Part1: Endurnýjunaráhrif ólífræns nítrats í kjölfar blóðþurrðar-endurflæðis nýrna

Fyrir frekari upplýsingar. sambandtina.xiang@wecistanche.com

ÁSTANDUR

Bakgrunnur: Nýrnablóðþurrð-endurflæði (IR) skaðier algeng orsök fyrirbráðum nýrnaskaða(AKI), sem tengist oxunarálagi og minni lífvirkni nituroxíðs (NO) og aukinni hættu á þróunlangvinnan nýrnasjúkdóm(CKD) og hjarta- og æðasjúkdóma (CVD). Nýjar aðferðir sem endurheimta redoxjafnvægi geta haft lækningaleg áhrif meðan á AKI stendur og fylgikvilla tengdum þeim.

Markmið: Að kanna lækningalegt gildi þess að efla nítrat-nítrít-NO ferilinn meðan á þróun á IR-örvuðum nýrna- og hjarta- og æðasjúkdómum stendur.

Aðferðir: Karlkyns C57BL/6 J músum var gefið natríumnítrat (10 mg/kg, ip) eða burðarefni 2 klst fyrir hlýja blóðþurrð í vinstra nýra (45 mín) fylgt eftir með natríumnítratuppbót í drykkjarvatninu (1 mmól/kg/ dag) næstu 2 vikur. Blóðþrýstingur og gaukulsíunarhraði var mældur og blóði og nýrum var safnað og notað til lífefna- og vefjagreininga auk rannsókna á hvarfgirni nýrnaæða. Glomerular æðaþelsfrumur útsettar fyrir súrefnisskorti-endursýringu, með eða án angíótensíns Ⅱ, voru notaðar í vélrænar rannsóknir.

Niðurstöður: IR tengdist skertri nýrnastarfsemi og örlítið hækkuðum blóðþrýstingi, ásamt nýrnaskaða, bólgu, truflun á starfsemi æðaþels, aukinni Ang Ⅱ þéttni og Ang II miðlaðri æðavirkni, sem allt var bætt með nítrati. Þar að auki endurheimti meðferð með nítrati (in vivo) og nítríti (in vitro) ENGIN lífvirkni og minnkaði oxunarálag og meiðsli í hvatbera.

Ályktanir: Bráð meðferð með ólífrænu nítrati fyrir nýrnablóðþurrð getur þjónað sem ný lækningaaðferð til að koma í veg fyrir AKI og langvinnan nýrnasjúkdóm og tengda hættu á þróuntruflun á hjarta- og æðakerfi.

Smelltu til að ná í birginn fyrir cistanche reynslu

1. Inngangur

Blóðþurrð-endurflæði (IR) skaði á nýrum, sem tengist ígræðslu, hjartahjáveituaðgerðum og losti, er mikil hætta á að fá bráðan nýrnaskaða (AKI) og síðari langvinnan nýrnasjúkdóm (CKD) [1]. Undirliggjandi aðferðir eru flóknar og fela í sér endurflæðistengda oxunarálag, skort á nituroxíði og virkjun ónæmisfrumna, sem saman leiða til truflunar á starfsemi æðaþels [2, 3]. Áframhaldandi rannsóknir hafa beinst að því að finna nýjar og árangursríkar meðferðir til að koma í veg fyrir og meðhöndla AKI og framvindu þess yfir í langvinnan nýrnasjúkdóm, svo sem fjarlæg blóðþurrðarforsendingu, tímabundinn staðbundinn ofkælingu auk nýrra lyfjafræðilegra inngripa [3,4].

Loftkennda boðsameindin nituroxíð (NO) stuðlar mikilvægu að stjórnun á hjarta- og æðakerfi og nýrnajafnvægi og hefur verið sýnt fram á að gegna verndandi hlutverki við IR meiðsli [5,6]. Hins vegar, meðan á blóðþurrðartilvikinu stendur, skerðir súrefnisskortur virkni NO-syntasa í æðaþels (eNOS), sem getur stuðlað að „engt endurflæði fyrirbæri“ í blóðþurrðarvefnum meðan á endurflæðisfasa stendur. Þetta fjölgar aftur áverka á æðaþekju og pípulaga þekjufrumum [7], sem stuðla að þróun skertrar nýrnastarfsemi. Auk súrefnisskorts á blóðþurrðartímabilinu, óhófleg framleiðsla á hvarfgefnum súrefnistegundum (ROS) sem myndast umfram af nikótínamíði adeníndínúkleótíðfosfati (NADPH) oxidasa og hvatberum meðan á endurflæðisfasa stendur, hreinsar NO [8]. Nýjar aðferðir sem draga úr oxunarálagi og viðhalda ENgri lífvirkni geta haft lækningalegt gildi í baráttunni við nýrnabilun af völdum IR.

