Hluti 1 Fyrirbyggjandi áhrif fenýletanóls glýkósíða frá Cistanche Tubulosa á nautgripasermi albúmín-völdum lifrartrefjum í rottum

Tengiliður: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Netfang:audrey.hu@wecistanche.com

Ágrip

Bakgrunnur:Cistanche tubulosa er hefðbundið kínverskt jurtalyf sem er mikið notað til að stjórna ónæmi.Fenýl etanól glýkósíð frá cistanche(CPhGs) frá þessari plöntu eru fyrst og fremst virk efni. Markmið þessarar rannsóknar var að meta fyrirbyggjandi og lækningaleg áhrif CPhGs á BSA-framkallaða lifrartrefjun í rottum og skylda sameindaaðferðir sem taka þátt í lifrarstjörnufrumum. Biejiarangan (BJRG), annað hefðbundið kínverskt jurtalyf, var notað sem jákvæð viðmiðun. Aðferðir: Í in vivo tilraunum var 75 SD rottum skipt af handahófi í 6 hópa: venjulegar (meðhöndlaðar með eimuðu vatni), líkan (BSA-meðhöndlaðar), jákvætt lyf (BSA-meðhöndlaðar auk BJRG 60{{29} } mg/kg/dag), og BSA-meðhöndlaðir auk CPhGs (125, 250 og 500 mg/kg/dag) hópa. Lifur og milta vísitölur, sermisþéttni aspartat amínótransferasa (AST), alanín amínótransferasa (ALT), hexadecensýru (HA), laminín (LN), tegund III procollagen (PCIII), tegund IV kollagen (IV-C), hýdroxýprólín ( Hyp), og umbreytandi vaxtarþáttur 1 (TGF- 1) voru mældir í rottu lifur. Vefjameinafræðilegar einkunnir fyrir bandvef í lifur voru metnar fyrir hvern hóp með H&E og Masson's trichrome litun. Tjáning TGF- 1, kollagens I (Col-I) og kollagens III (Col-III) voru ákvörðuð með ónæmisvefjaefnafræðilegri litunaraðferð. Þessi áhrif voru metin frekar in vitro með því að ákvarða tjáningarmagn NF-KB p65 og Col-I með magnbundinni rauntíma PCR greiningum. Col-I próteintjáning var einnig skoðuð með Western blotting. Niðurstöður: Allir skammtahópar (125, 250 og 500 mg/kg/dag) af CPhG lækkuðu marktækt lifrar- og miltavísitölu, lækkuðu ALT, AST, HA, LN, PCIII, IV-C sermisþéttni, TGF- 1 innihald (P < 0,01,="" p="">< 0,01="" og="" p="">< 0,01),="" og="" hyp="" efni.="" cphgs="" léttu="" einnig="" verulega="" á="" bólgu="" í="" lifrarfrumum="" og="" komu="" í="" raun="" í="" veg="" fyrir="" drep="" í="" lifrarfrumum="" og="" íferð="" bólgufrumna.="" ónæmisvefjaefnafræðilegar="" niðurstöður="" sýndu="" að="" cphg="" minnkaði="" marktækt="" tjáningu="" tgf-="" 1="" (p="">< 0,01,="" p="">< 0,01="" og="" p="">< 0,01),="" col-i="" og="" col-iii.="" in="" vitro="" áhrif="" cphgs="" (100,="" 75,="" 50="" og="" 25="" ug/ml)="" á="" hsc-t6="" sýndu="" að="" cphgs="" drógu="" verulega="" úr="" mrna="" tjáningu="" nf-kb="" p65="" og="" col-i="" og="" cphgs="" drógu="" einnig="" úr="" tjáningu="" col-i="" próteina.="" ályktanir:="" cphgs="" hafa="" marktæk="" andstæðingur-lifrartrefjunaráhrif,="" og="" má="" nota="" sem="" lifrarverndandi="" lyf="" til="" meðferðar="" á="">

Lykilorð: Lifrartrefjun, Cistanche tubulosa, Fenýletanól glýkósíð, Chemokine BSA, Forvarnir og meðferð.

