Hluti Ⅰ Smad3 skortur bætir hólmameðferð við sykursýki og nýrnaskaða af völdum sykursýki með því að stuðla að frumufjölgun í gegnum E2F3-háða vélbúnaðinn

Ágrip

1. Rökstuðningur

Léleg frumufjölgun er einn skaðlegi þátturinn sem hindrar frumuuppbótarmeðferð fyrir sjúklinga með sykursýki. Smad3 er mikilvægur umritunarþáttur TGF-boða og hefur verið sýnt fram á að stuðla að sykursýki með því að hindra frumufjölgun. Þess vegna gerum við þá tilgátu að Smad3-skortur eyjar geti verið ný frumuuppbótarmeðferð við sykursýki.

2. Aðferðir

Við skoðuðum þessa tilgátu hjá streptósósínörvuðum músum með sykursýki af tegund-1 og db/db músum með sykursýki af tegund-2 með því að ígræða Smad3 knockout (KO) og villigerð (WT) eyjar undir nýrnahylkið, í sömu röð. Skoðuð voru áhrif Smad3KO á móti WT-hólmauppbótarmeðferð á sykursýki og nýrnaskaða af völdum sykursýki. Að auki var RNA-seq beitt til að bera kennsl á markgenið sem liggur að baki Smad3-stýrðri frumufjölgun í Smad3KO-db/db á móti Smad3WT-db/db músaeyjum.

3. Úrslit

Í samanburði við meðferð með Smad3WT eyjum gaf meðferð með Smad3KO eyjum mun betri lækningaáhrif á bæði tegund-1 og tegund-2 sykursýki með því að lækka verulega blóðsykursgildi og HbA1c í sermi og vernda gegn nýrnaskaða af völdum sykursýki með því að koma í veg fyrir aukning á kreatíníni í sermi og þróun próteinmigu, þenslu á mesangial fylki og bandvefsmyndun. Þetta tengdist marktækri aukningu á útbreiðslu ágræddra frumna og insúlínmagni í blóði, sem leiddi til bætts glúkósaóþols. Vélrænt séð leiddi RNA-seq í ljós að samanborið við Smad3WT-db/db músahólma, uppstýrði brottfelling Smad3 úr db/db múseyjum E2F3, sem er mikilvægur eftirlitsaðili fyrir inngöngu frumahringsins G1/S, verulega. Frekari rannsóknir komust að því að Smad3 gæti tengst örva E2F3 og hindrað þannig frumufjölgun í gegnum E2F3-háð kerfi þar sem þöggun E2F3 stöðvaði fjölgunaráhrifin á Smad3KO frumur.

4. Niðurstaða

Smad3-skortur á hólmauppbótarmeðferð getur verulega bætt bæði tegund-1 og tegund-2 sykursýki og verndað gegn nýrnaskaða af völdum sykursýki, sem er miðlað af nýjum kerfi E2F3-háðs frumufjölgun.

Leitarorð

Smad3, hólmaígræðsla, sykursýki, E2F3, frumuhringur.

Smelltu hér til að fáCistanche ávinningur

Kynning

sykursýki af tegund-1 og 2 (T1DM og T2DM). frumu- eða hólmaígræðsla er aðlaðandi meðferð og hefur verið beitt með góðum árangri hjá sjúklingum með T1DM. Eymarnir eða frumurnar sem notaðar eru til ígræðslu eru venjulega frá gjafanum eða framkölluðum fjölhæfum stofnfrumum (iPSC) [1, 2]. Meira en 1500 tilfellum af klínískri hólmaígræðslu hefur verið lokið hjá sjúklingum með T1DM í samræmi við hina rótgrónu Edmonton-bókun [1]. Þrátt fyrir að um 50 prósent sjúklinga haldi insúlínósjálfstæði í 5 ár eftir ígræðslu, er ígræðslubilun algengt áhyggjuefni klínískt. Einn af þeim þáttum sem hindra ígræðslu eyja er afar lágt fjölgunartíðni ágræddu eyjafrumna [3]. Að auki getur hættulegt áreiti frá ígræddu örumhverfinu eins og bólga, höfnun ónæmisgræðslu og efnaskiptaálagi valdið því að ígræddar frumur gangast undir frumufrumu og drepi, sem leiðir til versnandi taps á ígræðslu [1]. Þess vegna er endurbót á ígræddri frumufjölgun lykilatriði fyrir árangur af meðferð sem byggir á hólmaígræðslu við sykursýki.