Áður var litið á ólífrænt nítrat (NO3) og nítrít (NOZ) sem tiltölulega óvirkar afurðir úr NO umbrotum. Hins vegar hafa rannsóknir sem gerðar hafa verið í meira en tvo áratugi sýnt að þessar anjónir geta gengist undir lífbreytingu, með raðskerðingu, og aftur myndað NO og aðrar lífvirkar köfnunarefnisoxíðtegundir [9]. Virkni þessarar óhefðbundnu nítrat-nítrít-NO ferils eykst við aðstæður með súrefnisskort og lágt pH þegar klassíska NOS kerfið getur orðið óvirkt [10].

Mataræðið, auk NOS kerfisins, er mikilvæg uppspretta nítrats og nítríts í blóðrásinni, vegna mikils nítrats til dæmis í grænu laufgrænmeti. Viðbót með ólífrænu nítrati og nítríti hefur verið tengt jákvæðum áhrifum á hjarta- og æðakerfi, þar á meðal blóðþrýstingslækkun, bæði í tilraunum og klínískum rannsóknum [11]. Líffæraverndandi áhrif hafa einnig verið sýnd í tilraunalíkönum með IR skaða á lifur [12], heila [13], lungum [14] og hjarta [12,15]. Hins vegar er hugsanlegt lækningalegt gildi ólífræns nítrats og nítríts við nýrna IR skaða enn umdeilt. Eins og nýlega var skoðað [5], breytileg útkoma í IR módelum, með því að nota nítrítmeðferð, kannski vegna mismunandi skammta sem notaðir eru, lyfjagjafar, meðferðarlengd, sem og tilraunalíkansins sjálfs [16,17]. Nokkrar tilraunarannsóknir hafa sýnt fram á verndandi áhrif nítratuppbótar í líkönum af hjarta- og nýrnasjúkdómum, með aðferðum sem fela í sér að draga úr oxunarálagi og bæta NO lífvirkni sem og mótun ábólguviðbrögð[5]. Hingað til er takmörkuð þekking til um áhrif ólífrænna nítratmeðferðar á nýrnaskaða. Við höfum áður sýnt fram á að langvarandi formeðferð í mataræði með nítrati dró úr síðari IR-völdum nýrnaskaða [18]. Hins vegar er minni þekking til um hugsanlegt gildi þess að efla nítrat-nítrít-NO ferilinn við upphaf IR til að draga úr hættu á að fá AKI og CKD. Ef það er verndandi gæti þetta haft víðtæka klíníska notkun hjá sjúklingum í hættu á að fá AKI, til dæmis þá sem gangast undir stóra skurðaðgerð.

Í þessari rannsókn notuðum við múslíkan af IR-skaða á nýrna til að kanna hugsanlegan ávinning af bráðri nítratmeðferð strax fyrir blóðþurrðartilvikið. Þetta var sameinað vélrænum ex vivo æðarannsóknum og in vitro frumuræktunartilraunum með nítrítmeðferð. Við gerðum þá tilgátu að ef nítrat-nítrít-NO ferlið eykst myndi stuðla að nýrnavörn gegn IR-skaða með mótun á oxunarálagi og NO lífvirkni sem og starfsemi hvatbera.

2. Aðferðir

2.1.Hvarfefni

Nema annað sé tekið fram voru öll hvarfefni fengin frá Sigma-Aldrich, Svíþjóð.

2.2. Dýra- og nýrnablóðþurrð-endurflæði líkan

C57BL/6 J mýs (karlkyns, 10 vikur) voru fengnar frá Janvier Lab-oratories (Frakklandi) og vistaðar í dýraaðstöðu okkar á Karolinska Institutet við loftslagsstýrðar aðstæður með 12-klst ljós/myrkri hringrás og veittar með venjulegu nagdýrafæði og kranavatni. Allar dýraaðgerðir voru samþykktar af svæðissiðanefnd um dýratilraunir (bókun ID: N139/15) og voru framkvæmdar samkvæmt leiðbeiningum National Institute of Health (NIH) og með tilskipun ESB 2010/63/ESB um framkvæmd tilraunir á dýrum.