Bakgrunnur

Lifrartrefjun er sáragræðandi viðbrögð við alvarlegum lifrarskaða sem á sér stað við meingerð langvinnrar lifrarbólgu sem orsakast af ýmsum þáttum. Þessir þættir eru veirusýking, áfengismisnotkun, gallteppa og efnaskipta- og sjálfsofnæmissjúkdómar [1-3]. Sívaxandi uppsöfnun utanfrumufylkis (ECM) og minnkuð endurgerð truflar eðlilega uppbyggingu lifrarinnar, sem leiðir til lifrartrefjunar [4]. Lifrartrefjun er mikilvæg í langvinnum lifrarsjúkdómum og þróast oft í óafturkræf skorpulifur og krabbameinsvaldandi áhrif. Sem stendur eru engar aðferðir eða áhrifarík lyf til meðhöndlunar á lifrartrefjun. Þess vegna er brýnt að finna bandvefslyf gegn lifur sem mun draga úr framvindu lifrarskaða til bandvefs og krabbameins.Cistanche tubulosaW (af fjölskyldunni Orobanchaceae) er sníkjudýr planta sem er mikið ræktuð í suðurhluta Xinjiang í Kína [5]. Fólk notar það venjulega til að endurlífga nýrun, næra blóðið, slaka á þörmum og seinka öldrun. Það er opinberlega skráð í kínversku lyfjaskránni [6]. C. tubulosa inniheldur ýmis virk efni. Þar á meðal eruFenýl etanól glýkósíð frá cistanche(CPhGs), iridoids og fjölsykrur. Sem einn af mörgum virkum íhlutum íC. tubulosa, CPhGs hafa sýnt sannfærandi andoxunarefni, þreytueyðandi, taugaverndandi og bólgueyðandi áhrif í bæði in vivo og in vitro rannsóknum [7]. Á undanförnum árum hefur verið greint frá því að CPhGs(Fenýl etanól glýkósíð frá cistanche) hafa lifrarverndandi áhrif. Hugsanlegir aðferðir sem liggja að baki þessum áhrifum eru hreinsun sindurefna, verndun lifrarhimna, ónæmisstjórnun, hömlun á frumudauða, hömlun á tjáningu HBsAg og HBeAg og hömlun á HBV DNA afritun og fleira [8-11]. Hins vegar eru fáar rannsóknir í bókmenntum sem fjalla um and-lifrartrefjunaráhrif grafík. Þess vegna miðar þessi rannsókn að því að kanna lifrartrefjunaráhrif GPhCs með því að nota líkan af nautgripasermi albúmíni (BSA) framkallað lifrartrefjun í rottum. Skyldar sameindaaðferðir voru rannsakaðar í HSC-T6 frumum.

Aðferðir

Efni og hvarfefni

Hýdroxýprólínsett (alkalín vatnsrof) (Lot: 20140616) var keypt frá Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Kína). Rottu TGF- 1 ELISA samlokusett (lota: 238240615) voru keypt frá Lianke Biotech Co., Ltd. (Kína). Rabbit Anti-Collagen I mótefni (lota: 140619), Rabbit Anti-Collagen III mótefni (lota: 980788 W), og Rabbit Anti-TGF- 1 mótefni (lota: 140619) var veitt af Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., LTD (Kína). Meðfylgjandi með venjulegu sauðfjársermi (vinnuvökvi) (hluti: WP141214), PV-6000 (hluti: WK141225) og DAB setti (hluti: K136621D) voru keyptir frá Zhongshan Golden Bridge Biotech Co., Ltd. (Kína) . Greining á frummótefnum var framkvæmd með því að nota 2. Mótefnalausn (Alk-Phos. Conjugated, Anti-rabbit) og 2. Mótefnalausn (Alk-Phos. Conjugated, Anti-mouse) (lota: 272387) keypt af Invitrogen Company (Bandaríkjunum) ). Bovine serum albumin (BSA) (lota: SLBG8239V) var keypt frá Sigma (Bandaríkjunum). Fyrir notkun var BSA útbúið við 18 g/L í venjulegu saltvatni, bakteríurnar fjarlægðar með síun og BSA geymt við 4 gráður. Ófullnægjandi hjálparefni Freunds sem innihélt 1 g af lípíði úr sauðfjárhári (hluti: AF0220LA14, Shanghai yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (Kína,) var blandað saman við 2 g fljótandi paraffín (hluti: 20130815, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. (Kína,), sótthreinsuð í gufuautoclave og geymd við 4 gráður. Jákvæða lyfið BJRG var fengið sem Biejiarangan töflur frá Inner Mongolia Furui Medical Science Co., Ltd. (Kína). BJRG lyfjabirgðir voru útbúnir með því að leysa upp BJRG töflur í eimuðu vatni í styrkleikanum 600 mg/kg.

