Part2: DHHC21 skortur dregur úr nýrnastarfsemi við rotþróaskaða

Hafðu sambandtina.xiang@wecistanche.com

Umræða

Í þessari vinnu greinum við frá DHHC21 sem nýrri eftirlitsaðila fyrir gegnflæði og virkni nýrna við rotþróaskaða. Nýjar niðurstöður okkar benda til: (1) Zdhhc21devde? mýs sýna betri nýrnastarfsemi og minni nýrnaskemmdir eftir rotþróaskaða samanborið við WT mýs;(2) DHHC21 virkniskortur varðveitir gegnflæði í nýrnavef, súrefnismettun og RBF við rotþróaskaða;(3)DHHC21-hvatuð alAR palmitoylering er sem þarf til að virkja alAR merkjaferil og alAR-framkallaða þrengingu nýrnaslagæða. Þessi rannsókn veitir nýja vélræna innsýn í stjórnun nýrnaflæðis og virkni við rotþróaskaða. Við leggjum til að DHHC21 virkniskortur veiti verndandi áhrif ánýrnastarfsemií rotþróaskaða og að hömlun á DHHC21 gæti þjónað sem lækningaaðferð til að berjast gegntruflun á nýrnastarfsemivið rotþróaskaða.

Smelltu hér til að vita kosti cistanche tubulosa þykkni

Ofgnótt/súrefnisskortur í nýrnavef er ein helsta orsök nýrnabilunar við rotþróaskaða3-5. Við fundum blóðflæði í nýrum í músum eftir CLP sem sést af veikt MSOT merkjastyrk heildarhemóglóbíns, minni súrefnismettun í nýrnavef og minnkað RBF eftir rotþróaskaða. Í samræmi við niðurstöður okkar hefur minnkun á RBF sést hjá blóðsýkingarsjúklingum með nýrnaskaða sem og í stórdýralíkönum af rotþróaskaða7,10l1. Rétt er að taka fram að nokkrar rannsóknir benda til þess að skert nýrnastarfsemi geti þróast hjá dýrum með blóðsýkingu með óbreyttum hætti. eða jafnvel hækkað RBF334. Þessar misvísandi niðurstöður má rekja til mismunandi dýralíkana og aðferða sem notaðar eru til að mæla blóðflæði. Til dæmis, á meðan CLP af völdum fjölörveru rotþróaskaða hefur verið almennt notað, nota sumar rannsóknir inndælingu Escherichia coli35 í bláæð.

Nýlega hefur verið greint frá próteinpalmitóýleringu sem nýr eftirlitsaðili próteinvirkni, sem tekur þátt í meingerð og framgangi margra sjúkdóma. Það var fyrst auðkennt sem ný tegund breytinga eftir þýðingu af Schmidt et al.3637. Uppgötvun DHHC fjölskyldunnar hafði síðan stuðlað að hraðri stækkun þessa sviðs38,39. Tilkynnt hefur verið um hlutverk palmitoylation og PATs í fjölmörgum lífeðlisfræðilegum og sjúklegum sjúkdómum, þar á meðal fituefnaskiptum,krabbamein, hjarta- og æðasjúkdóma, og taugasjúkdóma23,0,4. Þrátt fyrir að áður hafi verið greint frá þátttöku palmitoylering í fjölblöðrunýrnasjúkdómi og nýrnakrabbameini23., hafa verið mjög takmarkaðar rannsóknir sem rannsaka virknihlutverk PAT ínýrnasjúkdóma, sérstaklega við skerta nýrnastarfsemi við rotþróaskaða. Eftir því sem við best vitum erum við fyrst til að rannsaka hlutverk DHHC2l í nýrnastarfsemi við rotþróaskaða. Niðurstöður okkar benda til þess að hömlun á DHHC21 bjargar nýrnastarfsemi mjög og varðveitir uppbyggingu nýrna við rotþróaskaða.

Rannsókn okkar sem notar Zdhhc21dp/d4? mýs sýna fram á að jákvæð áhrif DHHC21-starfsskorts á nýrnastarfsemi eru rakin til getu þess til að bæta gegnflæði nýrnavefs við rotþróaskaða. Við grunnskilyrði sýna Zdhhc21ewaeP mýs engin merki um salt/vatnsójafnvægi eða nýrnaskemmdir á uppbyggingu/virkni5. Samt bætir DHHC21 tap á virkni niður rotþróaskaða af völdum RBF, nýrnaflæðis og súrefnismettunar í nýrum. Aukið æðaviðnám í nýrum af völdum of mikillar æðasamdráttar í nýrum er talin aðalástæða fyrir skertri nýrnavefsflæði við rotþróaskaða6.9. Niðurstöður okkar benda til þátttöku alAR í að miðla blóðflæðisskaða af völdum blóðflæðis í nýrnavef, eins og sést af aukningu á alAR palmitoylering og virkjun alAR merkjaleiðar í rotþróaskaða. Hins vegar hindrar DHHC21 virkniskortur alARpalmitóýleringu og leiðir til skertrar getu alAR til að virkja niðurstreymisáhrifa sinn og miðla æðasamdrætti af völdum fenýlefríns í nýrnaslagæðum.

