þurrís. DNA og RNA voru sameinangruð og hreinsuð með AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). RNA og DNA styrkur og gæði voru metin með því að nota NanoDrop2000 (NanoDrop, Wilmington, DE) og Agilent Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA). Fyrir RNA útdrátt var lágmarks RNA heilleikatalan (RIN) 8,5.

2.10 Transcriptome greining í gegnum

RNA raðasöfn voru útbúin af Huck Institute of the Life Sciences Genomics Core Facility (Penn State University) fyrir 150 bp einhliða lestur með því að nota Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina, San Diego, CA) og raðað á Illumina HiSeq 2500 í hraðkeyrsluham (þrjár keyrslur í röð með um það bil 10 milljón lestri í hverju sýni). FASTQ skrár voru gæðaskoðaðar í gegnum FASTQC og höfðu meðaltal á lestri Phred gæðastig yfir 30 (þ.e. minna en 0,1 prósent raðvillu). FASTQ skrár voru samræmdar við tilvísunarerfðamengi músar (mm10; UCSC Genome Browser) með því að nota TopHat (v2.1.0)32 á Galaxy Project33. Ermahnappar og Cuffmerge (v2.2.1.0)34 voru notaðir til að setja saman afrit úr kortlagðri lestri og sameina afritsskrár fyrir endanlega samsetningu umrita. Fölsk uppgötvunartíðni (FDR) leiðrétt P gildi voru reiknuð fyrir mismunadrifið genatjáningu úr NIC-Sired og SAL-Sired sýnum með því að nota Cuffdiff (v2.2.1.3),34 með stöðluðu FDR cut-off upp á 0.05.35 Transcriptome gagnasöfn voru afhent til Gene Expression Omnibus.

2.11 Auðgunargreining

Mismunandi tjáð gen voru greind með því að nota hugvitsferilgreiningu (IPA, keyrð desember 2018; www.qiagen.com/ingenuity; Qiagen, Redwood City, CA, USA)36 til að sýna fram á hugsanlega auðgun líffræðilegra tengslaneta. Keyrunarfæribreytur tilgreindu að hámarki 35 sameindir á hvert genakerfi og takmörkuð greining við miðtaugakerfi spendýra vef eða frumulínur. Tölfræðileg marktækni fyrir auðgun var ákvörðuð með því að nota Fisher's nákvæma próf með hægri hala leiðrétt fyrir margfeldisprófun.

2.12 Markviss bísúlfít raðgreining

DNA sameinangrað með RNA (sjá kafla 2.9) var notað fyrir DNA metýleringargreiningu. RNA-seq greindi 952 og 162 mismunandi tjáð gen í vHPC og DHCP, í sömu röð. 1010 einstaka genin úr þessum sameinuðu listum voru valin til auðgunar í bisúlfít-seq með því að nota sérsniðið SeqCap Epi auðgunarkerfi (Roche, Pleasanton, CA, USA; Tafla S1).38 Miðað bísúlfít raðgreining var framkvæmd á Penn State Huck Institute of the Life Sciences Genomics Core Facility. Bókasöfn voru smíðuð með því að nota KAPA Hyper Prep Kit (Kapa Biosystems, Wilmington, MA). Natríumbísúlfítumbreytt söfn voru PCR mögnuð og auðguð fyrir valin erfðafræðileg svæði með því að nota sérsniðið fangarannsóknarsett (SeqCap Epi Choice Probes; Roche, Pleasanton, CA, Bandaríkjunum). Fangað DNA var raðgreint á Illumina HiSeq 2500 með því að nota 100 nt pöruð aflestur. FASTQ skrár voru gæðaskoðaðar í gegnum FASTQC. Illumina millistykki voru fjarlægðar og lággæða basar voru klipptir með Trimmomatic.39 Lággæða grunnsnyrting var framkvæmd með rennandi glugganálgun, klipping þegar meðalgæði innan fjögurra grunnpara glugga fóru niður fyrir viðmiðunarmörkin 20, með lágmarks leslengd 35. Eftir að hafa verið klippt höfðu FASTQ skrár meðaltal á hverri lestri Phred gæðastig yfir 30 (þ.e. minna en 0,1 prósent raðvillu). Snyrt aflestrar voru kortlögð á viðmiðunarerfðamengi músarinnar (mm10) með því að nota Bowtie240 útfært í Bismark.41 Metýl_útdráttur innan Bismark var notað til að draga CpG metýleringarupplýsingar og til að búa til metýleringarskýrslur. MethylKit42 var notað til að greina mismunandi metýleruð svæði (DMR). Metýlerunarstaða var tekin saman yfir glugga sem ekki skarast af 500 basapörum og mismunametýleringargreining var framkvæmd, með staðlaða FDR upp á 0,05,35 Gagnasett hafa verið afhent í Gene Expression Omnibus.

Ávinningur af cistanche þykkni

3 NIÐURSTÖÐUR

3.1 Níkótín í föðurætt eykur samhengisfræðsluskilyrði og snýr við bráðri nikótínaukningu samhengishræðsluskilyrða í F1 og F2 kynslóð músum

NIC-Sired og SAL-Sired F1 karl- og kvenmýs voru hræddar eftir bráða SAL eða NIC gjöf (0.09 mg/kg ip, mynd 1A). Heildargreining á grunnlínu, pre-CS og CS frystingu er innifalin í Stuðningsupplýsingum. Þriggja leiða ANOVA á samhengisfrystingu með meðferð með feðra, bráðri lyfjameðferð og kynlífi sem þáttum leiddi í ljós marktæka milliverkun föður × bráða lyfjameðferð (F(1,36)=32.75, P < .{{27="" }}01).="" vegna="" þess="" að="" engin="" marktæk="" milliverkun="" var="" á="" milli="" kyns="" og="" föður="" eða="" bráðrar="" lyfjameðferðar,="" var="" gerð="" tvíhliða="" anova="" sem="" hrundi="" yfir="" kynlífi="" og="" leiddi="" í="" ljós="" marktæka="" feðrameðferð="" ×="" bráða="" lyfjameðferð="" milliverkun="" (f(1,40)="20.96" ,="" p=""><.001). post="" hoc="" samanburður="" benti="" til="" þess="" að="" saltvatnsmeðhöndlaðar="" nic-sired="" f1="" mýs="" sýndu="" aukna="" samhengishræðsluskilyrði="" samanborið="" við="" saltvatnsmeðhöndlaðar="" sal-sired="" f1="" mýs="" (t20="2.73," p=""><.05). í="" samræmi="" við="" fyrri="" niðurstöður,="" 43="" bráð="" nic="" við="" 0,09="" mg/kg="" olli="" aukinni="" samhengisótta="" ástandi="" í="" sal-sired="" músum="" (t22="2.99," p=""><.01). hins="" vegar,="" bráð="" nic="" við="" 0,09="" mg/kg="" skert="" samhengishræðsluskilyrði="" hjá="" nic-ættuðum="" músum="" (t18="3.36," p=""><.01). á="" heildina="" litið="" var="" samhengisfrysting="" í="" nic-sired="" nic="" músum="" sambærileg="" við="" það="" sem="" sást="" í="" sal-sired="" sal="" músum="" við="" bæði="" 0,09="" mg/kg="" (p=""> 0,05).

