Hluti 2: Áhrif akteósíðs sem frumuverndar til að framleiða klónaðan hund

Ji Hye Lee1☯, Ju Lan Chun1☯, Keun Jung Kim1 , Eun Young Kim1 , Dong-hee Kim1, Bo Myeong Lee1 , Kil Woo Han1 , Kang-Sun Park1 , Kyung-Bon Lee2 , Min Kyu Kim1*

Tengiliður:joanna.jia@wecistanche.com

Vinsamlegast smelltu hér til að hluta 1

Vinsamlegast smelltu hér til að hluta 3

Akteósíðinncistancheá margaheilsuKostir

tölfræðigreining

Gögnin voru greind með því að nota IBM SPSS tölfræði (SPSS Inc., Chicago, IL USA) með einhliða ANOVA og heiðarlega marktækum mismunaprófi Tukey. Mismunur var talinn tölfræðilega marktækur þegar P-gildið var minna en 0.05.

Niðurstöður

Áhrif akteósíðs á samstillingu frumuhringsins

Áhrifin afakteósíðá frumuhrings samstillingu var rannsakað með því að nota flúrljómunarvirkjaða frumuflokkun (FACS) (tafla 1). Huntafóstur trefjafrumur voru meðhöndlaðir með ýmsum styrkjum afakteósíð(10, 30, 50 μM) í mismunandi tímalengd (24, 48, 72 klst.), og frumurnar voru aðskildar í G0/G1 stig, S stig og G2/M stig með FACS. Niðurstöður FACS voru bornar saman við niðurstöður frumanna sem voru samstilltar með svelti í sermi og snertihömlun. Svelting í sermi leiddi til hæsta hlutfalls samstillingar frumuhrings (88,2 prósent) á G0/G1 stigi samanborið við snertihömlunina (84,6 prósent) ogakteósíðmeðferð (80,8–84,5 prósent).Akteósíðmeðferð í 24 klst. framkallaða G0/G1 frumuhringssamstillingu með minnstu skilvirkni (80.8, 81.1 og 82.0 prósent).Akteósíðvar áhrifaríkust við að framkalla samstillingu G0/G1 frumuhrings við 30 μM styrk og meðferðarlengd í 48 klst (84,5 prósent). Hins vegar var enginn marktækur munur á styrkleika og lengdakteósíðmeðferð til að framkalla G1/G0 frumuhringssamstillingu. Á heildina litið,akteósíðmeðferð sýndi engan marktækan mun samanborið við svelti í sermi og snertihömlun hvað varðar samstillingu G{{0}}/G1 frumuhrings. Það var heldur enginn munur á samstillingu frumuhrings á S-stigi meðal hópanna þriggja. Að auki var hlutfall frumna sem voru handteknir á G2/M stigi svipað og frumur handteknar á G0/G1 stigi.

Tafla 1. Áhrif snertihömlunar, svelti í sermi ogakteósíðmeðferð á samstillingu frumuhrings í hundafósturtrefjum.

Mynd 1. ROS gildi í hundafósturtrefjum. Samstilling frumuhrings með (A) snertihömlun, (B) svelti í sermi og (C) 30 μM akteósíð meðferð í 48 klst. Vefjarit sýna magn ROS sem greinst hefur í hundafósturtrefjum.

Áhrif akteósíðs á ROS og apoptosis

Áhrifin afakteósíðá ROS var ákvarðað með FACS með því að nota carboxy-H2DCFDA, oxunarálagsvísir sem virkjast í frumum þegar esterasar fjarlægja asetathópa á milli frumna (mynd 1). ROS greindist í lægra magni í akteósíðmeðhöndluðum frumum en í frumum sem voru samstilltar með svelti í sermi eða snertihömlun. Magn ROS var marktækt lægra í acteoside meðferðarhópnum (42,8 prósent) en í hópnum sem fékk snertihömlun og svelti í sermi (54,3 og 99,5 prósent í sömu röð) (tafla 2).