"Það á enn eftir að skýra að fullu þann sameindabúnað sem liggur að baki stjórnun alAR virkni með DHHC21. Gallinn í alAR virkni af völdum DHHC21 taps á virkni má rekja til formbreytingar alAR. Margir GPCRs treysta á palmitoylation fyrir viðeigandi innanfrumu sköpulag, Áfastur palmitat í C-enda hala GPCRs sest inn í plasmahimnuna til að búa til fjórðu innanfrumu lykkjuna, sem er nauðsynleg fyrir samspil GPCRs við makaprótein þeirra og fjölgun GPCR merkja17,4 Fyrri rannsókn hefur gefið til kynna að palmitoylering á Albar eigi sér einnig stað á C-enda svæði þess44. Þess vegna getur skortur á DHHC21-miðlaðri lAR palmitoylering breytt innanfrumugerð alAR og hindrað þannig útbreiðslu lAR merkja. Þetta er hægt að styðja. með niðurstöðum okkar sem sýna að virkjun ERK, sem er niðurstreymismerkisviðburður alAR virkjunar, er hindruð í Zdhhc21devider músum sem verða fyrir sept. ic meiðsli. Hins vegar þarf að staðfesta enn frekar DHHC21-stýrða svæðisfræði alAR karboxýlenda með röntgenkristöllun.

Annar nýr þáttur í rannsókn okkar er notkun MSOT til að meta nýrnaflæði og virkni við rotþróaskaða. MSOT hefur verið tilkynnt sem merkilausa aðferð til að mæla gegnflæði mismunandi líffæra og áreiðanlega myndgreiningartækni til að ákvarða nýrnastarfsemi2832,45. Í samanburði við Doppler flæðimælirinn sem leyfir ekki sjónræningu á öræðum45, myndar MSOT myndir með mikilli staðbundinni upplausn við 150 um á sama tíma og hún veitir magnbundið mat á gegnflæðisstöðu í smáæðum nýrna. Vatnsleysanlegt IRDye800CW er öruggt sporefni til að nota til að mæla nýrnaúthreinsun og það veldur ekki eiturverkunum við allt að 20 mg/kg skammta. Tveggja fasa hreyfing IRDye800CW sem við sáum er í samræmi við áður birtar rannsóknir. MSOT upptökur okkar benda til meiri Tmax-töf í nýrnasýkingu, sem bendir til skertrar nýrnaúthreinsunar. Rannsókn á nýrnakvilla sýnir að skert nýrnastarfsemi sem MSOT greinir er marktæk fylgni við vefjaskemmdir á gaukla30. Gögn okkar, í samræmi við fyrri útgáfur, benda til þess að MSOT sé lágmarks ífarandi og áreiðanleg tækni til að fylgjast með nýrnaflæði og virkni.

Sem stendur eru engir DHHC21-sérstakir hemlar í boði. Algengasta PAT hemillinn er 2-BP sem hefur víðtæk áhrif á mörg DHHC og truflar einnig fitusýruefnaskipti47. Þannig væri vænleg stefna að þróa litla sameindahemla sem miða sérstaklega að DHHC21. Það er líka þess virði að benda á að alAR er ekki eina hvarfefnið DHHC21. Nokkur önnur DHHC21 hvarfefni hafa nýlega verið auðkennd, þar á meðal blóðflagnaæðaþelsfrumuviðloðunarsameind (PFCA M-1), estrógenviðtaka caveolin-1, köfnunarefnisoxíðsyntasa (eNOS), Fyn, superoxíð dismutasi (SOD{{) 8}}), og PLCB122,41,4s,49, Þó að þau séu utan viðfangs þessarar rannsóknar, getum við ekki útilokað að þessi hvarfefni geti einnig haft áhrif á nýrnastarfsemi við rotþróaskaða.