Að auki voru karl- og kvenkyns NIC- og SAL-Sired dýr prófuð í höggnæmni (Mynd S2), hækkuðu plús völundarhús (EPM, Mynd S3), opnu sviði og nýrri hlutgreiningaraðferð (Mynd S4, sjá Stuðningsupplýsingar fyrir allar aðferðir og niðurstöður). Að undanskildum NIC-Sired kvendýrum í EPM (sem sýndu aukna kvíðalíka hegðun) og NIC-Sired dýrum í lost næmi (sem sýndu minnkað raddviðbrögð við losti, sem myndi ekki rugla aukinni ótta við að læra fjölkynslóða svipgerð), enginn munur greindust á milli NIC- og SAL-Sired músa.

MYND 1 Níkótín í föðurætt eykur samhengisbundna óttaskilyrðingu og dregur úr bráðri nikótínaukningu óttaskilyrða. Samhengisfrysting var marktækt hærri í NIC-Sired plús SAL samanborið við SAL-Sired plús SAL viðmiðunarhópa. Bráð nikótín við 0,09 mg/kg jók samhengisótta skilyrðingu hjá SAL-Sired en marktækt minnkað samhengis ótta skilyrðing í NIC-Sired dýrum (n=10-12 í hverjum hópi). B, Samhengisfrysting var marktækt hærri í NIC-grandsire plús SAL samanborið við SAL-grandsire plús SAL viðmiðunarhópa (n=9-11 í hverjum hópi). Villuslár gefa til kynna staðlaða meðalvillu (SEM), *P <>

Til að ákvarða hvort skert samhengishræðsluskilyrðing héldi áfram inn í næstu kynslóð (F2), voru NIC-afa- og SAL-afa- og F2-karl- og kvenkyns mýs ræktaðar úr barnalegum F1 karlkyns músum. Heildargreining á grunnlínu, pre-CS og CS frystingu er innifalin í Stuðningsupplýsingum. Þriggja leiða ANOVA af samhengisfrystingu var framkvæmd með ömmumeðferð, bráða lyfjameðferð og kynlíf sem sjálfstæða þætti (Mynd 1B). Þar sem engin marktæk víxlverkun var á milli kyns og föður eða bráðrar lyfjameðferðar, var gerð tvíhliða ANOVA sem hrundi yfir kynlífi. Marktæk aðaláhrif föður (F(1,37)=9.88, P < .01)="" fundust="" og="" samanburður="" eftir="" atvik="" gaf="" til="" kynna="" að="" nic-afa="" mýs="" sýndu="" aukna="" samhengisótta="" ástandi="" samanborið="" við="" með="" sal-afa="" músum="" (t39="3.04," p="">< 0.01).="" að="" auki="" höfðu="" sal-afa="" mýs="" sem="" fengu="" bráða="" nic="" aukna="" samhengisótta="" skilyrðingu="" (t19="2.41," p="0.026)" en="" bráð="" nic="" jók="" ekki="" samhengisótta="" ástand="" í="" nic-afa="">

MYND 2 Níkótín í föðurætt eykur áberandi hræðsluskilyrði og sjálfkrafa endurheimt hræðsluminnis. Til að kanna hugsanlega loftáhrif meðan á vísbendingum stóð, fékk sérstakur hópur F1 músa sömu þjálfun með aðeins einni CS-US pörun. Bæði samhengis- og kvíðaskilyrðing var aukin í NIC-Sired músum samanborið við SAL-Sired mús sem þjálfaðar voru með 1 CS-US pörun (n=8-10 í hverjum hóp). B, útsetning fyrir nikótíni hjá föður hafði ekki áhrif á útrýmingu samhengisfræðslu en jók sjálfkrafa endurheimt óttaminni 7 dögum eftir lokaútrýmingarlotuna (n=8-10 í hverjum hópi). Villuslár gefa til kynna staðlaða meðalvillu (SEM), *P <>

3.2 Níkótín af föðurætt eykur áberandi óttaskilyrði í F1 kynslóð músum

Til að kanna hvort loftáhrif útilokuðu greiningu á hópamun vegna kvíðaskilyrða (sjá stuðningsupplýsingar), var sérstakur hópur af F1 músum þjálfaður með einni CS-US pörun. Í þessum hópi fannst aukning á samhengisbundinni hræðsluskilyrðingu (t7=3.21, P < .05)="" sem="" og="" boðað="" óttaskilyrði="" í="" nic-sired="" músum="" (t6="2.41," p="">< .="" 05;="" mynd="">

3.3 Níkótín í föðurætt eykur sjálfkrafa endurheimt samhengis óttaminni í F1 kynslóð músum

Hópurinn af F1 músum sem fengu eina CS-US pörun var í kjölfarið prófaður með tilliti til útrýmingar og sjálfkrafa endurheimt samhengisminnis. F1 NIC-Sired mýs sýndu eðlilega hræðsluútrýmingu en sýndu aukinn sjálfkrafa bata á samhengis óttaminni miðað við SAL-Sired mýs (t7=3.38, P < 0.05;="" mynd="">

3.4 Nikótín af föður dregur úr sjálfsgjöf nikótíns

Fyrir þjálfun fyrir sjálfsgjöf nikótíns voru viðfangsefnin greind með tilliti til hæfni þeirra til að læra aðgerðaverkefni til að fá matarverðlaun og enginn munur sást (stuðningsupplýsingar, mynd S5). Til að kanna hugsanleg áhrif af nikótínútsetningu frá föður á nikótínstyrkingu hjá F1 afkvæmum, var öflun nikótíngjafar í bláæð (0,03 mg/kg/innrennsli) metin í tvíhliða ANOVA með blandaðri hönnun, sem auðkenndi aðaláhrif lotu (F(7,119)=13.60, P < .001)="" og="" lotu="" ×="" meðferðarvíxl="" við="" föður="" (f(7.119)="5.00," p="">< .001).="" hins="" vegar,="" post="" hoc="" prófanir="" leiddu="" ekki="" í="" ljós="" neinn="" tölfræðilega="" marktækan="" mun="" á="" milli="" hópanna="" á="" hverri="" af="" átta="" yfirtökulotunum="" (mynd="" 3a).="" fjöldi="" virkra="" og="" óvirkra="" ýta="" á="" lyftistöng="" var="" síðan="" greindur="" til="" að="" ákvarða="" hvort="" hóparnir="" héldu="" vali="" yfir="" lotu="" fyrir="" virku="" lyftistöngina="" meðan="" á="" tökunni="" stóð="" (mynd="" 3b),="" sem="" benti="" á="" helstu="" áhrif="" lotunnar="" (f(7,238)="" {{20}="" }.18,="" p="">< .001)="" og="" lotu="" ×="" meðferðarvíxlverkun="" með="" föður="" (f(21.238)="11.40," p="">< .001).="" post="" hoc="" greining="" leiddi="" í="" ljós="" að="" hóparnir="" voru="" ólíkir="" á="" fyrsta="" degi="" sjálfsgjafar="" nikótíns.="" nic-sired="" hópurinn="" sýndi="" meiri="" virka="" lyftistöng="" samanborið="" við="" sal-sired="" hópinn.="" þessi="" áhrif="" geta="" annað="" hvort="" táknað="" meiri="" lyfjaleitarhegðun="" á="" fyrsta="" degi="" útsetningar,="" þrautseigju="" til="" að="" bregðast="" við="" matarverðlaunum="" og/eða="" minni="" vitræna="" sveigjanleika="" við="" að="" skipta="" um="" svörun="" frá="" mat="" yfir="" í="" lyf.="" hins="" vegar="" var="" þessi="" munur="" ekki="" viðvarandi="" á="" fleiri="" fundum.="" sal-sired="" mýs="" sýndu="" stöðugt="" tölfræðilega="" marktækt="" val="" fyrir="" virku="" stönginni="" fram="" yfir="" óvirka="" stöngina="" (post="" hoc="" p=""><.01), en="" nic-sired="" mýs="" sýndu="" ekki="" þetta="" viðvarandi="" val="" fyrir="" lotur="" 3="" til="">

