Hluti 1: Kortlagning epigenomic og transcriptomic samspils við myndun minni og muna í Hippocampal Engram Ensemble

Fyrir frekari upplýsingar:ali.ma@wecistanche.com

Vinsamlega smelltu hér til að hluta 2

Asaf Marco1,2,*, Hiruy S. Meharena1,2, Vishnu Dileep1,2, Ravikiran M. Raju1,4, Jose Davila- Velderrain3, Amy Zhang2, Chinnakkaruppan Adaikkan1,2, Jennie Z. Young1,2, Fan Gao1, Manolis Kellis3,5, Li-Huei Tsai1,2,5,*

1Picower Institute for Learning ogMinni, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, Bandaríkjunum.

2Department of Brain and Cognitive Sciences, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, Bandaríkjunum.

3Computer Science and Artificial Intelligence Laboratory, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, Bandaríkjunum.

4Division of Newborn Medicine, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, Bandaríkjunum.

5Broad Institute of Harvard og MIT, Cambridge, Massachusetts, Bandaríkjunum.

Smelltu til aðCistanche vítamínbúð og Cistanche fyrir minni

Ágrip

Epigenome og þrívídd (3D) -erfðafræðileg arkitektúr eru að koma fram sem lykilþættir í kraftmikilli stjórnun mismunandi umritunaráætlana sem krafist er fyrir taugafrumustarfsemi. Hér notum við virkniháð merkingarkerfi í músum til að ákvarða epigenetic ástand, 3D erfðamengisarkitektúr og umritunarlandslag engram frumna yfir líftímaminnimyndun og innköllun. Niðurstöður okkar sýna þaðminnikóðun leiðir til frumunaratburðar sem einkennist af auknu aðgengi aukaefna án samsvarandi umritunarbreytinga.Minnisamþjöppun leiðir í kjölfarið til staðbundinnar endurskipulagningar á stórum litningahlutum og víxlverkunum sem stuðla að auknu efni. Að lokum, með endurvirkjun, nýta engram-taugafrumur undirmengi af denovolong-range víxlverkunum, þar sem grunnaðir aukaefni voru settir í snertingu við viðkomandi hvata til að uppstilla gena sem taka þátt í staðbundinni próteinþýðingu í taugamótahólfum. Sameiginlega útskýrir vinna okkar alhliða umritun og notendur geta skoðað, prentað, afritað og hlaðið niður texta og gagnaleit efni í slíkum skjölum, fyrir fræðilegar rannsóknir, með fyrirvara um allan notkunarskilmála: http://www.nature. com/authors/editorial_policies/license.html#terms

*Bréf til: marcoa@mit.edu. lhtsai@mit.edu.

Framlög höfunda:

AM og L.-HT mótuðu og hönnuðu verkefnið. AM og AZ gerðu hegðunartilraunir, ISH, ónæmislitun og MARIS greiningu. CA framkvæmdi veirusprautun og ónæmislitun. AM og HSM gerðu ATAC-seq tilraunir. AM og AZ gerðu kjarna-RNA-seq tilraunir. AM, HSM og VD gerðu pc-Hi-C og Hi-C tilraunir. AM, HSM, VD, RMR og JDV gerðu ATAC-seq greiningu. AM, RMR, HSM, VD og FG gerðu kjarna RNA-seq greiningu. AM, VD, HSM og RMR gerðu pc-Hi-C og Hi-C greiningu. Allir höfundar aðstoðuðu við að túlka gögnin. AM, HSM, VD, RMR, JZY, MK og LHT skrifuðu handritið með inntaki frá öllum höfundum. LHT útvegaði verkfærin og hafði umsjón með verkefninu.

Samkeppnishagsmunir:

Höfundar lýsa ekki yfir hagsmunum í samkeppni.

epigenomic landslag yfir líftímaminnimyndun og endurköllun í hippocampal engram ensemble.