Að lokum sýnir þessi rannsókn í fyrsta skipti að DHHC21 gegnir mikilvægu hlutverki við að stjórna nýrnaflæði við rotþróaskaða með aðferðum sem fela í sér alAR palmitoylering og alAR-miðlaða æðasamdrátt. Ennfremur hefur hömlun á DHHC21 verndandi áhrif á nýrnastarfsemi við rotþróaskaða.

efni og aðferðir

Hvarfefni. Öll hvarfefni eru skráð í viðbótartöflu S1.

Dýr. Zdhhc21depher mýs og villigerðarviðmiðunarmýs þeirra (B6C3Fe) voru keyptar frá Jackson Laboratory. Arfgerð Zdhhc21dephe? mýs voru staðfestar með raðgreiningu (Genewiz, Inc., NJ, USA). Grunnur sem notaður var við raðgreiningu voru: AGCTGACTGAAGGGCACC(áfram) og AAAACCTGTAACGCATTTCCA (aftur)23. Dýrum var haldið undir 12/12-klst. ljós/myrkri hringrás með frjálsan aðgang að mat og vatni. Mýs (16-20 vikur) af báðum kynjum voru notaðar í þessa rannsókn. Allar dýratilraunir eru samþykktar af háskólanum í Suður-Flórída Institutional Animal Care and Use Committee og eru í samræmi við NIH Guide for the Care and Use of Laboratory

Cecal binding og gata, Mýs voru svæfðar með ísóflurani (3 prósent framköllun og 1 prósent viðhald). Skurður á miðlínu var gerður í rakaða kviðarholssvæðið, og blindtarmurinn var tekinn utan, þétt bundinn 5 mm fyrir neðan ileocecal lokuna og götótt tvisvar með 20-mælinál fjarlægt bindipunktinum. Einn mm af saur var pressaður úr hverju stungugati. Þá var blindtoppurinn færður aftur og kviðurinn lokaður í tveimur lögum. 37 C Lactated Ringer lausn var borin á staðbundið til að koma í veg fyrir að cecum þornaði. Músum var síðan gefið 37 gráður 0,9 prósent saltvatn undir húð til að endurlífga vökva. Fyrir aðgerð var gefinn 0.5-1,5 mg/kg skammtur af búprenorfíni með forðalosun í verkjastillingu. Sham mýs voru látnar fara í sömu skurðaðgerð en án hálsbindi og stungu50,51.

Multispectral optoacoustic sneiðmyndataka. Mat á útskilnaði IRDye8 um nýru00CW. Mýs voru svæfðar með ísóflúrani og afhúðaðar í kringum búksvæðið. Mýs voru teknar af myndum með Altera Medical MSOT myndgreiningarkerfinu (München, Þýskalandi) á mörgum bylgjulengdum: 700,730,760,775,785, 800,850 nm á hraðanum 10 rammar/s. Mýs voru settar í liggjandi stöðu í haldara og færðar meðfram lárétta línulega stiginu til að staðsetja nýrun ofan á íhvolfa transducerinn sem er festur staðsettur. Eftir grunnlínuskráningu var 60 nmól af RDve800CW uppleyst í 100 ul af 0,9 prósent saltvatni sprautað í bláæð á 10 sekúndum. Myndir voru endurgerðar með bakvörpun formúlu og unnar með fjölrófsgreiningu. Áhugaverð svæði (ROIs) voru dregin í kringum nýrnaberki og merg/grindarsvæði og tímabundnar breytingar á MSOT merki í arðsemi voru sýndar.

Measurement of renal perfusion. Mice were prepared for MSOT imaging utilizing the same procedures mentioned above. Mouse respiration was closely monitored throughout the entire procedure. Images were reconstructed and spectral unmixing was performed. ROIs were drawn around the entire right kidney region. Mean pixel intensities of oxygenated hemoglobin (HbO,) and deoxygenated hemoglobin (Hb) were acquired. Total hemoglobin (HbT=HbO,+ Hb) and oxygen saturation (So=HbO, /HbT) were then calculated>2.

Vefmeinafræði nýrna. Nýru voru fest, skorin meðfram sagittal planinu og unnin fyrir paraffínísetningu. Hlutar (5 μm) voru af-paraffínaðir, endurvötnaðir og oxaðir með periodínsýru í 8 mínútur við stofuhita (RT), fylgt eftir með ræktun með Schiff's lausn í 25 mínútur. Hlutar voru síðan mótlitaðir með hematoxýlíni. Myndir voru teknar með Keyence BZ-X710 (Itasca, IL, Bandaríkjunum). Skipulagsskemmdir nýrna voru metnir út frá eftirfarandi einkennum: galla í gaukla, tapi á burstamörkum nærpípla, lofttæmingu, útvíkkun pípluþekju, losun pípla/dreps og íferð daufkyrninga. Hver eiginleiki var metinn á kvarðanum 0-5 miðað við alvarleika.

