Hluti 1: Andstæðingur-illkynja ascites áhrif heildar Diterpenoids frá Euphorbiae Ebracteolatae Radix má rekja til breytinga á Aquaporins með hamlandi PKC virkni í nýrum

Fyrir frekari upplýsingar. sambandtina.xiang@wecistanche.com

Ágrip: Þessi rannsókn metin and-ascites áhrif heildar díterpenóíða sem eru dregin úr Euphorbiae ebracteolate Radix(TDEE) á illkynja kviðarholsmýs og útskýrt undirliggjandi verkun þess. TDEE var dregið út með díklórmetani og sett í súluskiljun. Hreinleiki sex díterpenóíða sem voru einangraðir úr TDEE var ákvarðaður vera 77,18 prósent með HPLC. TDEE (3 og 0,6 g af hráum jurtum/kg, po) minnkaði kviðsótt og jók þvagframleiðslu. Á sama tíma benti greining á lífvænleika æxlisfrumna, hringrás og frumudauða að TDEE hefði enginæxlishemjandistarfsemi. Að auki er tjáningarmagn aquaporins (AQPs) og himnuflutningsstig próteinkínasa C (PKC) og PKC ínýruog frumur voru mældar. TDEE minnkaði magn AQP1-4 og hamlaði PKC tjáningu í himnuhlutanum. Fjórir aðaldíterpenóíðar, nema efnasamband 2, lækkuðu AQP1 gildi í nýrna-2 frumum manna. Efnasambönd 4 og 5 hamluðu AQP2-4 tjáningu í músa innri medullary safnrásarfrumum. Hömlun á AQP1-4 tjáningu af völdum díterpenóíða var læst af forbóli-12-myristat-13-asetati (PMA; örvi PKC). Diterpenoids frá TDEE eru helstu and-ascites þættirnir. Vöndunaráhrif diterpenoids geta tengst breytingum á AOPs í nýrum til að stuðla að þvagræsingu. Hömlun á AOP1-4 tjáningu með TDEE er tengd hömlun á PKC virkjun.

Leitarorð: Euphorbia ebracteolate Hayata; þvagræsi; lífvirkir þættir; terpenoids; nýrnafrumur; PKC hemill

Smelltu til að læra ávinning af cistanche jurtum

1. Inngangur

Euphorbia ebracteolate Hayata (EEH) er meðlimur í ættkvíslinni Euphorbia í fjölskyldunni Euphorbiaceae og er mikið notað við meðferð á kviðþenslu og bjúg, sníkjudýrasýkingu, berkla og aðra sjúkdóma í hefðbundinni kínverskri læknisfræði (TCM)[1]. Rót EEH (EER) inniheldur ýmsa terpenoids, sem eru taldir vera áhrifaríkir þættir. Nýlegar rannsóknir á terpenoids hafa verið gerðar til að ákvarða þeirrabólgueyðandi, veirueyðandi, berklalyf og önnur áhrif in vitro [2-5]. Hins vegar eru grunnrannsóknir á hefðbundnum áhrifum EER við meðferð á kviðþenslu og bjúg takmarkaðar. Samkvæmt kenningunni um TCM getur EER fljótt útrýmt kviðþenslu og bjúg með því að ýta undir þvaglát og niðurgang [6]. Fyrri rannsóknir okkar hafa sýnt að heildardíterpenóíð frá EER (TDEE) geta valdið niðurgangi með því að stjórna tjáningu aquaporin (AQP)-1 og AQP3 [7]. Hins vegar, hingað til, eru áhrifarík efni gegn ascites í EER óljós.