Myndun og varðveisla langtímaminninga er háð samræmdri genatjáningu og nýmyndun taugamótapróteina1. Þessir sameindaferlar starfa innan ákveðins hóps taugafrumna, sem vísað er til sem engram frumur2–4. Nýlegar aðferðir sem nota virkniháða tjáningu fréttamanna veittu ramma til að kanna engram ensemble5–8, en sameindaaðferðirnar sem stjórnaminnigeymsla og endurheimt er enn illa skilin. Nánar tiltekið, erfðafræðilegar breytingar og þrívíddarerfðafræðilegur arkitektúr eru að koma fram sem lykilþáttur í kraftmikilli stjórnun á tjáningu gena9– 17, og það er vaxandi skilningur á mikilvægi þeirra fyrir starfsemi taugafruma, þroska og sjúkdóma14, 16, 18

Hér notuðum við Targeted Recombination in Active Populations (TRAP) músalíkan5,6, þar sem virkjaðar taugafrumur sem tjá Activity Regulated Cytoskeleton Associated Protein, (Arc) genið, eru varanlega merktar á framkallanlegan hátt. Virkjaðar taugafrumur á meðanminnikóðun, samþjöppun og innköllun var flokkuð og sett í kjarna-RNA raðgreiningu (nRNA-seq), prófun á transposasa-aðgengilegu litningi með raðgreiningu (ATAC-seq) og litningauppbyggingu (Hi-C). Gögn okkar sýna þaðminnikóðun leiðir til aukinnar erfðamengis á aðgengi að litningi, án þess að búast megi við breytingum á genatjáningu. Ennfremur sýnum við fram á að seint áfangi minnisstyrkingar tengdist endurstaðsetningu stórra litningahluta (undirhólfa) úr óvirku umhverfi í leyfilegt umhverfi og endurskipulagningu á samskiptalandslagi sem stuðlar að auknum samskiptum. Að lokum, endurvirkjun taugafrumna á meðanminniinnköllun tengist milliverkunum denovopromoter-enhancer, sem notar stóran hlutmengi af aukaefnum sem voru undirbúnir meðan áminnikóðun. Þessar milliverkanir sem stuðla að auknu efni tengjast öflugri breytingu á tjáningu gena sem taka þátt í staðbundinni próteinmyndun og synaptic formgerð.

Niðurstöður

Tímabundin og staðbundin auðkenning á virkum og endurvirkjuðum engram frumum

Að fylgjast með taugavirkni með tímanum hefur verið ein helsta áskorunin þegar rannsakað er engram frumur, þar sem merkin fyrir taugavirkni, þekkt sem strax snemma gen (IEGs), fara aftur í grunnlínu stuttu eftir framköllun1,2. Til að vinna bug á þessari takmörkun nýttum við okkur TRAP5,6 líkanið, sem krefst tveggja transgena, annars vegar sem tjáir CreERT2 frá virkniháðum Arc promotera og hins vegar sem leyfir tjáningu gula flúrljómandi próteinsins (eYFP) blaðamanns, í Cre- háð hátt. Gjöf tamoxifens (TAM) til TRAP músanna leiðir til varanlegs eYFP merki í virkjaðar Arc taugafrumum. Án TAM er CreERT2 haldið í umfryminu og eYFP er ekki tjáð (Unbreidd gögn mynd 1a). TRAP mýs voru látnar sæta klassískri Pavlovian contextual fear conditioning (CFC) hugmyndafræði (Mynd 1a), sem er almennt notuð aðferð til að rannsaka andstæðar minningar19. Um það bil 1,5–2 klukkustundum eftir útsetningu fyrir FS var heilum safnað til að bera kennsl á i) RNA bindandi prótein refur-1 homolog 3 (Rbfox3) einnig þekktur sem NeuN plus og eYFP plús merktar taugafrumur sem voru virkjaðar við upphaflega útsetningu (virkjað) -snemma), sem hægt er að greina frá ii) NeuN plús /eYFP- óvirkjaðar taugafrumur í grunnstöðu (Basal) (mynd 1a). Eftir fimm daga, þar sem ekki var hægt að sækja, söfnuðum við iii) NeuN plús /eYFP plús taugafrumum sem voru merktar á þjálfunardegi, sem táknar langtímaminnisamþjöppun (Virkjaður-seint). Í

mismunandi árgangi, mýs voru aftur útsettar fyrir skilyrt áreiti og síðari innræn ARC prótein tjáning var mæld 1,5-2 klukkustundum eftir endurútsetningu. Þetta gerði kleift að bera kennsl á iv) tvöfalda jákvæða NeuN plús /eYFP plús / innræna Arc plús engram taugafrumur sem voru virkjaðar við þjálfun og endurvirkjaðar á meðanminniinnkalla (Endurvirkjað). Athyglisvert er að þó að DNA endurröðun gæti ekki átt sér stað að fullu 1,5–2 klst. eftir FS, sáum við mikla samstaðsetningu (að meðaltali 84 prósent) milli innræns Arc próteins og Arc:eYFP fréttaritarans (Extended Data Fig. 1b), sem var einnig í samræmi við fyrri skýrslur20.