Mæling á kreatíníni og þvagefni í blóði. Músablóði var safnað með hjartastungu 24 klst. eftir rotþróaskaða. Plasma var myndað með því að skila blóðinu í skilvindu við 2500g í 15 mínútur við RT. Mæling á kreatíníni: plasma var afpróteinað með því að nota 10-kDa snúningssúlu; magn kreatíníns í síuvökvanum var síðan mælt með kreatíníngreiningarsetti. Magn þvagefnisköfnunarefnis í blóði (BUN) var ákvarðað með þvagefnisnitrogen litagreiningarsetti samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.

Mæling á RBF og MAP. Mýs voru svæfðar með ísóflúrani. Blóðþrýstingsmælirinn var settur inn í hálsslagæðina. Miðlínuskurður var gerður á kviðarsvæðinu og síðan vinstri þverskurður til að afhjúpa nýrnaslagæðina. RBF var mæld með ómskoðun flutningstíma flæðimælis (TS-420; Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, Bandaríkjunum). Eftir að flæðismælirinn var settur í kringum nýrnaslagæðina var músum leyft að vera stöðugar í að minnsta kosti 30 mínútur. RBF og MAP voru skráð samtímis með PowerLab (AD Instruments, Colorado Springs, CO, Bandaríkjunum). Gögnin voru greind með LabChart Pro útgáfu 7 hugbúnaði4,55

Handtaka með trjákvoða. Nýrnaslagæðum var safnað og leyst í lýsisjafna (100 mM HEPES.25 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 μM palmostatín B, próteasahemlar, pH 7,4）22, 56. Vefjalýsi voru ræktuð með blokkandi jafnalausn (100 mM HEPES.1 mM EDTA, 2,5 prósent SDS, 6 ul/ml MMTS, pH 7,4) við 50 gráður C í 30 mínútur með stöðugri hringiðu. Eftir útfellingu með köldu asetoni voru próteinin pelletrað með skilvindu við 5000g í 30 mínútur og þvegið fimm sinnum með 70 prósent köldu asetoni Próteinkögglar voru enduruppleyst í bindandi jafnalausn (100 mM HEPES, 1,0 prósent SDS, 1 mM EDTA, pH 7,4). Hverju próteinsýni var skipt í tvo jafna hluta hvor um sig fékk sama magn af ísóprópýl sepharose 6B perlum, Hydroxvlamine (0,2 M, pH 7,4) og NaCl (0,2 M) bætt í hvern hluta, í sömu röð. Eftir 4 klst af ræktun við RT. með stöðugum snúningi voru palmitoyleruð prótein skoluð út með 50 mM DTT í 1×Sample Buffer og safnað fyrir SDS-PAGE.

Western blotting. Mæling á palmitoylated lAR. Sýnum sem safnað var frá RAC var hlaðið á 4-20 prósent Tris-Glycine hlaup og flutt yfir á nítrósellulósahimnu eftir rafdrætti. Eftir blokkun í 1 klst við RT var alAR rannsakað með kanínum and-lAR aðal mótefni (1:500) yfir nótt við 4 gráður. Eftir þvott þrisvar með TBST var himnan ræktuð með IRDye800CW asnamótefni gegn kanínu (1:20,000) í 45 mínútur við RT.

Mæling á ERK fosfórun. Nýrnaslagæðar voru greindar í 1×RIPA sem innihélt próteasa og fosfatasa hemla. Himnan var rannsökuð með kanínu and-ERK(1:1000) og músa andfosfórýleruðum ERK (1:1000) mótefnum. Mótefni IRDye800CW asna gegn mús og IRDye680RD asna gegn kanínu voru notuð til aukaræktunar (1:20.000). Himnurnar voru myndaðar og greindar með Li-COR Odyssey CLx.