Umbreytandi vaxtarþáttur-beta (TGF-) merkjaboð gegnir pleiotropic hlutverki í mörgum líffræðilegum ferlum. Merkjaflutningurinn hefst með því að TGF-bindillinn bindist við tegund 2 viðtaka hans TGFBR2. Sá síðarnefndi ræður og virkjar tegund 1 viðtaka TGFBR1 með fosfórýleringu. Virkjað TGFBR1 fosfórerar enn frekar viðtakastýrðu Smad próteinin (R-Smads), Smad2 og Smad3. R-Smads mynda flókið með Smad4, sem færist inn í kjarnann til að stýra markgenum með umritun [4, 5]. Greint er frá því að briseyjan viðheldur alhliða virkjaðri TGF-merki eins og kemur í ljós af tiltölulega miklu fosfórýleruðu Smad2/3 við lífeðlisfræðilegar aðstæður. Hins vegar, til að bregðast við insúlínþörf, minnkar TGF-merkjavirkni, samfara aukinni frumufjölgun [6]. Að auki stuðlar lyfjafræðileg hömlun á TGF-merkjaboðum frumufjölgun in vitro og in vivo [7, 8]. Mikilvægara er að eyðing Smad3 leiðir til öflugri frumufjölgunar samanborið við eyðingu Smad2 hjá músum með brot á brisi að hluta, sem gefur til kynna að Smad3 en ekki Smad2 sé aðaláhrifavaldurinn aftan við TGF-boð til að stjórna frumufjölgun [6]. Síðari rannsóknir sýna að Smad3 bælir frumufjölgun með því að örva tjáningu sýklínháðra kínasahemla (CDKI), þar á meðal p16, p21 og p57 [7, 8].

Nýleg vinna okkar leiddi einnig í ljós að eyðing Smad3 í db/db músum (Smad3KO-db/db) kemur í veg fyrir upphaf augljósrar sykursýki án offitu, blóðsykurshækkunar, insúlínviðnáms og glúkósaóþols. Athyglisvert er að Smad3KO-db/db mýs sýna ofvöxt í eyjum með marktækt aukinni frumufjölgun og viðvarandi insúlínhækkun [9]. Þetta gefur til kynna að Smad3 sé sjúkdómsvaldandi í sykursýki og að miða á Smad3 í frumum gæti táknað nýja frumu- eða hólmauppbótarmeðferð við sykursýki. Þetta var skoðað í þessari rannsókn með því að nota Smad3 knockout (Smad3KO) hólmaígræðslu í streptozocin (STZ) af völdum sykursýkismúsum af tegund-1 og í sykursýkismúsum af tegund-2 db/db.

Cistanche bætiefni

Niðurstöður

1. Smad3KO hólmaígræðsla hafði betri meðferðaráhrif á STZ af völdum sykursýki-1

Til að bera saman meðferðaráhrif Smad3KO á móti Smad3WT eyja á sykursýki, gerðum við fyrst samruna eyjaígræðslu undir nýrnahylki af STZ-völdum sykursýkismúsum þar sem blóðsykurshækkun stafar af frumuskorti. Sykursýkismýs á 7. degi eftir STZ inndælingu voru ígræddar með 3 skömmtum af hólmum (50, 100 og 200 hólmar á mús) sem voru nýeinangraðir úr Smad3WT eða Smad3KO músum. Fylgst var með bæði tilviljunarkenndum blóðsykursgildum (RBG) og fastandi blóðsykursgildum (FBG) vikulega í 16 vikur. Ígræðsluskammtarnir voru valdir út frá fyrri niðurstöðum um að ígræðsla á 300 hólmum nægi til að endurheimta blóðsykurshækkun hratt í frumuþurrðum músum [10]. Eins og sýnt er á myndum 1A til D, þróuðu sykursýkismýsnar með sýndaraðgerð viðvarandi blóðsykurshækkun í 16 vikur. Ígræðsla með litlum skammti (50 hólma) af Smad3KO eða WT eyjum náði ekki að draga úr bæði RBG og FBG gildi. Hins vegar, sykursýkis mýs sem fengu 100 Smad3KO eyjar, en ekki sama skammt af Smad3WT eyjum, náðu smám saman eðlilegum RBG og FBG svipað og þær sem fengu 200 Smad3KO eða WT eyjar. Við komumst líka að því að blóðsykurslækkandi áhrifin eru eingöngu rakin til ígræddu eyjanna þar sem blóðsykurshækkun kom strax aftur þegar nýrun sem bera hólma voru fjarlægð frá 16 vikum og áfram (ör, mynd 1A).

Skert glúkósaþol var einnig þróað í sýndarstýrðum sykursýkismúsum, sem var verulega létt með því að ígræða stóra skammtinn (200) af Smad3KO eða WT eyjum og 100 Smad3KO eyjum, en ekki með litlum skammti af 50 Smad3KO eða WT eyjum og 100 Smad3WT hólmar (Mynd 1E og G). Eins og búist var við, þróuðu STZ-framkallaðar sykursýkismýs ekki insúlínviðnám.