MYND 3 Nikótín af föður dregur úr sjálfsgjöf nikótíns. NIC- og SAL-Sired karlkyns mýs (n=9-10 í hverjum hópi) voru ekki mismunandi í heildarfjölda innrennslis sem aflað var fyrir hverja lotu á tökutímabilinu á 0 ,03 mg/kg/innrennslisskammtur. B, Við töku var fjöldi virkra og óvirkra lyftistöngpressa marktækur mismunandi á fyrstu lotunni, þar sem NIC-Sired mýs nikótín sýndu meiri fjölda virkra lyftistöngpressa samanborið við SAL-Sired mýs. Hins vegar, á síðari fundum, minnkuðu NIC-Sired mýs svörun, sem leiddi til þess að ekki var marktækur munur á virkum og óvirkum fjölda þrýsta á lyftistöng yfir lotur 3 til 8. Aftur á móti sýndu SAL-Sired dýr stöðugt tölfræðilega marktækt val fyrir virku lyftistönginni yfir óvirka lyftistöng þeirra. C, Meðalfjöldi nikótíninnrennslis í þremur síðustu tökulotum var ekki marktækur munur á milli NIC- og SAL-Sired músa. D, við miðlungs skammt af 0,1 mg/kg/innrennsli, gáfu NIC-Sired mýs sjálf marktækt lægri fjölda nikótíninnrennslis. E, Ræktun á þrá mati leiddi í ljós marktæka aukningu á svörun á áður virku lyftistönginni eftir 21 dags bindindi eingöngu fyrir SAL-Sired mús. Villuslár gefa til kynna staðlaða meðalvillu (SEM), *P <>

Til að kanna frekar hugsanlegan mun á hópum á meðan stjórnað var fyrir breytileika á upphafsstigi öflunar, var meðalfjöldi nikótíninnrennslis skoðaður fyrir síðustu þrjár loturnar, en þá sýndu einstaklingar stöðugri svörun fyrir nikótín (mynd 3C). Ekki var marktækur munur á hópunum hvað varðar meðalfjölda nikótíninnrennslis (P > .05). Eftir það var músunum skipt yfir í 0,1 mg/kg/innrennslisskammt af nikótíni, sem áður hefur verið sýnt fram á að væri ákjósanlegur hjá fullorðnum C57BL6/J músum.44 Við þennan skammt gáfu NIC-Sired mýs sjálfar lægri fjölda innrennslis (t{ {7}}.20, P < .05;="" mynd="" 3d).="" fyrir="" ræktun="" á="" þráhegðun,="" sem="" er="" talinn="" mælikvarði="" á="" aukna="" lyfjaleit="" meðan="" á="" bindindi="" stendur,="" greindi="" tvíhliða="" anova="" með="" blandaðri="" hönnun="" með="" lotu-="" og="" föðurmeðferð="" helstu="" áhrif="" lotunnar="" (f(1,17)="" {{16}="" }.90,="" p="">< .001).="" þó="" að="" sal-sired="" dýr="" sýndu="" ræktunaráhrif="" með="" meiri="" svörun="" á="" degi="" 21="" bindindis="" samanborið="" við="" dag="" 1,="" sýndu="" nic-sired="" mýs="" ekki="" aukningu="" á="" nikótínleitarhegðun="" (p=""><>

3.5 Útsetning fyrir nikótíni föður breytir kólínvirkri bindingu og virkni hippocampus

Hásækni hippocampal heteromerísk nAChR-binding var uppstillt í NIC-Sired F1 músum (t28=2.14, P < .05;="" sal-sired="1.21" ±="" {{10}="" }.043,="" nic-sired="1.34" ±="" 0,044).="" einn="" einstaklingur="" (nic-sired)="" var="" fjarlægður="" vegna="" þess="" að="" bindigildi="" voru="" tvö="" staðalfrávik="" yfir="">

Mælingar á ACh straumum af kalíum og nikótíni voru metnar í F1 dHPC og vHPC. Vegna ójafnrar sýnastærðar á kyni var kyn ekki tekið með sem bráðabirgðaþáttur í þessum greiningum. KCl afskautun framkölluð kólínvirk merki voru ekki mismunandi á milli SAL- og NIC-Sired músa í dHPC (P > 0,05; mynd 4A); staðbundin nikótínnotkun leiddi hins vegar til marktækrar minnkunar á kólínvirkum merkjaamplitudum í NIC-Sired músum (t8=2.33, P <.05; mynd="" 4c).="" í="" vhpc="" var="" losun="" ach="" minnkuð="" í="" nic-sired="" músum="" eftir="" notkun="" kcl="" (t8="2.60," p=""><.05; mynd="" 4b)="" eða="" nikótín="" (t8="2.98," p=""><.05 ;="" mynd="">

MYND 4 Nikótín frá föður dregur úr kólínvirkum boðum í hippocampus. DHPC íbúa kólínmerki framkölluð af KCl-framkölluðum endaskautun. Enginn marktækur munur greindist á milli NIC- og SAL-sired dýra (n=5 í hverjum hópi). B, vHPC þýði kólínmerki framkallað af KCl-framkallaðri endaskautun minnkaði í NIC-Sired músum. C, Nikótín-vakað þýði dHPC kólínmerki voru minnkuð í NIC-Sired músum. D, Nikótín-vakað þýði vHPC kólínmerki voru minnkuð í NIC-Sired músum. Engin áhrif kynlífs á kólínvirk boð komu fram. Villuslár gefa til kynna staðlaða meðalvillu (SEM), *P <>

3.6 Útsetning föður fyrir nikótíni breytir mismunadrif á bak- og kviðlægum hippocampal genatjáningu

F1 umritagreining á hippocampus með RNA-raðgreiningu leiddi í ljós 952 mismunandi tjáð gen í vHPC (FDR=0.05; Tafla S2). Af þessum genum voru 612 lækkuð og 340 í NIC-Sired músum. Í dHPC voru aðeins 162 gen tjáð á mismunandi hátt í NIC-Sired músum samanborið við SAL-Sired mús (FDR=0.05). Af þessum 162 genum var 86 með niðurstýringu og 76 uppstýrt. Hundrað þrjú gen með breytta genatjáningu skarast á milli vHPC og dHPC.

3.7 Útsetning fyrir nikótíni af föður breytir umritunarferlum sem taka þátt í þróun taugakerfis

Í vHPC greindi IPA greining efsta netið „Taugasjúkdómur, lífveruáverkar og afbrigðileikar, frumudauði og lifun“ (stig=41, tafla S3) og næst efsta netið „Þróun og virkni taugakerfis, vefjagerð, taugafræðileg Sjúkdómur" (stig=23). Efstu fimm flokkarnir sameinda- og frumuvirkni voru: "Frumuformgerð" (88 sameindir), "Frumusamsetning og skipulag" (79 sameindir), "Frumuþróun" (96 sameindir), "Frumuvirkni og viðhald" (79 sameindir), og "Frumuvöxtur og fjölgun" (87 sameindir). Efstu lífeðlisfræðilega kerfisþróun og virkni voru "Taugakerfisþróun og virkni" (175 sameindir), og sumir af helstu sjúkdómum og sjúkdómum eru "taugasjúkdómur" (í öðru lagi, 191 sameind) og "sálfræðilegir sjúkdómar" (fjórða, 90 sameindir) ) (Tafla S4).