Til að skilja áhrifin afakteósíðá frumulifun og dauða, var frumudauði rannsökuð í frumum eftir framköllun frumuhringssamstillingar. Lifunarhlutfall akteósíðmeðhöndlaðra frumna (94,8 ± 1,2 prósent) var marktækt hærra en bæði snertihömlun og sveltihópar í sermi (87,3 ± 0,5 prósent) (mynd 2D). Hlutfall apoptosis í sermi svelti hópnum

(52,1 ± 5,3 prósent) voru marktækt hærri en þeir sem voru í snertihömlun og akteósíð meðferðarhópunum (mynd 2E). Apoptosis sem sást í snertihömlunarhópnum var 10,6 prósent, sem var einnig marktækt hærra en akteósíð meðferðarhópurinn (4,2 prósent) (mynd 2E). Að auki fannst minna drep í akteósíðmeðhöndluðum frumum samanborið við snertihömlunarhópinn (mynd 2F).

Cistanchedeserticola acteoside getur aukiðfriðhelgiog minnkaapoptosis

Áhrif akteósíðs á in vitro þróun kjarnaflutningsfósturvísa hunda

Til að kanna áhrif akteósíðs á þróun SCNT fósturvísa voru kjarnagjafafrumur fluttar inn í eggkjarna eggfrumur í hunda eftir samstillingu frumuhrings meðakteósíð. Eins og sést í töflu 3 var enginn marktækur munur á frumþroska fósturvísa frá kjarna

Tafla 2. Magngreining á ROS

Mynd 2. Hlutfall frumulifunar, frumudauða og dreps á hundafósturtrefjum. Apoptotic frumur í (A) snertihömlun, (B) svelti í sermi og (C) 30 μMakteósíðmeðferð fyrir 48 klst hóp var ákvörðuð með FACS; Magngreining á niðurstöðum FACS á (D) frumulifun, (E) frumudauða og (F) drepi. Þessi tilraun var endurtekin fjórum sinnum sjálfstætt. (Bls<>

gjafafrumur með mismunandi frumuhringssamstillingaraðferðir, annaðhvort snertihömlun eða akteósíðmeðferð. Hins vegar þróuðust aðeins SCNT-fósturvísar hunda sem voru hannaðir með því að nota kjarnagjafafrumurnar sem voru samstilltar á G0/G1 stigi við akteósíð lengra en 10-fósturfósturstigið.

Framleiðsla á klónuðum hundi með því að nota frumur ræktaðar meðakteósíð

Fimmtíu og sjö klónaðir hundafósturvísar framleiddir með snertihindruðum gjafafrumum voru fluttir með skurðaðgerð yfir í eggjastokka 6 viðtakenda. Enginn af 6 viðtakendum eignaðist afkvæmi

Tafla 3. In vitro þróun kjarnaflutningsfósturvísa hunda.

Tafla 4. Framleiðsla á klónuðum hundi með SCNT.

eða jafnvel orðið ólétt. Þrjátíu og átta klónaðir hundafósturvísar framleiddir úr akteósíðmeðhöndluðum gjafafrumum voru einnig fluttir með skurðaðgerð í eggjastokka þriggja viðtakenda. Meðganga var staðfest hjá einni af þremur staðgöngumæðrum, sem að lokum fæddi heilbrigðan hvolp með keisaraskurði sem vó 354 g (tafla 4 og mynd 3). Til að ákvarða uppruna erfðamengisins var gerð örgervihnattamögnun með genum klóna hundsins. Örgervihnöttur eru stuttar endurteknar raðir sem notaðar eru í erfðamengiskimunum til að rekja erfðir og tengslagreiningu í fjölskyldum. Sjö örgervihnattamerki voru notuð til að bera kennsl á uppruna erfðamengisins í einrækta hundinum (tafla 5). Klónuðu hundurinn og gjafafrumurnar sem notaðar voru til að klóna hundinn áttu sömu örgervihnattamerkin, en eggfrumugjafinn og staðgöngugjafinn deildu aðeins samsætum að hluta (tafla 5). Í forfeðraprófi móðurinnar höfðu einræktaði hundurinn og eggfruma viðtakanda eins hvatbera DNA (mtDNA) röð, sem sýndi að mtDNA klónaða hundsins var fengið frá eggfrumugjafanum (tafla 6).

akteósíðí cistanche

Umræða

Samstilling gjafafrumuhrings er mikilvægur þáttur til að bæta SCNT skilvirkni [43]. Hraði þróunar SCNT fósturvísa og skilvirkni klónunar dýraframleiðslu

Mynd 3. Einræktaður hundur: (A) Ómskoðun af fóstrinu í fósturblöðru 32 dögum eftir flutning fósturvísa; (B) Klónaði beagle við 2 mánaða aldur.

akteósíðinncistanchegetur gegn öldrun