Kviðþensla og bjúgur er lýst sem ascites í nútíma læknisfræði. Ascites er sjúkleg uppsöfnun kviðvökva [8]. Það eru margar orsakir kviðsóttarmyndunar, svo sem skorpulifur, æxli, hjartabilun og nýrnaheilkenni [9]. Tilkoma kviðsóttar tengist portháþrýstingi, sem leiðir til æðavíkkunar í slagæðum í slagæðum, minnkun á virku blóðrásarrúmmáli, virkjun innrænna æðasamdráttarkerfa og ákafur vökvasöfnun í nýrum [10]. AQPs eru fljótir himnuflytjendur vatns til að fara yfir þekju- og æðaþekjuhindranir og gegna því grundvallarhlutverki við að viðhalda vatnsjafnvægi [11]. Fjölmargar rannsóknir hafa sýnt að AQPs gegna lykilhlutverki í myndun og röskun á ascites [12-15]. Það eru margar tegundir af AQP í nýrum, svo sem AQP1, AQP2, AQP3 og AQP4[16]. Vegna þess að TDEE getur stjórnað tjáningu AQPs í þörmum [7], leggjum við til að hægt sé að nota TDEE í meðhöndlun á kviðbólgu með því að stjórna AQPs í nýrum.

AQPs gegna mikilvægu hlutverki í myndun þvags, hins vegar hefur ekki verið skýrt frá aðferðum við að stjórna tjáningu AQPs í nýrum. Eins og er bendir aðeins takmarkaður fjöldi skýrslna til þess að AQPs sé stjórnað með próteinkínasa C(PKC) og próteinkínasa A(PKA) leiðum [17-20]. Sum terpenoids einangruð frá Euphorbia (td uphold og ingenol 3-angelate) hafa stjórnunaráhrif á PKC. TDEE getur stjórnað tjáningu AQPs í nýrum með PKC leiðinni.

Í þessari rannsókn tókum við út TDEE og metum and-ascites áhrif þess sem og greinda AQPs tjáningu, PKC og PKA virkni í nýrum ascitic músa. Síðan einangruðum við og hreinsuðum helstu diterpenoids úr TDEE til að kanna áhrif þess á AQPs prótein og mRNA tjáningarstig í tvenns konarnýrnafrumum(mannlegra nýrna-2 frumur (HK-2) og músa innri medullary safnrásarfrumur (mIMCD3)). Að lokum veljum við díterpenóíð efnasamband (euphebracteolatin A), með því að nota phorbol-12-myristat-13-asetat (PMA; örvandi PKC) til að virkja PKC ferlið, til að bera kennsl á hvort tjáningu AQPs í nýrum sé stjórnað eftir PKC leið. Þessi rannsókn miðar að því að ákvarða and-ascites áhrif TDEE í EER og leggja grunn fyrir klíníska beitingu EER og auðkenningu á frambjóðandi lyfjum fyrir þvagræsingu og and-ascitic áhrif.

2. Úrslit

2.1. Áhrif TDEE á þyngd svifvökva, þvagþyngd og saurvatnsinnihald

Meðhöndlun á músum með kviðarholi með heildarútdrætti af EER (TEER) og TDEE (3 og 0,6 g hráum jurtum/kg, po) og fúrósemíði (jákvætt lyf) dró verulega úr aukningu á kviðvökvaþyngd miðað við líkanið hópur (Mynd 1A). Mynd 1C sýndi að þvagið vegur verulega (bls<0.05, compared="" to="" the="" model="" group)increased="" in="" ascitic="" mice="" pretreated="" with="" teer,="" tdee,="" and="" furosemide.="" in="" addition,="" in="" the="" teer="" and="" tdee="" groups="" at="" a="" dose="" of="" 3="" g="" raw="" herbs/kg,="" a="" significant="" increase="" in="" fecal="" water="" content="" was="" observed="" compared="" with="" the="" model="" group="" (figure="" 1d).="" however,="" the="" non-diterpenoid="" fraction="" of="" eer(ntdee)="" groups="" showed="" no="" significant="" influence="" on="" ascites="" weight,="" urine="" weight,="" and="" fecal="" water="" content="" compared="" to="" the="" model="">