Aftur á móti kom fram langvarandi svörun við insúlíni hjá músum með blóðsykurshækkun við sýndaraðgerðina eða árangurslausa meðferð með 50 Smad3WT eða KO eyjum og 100 Smad3WT eyjum (Mynd 1F og H). Í samræmi við endurheimt blóðsykursfall og bætt glúkósaóþol, sýndu sykursýkismýs sem fengu 200 Smad3KO eða WT eyjar og 100 Smad3KO eyjar, en ekki 50 Smad3KO eða WT eyjar og 100 Smad3WT eyjar, minnkað blóðmagn HbA1c ásamt insúlínmagni 1 ásamt IFigur og J). Ennfremur olli STZ-völdum sykursýki vaxtarskerðingu, sem endurheimtist að hluta í músum sem voru ígræddar með 200 Smad3KO eða WT eyjum og 100 Smad3KO eyjum (Mynd S1). Að auki þróuðu STZ af völdum sykursýkismýs einnig nýrnakvilla af völdum sykursýki eftir 16 vikur eins og sýnt er fram á mesangial stækkun, millivefsvefjamyndun, próteinmigu og auknu kreatíníni í sermi (Mynd 2). Það er forvitnilegt að meðferð með 100 Smad3KO eyjum, en ekki 100 Smad3WT eyjum, leiddi til verndar gegn þróun nýrnasjúkdóms af völdum sykursýki, þó að þetta hafi einnig verið áberandi hjá sykursjúkum músum sem fengu háan skammt af 200 Smad3KO eða WT eyjum (Mynd 2). Þessar niðurstöður sýna fram á betri meðferðaráhrif Smad3KO eyja á sykursýki af völdum STZ og benda til um 50 prósenta minnkunar á þeim hólmum sem þarf til að ná hæfri blóðsykursstjórnun og vernd gegn nýrnaskaða af völdum sykursýki með því að nota Smad3-skorta hólmauppbótarmeðferð fyrir sykursýki.

2. Smad3KO hólmaígræðsla hafði betri meðferðaráhrif á sykursýki af tegund -2 í db/db músum

Greint hefur verið frá því að hólmaígræðsla bætir T2DM í fituríku mataræði músalíkani sem er ögrað með litlum skammti af STZ [11]. Við könnuðum næst hvort ígræðsla á Smad3KO eyjum hafi einnig betri lækningaáhrif á T2DM með því að meðhöndla db/db mús með 250 Smad3KO eða WT eyjum frá aldri fyrir sykursýki viku 4 til viku 12. Við fundum að ígræðsla með annað hvort Smad3KO eða WT eyjar höfðu ekki áhrif á vöxt viðtakanda db/db músa (Mynd S2). Þrátt fyrir að db/db mýs sem fengu Smad3WT hólmaígræðslu sýndu tilhneigingu til lækkunar á RBG og FBG samanborið við sýndaraðgerðir db/db mýs, sýndu db/db mýs sem voru ígræddar með samsvarandi skammti af Smad3KO eyjum marktæka lækkun á RBG og FBG (mynd 3A og B). Glúkósaóþol þróað í db/db músum batnaði marktækt með Smad3KO en ekki Smad3WT hólmaígræðslu, þó insúlínviðnám hafi ekki breyst (Mynd 3C-F). Samræmt, samanborið við Smad3WT eyjaígræðslu eða sýndaraðgerð, sýndu db/db mýs sem voru meðhöndlaðar með Smad3KO eyjaígræðslu einnig marktæka lækkun á HbA1c gildum í blóði, sem fylgdi áberandi aukning á þéttni blóðinsúlíns (Mynd 3G og H). Ennfremur dró meðhöndlun með 250 Smad3KO-hólmum verulega úr gauklaþenslu (Mynd 4). Hins vegar, þar sem engar marktækar breytingar á kreatíníni í sermi, próteinmigu og nýrnatrefjun komu fram hjá db/db músum við 12 vikna aldur, fundust engar augljósar breytingar á þessum breytum hjá db/db músum sem fengu Smad3KO eða WT eyjar (mynd 4). Samanlagt benda þessi gögn aftur til þess að ígræðsla á Smad3KO eyjum skili betri meðferð en Smad3WT eyjum í sykursýkisdb/db músum af gerðinni -2.