Plöntuefni

C. tubulosa(Orobanchaceae fjölskyldan) var keypt frá Minfeng svæðinu í Xinjiang í Kína. Efnið var staðfest af vísindamanninum Jun Zhao, Key Laboratory for Uighur Medicine, Institute of Materia Medica of Xinjiang. Skírteinissýni voru geymd í Institute of Materia Medica í Xinjiang.

Undirbúningur CPhGs(Fenýl etanól glýkósíð frá cistanche)

Þurrkaðir og sneiddir rhizomes afC. tubulosa(6,0 kg) voru dregin út í röð undir bakflæði þrisvar sinnum með 70 prósent etanóli, og leysirinn var fjarlægður til að fá etanólútdráttinn. Etanól útdrættir voru hreinsaðir með því að nota AB-8 plastefni til að fá fenýletanól glýkósíð (CPhGs). Stofnlausnir CPhGs sem notaðar voru fyrir mismunandi skammtahópa í dýrarannsóknum (500 mg/kg, 250 mg/kg, og 125 mg/kg, í sömu röð) voru leystar upp í 0,5 prósent (5 g/L) karboxýmetýl sellulósa (natríumsalt).

Magngreining CPhGs(Fenýl etanól glýkósíð frá cistanche)

Innihald tveggja þátta (echinacoside og acteoside) í CPhGs var ákvarðað með HPLC með því að nota áður tilkynnt aðferð (Zhang o.fl. 2004) [12]. HPLC var framkvæmt með því að nota Shimadzu LC-10A HPLC með UV skynjara. HPLC súlan var Phenomenex Gemini ODS súla (250 × 4,6 mm, 5 μm). Ísókratíski hreyfanlegur fasinn samanstóð af metanól-asetónítríl -1 prósent ediksýru (15:10:75, rúmmál / rúmmál). Skolun var í 40 mínútur og flæðihraða var haldið við 0,6 ml/mín. Súluhitanum var haldið stöðugu við 30 gráður. UV uppgötvun var við 334 nm.

Dýr og HSC-T6 frumulína

Heilbrigðar fullorðnar Sprague–Dawley (SD) karlkyns rottur (180–220 g) voru keyptar frá Xinjiang Medical University Animal Center, leyfisnúmer: SCXK (Nýtt) 2011–0004. Rottum var gefið fæðu án sérstaks sjúkdómsvalda (SPF). Allar aðferðir sem tengjast dýratilraunum voru samþykktar af dýrasiðanefnd fyrsta tengda sjúkrahússins í Xinjiang læknaháskólanum. Rottur voru geymdar í búrum við stýrðar umhverfisaðstæður (25 gráður og 12 klst ljós/myrkur hringrás) og höfðu frjálsan aðgang að venjulegu rottukornafóðri og kranavatni. Rottur voru aðlagðar fyrir meðferð. Ódauðleg rottulifrarstjörnufrumulína, HSC-T6, var fengin frá Wuhan Procell Gene Biotechnology Co., LTD. (Wuhan, Kína). HSC-T6 frumur voru ræktaðar í Dulbecco's Modified Eagle's Medium (High Glucose) (DMEM, Peking, Kína) ásamt 10% nautgripasermi (Gibco, Suður-Ameríku), 100 ae/ml penicillíni og 100 ug/ml streptomycin (Peking). , Kína) í rakaðri hitakassa við 37 gráður með 5 prósent CO2.