Til viðbótar við IPA niðurstöðurnar, veitti auðgunargreining með Enrichr frekari vísbendingar um breytingar á frumuvexti og þroska í vHPC, með helstu GO líffræðilegum hugtökum þar á meðal "RNA splicing", "svörun við óbrotnu próteini," og "stjórnun frumuvaxtar" og " próteinstöðugleiki“ (tafla S5). Að sama skapi var „spliceosomal complex“ auðkennt sem efsta GO frumuhugtakið. KEGG ferlagreining í gegnum Enrichr benti að auki á virkni spliceosome og MAPK boð sem hugsanlega áhrif á ferla.

Þrátt fyrir töluvert styttri lista yfir gena sem tjáð eru á mismunandi hátt í dHPC samanborið við vHPC, fundust svipaðar dHPC-auðgaðar leiðir og hugtök (töflur S3 og S4). IPA greining benti á efsta netið „Hegðun, taugasjúkdómar, líffærameiðsli og frávik“ (einkunn=24) og næst efsta netið „taugasjúkdómar, líffærameiðsli og frávik og sálrænar truflanir (stig=20) .

Fimm efstu flokkarnir sameinda- og frumuvirkni í dHPC voru "Frumuþróun" (29 sameindir), "Frumuvöxtur og útbreiðslu" (29 sameindir), "Frumuformfræði" (27 sameindir), "Frumusamsetning og skipulag" (23 sameindir) , og "Frumuvirkni og viðhald" (25 sameindir). „Þróun og virkni taugakerfis“ var aftur auðkennd sem auðgað hugtak undir flokkun lífeðlisfræðilegrar kerfisþróunar og virkni (í öðru lagi, 44 sameindir). Efstu auðguðu hugtökin undir flokkun sjúkdóma og sjúkdóma innihéldu "taugasjúkdóma" (1., 51 sameindir) og "sálfræðilegar sjúkdómar" (fimmta, 31 sameind). Auðgunargreining með Enrichr benti á mörg mismunandi GO líffræðileg hugtök fyrir dHPC samanborið við vHPC, þar á meðal "stjórnun taugafrumudauða" og "heilaþroska" (tafla S5), sem er viðbót við IPA sameinda- og frumustarfsemina "Frumudauði og lifun."

Til að kanna frekar starfrænt hlutverk mismunatjáðra umrita sem skarast á milli dHPC og vHPC, voru mistjáð gen sem eru sameiginleg báðum svæðum (103 alls) metin. Skörandi mismunandi tjáð umrit milli svæðanna tveggja voru öll niðurstýrð eða uppstillt í sömu átt, sem bendir til algengra breytinga á umritunarferlum þvert á heilasvæði í músum með NIC-ætt. Fimm efstu flokkarnir sameinda- og frumuvirkni sem IPA greindi frá voru "Frumudauði og lifun" (17 sameindir), "Frumuhreyfing" (10 sameindir), "Frumu-til-frumuboð og víxlverkun" (17 sameindir), "Frumuvöxtur" og útbreiðslu" (18 sameindir) og "frumuformfræði" (17 sameindir) (tafla S4)

Mismunandi tjáð gen einstök fyrir dHPC og vHPC voru síðan greind sérstaklega í IPA til að prófa fyrir mismunandi taugalíffræðilega aðlögun milli svæðanna tveggja (tafla S6). Engar auðgaðar kanónískar leiðir skarast á milli einstöku vHPC einstaka dHPC greininga. Helstu auðguðu kanónísku leiðirnar sem eru einstakar fyrir vHPC (44 samtals) innihéldu „kalsíumboð“ og „sykursteraviðtakamerki“, en efstu dHPC kanónískar leiðirnar (alls átta) innihéldu „skjaldkirtilshormóna umbrot“ og „retínósýrumiðlað apoptosis merki“. Auðgaðir sjúkdómar og aðgerðir einstakar fyrir vHPC (alls 295) innihéldu „myndun [Hippocampus] ammonshorns“ og „Magn frumuútskota“ á meðan einstaklega dHPC auðgað sjúkdóma og virkniskilmála (alls 111) innihéldu „Bólga í hvítu efni“ og „afmýelinæðing“ ."

3.8 Útsetning fyrir nikótíni af föður breytir DNA metýleringu hippocampus

Markviss DNA metýleringargreining var gerð til að ákvarða hvort breytt DNA metýlering á samsvarandi eftirlitssvæðum skýrði mismunabundinni genatjáningu í NIC-Sired F1 afkvæmum. Markmiðin innihéldu 1114 gen sem voru tjáð á mismunandi hátt sem eru auðkennd í annað hvort dHPC eða vHPC. Í vHPC greindust 11 mismunandi metýleruð svæði (DMR), þar sem átta sýndu aukna metýleringu og þrjú sýndu minnkaða metýleringu (tafla 1). Af 11 DMR voru 10 staðsett á svæðum sem tengjast geni sem sýndi breytta tjáningu í vHPC. Í dHPC greindust 30 DMR, þar sem 15 sýndu aukna metýleringu og 15 sýndu minnkaða metýleringu. Af 30 DMR voru 29 staðsett á svæðum sem tengjast geni sem sýndi breytta tjáningu í dHPC.

Benefit af cistanche echinacoside

4 UMRÆÐA

Aukinn skilningur á erfðafræðilegum ferlum í tengslum við nýleg gögn, þar á meðal núverandi niðurstöður, hefur ögrað hefðbundnum skilningi á erfðum. Þættir umfram arfgerðina einir og sér geta ákvarðað svipgerð í næstu kynslóðum og útsetning innan kynslóðar getur ekki verið bundin frá afkvæmum. Þessi rannsókn bendir til þess að skaðleg heilsufarsleg áhrif af útsetningu fyrir nikótíni geti farið yfir einstaka útsetningu og haft áhrif á næstu kynslóðir. Við greindum fjölkyns og kynslóðaáhrif af útsetningu fyrir nikótíni hjá föður fyrir getnaði í C57BL/6J músum á Pavlovian óttaskilyrði, sem leiddi til sterkari óttaminningar í F1 og F2 afkvæmum. Útsetning fyrir nikótíni af föður leiddi einnig til minnkaðrar sjálfsnotkunar nikótíns og minnkandi hegðunar sem tengdist bakslagi, sem bendir til meiri andúðarsvörunar við nikótíni. Til stuðnings þessum hegðunarmismun komu fram fjölkynslóða breytingar á kólínvirkri starfsemi hippocampus og epigenetic ferlum. Saman benda þessar niðurstöður til breytinga á starfsemi taugakerfisins hjá afkvæmum músa sem verða fyrir nikótíni sem leiða til breyttra hegðunarsvipgerðar.