3. Smad3 skortur stuðlar að frumufjölgun í ágræddu hólmunum í bæði STZ-völdum sykursýkismúsum og db/db músum.

Næst könnuðum við hugsanlega aðferðir þar sem ígræðsla á Smad3KO eyjum framkallar betri meðferðaráhrif á bæði T1DM og T2DM. Við skoðuðum fyrst frumumassann í ágræddu eyjunum með ónæmislitun með insúlíni. Við sykursýki af völdum STZ tókst okkur ekki að greina tilvist insúlínjákvæðra frumna undir nýrnahylkinu í músum sem voru ígræddar með 50 Smad3KO eða WT eyjum í viku 16 eftir ígræðslu, sem bendir til þess að frumur hafi tapast. Óvænt sýndu sykursýkismýs sem fengu 100 Smad3WT eyjar aðeins nokkra dreifða insúlínframleiðandi frumuklasa, en þetta jókst að miklu leyti hjá sykursýkismúsum sem fengu 100 Smad3KO eyjar, sem leiddi til næstum 17-faldrar aukningar á frumumassa (Mynd 5A og B). Athyglisvert er að sykursýkismýs sem fengu stóran skammt af 200 Smad3KO eða WT eyjum sýndu svipaðan frumumassa (myndir 5A og B). Þessar niðurstöður voru í samræmi við skammtaháð áhrif hólmaígræðslu á blóðsykurshækkun eins og sýnt er á myndum 1A og B.

Við könnuðum næst hvort aukinn frumumassi í Smad3KO hólmaígræðslu tengist aukinni frumufjölgun. Tveggja lita ónæmisflúrljómun sýndi að í viku 16 eftir hólmaígræðslu sýndu mýsnar sem fengu 100 Smad3WT eyjar ógreinanlegar eða sjaldgæfar PCNA plús insúlín plús frumur, sem var fyrst og fremst aukið hjá þeim sem fengu 100 Smad3KO eyjar eða stóran skammt af 200 Smad3KO eða W hólma (Mynd 5C og D). Við könnuðum síðan hvort Smad3 stjórnar frumufjölgun í ágræddu eyjunum við versnandi sykursýkissjúkdóma með BrdU merkingu á degi 7 eftir ígræðslu í hólma þegar blóðsykursgildi hélst hátt. BrdU merking leiddi í ljós 3-föld aukningu á BrdU plús insúlíni plús frumum í 100 Smad3KO hólmaígræðslu samanborið við sama skammt af Smad3WT hólmaígræðslu (Mynd 5E og F). Þessi niðurstaða bendir til þess að Smad3 skortur ýtir að mestu undir frumufjölgun í gegnum S-fasa frumuhringinn við blóðsykurshækkun, sem stuðlar að 17-faldri aukningu á frumumassa eins og sést í viku 16 eftir hólmaígræðslu (Mynd 5A og B) . Samanlagt benda allar þessar niðurstöður til þess að Smad3 skortur stuðli að mestu leyti að frumufjölgun og endurheimtir þar með blóðsykurshækkun í STZ af völdum sykursýki af -1 tegund.

Að sama skapi greindist mikil frumufjölgunarvirkni í Smad3KO hólmaígræðslu í tegund-2 sykursýkisdb/db músum eins og sést af 5-földri aukningu á frumumassa samanborið við þá sem voru með Smad3WT hólmaígræðslu við aldur viku 12 eftir hólmaígræðslu (Mynd 6A og B), sem tengdist 2.5-faldri aukningu á insúlíni auk PCNA plús frumum (Mynd 6C og D). Með því að nota BrdU-merkingu fundum við einnig 3-föld aukningu á insúlíni auk BrdU plús frumum í Smad3KO hólmaígræðslu á 7. degi eftir ígræðslu í 12-vikukömlum db/db músum (Mynd 6E og F). Þessi niðurstaða staðfestir aftur að frumur sem skortir Smad3 eru ónæmar fyrir blóðsykurshækkun og eru áfram mjög fjölgandi til að viðhalda frumumassanum til að bæta T2DM.

4. Smad3 skortur stuðlar að frumufjölgun in vitro

Greint hefur verið frá því að lyfjafræðileg hömlun á TGFBR1 stuðlar að frumufjölgun in vitro [7, 8]. Við könnuðum því hvort erfðafræðileg eyðing Smad3 stuðlar einnig að frumufjölgun með því að rækta Smad3KO og WT eyjafrumurnar og síðan BrdU merking. Tvöföld ónæmisflúrljómun sýndi að frumur í hólma sem skorti Smad3 sýndu marktækt hærra magn BrdU-jákvæðra frumna (5,7 prósent) samanborið við Smad3WT eyjafrumur (2,4 prósent) (Mynd 7A og B). Aukin fjölgun Smad3KO frumna var einnig sýnd með aukinni tjáningu PCNA eins og kemur fram með Western blot greiningu (Mynd 7C), sem staðfestir lykilstjórnarhlutverk Smad3 í frumufjölgun.