BSA af völdum lifrarskaða og meðferðir

Sjötíu og fimm SD rottum var skipt af handahófi í sex hópa: Venjulegar (meðhöndlaðar með eimuðu vatni), líkan (BSAmeðhöndlaðar), jákvætt lyf (BSA-meðhöndlaðar auk BJRG 600 mg/kg/dag) og BSA-meðhöndlaðar auk CPhGs(Fenýl etanól glýkósíð frá cistanche)(125, 250, 5{{20}}0 mg/kg/dag) hópa. BSA-meðhöndlaðir auk CPhGs (125, 250, 500 mg/kg/dag) hópar voru með 13 rottur í hverjum hópi og í hinum hópnum voru 12 rottur í hverjum hópi. BSA-framkallaða lifrarskaðalíkanið er skipt í frumnæmingu fylgt eftir með ónæmisfræðilegu árás) [13]. Að venjulegum hópi undanskildum fengu hinir hóparnir margar inndælingar undir húð með 0,5 ml (9 mg/ml) ófullnægjandi BSA Freund's hjálparefni á degi 1, degi 15, degi 22, degi 29 og degi 36 fyrir frumnæmingu. Sjö dögum eftir fimmtu inndælinguna var blóð fengið í gegnum sjónhimnubláæðafléttuna hjá rottum og prófað með tilliti til albúmínmótefna í sermi. BSA mótefni í rottusermi var greint með tvöfaldri agardreifingaraðferð. Árásarsprautan var framkvæmd með því að gefa 0,4 ml af BSA í venjulegu saltvatni í gegnum bláæð í BSA mótefnajákvæðum rottum tvisvar í viku í tíu sinnum. Styrkur og inndælingartími var 5.00, 5.50, 6.00, 6.50, 7.00, 7.50, 8.50, 9.00, 9.50 og 10.00 g/L á degi 46, degi 50, dag 53, dag 57, dag 60, dag 64, dag 67, dag 71, dag 74 og dag 78, í sömu röð. Í venjulegum hópi var venjulegt saltvatn notað fyrir ónæmisfræðilegar frum- (næmingar) og auka- (árás) inndælingar í stað BSA og aðrar aðstæður voru þær sömu og í líkanahópnum. Venjulegur hópur fékk eimað vatn til inntöku með skammti upp á 10 ml/kg/dag. Fyrirmyndarhópnum var gefið til inntöku 10 ml/kg/dag 0,5 prósenta CMC-Na lausn. Jákvæði lyfjahópurinn var gefinn til inntöku 600 mg/kg/dag BJRG. BSA-meðhöndluðu plús CPhGs (125,

250 og 500 mg/kg/dag) hópar fengu til inntöku 125, 250 og 500 mg/kg/dag CPhGs(Fenýl etanól glýkósíð frá cistanche), í sömu röð. Dagleg skömmtun rottur hélt áfram í tvær vikur eftir síðustu inndælingu. Eftir tilraunatímabilið voru rottur fastaðar í 12 klst áður en þær fengu 10 prósent klóralhýdrat og síðan strax aflífaðar. Sermissýni voru tekin úr hverri rottu og notuð strax. Lifur voru tíndar í tvennum tilgangi: (1) varðveislu í fljótandi köfnunarefni fyrir Hyp-sett og (2) festing í 10 prósent formaldehýð fyrir vefja- og ónæmisvefjafræðilegar rannsóknir. Allur lengd dýrarannsóknanna var 93 dagar.

Lifur og milta vísitölur

Lifur og milta voru krufin með kviðarholsskurði og þvegin með 4 gráðu venjulegu saltvatni. Eftir að hafa tekið umframvatn í sig með síupappír voru lifur og milta vigtuð til að reikna út samsvarandi vísitölur: Hlutfallsleg líffæraþyngd=líffæramassi (g)/líkamsþyngd einstaklings (g) × 100 prósent [14].

Frumutilraunir

HSC-T6 frumur voru húðaðar í 96-brunnsplötu. Upphaflega voru frumur ræktaðar með DMEM sem innihélt 10 prósent FBS í 48 klst. Miðlinum var síðan skipt út fyrir DMEM án FBS til að svelta frumurnar í 12 klst. Frumurnar voru síðan ræktaðar með DMEM sem innihélt 5,0 ng/mL TGF - 1 (án FBS) í 24 klst. Að lokum, mismunandi styrkur CPhGs(Fenýl etanól glýkósíð frá cistanche)(100 ug/ml, 50 ug/ml og 25 ug/ml), akteósíð (6 ug/ml, 3 ug/ml og 1,5 ug/ml) og echinacoside (500 ug/ml, 250 ug/ml og 125 ug/ml) voru gerðar í plötunni í fjórfalda holum og ræktaðar í 48 klst.