F1 og F2 afkvæmi karlkyns músa sem urðu fyrir nikótíni sýndu aukna samhengis- og vísbendingu um ótta. Þrátt fyrir engan mun á útrýmingu ótta í samhengi milli NIC- og SAL-Sired F1 músa, sýndu NIC-Sired mýs aukinn sjálfkrafa endurheimt samhengishræðsluminninga. Mikilvægt er að enginn munur á lostnæmi milli NIC- og SAL-Sired músa fannst sem gæti skýrt aukna hræðsluskilyrði. Aukin hræðsluskilyrðing getur bent til almennrar aukningar á námsferlum öfugt við mótun ferla sem eru sértækari fyrir ótta við að læra. Hins vegar sáust engar breytingar á greiningu nýrra hluta, þjálfun í virkri fæðu eða hreyfingu á opnum vettvangi hjá NIC-Sired músum, þó að kynsértæk áhrif af auknum EPM opnum handleggstíma í NIC-Sired kvenkyns músum hafi komið í ljós. Þó að þetta útiloki ekki hugsanlegar breytingar á öðrum námskerfum eða vitsmunalegum ferlum, benda þessar niðurstöður saman til þess að hræðslunám gæti verið næmari fyrir fjölkynslóða- og kynslóðaáhrifum af útsetningu föður fyrir nikótíni. Þar að auki benda þessar niðurstöður til breyttrar kólínvirkrar virkni í NIC-sired dýrum. Nikótín stjórnar samhengisbundinni óttaskilyrðingu. Þar sem bráð nikótín eykur samhengisótta ástand, 15,45 fráhvarf frá langvarandi nikótíni truflar samhengis ótta skilyrðingu.16,21 Í þessari rannsókn eykur bráð nikótín samhengis ótta skilyrðingu í F1 og F2 músum frá saltlausnum músum. Aftur á móti truflaði bráð nikótín-trufluð samhengisótta ástand í NIC-Sired músum og hafði engin áhrif í NIC-grandsire músum, sem gæti bent til breyttrar kólínvirkrar starfsemi í hippocampus.

Áhrif nikótínútsetningar föður á síðari sjálfsgjöf nikótíns í F1 kynslóðinni benda einnig til truflaðrar kólínvirkrar virkni. Við öflun nikótíns sjálfsgjafar í bláæð við lægri skammtinn var ekki munur á hópunum hvað varðar fjölda nikótíninnrennslis, þó að aukning á fjölda virkra lyftistöngpressa hafi fundist í NIC-Sired hópnum. Þetta bendir til þess að NIC-Sired mýsnar gætu hafa sýnt þrautseigju í að bregðast við matarverðlaunum og/eða minnkað vitræna sveigjanleika við að skipta um svörun frá mat yfir í lyf. Hins vegar er einnig rétt að hafa í huga að ekki var ólíkur hópur á fyrsta degi ræktunar þrá, sem táknar útrýmingarlotu (td engin nikótíninnrennsli á meðan á meðferð stendur) og þess vegna virðast þessi áhrif hafa verið til staðar þegar styrkingarlyf eru skipt en ekki án styrkingartækis meðan á útrýmingartíma stendur. NIC-Sired mýsnar sýndu einnig minni sjálfsgjöf nikótíns í hóflegum skömmtum, sem er í samræmi við nýlegar rannsóknir sem greina minnkun á áfengis-, kókaín- og ópíóíðgjöf í tengslum við útsetningu fyrir alkóhóli, kókaíni og morfíni frá foreldrum (td Vassoler et al,46 sem rifjað upp í Goldberg og Gould47). Lækkun á sjálfsgjöf nikótíns sem sést má rekja til annað hvort minnkaðs næmis fyrir gefandi áhrifum nikótíns og/eða aukins næmis fyrir andvekjandi áhrifum nikótíns. Reyndar voru hóparnir ólíkir með miðlungs nikótínskammtinn en ekki lægri nikótínskammtinn, sem styður hugmyndina um aukna andúðarsvörun við stærri skammtinn. Athyglisvert er að við fundum einnig skort á ræktun þrá á degi 21 í NIC-Sired músum eftir sjálfsgjöf í hóflegum skammti, sem bendir til þess að minni nikótínleitarhegðun gæti tengst andúðartengdu minni fyrir nikótíni. Þótt ýmis taugahvarfefni geti legið undir þessum áhrifum á nikótíninntöku og bakslagstengda svörun, kom í ljós í nýlegri rannsókn að minnkaður DNA metýltransferasa á CA1 svæðinu í hippocampal dró úr sjálfsgjöf morfíns.48 Þessi niðurstaða, ásamt þekktri virkni kólínvirkrar hippocampus starfsemi í náms- og minnisferli, styður enn frekar hugmyndina um truflaða nikótínmiðlaða vinnslu í hippocampus NIC-Sired músa.

Á þessum nótum sýndu NIC-Sired mýs aukna hippocampal hásækni nAChR bindingu. Við fundum einnig minnkun á kalíum-vakaðri ACh losun í vHPC sem og nikótín-vakaðri ACh losun bæði í dHPC og vHPC NIC-Sired dýra. Breytingar á afskautun framkölluðum ACh losun endurspegla breytta kólínvirka virkni neðan við viðtakabindingu, en breytingar á nikótínvakaðri ACh losun endurspegla breytta nAChR virkni. Þessi gögn eru í samræmi við fyrri niðurstöður um uppstýrða nAChR-bindingu með mikilli sækni í kjölfar minnkaðrar nAChR-virkni.49 Vegna þess að bæði kalíumvakin og nikótínvakin ACh losun var breytt í vHPC NIC-Sired músa, gæti vHPC verið næmari fyrir fjölkynslóðaáhrif útsetningar föður fyrir nikótín. Vitað er að DHPC stýrir samhengisfræðsluskilyrðum.31,50 Hömlun vHPC truflar bæði kvíða- og samhengisóttaástand ing51,52 og vHPC kólínvirkar meinsemdir skerða kvíðaskilyrði.53

Herb cistanche

Við höfum einnig sýnt fram á að beint nikótíninnrennsli í dHPC eykur samhengisfræðsluskilyrði á meðan innrennsli í vHPC truflar samhengisfræðsluskilyrði.15 vHPC getur einnig mótað sjálfkrafa endurheimt samhengishræðsluminninga, þar sem óvirkjun vHPC-forrásarrásar dregur úr sjálfkrafa endurheimt samhengishræðsluminninga. 54 Þótt önnur heilasvæði sem taka þátt í hræðsluskilyrðum, eins og amygdala,55 geti einnig orðið fyrir áhrifum af útsetningu fyrir nikótíni frá föður, benda þessar niðurstöður ásamt núverandi gögnum til þess að breytingar á vHPC-virkni geti verið ábyrg fyrir breyttri hræðsluskilyrðingu hjá NIC-Sired músum . Við gerðum þá tilgátu að fjölkynslóðaáhrif af útsetningu fyrir nikótíni hjá föður gætu tengst breytingum á umritunaráhrifum sem verka framan við þessi taugakerfi. Erfðamengi-breitt umritunarraðgreining í vHPC og dHPC af F1 kynslóð músum greindi 1114 mismunandi tjáð gen milli NIC- og SAL-Sired músa. Þessi munur var meiri í vHPC (952) samanborið við dHPC (162), í samræmi við meiri breytingu á vHPC miðað við dHPC kólínvirka virkni og breytingar á bæði samhengisbundinni og vísbendingu um ótta. Síðari greining á ferli gaf til kynna víðtækar breytingar á umritunarferlum sem tengjast sykursteraboðum og taugaþroska/mýkingu á báðum hippocampus svæðum.