2.2. Áhrif TDEE á albúmínmagn í sermi í ascitic músum

Serum albúmín er algengasta próteinið í plasma hryggdýra og getur viðhaldið osmósuþrýstingi blóðs og stjórnað vatnsflutningi. Mynd 1B sýndi að framleiðsla á ascites í líkanmúsum olli marktækri lækkun á sermi albúmíni samanborið við venjulega hópinn. Eftir meðferð með fúrósemíði, TEER og TDEE(3 og 0.6 g hráum jurtum/kg, po), var magn albúmíns í sermi endurheimt á áhrifaríkan hátt samanborið við líkanahópinn. Enginn bati á þessari vísitölu sást í NTDEE hópunum.

2.3. Áhrif TDEE á lífvænleika æxlisfrumna, hringrás og frumufrumu í askismúsum

Í illkynja ascites fljóta æxlisfrumur í askites vökvanum. Við metum hvort minnkun á vöðvabólgu tengist krabbameinsvirkni TEER og TDEE. Niðurstöðurnar sýndu að þessi lyf hamluðu ekki lífvænleika æxlisfrumna (Mynd 2A) og leiddu ekki til frumuhringsstopps (Mynd 2B) og frumudauða (Mynd 2C, D).

2.4. Áhrif TDEE á tjáningu AQPs í nýrum ásóttamúsa

Nýrað er mikilvægt líffæri fyrir endurupptöku vatns og styrk í þvagi. AQP vatnsrásir miðla hröðum flutningi vatns um nýrun. Þannig skoðuðum við tjáningu AQPs í nýrum. Mynd 3 sýndi að aukning á ascites hafði lítil áhrif á AQP tjáningu í nýrum í samanburði við venjulega hópinn. Þegar þau voru meðhöndluð með TEER og TDEE var tjáning AQP1, AQP2, AQP3 og AQP4 próteina verulega lægri en í líkanahópnum við flesta skammta. TEER leiddi til marktækrar minnkunar á tjáningu AQP2, AQP3 og AQP4 við skammta upp á 3.0 og {{10}}.6g hráar jurtir/kg, en AQP1 tjáning minnkaði aðeins við a. lítill skammtur (0,6g hráar jurtir/kg). Sérstaklega hafði TDEE sömu hamlandi áhrif á tjáningu AQP3 og AQP4 og TEER við tvo skammta. Munurinn á TDEE og TEER er sá að TDEE hamlaði tjáningu AQP1 og AQP2 aðeins í stórum skömmtum (3g hráar jurtir/kg).NTDEE hafði lítil áhrif á AQP-gildi í nýrum og stjórnaði aðeins tjáningu AQP4 próteins við skammt af 3g hráar kryddjurtir/kg.

2.5. Áhrif TDEE á PKC og PKA virkjun í nýrum askismúsa

Fyrri rannsóknir hafa bent til þess að AQPs tjáningu gæti verið stjórnað með PKC og PKA virkjun. Við skoðuðum áhrif TDEE á PKC-a, PKC- og PKA virkjun. PKC virkjun var mæld með flutningi þess frá frumuhimnu til frumuhimnunnar. Eins og sést á myndum 4A og B var próteintjáningarstig PKC- í himnuhlutanum marktækt lækkað í TDEE hópum, en engin marktæk áhrif voru á tjáningarstig PKC- himnupróteins. Fosfólípasa C(PLC) er mikilvæg andstreymis boðsameind sem miðlar virkjun PKC.TDEE meðferðar hafði engin áhrif á magn fosfórýleraðs og heildar PLC (Mynd 4D). PKA er heterótetramer sem samanstendur af tveimur hvata undireiningum sem eru bundnar tveimur stjórnunarundireiningum. Losun hvata undireininga er einkenni PKA virkjunar. Á mynd 4C hafði TDEE ekki áhrif á tjáningu PKA hvata undireininga.