Rauntíma PCR greining

MRNA tjáningarstig NF-KB, p65 og kollagens I var ákvarðað með rauntíma PCR. Til að ákvarða mRNA tjáningu í HSC-T6 frumum voru frumurnar (4 × 105 frumur) sáð í sex brunna plötur með 3 mL DMEM með 10 prósent FBS og ræktaðar yfir nótt við 37 gráður og 5 prósent CO2, eftir það er frumuræktunarmiðillinn var breytt í sermislaust DMEM. Næst, CPhGs(Fenýl etanól glýkósíð frá cistanche)(100 ug/ml, 50 ug/ml og 25 ug/ml), akteósíð (6 ug/ml, 3 ug/ml og 1,5 ug/ml) og echinacoside (500 ug/ml) 250 ug/ml, og 125 ug/ml) var bætt við brunnana. Eftir 48 klst ræktun með CPhGs eða einliða samsetningum var heildar-RNA dregið út með því að nota TRIzol hvarfefni (Invitrogen, USA) og hrist kröftuglega með klóróformi í 15 s. Eftir að hafa setið við stofuhita í 3 mínútur var lýsatið skilið í skilvindu við 12,000 × g í 15 mínútur við 4 gráður. RNA í vatnsfasanum var fellt út með ísóprópanóli og efri vatnsfasinn fluttur yfir í nýtt örskilvindurör. RNA var fellt út með því að bæta við 0,75 prósent etanóli, eftir það var örskilvindurörið skilið við 12,000 × g við 4 gráður í ekki meira en 5 mínútur. Vökvinn var fjarlægður og RNA var þurrkað við stofuhita í 5-10 mínútur. Sérstök sett af primerum (Sangon, Shanghai, Kína) sem voru notuð til mögnunar á rottu-aktíni [GenBank: NM_031144.3], Kollagen I [GenBank: NM_ 053304.1] og NF -κB p65 [GenBank: NM_199267.2] gen voru hönnuð með því að nota Batch Primer 3. Fram (fw) og afturábak (rv) frumur voru sem hér segir: Kollagen I (fw: GGA GAG AGC ATG ACC GAT GG , rv: GGG ACT TCT TGA GGT TGC CA), NF-κB p65 (fw: CAT ACG CTG ACC CTA GCC TG, rv: TTT CTT CAA TCC GGT GGC GA), -aktín (fw: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GAT G, rv: AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A). Niðurstöður voru staðlaðar í samræmi við mRNA húshaldsgensins -aktíns sem innra eftirlit og eru settar fram sem hlutfallslegt mRNA gildi. Viðbrögð voru framkvæmd með 8 μL iQ SYBR Green Supermix, 1 μL 10 pM grunnpar, 8,5 μL eimuðu vatni og 2,5 μL cDNA. Hver pólýmerasa keðjuverkun var framkvæmd við eftirfarandi aðstæður: 95 gráður í 3 mínútur, síðan 40 lotur af 10 sekúndum við 95 gráður, 30 sekúndur við 55 gráður og 10 s við 55 gráður – 95 gráður til framlengingar, fylgt eftir með einni flúrljómunarmælingu . Lokaniðurstöðum var lýst með hlutfallslegum gildum (2-ΔΔCt). Útreikningur og greining var framkvæmd með iQ5 rauntíma PCR uppgötvunarkerfinu.

Western blot greining

Kollagen I (Abcam, Cambridge, Bretlandi, vörunúmer: ab34710) próteintjáningarstig var ákvarðað með Western blotting [með -aktíni (Lot: 60008-1-lg; Proteintech, Kína) sem eftirlit með heimilishaldi. Heilfrumuþykkni voru útbúin með því að nota Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) (Thermo Scientific, USA) jafnalausn með 1 prósent Halt próteasa hemla kokteil (Thermo Scientific, USA) og 1 prósent Halt fosfatasa hemla kokteilum (Thermo Scientific, Bandaríkjunum). Próteinstyrkurinn var mældur og magngreindur með Bradford aðferðinni [18]. Prótein (10–50 ug) var aðskilið á 10 prósent SDS-PAGE hlaupi og flutt yfir á PVDF himnur (Millipore, Bandaríkjunum). Himnur voru lokaðar í 1 klst við stofuhita með 5 prósent BSA og aðal mótefnin (Anti-Colla gen I mótefni, 1:200 þynning eða mAb af -aktíni frá músum, 1:5000 þynning) voru ræktuð við 4 gráður yfir nótt. Samsvarandi Alk-Phos. samtengd aukamótefni voru ræktuð við stofuhita. Að lokum voru himnurnar þvegnar þrisvar sinnum með 1 × Tris-HCl saltvatni með 0,1 prósent Tween 20, og merki voru skönnuð og sýnd með GEL DOC XR Imaging System (Bio-Rad). Densitometric greining var framkvæmd á próteinum sem vekur áhuga og staðlað í -aktín með GEL DOC Image Studio hugbúnaði (Bio-Rad). -aktín var notað sem innra eftirlit.