Til þess að bera kennsl á hugsanlegar aðlöganir sem eru sértækar fyrir vHPC, var leiðagreining gerð með því að nota aðeins afrit sem eru sértæk fyrir annað hvort hippocampal undirsvæði. Engar auðgaðar IPA kanónískar leiðir skarast á milli vHPC og dHPC, sem eru starfrænt aðskilin undirsvæði hippocampus.31 Þegar gen sem skarast á milli dHPC og vHPC voru fjarlægð, voru efstu auðguðu kanónískar leiðirnar sem eru einstakar fyrir vHPC innifalinn "Bykjastertviðtakamerki", sem bendir til einstakrar , frekari breyting á sykursteravirkni á þessu svæði samanborið við dHPC. Með það að markmiði að bera kennsl á uppstreymis erfðafræðilega eftirlitsaðila sem gætu virkað á genatjáningu, framkvæmdum við markvissa DNA metýlerunarraðgreiningu með því að nota samantekinn lista yfir dHPC og vHPC mismunatjáð gen sem auðkennd eru úr RNA-raðgreiningu. Það kom á óvart að við fundum aðeins 11 DMR í vHPC og 30 DMR í dHPC á milli NIC- og SAL-Sired dýra. Þó að þetta sé óvænt miðað við mun meiri fjölda mismunatjáðra umrita í vHPC, er DNA metýlering aðeins einn af nokkrum stjórnunarþáttum sem geta haft áhrif á genatjáningu og DNA metýlering skilar sér ekki stöðugt í breytta genatjáningu.56 Af 11 vHPC DMRs, sjö sýndi metýlunarmynstur í samræmi við stefnu mismunaumritunar (minnkuð umritun með aukinni DNA metýleringu og aukin umritun með minni metýleringu). Mismunandi metýleruð gen í vHPC innihéldu Fkbp5, Ksr1 og Pnpla2. Athyglisvert var að Fkbp5 og Ksr1 umritun voru truflað í einu hegðunarmúsarlíkani af áfallastreituröskun,57 þar sem mýs voru útsettar fyrir rafmagnsfótstuðli og kynntu síðan aðstæðubundnar áminningar. Fkbp5 umritar sykurstera viðtaka aðstoðarmann sem hefur virkni hans verið tengd við vanhæft langvarandi streituviðbrögð hjá einstaklingum með áfallastreituröskun og aðrar kvíðaraskanir.58

Nánar tiltekið sýna rannsóknir á mönnum að Fkbp5 metýlering og umritun tengist alvarleika PTSD einkenna, þannig að aukin metýlering og minnkuð umritun spáir fyrir um alvarlegri PTSD einkenni. Áfallastreituröskun.59,61 Niðurstaða okkar um aukinn sjálfkrafa endurheimt óttaminni í tengslum við stjórnun á umritunarferlum sem tengjast sykursteraboðum hjá NIC-sired dýrum gæti bent til aukinnar varnarleysis fyrir PTSD-líkum svipgerðum. Í dHPC voru DMR mynstur að mestu í ósamræmi við stefnu mismunadrifatjáningar sem fannst með RNA-raðgreiningu, sem bendir til þess að breytingar á vHPC DNA metýleringu sem myndast við útsetningu fyrir nikótíni hjá föður hafi meiri afleiðingar hvað varðar áhrif á genatjáningu en þær í dHPC. Þetta er í samræmi við auðkenningu okkar á meiri fjölda afrita sem tjáð eru á mismunandi hátt og ýktari breytingar á kólínvirkri sendingu í NIC-Sired vHPC samanborið við dHPC. Markviss raðgreiningaraðferð okkar gæti hafa takmarkað getu til að greina hugsanlega umritunarstjórnun með fjarmetýleruðum röðum. Framtíðarrannsóknir, þar á meðal greining á DNA-metýleringu í gegnum erfðamengi, breytingar á históni og litla RNA-tjáningu, munu veita fullkomnari túlkun á þessum niðurstöðum.

Hugsanleg takmörkun á hönnun okkar á útsetningu fyrir nikótíni er áhersla á útsetningu fyrir nikótíni hjá föður til að kanna fjölkynslóða og kynslóðafjölda áhrif útsetningar fyrir nikótíni. Þrátt fyrir að aðrar rannsóknir sem fundu fjöl-/kynslóðarsvipgerðir eftir útsetningu fíkniefna hjá föður, þar á meðal kókaíni46 og morfíni,62 hafi ekki fundið neinn mun á umönnun móður, er mögulegt að útsetning fyrir nikótíni hjá föður geti haft áhrif á umönnun móður. Framtíðarrannsóknir sem rannsaka áhrif á umönnun mæðra eru réttlætanlegar. Þar sem núverandi áhersla okkar var á váhrif föður, ætti framtíðarvinna einnig að bera saman áhrif váhrifa af föður vs móður. Á heildina litið veita þessar niðurstöður nýjan skilning á fjölkynslóða og kynslóðaáhrifum útsetningar fyrir nikótíni, sem eru studd af vaxandi bókmenntum sem einkenna fjölkynslóða og kynslóðaáhrif útsetningar fyrir lyfjum (eins og skoðað er í Goldberg og Gould47). Þessi rannsókn var sú fyrsta til að prófa samhengisbundna óttaskilyrði í F1 og F2 afkvæmum karlmanna sem voru útsettir fyrir nikótíni og greindi aukna myndun óttaminnis og sjálfkrafa endurheimt óttaminninga. Þessi rannsókn var einnig sú fyrsta til að bera kennsl á breytta sjálfsgjöf nikótíns og ræktun þrá hjá F1 afkvæmum sem verða fyrir nikótíni.

Mismunandi metýlering í genum sem tengjast áfallastreituröskun og vanstjórnun á HPA-ás sem og samhliða truflun á streitutengdum umritunarferlum fundust í NIC-Sired músum. Nikótín af föðurætt var einnig tengt minnkaðri kólínvirkri starfsemi hippocampus og aukinni hippocampal nAChR bindingu. Athyglisvert er að sjúklingar með áfallastreituröskun, sem reyktu ekki, sýna marktækt meiri nAChR-bindingu með hásækni í heilaberki63, og áfallastreituröskun tengist meiri hræðsluskilyrðum og sjálfkrafa endurheimt slökktra óttaminninga.64 Saman benda niðurstöður okkar til þess að útsetning fyrir nikótíni geti haft fjölkynslóðaáhrif auka næmi afkvæma fyrir áfallastreituröskun-líkum einkennum. Þessi niðurstaða ásamt öðrum nýlegum niðurstöðum sem sýna fjölkynslóða áhrif útsetningar fyrir nikótín á vitræna sveigjanleika2 benda til þess að neikvæðar heilsufarslegar afleiðingar útsetningar fyrir nikótíni hafi breiðari net en áður var talið.

Cistanche þykkni

HEIMILDIR

1 Dai J, Wang Z, Xu W, o.fl. Útsetning föður fyrir nikótín skilgreinir mismunandi hegðun í síðari kynslóð með ofmetýleringu á mmu-miR-15b. Sci Rep. 2017;7(1):7286.

2. McCarthy DM, Morgan TJ Jr, Lowe SE, o.fl. Nikótínútsetning karlmúsa veldur hegðunarskerðingu hjá mörgum kynslóðum afkomenda. PLoS Biol. 2018;16(10):e2006497.

3. Zhu J, Lee KP, Spencer TJ, Biederman J, Bhide PG. Kynslóðaflutningur á ofvirkni í múslíkani af ADHD. J Neurosci. 2014;34(8):2768-2773.