Eftir 1 viku af aðlögun var músum gefið lyfleysu (NaCl) eða natríumnítrat (NaNO3) í kviðarhol (10 mg/kg) 2 klst. fyrir einhliða blóðþurrð í vinstra nýra. Hægra nýrað var skoðað en að öðru leyti látið óskert. Sýndaraðgerðir voru gerðar á sama hátt en án þess að klemma vinstra nýra. Mýs voru svæfðar með ísóflurani og líkamshita var haldið við 37 ± 0,5 gráður með því að nota hitalampa og sjálfstýrðan hitapúða alla aðgerðina. Eftir aðgerðina voru mýs meðhöndluð með annaðhvort natríumnítrati (1 mmól/kg/dag) eða lyfleysu í 2 vikur þar til henni var hætt.

2.3. Blóðþrýstingsmæling

Blóðþrýstingur var mældur í músum með því að nota ekki ífarandi tail-cuff aðferð fyrir uppsögn. Mýs voru lagðar á heitan disk við 35 gráður C í 10 mínútur og síðan settar í plasthlífar. Beggi með pneumatic púlsnema var fest við skottið og blóðþrýstingsgildi voru skráð með CODA kerfinu (Kent Scientific, Torrington, CT, Bandaríkjunum). Dýr voru þjálfuð með aðhaldsbúnaðinum á hitaplötunni að minnsta kosti þremur dögum fyrir blóðþrýstingsmælingar. Slagbilsþrýstingur, þanbilsþrýstingur og meðalslagæðaþrýstingur var safnað á 3 dögum í röð og einstaklingsmiðgildi allra viðurkenndra gilda var tekin saman til mats.

2.4.Vefjauppskera

Fyrir uppsögn voru mýsnar settar í efnaskiptabúr til að safna þvagi til að reikna út gaukulsíunarhraða (GFR). Dýr voru síðan svæfð með isoflurani og blóðsýnum safnað í gegnum neðri holæð. Öll sýnin voru skilin strax í skilvindu við 6000×g, 4 gráður C í 5 mínútur í viðurvist EDTA (Sigma-Aldrich, Stokkhólmi, Svíþjóð), endanlegur styrkur 2 mM. Plasmasýni voru flutt yfir í nýjar glös og strax snöggfryst í þurrís og loks geymd við -80 gráðu. Nýru voru dregin út og skorin í nokkra hluta fyrir ex vivo æðavirknitilraunir (slagæðar og aðlægar slagæðar), vefjafræði ( HE og PAS litun), og magngreining á frumudauða og bólgu (Tissue-Tek Optimum Cutting Tempera-ture(OCT) efnasamband innfellt og fryst fyrir TUNEL og F4/80 litun).

2.5. Mælingar á nítrati, nítríti, cGMP, kreatíníni, blóðþvagefnisnitrogeni (BUN) og angíótensíni II

Nítrít og nítrat voru greind með HPLC(ENO-20) eins og áður hefur verið lýst 【19】. Plasmasýni (10 ul) var sprautað inn í HPLC kerfið með Hamilton sprautu. Í kjölfarið voru nítrít og nítrat aðskilið með öfugfasa/jónaskiptaskiljun og fylgt eftir með nítratskerðingu í nítrít með kadmíum og afoxuðum kopar. Nítrít var afleitt með því að nota Griess hvarfefni til að mynda díasósambönd og greindist við 540 nm. Til að koma í veg fyrir niðurbrot cGMP var blóðvökvinn fluttur í glös sem innihéldu PDE hemla, BMX(3-ísóbútýl-1metýlxantín; Sigma-Aldrich #I5879) til að gefa lokastyrk (10 μM). Sýni voru síðan fryst og geymd við-80 gráðu áður en cGMP er greind með ELISA setti (GE Healthcare #RPN226), samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.

Kreatínínmagn í plasma og þvagi var greint með því að nota kreatínín litamælingarsett (Cayman Chemical, #700460 og #500701). Kreatínínúthreinsunarformúla (CLcr =Urinecrx þvagflæði/Plasmacr) var notuð til að áætla GFR. BUN-gildi í plasma voru greind með því að nota BUN Colorimetric Detection Kit (Invitrogen,#EIA-BUN). Magn Ang í plasma- og nýrnavef var mælt með því að nota Ang ⅡI ELISA kit (Cloud-Clone Corp., # CEA005Mu) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Hins vegar var undirbúningur vefjaþykknisins örlítið frábrugðinn ráðleggingunum. 10 rúmmál 50 mM HCl í 50 prósent EtOH var bætt við vefinn og hitað upp í 10 mínútur við 100 gráður, skilið í skilvindu 10 000×g 10 mínútur. Síðan voru sýnin fryst og geymd við -80 gráðu áður en þau voru greind. Allar gleypnimælingar voru gerðar í SpextraMax iD3 frá Molecular Devices.