tölfræðigreining

Shapiro-Wilk eðlilega prófið og Levene's dreifni einsleitni prófið var beitt til að sannreyna eðlilegt og You o.fl. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences (2015) 23:52 Bls. 4 af 13homogenity of dreifni. Dreifnigreining (ANOVA) fylgt eftir með Tukey's post hoc prófi var notað til að bera kennsl á tölfræðilegan mun á ójafnri, normaldreifðum gögnum. Kruskal-Wallis prófið sem ekki var parametrískt var notað til að greina gögn sem voru ekki normaldreifð eða einsleit. Niðurstöður voru gefnar upp sem meðaltal ± SD. Marktekt var stillt á P < 0.05.="" öll="" gögn="" voru="" greind="" með="" spss="" 16.0="" hugbúnaði="" (xinjiang="" medical="">

Niðurstöður

Magnbundin ákvörðun CPhGs

CPhG í C. tubulosa innihalda tvö fenýletýl alkóhól glýkósíð, echinacoside og acteoside, og var innihald þeirra í CPhGs ákvarðað með HPLC greiningu (mynd 1) vera 42,71 ± 0,42 prósent og 14,27 ± {{7 }}.18 prósent, í sömu röð.

Lifur og milta vísitölur

Eins og tafla 1 var sýnd hækkuðu lifrar- og miltavísitölur líkanahópsins marktækt [P < 0.01,="" p="">< 0,05].="" lifur="" og="" miltavísitölur="" jákvæða="" lyfsins="" bjrg="" og="" cphgs="" við="" mismunandi="" skammtahópa="" voru="" marktækt="" lækkuð="" samanborið="" við="" líkanahópinn="" [pliver="0.004," pliver="0.003," pliver="0." 004,="" pliver="0.005;" pspleen="0.017," pspleen="0.027," pspleen="0.024," pspleen="0.070," í="" sömu="" röð].="" lifur="" og="" milta="" vísitölur="" voru="" lægri="" en="" hjá="">

Áhrif CPhGs á ALT, AST starfsemi og lifrartrefjunarmerki

Í þessari rannsókn var sermisþéttni lifrarensímanna AST og ALT marktækt aukið í líkanahópnum, sem endurspeglar lifrarfrumuskemmdir í lifrartrefjunarrottum af völdum BSA. Hins vegar tilraunirnar.

sýndi að meðferð með BJRG (600 mg/kg) og CPhGs (125, 250 og 5{{10}}0 mg/kg) minnkaði AST marktækt [FYRIR < 0.0{{60}}1,="" fyrir="">< 0.001,="" fyrir="">< 0.001,="" fyrir="">< 0.001="" ,="" hver="" fyrir="" sig]="" og="" alt="" [palt="0.117," palt="0.139," palt="0.189," palt="0.255," í="" sömu="" röð]="" í="" lifrartrefjunarrottum="" .="" (tafla="" 2).="" magn="" ha,="" ln,="" pc="" og="" iv-c="" í="" líkanrottum="" jókst="" marktækt="" [pha="">< 0,001,="" pln="">< 0,001,="" ppciii="0.002," piv-c="">< 0,001,="" í="" sömu="" röð].="" í="" samanburði="" við="" líkanahópinn,="" gildi="" ha="" [pha="0.009," pha="0.007," pha="0.009," pha="0.023," í="" sömu="" röð],="" ln="" [pln="0.011," p="" ln="0.004," p="" ln="0.026," p="" ln="0.069," í="" sömu="" röð],="" pc="" iii="" [p="" pciii="" {="" {47}}.006,="" p="" pciii="0.067," p="" pciii="0.136," p="" pciii="0.296," í="" sömu="" röð]="" og="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" í="" sömu="" röð]="" hjá="" rottum="" minnkaði="" verulega="" vegna="" bjrg="" (600="" mg/kg)="" og="" cphgs="" við="" mismunandi="" skammtahópa="" (125,="" 250="" og="" 500="" mg/kg)="" (tafla="" 3).hyp="" innihald="" og="" tgf-="" 1="" kollageninnihald="" var="" einnig="" greint="" með="" því="" að="" mæla="" hyp="" gildi="" í="" lifrarvef.="" eins="" og="" sýnt="" er="" í="" töflu="" 4="" er="" meðaltal="">magn í líkanahópnum var marktækt hærra en venjulega hópnum, en það var verulega lækkað í BJRG hópnum og mismunandi CPhGs skammtahópum. Lifrarstyrkur TGF{{0}} í líkanahópnum í rottum jókst marktækt [P < 0.001].="" í="" samanburði="" við="" líkanahópinn="" var="" tgf-="" 1="" styrkur="" jákvæða="" lyfsins="" og="" mismunandi="" cphgs="" skammtahópa="" verulega="" lækkaður="" [p="" tgf-="" 1="">< 0.001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0,001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0,001,="" ptgf-="" 1="">< 0,001,="" í="" sömu="" röð].="" niðurstöðurnar="" eru="" teknar="" saman="" í="" töflu="">