Að staðfestaminnikóðun og innköllun meðan á CFC stóð, var frystihegðun skráð við þjálfun og endurútsetningu fyrir vísbendingum sem vekja ótta (Extended Data Fig. 1c). Í samræmi við fyrri útgáfur6,20 sýndu gögn okkar marktæka aukningu á fjölda eYFP plús (virkjaðar-snemma og -seint) taugafrumna í hippocampus, samanborið við mýs sem voru áfram barnalegar fyrir CFC í búrinu sínu (F (2, 70)=240.3, bls<0.0001, fig.="" 1b).="" activity-dependent="" tagging="" was="" also="" negligible="" (~1%)="" in="" the="" absence="" of="" tam="" induction="" (fig.="" 1c,="" extended="" data="" fig.="" 1d).="" with="" tamoxifen="" treatment,="" we="" observed="" a="" wide="" distribution="" of="" activity-labeled="" populations="" across="" all="" hippocampal="" sub-regions,="" where="" early="" activation="" was="" predominantly="" observed="" in="" the="" dg="" and="" late="" tagging="" was="" most="" abundant="" in="" the="" ca1="" (fig.="" 1d).="" to="" further="" interrogate="" the="" specificity="" of="" engram="" formation,="" we="" subjected="" trap="" mice="" to="" cfc="" learning="" in="" context="" a="" and="" then="" exposed="" them="" 5="" days="" later="" to="" the="" same="" context="" (a-a)="" or="" a="" novel="" neutral="" context="" b="" (a-b)="" (fig.="" 1e,="" extended="" data="" fig.="" 1e).="" we="" found="" comparable="" numbers="" of="" activated="" –late="" neurons="" in="" both="" groups="" (p="0.9)" and="" significantly="" fewer="" reactivated="" neurons="" in="" the="" a-b="" group=""><0.0001, fig.="" 1f;="" extended="" data="" fig.="" 1f),="" confirming="" that="" the="" reactivated="" cells="" play="" a="" key="" role="" in="" encoding="" prior="">

Minnimyndun tengist auknu aðgengi að krómatíni, aðallega á aukaefnum

Til að skilja betur sameindakrafta sem stjórna mismunandi umritunaráætlunum, mældum við breytingar á erfðamengi á aðgengi krómatíns á mismunandi stigumminni. Hippocampal vefir voru settir saman og einangraðir kjarnar (útvíkkuð gögn mynd 2a, viðbótartafla 1) voru látnir undirbúa ATAC-seq bókasafn. Greining á mismunandi aðgengilegum svæðum (DAR) (Diffbind, DESeq2 háttur) á milli allra þýða (mynd 2a) leiddi í ljós að flestar breytingar á litningaástandi eiga sér stað á fyrstu stigum minnismyndunar, þar sem 7,862 svæði þvert yfir erfðamengi aukast aðgengi (Basal vs. Early, viðbótartafla 2). Aftur á móti sáum við tiltölulega lágmarksbreytingar á litningaástandi þegar skipt var úr virkjað-snemma yfir í virkjað-seint (582 DAR) og á milli virkjaðar-síða og endurvirkjaðar taugafrumur (725 DAR), með 48 prósenta skörun á milli þeirra (útvíkkuð gögn mynd 2b ). Merkilegt nokk greindum við stórt hlutfall (52 prósent) af stöðugt áunnum DARs sem urðu aðgengilegri í Activated-snemma og héldust aðgengilegar í bæði Activated-sein og Endurvirkjuð taugafrumum (mynd 2b, c; viðbótartafla 2). Athyglisvert er að á meðan bæði snemma breytingar (Basal vs. Early) og stöðugt náð DARs voru auðguð fyrir intergenic svæði, voru seint chromatin breytingar (snemma vs seint og seint vs. endurvirkjaðar) að mestu auðgað fyrir verkefnisstaði, (mynd 2d).