2.6. Einangrun og gegnflæði milli slagæða

Nýrun voru tekin eftir fórn og geymd í ísköldri lífeðlisfræðilegri saltlausn (PSS) þar til æðar á milli liða voru einangraðar. Nýrnaslagæðar voru krufðar (2 mm að lengd) og settar í a

myograph hólf (Model 620 M, Danish Myo Technology, Danmörk) með PS eins og áður hefur verið lýst [20]. Ísómetrísk spenna var skráð með Powerlab kerfi (Powerlab 4/30, AD Instruments, Ástralíu). Eftir að hafa verið sett upp voru æðarnar færðar í jafnvægi í 20 mínútur í PSs bólum með carbogen (95 prósent O2; 5 prósent CO2) við 37 gráður, pH 7,4. Síðan var hvíldarspenna slagæðanna stillt eins og áður hefur verið lýst [21], sem er í samræmi við normalization málsmeðferð Mulvany [22]. Eftir aðra jafnvægisstillingu var 0,1 mól/L KCl sett á til að meta lífvænleika slagæðahringsins.

2.7. Einangrun og örflæði afferent arterioles

C57BL/6 J mýs voru svæfðar með ísóflurani til innöndunar og nýru voru fjarlægð og sneið í sneiðar eins og áður hefur verið lýst [23-25]. Nýrnasneiðar voru settar í ísköld Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM). Ein aðlæg slagæð með áföstum glomerulus var örkrufin undir stereomicroscope og flutt í

hitastýrt hólf á sviðinu í öfugum smásjá. Hnoðhnoðurinn var festur með haltandi örpípettu og aðlæga slagæðin var sett í holræsi og gegnsætt með setti af örpípettum. Innri ljósþrýstingur innrennslisslagæðarinnar var haldið við 60 mmHg meðan á tilraunum stóð. Tíminn fyrir krufningu og eftirfarandi örflæði var takmarkaður við 120 mínútur eftir að músinni var fórnað eins og áður hefur verið lýst [26]. Eftir 30 mínútna jafnvægistímabil við 37 gráður fengust uppsafnaðar skammta-svörunarferlar við Ang II (10-12 til 10-8 mól/L). Hver styrkur af Ang II var blástur í 2 mínútur, samdráttarsvörunin var skráð og síðan var þvermál aðlægu slagæðarinnar mæld.

2.8. Vefjafræðileg skoðun

Nýrnasýnin voru tekin og fest í 4 prósent paraformaldehýðlausn. Fastur nýrnavefur var felldur inn í paraffín og síðan skorinn í sneiðar og litaður með Hematoxylin-Eosin (H&E) eða Periodic Acid Schiff (PAS) fyrir vefjafræðilegt mat. Fjögur slembivalin dýr úr hverjum tilraunahópi voru notuð til greiningar. Tíu af handahófi valdir reitir úr hverjum hluta voru teknir með 400× stækkun. Allar formfræðilegar greiningar voru gerðar á blindan hátt.

2.9. TUNEL litun

OCT-innfelld nýrnasýni voru notuð fyrir TUNEL litun. 6-Míkrómetrar þykkir hlutar voru ræktaðir með 20g/mL próteinasa K í 15 mínútur við stofuhita og TUNEL viðbrögð voru framkvæmd með því að nota Click-iTTM Plus TUNEL prófið (Invitrogen C10618, USA) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Í lok samskiptareglunnar var DAPI litun framkvæmd. Til magngreiningar voru þrjú dýr og þrjú sviðssvæði myndarinnar (200 ×) valin af handahófi og mynduð með Zeiss LSM800-Airy confocal smásjá, jákvæðu merkin voru magngreind með ImageJ/Fiji hugbúnaði og voru reiknuð sem hlutfall jákvæðu merkjanna og DAPI.