Mat á æðavirkni með vírvöðvariti. Nýrnaslagæðar músa. Nýrnaslagæðar（{{0}} μm í þvermál) voru einangraðar úr WT og Zdhhc21dp/de músum og sökkt í ísköld súrefnisrík (95 prósent O,/5 prósent CO.) lífeðlisfræðilega saltlausn (PSS,13{ {47}} mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,18 mM KH, PO, 1,17 mM MgSO.7H,O, 14,9 mM NaHCO, 5,5 mM glúkósa, 0,026 mM EDTA og 1,6 mM CaCl, pH 7,4). 2 mm að lengd) voru festir á vírmyograph hólfið (Living Systems Instrumentation, VT, USA) á milli tveggja wolfram víra (30 um í þvermál). Ísómetrísk spenna var skráð með Living Systems merkjakælibúnaði (MYO-SC-1) ásamt LabScribe v4 iWorks hugbúnaði. Eftir að hafa náð jafnvægi í 30 mínútur við 37 gráðu Cin PSS, var stöðlunaraðferðin framkvæmd til að ákvarða ákjósanlegt innra ummál L,=0.9×L(Lo=innra ummál sem samsvarar 100 mmHg þrýstingi yfir vegginn) . Næst var lífvænleiki æðanna prófaður með 60 mMKPSS (74,7 mM NaCl, 60 mM KCl, 1,18 mM KH, PO.1,17 mM MgSO.7H, O, 14,9 mM NaHCO, 5,5 mM glúkósa, 0,026 mM EDTA, 1,6 mM CaCl, 1,6 mM 7.4). Æðar sem svöruðu ekki KPSS var fargað. Slagæðarnar voru meðhöndlaðar með vaxandi styrk fenýlefríns (10 nM -30 μM). Heilleiki æðaþels var síðan metinn með asetýlkólíni (10 μM). Styrkunar-svörunarferlar voru smíðaðir.

Litlar slagæðar frá nýrum manna. Litlar slagæðar (~1000 um í þvermál) voru krufðar úr ósnortnum lífvænlegum nýrum úr mönnum sem var hafnað fyrir ígræðsluaðgerð. Skipahlutar (~2 mm langir) voru festir á I-stangirnar (250 um í þvermál) vírvöðvamyndahólfsins. Svipaðar jafnvægis- og eðlilegar aðgerðir voru gerðar á slagæðum manna. Næst voru æðarnar ræktaðar með burðarefnisstýringu (0,02 prósent DMSO í PSS) í 1 klst. Skipin voru síðan prófuð með tilliti til lífvænleika með 60 mM KPSS og meðhöndluð með vaxandi styrk fenýlefríns (10 nM -30 uM). Eftir þvott voru ílátin ræktuð með 2-BP(100 uM) í 1 klst; lífvænleiki skipsins var síðan prófaður aftur með 60 mM KPSS með 100 uM 2-BP. Litlu slagæðunum með engin eða minni svörun við KPSS var hent. Æðarnar voru síðan ögraðar með sama styrk af fenýlefríni og síðan acetýlkólíni (10 uM). Styrkur-svörunarferlar burðarstýringar-eða 2-BP-meðhöndlaðra slagæða voru smíðaðir og bornir saman.

Ónæmisflúrljómun. Nýrnaslagæðar manna voru festar í 10 prósent formalíni í 48 klst., innfelldar í paraffíni og þær skiptar. Skyggnur voru síðan afparaffínaðar, endurvökvaðar og gegndreyptar með PBS sem innihélt 0,05 prósent Triton X-1002. Eftir lokun voru skyggnur merktar með kanínu-anti-DHHC21 og geita-anti-lAR mótefnum (1:100) yfir nótt við 4 gráður C. Eftir þvott var ræktun á öðru mótefnaefni gerð með asna-anti-kanínu Alexa Fluor 488 og asna gegn geit Alexa Fluor 568(1:500). Eftir uppsetningu með ProLong Diamond festingarmiðli með DAPI, voru glærur teknar upp með Leica SP8 litrófsrófsrófssnúinni leysiskönnun confocal smásjá.

tölfræðigreining. Ítarlegar upplýsingar (td heiti prófsins, post-hoc próf, n gildi, alfastig, p-gildi) fyrir hvert tölfræðilegt próf eru skráðar í viðbótartöflu S2. Öll gögn uppfylla forsendu normaldreifingar. Eðlileikapróf var framkvæmt með því að nota Shapiro-Wilk próf með alfastigi stillt á 0.05. Samanburður á milli tveggja hópa var greindur með t-prófi nemenda (tvíhliða) og þrír hópar eða fleiri voru bornir saman með Einstefnu ANOVA með Tukey post-hoc greiningu. Samanburðurinn fyrir vírvöðvaferla var gerður með því að nota tvíhliða ANOVA.p<0.05 was="" used="" for="" statistical="" significance.="" all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" graphpad="" prism="" 7.0d="" (san="" diego,="" ca,="" usa).="" the="" actual="" values="" for="" all="" quantification="" results="" are="" listed="" in="" supplementary="" table="">