2.6. Ákvörðun á innihaldi sex díterpenóíða í TDEE með High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Niðurstöður dýratilrauna sýndu að TDEE var helsta áhrifaríka brotið af EER. Við einangruðum sex díterpenóíða (bygging efnasambanda 1 til 6 er sýnd á mynd 5; litrófsgögnunum var bætt við viðbótarefnið) úr TDEE og notuðum þessi efnasambönd sem staðla til að ákvarða innihald díterpenóíða í TDEE. HPLC litskiljunin fyrir TDEE og sex díterpenóíð staðlarnir eru sýndir á mynd 6. Innihald efnasambanda 1 til 6 var 1,07 prósent ,12.00 prósent ,12.69 prósent ,9.15 prósent , 39.26 prósent og 3.02 prósent , í sömu röð. fyrir 77,18 prósent af TDEE.

2.7. Áhrif diterpenoids frá TDEE á AQPs tjáningu í nýrnafrumum

TDEE var virka hluti EER sem hamlaði kviðbólgu með því að draga úr tjáningu AQP1, AQP2, AQP3 og AQP4 í nýrum. Á sama tíma dró TDEE einnig verulega úr próteini og mRNA tjáningu AQP1, AQP2, AQP3 og AQP4 í nýrna-2 frumum (HK-2) og innri medullary collecting duct frumum úr músum (mIMCD3) (Mynd 7). Helstu þættir TDEE eru diterpenoids. Við bárum saman áhrifin á milli TDEE og díterpenóíða blöndu (sex einangruðum díterpenóíðum var blandað saman í samræmi við innihald þeirra í TDEE). Niðurstöðurnar sýndu að hamlandi áhrif díterpenóíðablöndu og TDEE á tjáningu AQP1, AQP2, AQP3 og AQP4 voru svipuð (Mynd 7). Virkni fjögurra helstu díterpenóíða frá TDEE var metin in vitro. Myndir 8 og 9 sýndu að prótein og mRNA tjáningarmagn AQP1 í HK-2 frumum minnkaði marktækt með efnasamböndum 3,4 og 5. Meðferð með efnasambandi 2 olli ekki merkjanlegri lækkun á AOP1 við próteinið og mRNA. stigum. Fyrir þessi efnasambönd var efnasamband 3 (díterpenóíð af ent-abietane gerð) virkara en hin efnasamböndin. Í mlMCD3 frumum ollu fjögur diterpenoid efnasambönd mismunandi hömlun á tjáningu AQP2, AQP3 og AQP4. Niðurstöður prótein- og genatjáningar eru sýndar á myndum 8 og 9. Efnasambönd 4 og 5 höfðu öflug AQP2, AQP3 og AQP4 hamlandi áhrif samanborið við viðmiðunarhópinn á gena- og próteinstigum. Efnasambönd 2 og 3 sýndu aðeins mismunandi áhrif á Aqp2, Aqp3 og Aqp4 mRNA tjáningu.

2.8. Áhrif virkjunar PKC á hömlun AQPs af völdum díterpenóíða

Niðurstöður úr dýratilrauninni bentu til þess að TDEE hamlaði samtímis PKC virkni og AQPs tjáningu í nýrum músa sem bera H22 æxlisfrumu. Til að skýra frekar hvort PKC stjórnaði tjáningu AQPs í nýrnafrumum, var PKC örvandi (PMA) formeðhöndluð í HK-2 og mIMCD3 frumum 1,5 klst. fyrir díterpenóíð (Euphebracteolatin A) örvun. Breyting á himnu PKC , AOP1, AOP2, AOP3 og AOP4 tjáningu greindist. Western Bolt niðurstöður sýndu að euphebracteolatin A gæti dregið úr próteintjáningu himnu PKC , AOP1, AOP2, AOP3 og AOP4 og áhrifin gætu minnkað með PMA formeðferð (Mynd 10).