5. RNA-seq auðkennir E2F3 sem Smad3 markgen sem stjórnar frumufjölgun

Til að afhjúpa niðurstreymiskerfi Smad3 við að stjórna frumufjölgun, gerðum við RNA-seq í hólmum einangruðum úr db/m eða db/db músum með eða án eyðingar á Smad3 geni þar á meðal Smad3WT-db/db, Smad3KO-db/db, Smad3WT -db/m, og Smad3KO-db/m mýs eins og áður hefur verið lýst [9]. Leiðarauðgunargreining var gerð meðal mismunandi tjáðra gena (DEGs) milli Smad3WT og Smad3KO hólma í db/m eða db/db bakgrunni. Í erfðafræðilegum bakgrunni db/db leiddi Smad3KO til verulegra breytinga á frumuhringstengdum genum eða ferlum eins og kom í ljós með GO og KEGG greiningu (Mynd 8A og Mynd S3). Miðað við einstök gen leiddi RNA-seq greining í ljós aukningu á tjáningu gena sem taka þátt í sýklíni, sýklínháðum kínasa (CDK) og frumuskiptingarlotu (CDC) próteinfjölskyldu í Smad3KO-db/db eyjum samanborið við Smad3WT-db /db eyjar, sem var staðfest enn frekar í ræktuðum Smad3KO eyjafrumum með RT-PCR (Mynd S4 A og C). Aftur á móti, í erfðafræðilegum bakgrunni db/m, olli Smad3KO engin merkileg áhrif á frumuhringstengda gen eða ferla (Mynd S3B og C). Greint er frá því að TGF-/Smad3 merkjasendingar stjórna frumuhringnum á neikvæðan hátt með því að örva sýklínháð kínasahemil gen (CDKI) [7, 8, 12]. Það kemur á óvart að ekkert af þessum CDKI genum var bælt í Smad3KO-db/db eyjum in vivo og ræktuðum Smad3KO eyjafrumum eins og kom í ljós með RNA-seq og RT-PCR, í sömu röð (Mynd S4B og C). Aftur á móti var tjáningarstig nokkurra CDKI gena eins og p16, p18 og p57 jafnvel uppstýrt í ræktuðum Smad3KO eyjafrumum (Mynd S4C). Þetta gefur til kynna að annað kerfi sé til í Smad3-stýrðri frumufjölgun.

Við greindum þannig Smad3 bindingarmöguleika fyrir 224 gráður 224 gráður í GO tíma frumuhringsins með ECR vafrahugbúnaðinum (Mynd 8A). Meðal þeirra vakti eitt gen sem heitir E2F3 athygli okkar þar sem það er lykill og endanleg framkvæmdaraðili sem stjórnar G1/S innkomu frumuhringsins [13, 14]. Við fundum mögulegan Smad3 bindistað í efla músar E2F3 staðsetningarinnar sem er einnig varðveitt í mönnum (Mynd 8B).

Cistanche tubulosa

Til að kanna hvort E2F3 sé nauðsynlegt fyrir Smad3-stýrða frumufjölgun, skoðuðum við tengsl E2F3 og Smad3 í hólmum. Í samræmi við RNA-seq, greindist ónæmisvefjaefnafræðin að tjáning E2F3 var að mestu minni í hólmum Smad3WT-db/db músa en jókst mjög í Smad3KO-db/db músum (Mynd 8C). Ennfremur sást aukin tjáning E2F3 einnig í ræktuðum Smad3KO eyjafrumum bæði á RNA og próteini (mynd 8 DF). Aftur á móti stöðvaði adenoveirumiðluð þögn E2F3 útbreiðsluvirkni frumna (insúlíns)^plúsBrdU^plús) í Smad3KO hólmafrumum (Mynd 9), sem sýnir mikilvægt hlutverk E2F3 í Smad3-stýrðri frumufjölgun.

Til að staðfesta enn frekar fyrirhugaða bindingu Smad3 í E2F3 verkefnisstjóranum, framkvæmdum við chromatin immunoprecipitation (ChIP) í einangruðum músaeyjum (Mynd 10A). Sérhæfni Smad3 mótefnisins sem notað var fyrir ChIP var upphaflega staðfest með ónæmisútfellingu í músaeyjum (Mynd 10B). ChIP PCR staðfesti bindingu Smad3 við E2F3 hvata sem and-Smad3 mótefni, en engin ósérhæfð IgG samsæta útfelldi með góðum árangri litningabrotið sem samsvarar E2F3 hvata (Mynd 10C). Magnbundin RT-PCR leiddi í ljós 6-falda auðgun á E2F3 stýrisröðinni í ChIP prófuninni með Smad3 mótefninu samanborið við IgG samsætuna (Mynd 10D), sem sýndi fram á að Smad3 getur tengst promotera svæðinu í E2F3 erfðamengistaðnum .