Vefjameinafræðileg skoðun

Athuganir á venjulegum lifrarvefshlutum lituðum með H&E og Masson's trichrome sýna aðgreindar lifrarblöðrur og lifrar sinusoids. Uppbygging lifrarvefs í módelrottunum var röskuð og í stað lifrarvefs og lifrar sinusoids kom mikið magn af bandvef. Hins vegar greindist eðlilegri frumuarkitektúr og minni bandvefur í meðferðarhópnum en í líkanahópnum.

H&E litun

Hjá venjulegum hópi sást burðarvirki lifrarblaða án óeðlilegra gáttsvæða og lifrarskúta. Lifrarstrengjunum var raðað á skipulegan hátt, með kjarnanum hringlaga og skýra. Kjarnarnir eru staðsettir í miðju frumunnar, með miklu umfrymi. Aðeins gáttarsvæðið hefur lítið magn af trefjavef (mynd 2a). Í líkanahópnum skemmdist lobularbyggingin mikið. Lifrarfrumur sýndu væga hrörnun í vatni, aðallega blöðruhrörnun og/eða fituhrörnun. Einnig sást myndun bólgufrumuíferðar, víðtækrar ofvöxtur trefjavefs, myndun mikils fjölda trefjaskila, klofna blaðra og verulegrar lifrarfrumnafjölgunar. Þessar athuganir staðfestu árangur af stofnun rottuónæmisdýralíkans af lifrartrefjun (mynd 2b). Í samanburði við líkanahópinn var minnkun á íferð bólgufrumna í mismunandi CPhGs. Einnig sást minna drep og fituhrörnun lifrarfrumna sem og léttir á bandvefsmyndun. CPhGs milduðu verulega meinafræði BSA-framkallaðrar lifrartrefjunar í rottum, milduðu bólgu í lifrarfrumum og komu í raun í veg fyrir lifrarfrumudrep og íferð bólgufrumna, sem bendir til þess að CPhGs hafi verndandi áhrif á BSA-framkallaða lifrartrefjun hjá rottum. (Mynd 2c–f ). Masson's trichrome litun Í venjulegum hópi var lifrarvefurinn eðlilegur. Lifrargáttarsvæðið sýndi lítið magn af bláum kollagenþráðum og lifrarvefurinn var venjulega uppbyggður (mynd 3a). Í samanburði við lifrarvef venjulegs hóps fjölgaði trefjavefur með miðbæklingnum og stækkaði í lifrarhlífina. Kollagenþræðir framlengdir og tengdir og

umvefði allan hnakkann og umkringdi miðbláæð. Þessi áhrif, ásamt lifrarfrumnatrefjum, skemmdum á lobular uppbyggingu, periportal bandvefsmyndun og gervifrumumyndun (mynd 3b) gáfu vísbendingar um að líkanið væri komið á fót. Í samanburði við líkanahópinn voru kollagenþræðir í jákvæða lyfjaviðmiðunarhópnum væglega teygðir út frá útlæga gáttsvæðinu (mynd 3c). Samanborið við líkanahópinn minnkuðu kollagenþræðir í mismunandi CPhGs skammtahópum marktækt, trefjafjölgun var hindruð og fjölgun trefjavefs innan lifrarhlífarinnar minnkaði verulega. Þessar niðurstöður bentu til þess að CPhGs vernduðu rottur gegn BSA-völdum lifrartrefjun (mynd 3d-f).