4. Cummings KM, Proctor RN. Breyting almennings ímynd reykinga í Bandaríkjunum: 1964-2014. Krabbameinsfaraldur Biomarkers Prev. 2014;23(1):32‐36.

5. Huang LL, Kowitt SD, Sutfin EL, Patel T, Ranney LM, Goldstein AO. Rafsígarettunotkun meðal framhaldsskólanema og tengsl þess við sígarettunotkun og reykingar, North Carolina Youth Tobacco Surveys, 2011 og 2013. Prev Chronic Dis. 2016;13:E103.

6. Holliday ED, Nucero P, Kutlu MG, o.fl. Langtímaáhrif langvarandi nikótíns á tilfinningalega og vitræna hegðun og frumuformgerð hippocampus í músum: samanburður á útsetningu fyrir nikótíni fullorðinna og unglinga. Eur J Neurosci. 2016;44:2818-2828.

7. Johnson JG, Cohen P, Pine DS, Klein DF, Kasen S, Brook JS. Samband sígarettureykinga og kvíðaraskana á unglingsárum og snemma á fullorðinsárum. JAMA. 2000;284:2348-2351.

8. Jung Y, Hsieh LS, Lee AM, o.fl. Epigenetic vélbúnaður miðlar þroska nikótínáhrifum á uppbyggingu og hegðun taugafrumna. Nat Neurosci. 2016;19(7):905-914.

9. Gitik M, Holliday ED, Leung M, o.fl. Kólín dregur úr námsskorti fullorðinna og snýr við epigenetic breytingu á krómatín endurgerð þáttum sem tengjast nikótíni unglinga. Neurobiol Lærðu Mem. 2018;155:239-248.

10. Fugl A. Skynjun á erfðafræði. Náttúran. 2007;447:396-398.

11. Skinner MK. Erfðir milli kynslóða í umhverfinu og mítósustöðugleika í líkamanum. Epigenetics. 2011;6:838-842.

12. Davis JA, Gould TJ. Félagsnám, hippocampus og nikótínfíkn. Curr Drug Abuse Rev. 2008;1:9‐19.

13. Kutlu MG, Parikh V, Gould TJ. Nikótínfíkn og geðsjúkdómar. Int Rev Neurobiol. 2015;124:171-208.

14. Parikh V, Kutlu MG, Gould TJ. nAChR truflun sem algengt hvarfefni fyrir geðklofa og samhliða nikótínfíkn: núverandi þróun og sjónarmið. Schizophr Res. 2016;171:1-15.

15. Kenney JW, Raybuck JD, Gould TJ. Nikótínviðtakar í dorsal og ventral hippocampus móta á mismunandi hátt samhengislegri óttaskilyrðingu. Hippocampus. 2012;22:1681-1690.

16. Wilkinson DS, Turner JR, Blendy JA, Gould TJ. Erfðafræðilegur bakgrunnur hefur áhrif á áhrif fráhvarfs frá langvarandi nikótíni á nám og bindingu nikótínasetýlkólínviðtaka með mikilli sækni í bak- og kviðhjúpi. Sállyfjafræði (Berl). 2013;225(1): 201–208.

17. Davis JA, Gould TJ. Áhrif DHBE og MLA á nikótín-framkallaða aukningu á samhengishræðslu í C57BL/6 músum. Sállyfjafræði (Berl). 2006;184:345-352.

18. Kutlu MG, Zeid D, Tumolo JM, Gould TJ. Fyrir unglings- og unglingsmýs eru minna næmar fyrir áhrifum bráðs nikótíns á útrýmingu og sjálfsprottinn bata. Brain Res Bull. 2018;138:50-55.

19. Kutlu MG, Gould TJ. Bráð nikótín seinkar útrýmingu samhengisótta í músum. Behav Brain Res. 2014;263:133-137.

20. Benowitz NL, Hukkanen J, Jacob P 3. Nikótínefnafræði, efnaskipti, hreyfifræði og lífmerki. Í: Nikótínsállyfjafræði. Berlín, Heidelberg: Springer; 2009:29-60.

21. Davis JA, James JR, Siegel SJ, Gould TJ. Fráhvarf frá langvarandi nikótíngjöf dregur úr samhengishræðslu í C57BL/6 músum. J Neurosci. 2005;25:8708-8713.

22. Petersen DR, Norris KJ, Thompson JA. Samanburðarrannsókn á ráðstöfun nikótíns og umbrotsefna þess í þremur innræktuðum músastofnum. Drug Metab Losun. 1984;12:725-731.

23. Gould TJ, Portúgal GS, Andre JM, o.fl. Lengd nikótínfráhvarfstengdra skorts í samhengishræðsluskilyrðum er samhliða breytingum á uppstillingu nikótínasetýlkólínviðtaka með mikilli sækni í hippocampus. Taugalyfjafræði. 2012;62:2118-2125.

24. Kutlu MG, Oliver C, Huang P, Liu-Chen LY, Gould TJ. Skerðing á útrýmingarhættu í samhengi vegna langvarandi nikótíns og fráhvarf frá langvarandi nikótíni tengist nAChR uppstjórnun hippocampus. Taugalyfjafræði. 2016;109:341-348. 25. Damaj MI, Kao W, Martin BR. Einkenni sjálfkrafa og útfelldrar nikótínfráhvarfs í músum. J Pharmacol Exp Ther. 2003;307:526-534.

26. Fowler CD, Lu Q, Johnson PM, Marks MJ, Kenny PJ. Habenular alfa5 nikótínviðtaka undireining boðefna stjórnar nikótíninntöku. Náttúran. 2011;471:597-601.

27. Lomazzo E, MacArthur L, Yasuda RP, Wolfe BB, Kellar KJ. Magngreining á heterómerískum nikótínviðtökum í taugafrumum í hippocampus hjá rottum. J Neurochem. 2010;115:625-634.

28. Turner JR, Castellano LM, Blendy JA. Samhliða kvíðastillandi áhrif og uppstjórnun á nikótínacetýlkólínviðtökum í taugafrumum eftir langvarandi nikótín og vareniclín. Nikótín Tob Res. 2011;13:41-46.

29. Parikh V, Ji J, Decker MW, Starter M. Prefrontal beta2 undireiningu sem inniheldur og alfa7 nikótín asetýlkólínviðtakar stjórna á mismunandi hátt glútamatergic og cholinergic boðskap. J Neurosci. 2010;30: 3518-3530.

30. Parikh V, Starter M. Framheila kólínvirk kerfi og vitsmuni: ný innsýn byggð á hraðri uppgötvun á kólín toppum með því að nota lífskynjara sem byggja á ensímum. Í: Microelectrode Biosensors. Totowa, NJ: Humana Press; 2013:257-277.

31. Fanselow MS, Dong HW. Eru dorsal og ventral hippocampus starfrænt aðgreindar byggingar? Taugafrumur. 2010;65(1):7‐19.

32. Kim D, Pertea G, Trapnell C, Pimentel H, Kelley R, Salzberg SL. TopHat2: nákvæm röðun umrita í viðurvist innsetningar, úrfellinga og genasamruna. Erfðamengi Biol. 2013;14(4): R36.

33. Afgan E, Baker D, van den Beek M, et al. Galaxy vettvangurinn fyrir aðgengilegar, endurgerðanlegar og samvinnu líflæknisfræðilegar greiningar: 2016 uppfærsla. Nucleic Acids Res. 2016;44:W3‐w10.