Til að sannreyna virka þýðingu Smad3 bindingar á E2F3 verkefnisstjóra, smíðuðum við lúsiferasa boðbera sem knúinn er áfram af E2F3 músa hvata sem hýsir Smad3 bindisstaðinn eða stökkbreytt form hans (Mynd 10E). Dual-luciferasa próf í HEK293T frumum leiddi í ljós öfluga umritun á luciferasa knúin áfram af einrækta E2F3 verkefnisstjóranum, sem var verulega hamlað með oftjáningu Smad3. Hins vegar, stökkbreyting á Smad3 bindistaðnum stöðvaði hamlandi áhrif Smad3 (Mynd 10F). Þessar niðurstöður gáfu bein sönnunargögn fyrir bælandi hlutverki Smad3 í E2F3 umritun með því að bindast við hvata þess.

Í þessari rannsókn sýndum við fram á að ígræðsla á Smad3--skortum eyjum gaf betri lækningaáhrif á sykursýki og nýrnaskaða af völdum STZ í sykursýkismúsum og db/db músum. Í sykursýki af völdum STZ leiddi ígræðsla á 100 Smad3KO en ekki 100 Smad3WT eyjum til 17-faldrar aukningar á frumumassa, sem tengdist marktækri aukningu á insúlínmagni í blóði og bætti þar með glúkósaóþol og endurheimti blóðsykurshækkun, sem leiddi til til verndar gegn nýrnaskaða af völdum sykursýki.

Svipaðar niðurstöður fundust einnig í T2DM í db/db músum þar sem ígræðsla með 250 Smad3KO eyjum en ekki sama skammti af Smad3WT eyjum jók einnig 5-faldan frumumassa og framkallaði betri blóðsykursstjórnun. Þessar niðurstöður benda til þess að Smad3 skortur sé ónæmur fyrir örumhverfi sykursýki og stuðlar að miklu leyti að stækkun ágræddra eyjafrumna og insúlínframleiðslu til að sýna betri blóðsykursstjórnun. Athyglisvert er að við komumst líka að því að meðferð með 100 Smad3KO eyjum gæti framkallað jafna blóðsykursstjórnun og notkun 200 Smad3WT eða KO hólma við sykursýki af völdum STZ. Þessi athugun bendir til þess að Smad3 skortur gæti að mestu dregið úr (að minnsta kosti 50 prósent) fjölda hólma sem þarf til að koma á árangursríku insúlínsjálfstæði í hólmfrumuuppbótarmeðferð við T1DM. Þessar niðurstöður eru í samræmi við fyrri skýrslu um að formeðferð á hólmunum með SB-431542, hemli TGFBR1, stuðlar að útbreiðslu og starfsemi frumna eftir ígræðslu [15]. Hins vegar, þar sem Smad2 gegnir einnig mikilvægu hlutverki í glúkósaörvaðri losun insúlíns í frumum [16], gæti það verið hagstæðara að miða á Smad3 en ekki andstreymis TGFBR1 í hólmum (frumum) fyrir frumuuppbótarmeðferð við sykursýki. Þannig getur Smad3-skortur eyjaígræðsla verið ný meðferð fyrir bæði T1DM og T2DM klínískt. Að auki gæti meðferð með Smad3KO eyjum einnig verndað gegn nýrnaskaða af völdum sykursýki eftir 16 vikna T1DM, þó að þetta sé ekki djúpt í T2DM vegna lágmarks sykursýkis nýrnaskaða sem kemur fram hjá db/db músum á aldrinum 12 viku.

Vélrænt komumst við að því að Smad3 virkar með því að bæla E2F3 til að hindra frumufjölgun. Þetta er studd af sönnunargögnum um að E2F3 hvati inniheldur virkan Smad3 bindiset eins og staðfest er með ChIP og luciferase reporter prófun. Eyjafrumur sem skorti Smad3 sýndu aukna fjölgun í E2F3-háð kerfi þar sem niðurfelling E2F3 afnam þessa fjölgunarvirkni. E2F3 tilheyrir E2F fjölskyldunni og er mikilvægur þáttur í Rb-E2F vélinni sem stjórnar G1/S frumuhringsfærslu [13]. E2F eru umritunarþættirnir og lokaframkvæmdirnar til að stjórna genum sem skipuleggja framvindu frumuhringsins [14]. Sýnt hefur verið fram á að oftjáning á E2F3 stuðlar að frumufjölgun í eyjum frá nagdýrum og mönnum [17]. Niðurstöðurnar um að Smad3 umritað miðar á E2F3 til að bæla frumuhringinn í frumum veita nýjan stjórnunarmáta fyrir frumufjölgun. Þannig stuðlar truflun á Smad3 í hólmafrumum E2F3-háðri frumufjölgun eins og sýnt er fram á marktækri aukningu á insúlínframleiðandi PCNA plús eða BrdU plús frumum, sem bendir til þess að meðferð með undirmeðferðarskammti af Smad3KO eyjum sé nægjanleg til að stækka frumuna massa og hamlar bæði T1DM í STZ-örvuðum músum og T2DM í db/db músum.