Ónæmisvefjaefnafræðileg litun

Mikilvægt er að tjáning kollagens tegundar I og kollagens tegundar III gegnir mikilvægu hlutverki í þróun lifrartrefjunar, og myndun þeirra og útfelling í lifrarvef gæti þjónað sem mikilvægur ákvörðunaraðili um verkun lifrartrefjunar. Niðurstöðurnar eru teknar saman í töflu 5

Kollagen tegund I

Venjulegur hópur tjáði kollagen tegund I aðallega í æðum og portsvæðinu. Líkanhópurinn tjáði mjög kollagen tegund I æðatrefjun á gáttasvæðum. Í rými Disse sáust kollagen litun af tegund I, rákir eða sem flekkótt dreifing. Kollagenhjúpuð trefjaskil til að mynda gervihólf. Í þessum tilraunum mynduðust færri trefjaskil fyrir BJRJ (600 mg/kg) og mismunandi skammtahópa CPhGs (125, 250 og 500 mg/kg) [PCol I=0.002, PCol I {{ 6}}.001, PCol I=0.023, og P Col I=0.044, í sömu röð]. Hálfmagndar niðurstöður leiddu í ljós að tjáning kollagen gerð I þeirra var marktækt lægri samanborið við líkanahópinn (mynd 4).

Kollagen gerð III

Kollagen tegund III var veikt tjáð í venjulegum hópi og útlæg svæði umhverfis gáttina og lifraræðar sýndu lítið magn af fíngulu í stað samfelldra trefja (mynd 5a). Í líkanahópnum sýndu kollagenþræðir breiðar og þykkar strengir, sem gefa til kynna sterka tjáningu, aðallega staðsett á gátt- og trefjavefssvæðum (mynd 5b). Kollagentrefjar BJRJ (600 mg/kg) og mismunandi skammtahópar CPhGs (125, 250 og 500 mg/kg) voru þráðlaga og dreifðust um miðbláæð og gáttsvæði. Í samanburði við líkanahópinn voru kollagenþræðir verulega skertir, litun var föl og þunn og ónæmisvefjaefnafræðileg litun var veik jákvæð (mynd 5c-f). Þessar hálf-magnlegu niðurstöður sýna að frumurnar sem tjáðu sig jákvætt í jákvæðu og mismunandi skammtahópunum [PCol III=0.015, PCol III=0.001, PCol III=0.010 og P Col III=0.037, í sömu röð] voru frábrugðnar þeim í líkanahópnum.

TGF- 1

Það var lítil tjáning á TGIF{{0}} í venjulegum rottulifrarfrumum. Tjáning var takmörkuð við lítinn fjölda millivefsfrumna (mynd 6a). Í líkanahópnum dreifðist TGF- 1 tjáning víða um gáttsvæðið, trefjarými, lifrarstjörnufrumur, bólgufrumur, sinusoidal vegg og umfrymi. Tiltekið gáttarsvæði sýndi mjög jákvæða tjáningu með brúngulum litun (mynd 6b). Lítil tjáning var á gáttsvæði og trefjaskilum BJRJ (600 mg/kg) og mismunandi skammtahópa CPhGs (125, 250 og 500 mg/kg). Umfang jákvæðrar litunar í þessum hópum minnkaði verulega samanborið við fyrirmyndarhópinn. Litun í millivefsfrumum í trefjaskilum og umfrymi bólgufrumna minnkaði (mynd 6c–f). Hálftaldar niðurstöður leiddu í ljós að BJRJ og mismunandi skammtahópar CPhGs [P TGF- 1=0.001, P TGF- 1 < 0.001,="" p="" tgf-="" 1="0.009," ptgf-="" 1="0" .004,="" í="" sömu="" röð]="" voru="" marktækar="" samanborið="" við="" líkanahópinn.="" eins="" og="" fram="" kemur="" fyrr="" í="" greininni="" er="" tgf-="" 1="" mikilvægt="" frumuefni="" í="" meinalífeðlisfræði="">

bandvefsmyndun, örvar framleiðslu á utanfrumu fylki [19]. Við sýndum að magn TGF- 1 jókst í líkanahópnum í samræmi við alvarleika lifrartrefjunar. Tjáningarmagn TGF- 1 í lifur var í samræmi við gildi TGF- 1 í sermi. Þetta gefur til kynna að CPhGs geti dregið verulega úr lifrartrefjun vegna TGF- 1 tjáningar með því að taka þátt í myndun og niðurbroti ECM. Tjáning kollagens tegundar I, kollagens tegundar III og TGF- 1 getur greint meinafræðilegt ferli lifrartrefjunar. Tjáningarmagn þeirra í meðferðarhópunum minnkaði marktækt og sýndi fram á að CPhGs geta bætt kollagenasavirkni, viðhaldið kraftmiklu jafnvægi lifrar-ECM nýmyndunar og niðurbrots og þannig seinkað og komið í veg fyrir myndun lifrartrefjunar.