34. Trapnell C, Williams BA, Pertea G, o.fl. Uppskriftarsamsetning og magngreining með RNA-Seq leiðir í ljós óskilgreind afrit og ísóformaskipti við frumuaðgreiningu. Nat Biotechnol. 2010;28(5): 511-515.

35. Benjamini Y, Drai D, Elmer G, Kafkafi N, Golani I. Að stjórna fölskum uppgötvunartíðni í rannsóknum á hegðunarerfðafræði. Behav Brain Res. 2001; 125(1-2):279-284.

36. Kramer A, Green J, Pollard Jr, Tugendreich S. Orsakagreiningaraðferðir í hugvitsbrautargreiningu. Lífupplýsingafræði. 2014;30(4): 523-530.

37. Kuleshov MV, Jones MR, Rouillard AD, o.fl. Enrichr: alhliða genasett auðgunargreining vefþjóns 2016 uppfærsla. Nucleic Acids Res. 2016;44(W1): W90–W97.

38. Wendt J, Rosenbaum H, Richmond TA, Jeddeloh JA, Burgess DL. Markviss bísúlfít raðgreining með SeqCap epi auðgunarkerfinu. Aðferðir Mol Biol. 2018;1708:383-405.

39. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: sveigjanlegur trimmer fyrir Illumina röð gögn. Lífupplýsingafræði. 2014;30(15):2114‐2120.

40. Langmead B, Salzberg SL. Fljótleg uppröðun með Bowtie 2. Nat Methods. 2012;9(4):357-359.

41. Krueger F, Andrews SR. Bismark: sveigjanlegur aligner og metýleringarkall fyrir Bisulfite-Seq forrit. Lífupplýsingafræði. 2011;27(11):1571-1572.

42. Akalin A, Kormaksson M, Li S, et al. methylKit: alhliða R-pakki til greiningar á DNA-metýleringarprófílum í genamengi. Erfðamengi Biol. 2012;13(10): R87.

43. Gould TJ, Lommock JA. Nikótín eykur hræðsluskilyrði í samhengi og dregur úr skorti af völdum etanóls í samhengishræðslu. Hegðu þig Neurosci. 2003;117(6):1276-1282.

44. Fowler CD, Kenny PJ. Sjálfsgjöf nikótíns í bláæð og endurnýjun af völdum vísbendinga í músum: áhrif nikótínskammta, hraða lyfjainnrennslis og fyrri þjálfunar. Taugalyfjafræði. 2011;61(4):687-698.

45. Gould TJ, Wehner JM. Nikótínaukning á samhengislegri óttaskilyrðingu. Behav Brain Res. 1999;102(1-2):31-39.

46. ​​Vassoler FM, White SL, Schmidt HD, Sadri‐Vakili G, Pierce RC. Epigenetic arfleifð kókaínónæmis svipgerðar. Nat Neurosci. 2013;16(1):42‐47.

47. Goldberg LR, Gould TJ. Fjölkynslóða og kynslóðaskipti áhrif af útsetningu föður fyrir misnotkunarlyfjum á hegðun og taugastarfsemi. Eur J Neurosci. 2018;50(3):2453-2466.

48. Zhang JJ, Jiang FZ, Zheng W, o.fl. DNMT3a í hippocampal CA1 skiptir sköpum við öflun morfíns sjálfsgjafar hjá rottum. Fíkill Biol. 2019;▪:▪‐▪.

49. Schwartz RD, Kellar KJ. Nikótín kólínvirk viðtaka bindistaðir í heila: stjórnun in vivo. Vísindi. 1983;220(4593):214-216.

50. Logue SF, Paylor R, Wehner JM. Skemmdir á hippocampus valda námsbrestum hjá innræktuðum músum í Morris vatnsvölundarhúsinu og skilyrtum ótta. Hegðu þig Neurosci. 1997;111(1):104-113.

51. Zhang WN, Bast T, Feldon J. Ventral hippocampus og hræðsluskilyrði í rottum: mismunandi anterograde minnisleysi af ótta eftir innrennsli N-metýl-D-aspartats eða ósamkeppnis mótlyfs þess MK-801 í kviðhjúpinn. Behav Brain Res. 2001;126(1-2):159-174.

52. Maren S, Holt WG. Hippocampus og Pavlovian óttast ástand hjá rottum: innrennsli muscimols í kvið, en ekki bakið, hippocampus skerða öflun skilyrtrar frystingar til hljóðræns skilyrts áreitis. Hegðu þig Neurosci. 2004;118(1):97-110.

53. Staib JM, Della Valle R, Knox DK. Truflun á miðlægum septum og skáböndum Broca kólínvirkra útvarpa til kviðhjúpsins truflar heyrnarhræðsluminnið. Neurobiol Lærðu Mem. 2018;152:71-79.

54. Vasquez JH, Leong KC, Gagliardi CM, Harland B, Apicella AJ, Muzzio IA. Leiðarsértæk virkjun kviðhjúpsfrumna sem stökkva út í forlimbic cortex dregur úr endurnýjun ótta. Neurobiol Lærðu Mem. 2019;161:63-71.

55. LeDoux JE, Cicchetti P, Xagoraris A, Romanski LM. The lateral amygdaloid nucleus: skynjunarmót amygdala í hræðsluskilyrðum. J Neurosci. 1990;10(4):1062-1069.

56. Jones PA. Aðgerðir DNA metýleringar: eyjar, upphafsstaðir, genalíkama og víðar. Nat Rev Genet. 2012;13(7):484-492.

57. Tanaka M, Li H, Zhang X, o.fl. Svæðis- og tímaháð genastjórnun í amygdala og fremri cingulate heilaberki í PTSD-líku músarlíkani. Mol Brain. 2019;12(1):25.

58. Bindi EB. Hlutverk FKBP5, meðfylgjandi sykursteraviðtaka í meingerð og meðferð á tilfinninga- og kvíðaröskunum. Psychoneuroendocrinology. 2009;34 (fylgi 1): S186-S195.

59. Sarapis C, Cai G, Bierer LM, o.fl. Erfðavísar fyrir áfallastreituröskun og seiglu meðal þeirra sem lifðu af World Trade Center árásirnar. Dis Markers. 2011;30(2-3):101-110.

60. Yehuda R, Daskalakis NP, Desarnaud F, o.fl. Epigenetic lífmerki sem spá og fylgni um bata einkenna í kjölfar sálfræðimeðferðar hjá vopnahlésdagurinn í bardaga með áfallastreituröskun. Front Psych. 2013;4:118.

61. Yehuda R, Cai G, Grolier JA, o.fl. Genatjáningarmynstur sem tengist áfallastreituröskun eftir útsetningu fyrir World Trade Center árásunum. Biol geðdeild. 2009;66:708-711.

62. Li CQ, Luo YW, Bi FF, o.fl. Þróun kvíðalíkrar hegðunar með hippocampal IGF-2 merkjum hjá afkvæmum morfíns útsetningar foreldra: áhrif auðgaðs umhverfis. Taugasállyfjafræði. 2014;39(12):2777-2787.

63. Czermak C, Staley JK, Kasserman S, o.fl. beta2 Nikótín asetýlkólínviðtaka aðgengi í áfallastreituröskun. Int J Neuropsychopharmacol. 2008;11(3):419-424.

64. Milad MR, Pitman RK, Ellis CB, o.fl. Taugalíffræðilegur grundvöllur þess að ekki er hægt að muna útrýmingarminni í áfallastreituröskun. Biol geðdeild. 2009;66(12):1075-1082.