Herba CistancheogCistanche þykkni

Greint er frá því að TGF-merki gegni mikilvægu hlutverki í þróun og virkni briseyjafrumna, stöðvar frumuhringinn og veldur frumudreifingu með því að örva CDKIs [7, 8, 18]. Okkur til undrunar, bæði in vivo og in vitro tilraunir leiddu í ljós að umritun CDKIs var ekki breytt eða jafnvel uppstýrt í Smad3KO eyjum (Mynd S4). Þetta misræmi má rekja til mismunandi tilraunaaðstæðna. Niðurstöðurnar í núverandi rannsókn voru fengnar úr Smad3KO músum (hólmum). Hins vegar eru fyrri rannsóknir byggðar á lyfjafræðilegri hömlun á TGFBR1, sem mun hafa áhrif á alla TGF-merki [7, 8]. Ennfremur notuðum við hólmasýni úr ungum fullorðnum músum (8-10 vikna aldur), á meðan hólmar frá tiltölulega gömlum dýrum eða dauðsföllum aldraðra voru notaðir í fyrri rannsóknum [7, 8]. Þar sem frumur í hólmum sýna aldurstengda uppsöfnun CDKIs [19], gætu CDKIs í öldruðum frumum verið næmari fyrir TGF-merkjahömlun.

Það voru nokkrar takmarkanir í þessari rannsókn. Í fyrsta lagi er virkni hólmaígræðslu rannsökuð í STZ-örvuðu sykursýkismúslíkani án sjálfsofnæmisviðbragða. Þess vegna ætti einnig að sannreyna kosti Smad3KO umfram Smad3WT hólmameðferð við sykursýki í ósviknu T1DM líkani í framtíðinni. Í öðru lagi eru niðurstöður þessarar rannsóknar byggðar á heil-hólmanum en ekki frumusértækri Smad3KO frumumeðferð. Það er óljóst hvort aðrar frumutegundir en frumur í hólmanum myndu gegna Smad3-háð hlutverki til að móta frumufjölgun með millifrumu-víxlunarferlum. Þess vegna eru frekari rannsóknir á frumusértækum Smad3KO nauðsynlegar. Ennfremur þarf að sannreyna niðurstöður úr þessari rannsókn í sýni úr hólmum úr mönnum til að sanna klíníska þýðingu þeirra.

Heimildir

1 Shapiro AM, Pokrywczynska M, Ricordi C. Klínísk brishólmaígræðsla. Nat Rev Endocrinol. 2017; 13: 268-77.

2. Jacobson EF, Tzanakakis ES. Mannleg fjölhæf stofnfrumuaðgreining í starfhæfar brisfrumur fyrir sykursýkismeðferðir: Nýjungar, áskoranir og framtíðarstefnur. J Biol Eng. 2017; 11:21.

3. Toso C, Isse K, Demetris AJ, Dinyari P, Koh A, Imes S, et al. Vefjafræðilegt mat eftir klíníska hólmaígræðslu. Ígræðsla. 2009; 88: 1286-93.

4. Lan HY. Fjölbreytt hlutverk TGF-beta/Smads í bandvefsmyndun í nýrum og bólgum. Int J Biol Sci. 2011; 7: 1056-67.

5. Meng XM, Tang PM, Li J, Lan HY. TGF-beta/Smad merki í nýrnatrefjun. Front Physiol. 2015; 6: 82.

6. El-Gohary Y, Tulachan S, Wiersch J, Guo P, Welsh C, Prasadan K, et al. Slæmt merkjakerfi stjórnar útbreiðslu hólmafrumna. Sykursýki. 2014; 63: 224-36.

7. Dhawan S, Dirice E, Kulkarni RN, Bhushan A. Hömlun á TGF-beta merkjum stuðlar að beta-frumuafritun manna í brisi. Sykursýki. 2016; 65: 1208-18.

8. Wang P, Karakose E, Liu H, Swartz E, Ackeifi C, Zlatanic V, et al. Samsett hömlun á DYRK1A, SMAD og Trithorax leiðum hefur samvirkni til að framkalla öfluga afritun í fullorðnum beta frumum úr mönnum. Cell Metab. 2019; 29: 638-52 e5.

9. Sheng JY, Wang L, Tang PM-K, Wang HL, Li JC, Xu BH, o.fl. Smad3 skortur stuðlar að beta frumufjölgun og virkni í db/db músum með því að endurheimta Pax6 tjáningu. Læknisfræði. 2021; 11: 2845-59.

10. Zmuda EJ, Powell CA, Hai T. Aðferð til einangrunar múshólma og nýrnaígræðslu undir hylkis. J Vis Exp. 2011.

11. Choi MY, Lim SJ, Kim MJ, Wee YM, Kwon H, Jung CH, o.fl. Islet ígræðsla bætir insúlínnæmi í múslíkani af sykursýki af tegund 2. Innkirtla. 2021; 72: 660-71.