2.10. Litun með ónæmisflúrljómun vefja og smásjárgreining (F4/80)

Nýru voru fryst í október (Tissue-Tek, Torrence, CA, Bandaríkjunum) og hlutar (6 μm) voru útbúnir og unnar frekar. Frosnir hlutar voru skolaðir með 1× PBS og lokaðir með 2 prósent BSA í PBS í 30 mínútur og síðan ræktaðir með and-F4/80 (1:50, BIO-RAD Cl: A3-1) yfir nótt í 4 gráðum köldu herbergi og í kjölfarið með aukamótefni (1:200 Cell signaling Tech #4417) við stofuhita í 1 klst., fylgt eftir með mótlitun með 300 nmól/L DAPI(4'6-diamidino-2-fenýl -indól, díhýdróklóríð, Invitrogen) í 3 mín. Ónæmisflúrljómunarmerkin voru sýnd undir Zeiss LSM800-loftsmásjánni. þrjú dýr og þrjú svæði á myndinni (200×) voru valin af handahófi. F4/80 jákvæð merki voru magngreind með ImageJ/Fiji hugbúnaði og voru reiknuð út sem hlutfall jákvæðu merkjanna og DAPI.

2.11. Frumuræktun

Gauklaæðaþelsfrumur (GEC) (DSMZ ACC262, Þýskalandi) voru ræktaðar í RPMI1640(Gibco 21870-076) miðli með 10 prósenta sermi nautgripa fósturs og 2 m ML-glútamíni (Gibco 25030-082), penicillíni og streptómýsíni. (50 mg/L, Gibco 15140-122). Frumum var haldið við 37 gráður í rakaðri andrúmslofti með 5 prósent CO2. Í tilraunum með súrefnisskortur voru frumur ræktaðar í HBSS(Gibco 14025-092) í stað sermislausa miðilsins í hólfi með 1 prósent súrefni við 37 gráður C í 2 klst. Frumur voru forræktaðar með nítríti (10 μM, með/án xanthine oxidoreductase(XOR) hemlans febuxostat (100 nM), í 30 mínútur fyrir dreifingu. Lífvænleiki frumna var metinn með PrestoBlue⑧ prófun (Invitrogen, A13261 og A13262) og frumudauði var metinn með Trypan Blue útilokunarprófi (Sigma, T8154-20 ML).

2.12. Greining á hvatbera ROS

Magn hvatbera ofuroxíðs greindist með flúormyndandi litarefni (MitoSOXTM, Invitrogen M36008). Eftir meðferð voru æðaþelsfrumurnar ræktaðar með 2 μmól/L MitoSox í ræktunarmiðli við 37 gráður í 10 mín. Síðan voru frumurnar þvegnar með 1× HBSS tvisvar og flúrljómunarmerkið mælt (SpectraMax iD3 reader, Molecular Devices, USA) og staðlað í frumulífvænleika.

2.13. Ónæmisblóðgreining

Frosin nýrnasýni eða æðaþelsfrumur voru greind í jafnalausn sem innihélt 10 mmól/L Tris-HCl pH 8, 150 mmól/L NaCl, 5 mmól/L EDTA, 60 mmól/L N-oktýl-glúkósíð, 1 prósent Triton X{{9 }}, próteasahemla kokteil og próteinfosfatasahemlar. Frumu- eða vefjalýsin voru skilin í skilvindu í 5 mínútur við 10,000×g við 4 gráður. Fljótandi vökvinn/prótein voru flutt yfir í nýja glös og magngreind með því að nota Bio-Rad

próteinprófun. Próteinútdrættir sem innihéldu jafngilt magn af próteinum voru greindir með því að nota {{0}} prósent natríumdódecýlsúlfat-pólýakrýlamíð gel rafdrætti (SDS-PAGE). Prótein voru flutt yfir á immobilon pólývínýliden difluoride himnu í 1 klst við 300 mA. Himnur voru stíflaðar í 20mM Tris-HCl(pH7,4), 150 mM NaCl og 0,1 prósent Tween 20 (TBS-T) sem innihélt 5 prósent fitufrítt mjólkurduft í 1 klst og ónæmisgreind með mótefnum gegn and-TFAM(1:2000, ab131607), and-OXPHOS(1:1000, ab110413), and-vinculin(1:5000, ab129002)(Abcam Cambridge, UK) og and -Cleaved caspase-3 (1:1000,#9664)(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, Bandaríkjunum). Öll aukamótefni fyrir ónæmisblottagreiningu voru frá Cell Signaling Technology. Fyrir vestræna bletti eru óklipptar, merktar myndir í fullri lengd með MW merkjum sýndar í viðbótarskránni.

2.14. tölfræðigreining

Margvíslegur samanburður meðal hópa var greindur með ein- eða tvíhliða ANOVA og síðan mælt með post-hoc prófi. Gögn eru sett fram sem meðaltal ± SEM. Allir tölfræðilegir útreikningar voru gerðir með Graphpad Prism 8.0. Tölfræðileg marktækni var skilgreind sem bls<>