12. Vijayachandra K, Higgins W, Lee J, Glick A. Framleiðsla á p16ink4a og p19ARF með TGFbeta1 stuðlar að vaxtarstoppi og öldrunarviðbrögðum í keratínfrumum músa. Mol Carcinog. 2009; 48: 181-6.

13. Dyer MA, Cepko CL. Stýrir útbreiðslu við þróun sjónhimnu. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 333-42.

14. Dyson N. Stjórnun E2F með pRB-fjölskyldu próteinum. Genes Dev. 1998; 12: 2245-62.

15. Xiao X, Fischbach S, Song Z, Gaffar I, Zimmerman R, Wiersch J, et al. Tímabundin bæling á TGFbeta viðtakamerkjum auðveldar ígræðslu mannaeyja. Innkirtlafræði. 2016; 157: 1348-56.

16. Nomura M, Zhu HL, Wang L, Morinaga H, Takayanagi R, Teramoto N. SMAD2 truflun í beta-frumum í brisi í músum leiðir til offjölgunar eyja og skertrar insúlínseytingar vegna dempunar á ATP-næmri K plús rás virkni. Sykursýki. 2014; 57: 157-66.

17. Rady B, Chen Y, Vaca P, Wang Q, Wang Y, Salmon P, o.fl. Oftjáning E2F3 stuðlar að útbreiðslu starfhæfra beta-frumna úr mönnum án þess að framkalla frumudauða. Frumuhringur. 2013; 12: 2691-702.

18. Zhang Y, Alexander PB, Wang XF. TGF-beta fjölskylduboð til að stjórna frumufjölgun og lifun. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017; 9.

19. Wang P, Fiaschi-Taesch NM, Vasavada RC, Scott DK, Garcia-Ocana A, Stewart AF. Sykursýki--framfarir og áskoranir í beta-frumufjölgun manna. Nat Rev Endocrinol. 2015; 11: 201-12.

20. Yang X, Letterio JJ, Lechleider RJ, Chen L, Hayman R, Gu H, o.fl. Markviss röskun á SMAD3 leiðir til skerts slímhúðarónæmis og minnkaðrar svörunar T-frumna fyrir TGF-beta. EMBO J. 1999; 18: 1280-91.

21. Li DS, Yuan YH, Tu HJ, Liang QL, Dai LJ. Samskiptareglur um einangrun hólma frá brisi í músum. Nat Protoc. 2009; 4: 1649-52.

22. Szot GL, Koudria P, Bluestone JA. Ígræðsla brishólma í nýrnahylki sykursjúkra músa. J Vis Exp. 2007: 404.

23. Xu BH, Sheng J, You YK, Huang XR, Ma RCW, Wang Q, o.fl. Eyðing á Smad3 kemur í veg fyrir bandvefsmyndun í nýrum og bólgu í nýrnakvilla af tegund 2 sykursýki. Efnaskipti. 2020; 103: 154013.

Hong-Lian Wang1,2, Biao Wei2, Hui-Jun He2, Xiao-Ru Huang2,3, Jing-Yi Sheng2,4, Xiao-Cui Chen2,5, Li Wang1, Rui-Zhi Tan1, Jian-Chun Li1, Jian Liu1, Si-Jin Yang6, Ronald CW Ma2 og Hui-Yao Lan2,7

1 Rannsóknarmiðstöð fyrir samþætta læknisfræði og nýrnalækningadeild, tengdur hefðbundinn kínverskur læknisfræðisjúkrahús við Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan, 646000, Kína.

2. Department of Medicine and Therapeutics, og Li Ka Shing Institute of Health Sciences, Kínverska háskólinn í Hong Kong, Hong Kong, 999077, Kína.

3. Guangdong-Hong Kong sameiginleg rannsóknarstofa um ónæmisfræðilega og erfðafræðilega nýrnasjúkdóma, Guangdong Provincial People's Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou, Guangdong, 510080, Kína.

4. State Key Laboratory of Bioelectronics, Jiangsu Key Laboratory for Biomaterials and Devices, School of Biological Sciences & Medical Engineering, Southeast University, Nanjing, Kína.

5. Lykilrannsóknarstofa um forvarnir og stjórnun á langvinnum nýrnasjúkdómum í Zhanjiang City, Institute of Nephrology, Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Zhanjiang, Guangdong, 524001, Kína.

6. National Traditional Chinese Medicine Clinical Research Base, Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital of Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan, 646000, Kína.

7. CUHK-Guangdong Provincial People's Hospital Sameiginleg rannsóknarstofa um ónæmisfræðilega og erfðafræðilega nýrnasjúkdóma, Kínverski háskólinn í Hong Kong, Hong Kong, 999077, Kína.