Hagnýtur innsýn var veittur með því að meta hvernig DAR eru merkt með mismunandi histónbreytingum. Við notuðum ChromHMM fyrst til að koma á litningaástandslíkani úr tveimur sjálfstæðum rannsóknum sem nýttu lausan hippocampus vef fyrir og eftir fótlost 21,22. Næst gerðum við faltauðgunargreiningu (séð yfir væntanlegri dreifingu) á DAR fyrir þessi mismunandi ástand og komum í ljós að snemma litningabreytingar og stöðugar DAR voru auðguð fyrir aukamerki (mynd 2e; Ítarleg gögn mynd 2c, viðbótartafla 3) .

Þessar niðurstöður eru í samræmi við fyrri útgáfur, sem sýna að örvun frumtaugafrumnaræktunar veldur langvarandi aukavirkni12,23. Næst greindum við skörun einstakra stöðugra staðla við H3K4me1 og H3K27ac21. Þessi tvö histónmerki afmarka mismunandi þýða eyrnalyfja, sem geta annað hvort verið „fræst“ (aðeins H3K4me1), „virk“ (H3K4me1 og H3K27ac), eða „leynd“ (engin merki)18. Stöðugir toppar sýndu dreifingu yfir bæði grunnað og virkt aukaefni (Extended Data Fig. 2d), þar sem spáð var að 47 prósent af þessum stöðum væru „leynd“ (engin skörun milli DARs og histónmerkja21 sem fengust 1 klst. eftir FS). Til að staðfesta líkanið okkar, framkvæmdum við chromatin immunoprecipitation (ChIP) fyrir H3K4me1 og H3K27ac histónmerki, fylgt eftir með qPCR. Fjórir valdar staðir voru valdir úr mögulegri aukningu líkanagreiningu okkar (útvíkkuð gögn mynd 2d; Enhancer 1 – spáð grunnur, Enhancer 2- spáð Active, Enhancer 3 og 4 – spáð duld). Í samræmi við líkanið okkar auðkenndum við tvo „dulda“ staði í grunnástandinu (Enhancers 3 og 4) sem breyttust í „virkt“ ástand á meðanminnimyndun (mynd 2f). Ennfremur kom í ljós að hinn meinti eykur 1 var „fræstur“ í grunnástandinu og varð virkur, þar sem marktæk stöðug aukning var á H3K27ac merkjum á seinni áfanga og innköllun (mynd 2f). Saman benda þessi gögn til þess að efnisskrá nýaðgengilegra aukaefna hafi verið stækkuð í styrktum engram-taugafrumum, þar sem duld eða grunnsvæði fengu H3K4me1 og H3K27ac merki og urðu þannig virkir aukaefni.

Til að skilja hagnýt hlutverk aðgengilegra hvata- og aukaefnasvæða, gerðum við mótífauðgunargreiningu (viðbótartafla 4). Gögnin okkar benda til þess að meirihluti (70 prósent) mótífa á aðgengilegum kynningum séu jafn auðguð og voru auðkennd á öllum stigumminni(Unbreidd gögn mynd 2e). Aftur á móti sýndu meirihluti efnahækkunarstaðanna sérstakt mynstur umritunarþátta (TF) bindandi mótífa yfir mismunandi minnisfasa. Athyglisvert er að mótífin sem voru alls staðar tjáð frá Jun Proto-Oncogene, Ap-1 Transcription Factor Subunit (þ.e. Jun-Ap1), og Regulatory Factor X (Rfx) fjölskyldu TFs, auðguðust marktækt aðeins eftir upphafsstig kóðun (Extended Data Fig. 2e). Áður var greint frá því að Jun-Ap1 flókið gegnir lykilhlutverki í vali á aukaefnum og gæti virkað sem brautryðjandi TF til að skilgreina bætistöðvar meðan á heilaþroska og taugavirkni stendur12,24. Þessar niðurstöður eru í samræmi við gögn okkar sem sýndu hátt hlutfall af duldum/frumum stað í grunnstöðu (mynd 2f, útvíkkuð gögn mynd 2c, d). Þess vegna virðist sem taugafrumuvirkni gæti komið af stað bindingu Jun-Ap1 við dulda eykur, sem síðan ræður til sín litningabreytandi efni sem virkja dulda eykur. Að sama skapi bendir auðgun á umritunarstuðlinum Yin Yang 1 (Yy1) mótífum aðeins í aukaefnum frá fyrstu og seinustu ríkjum, að skipulagning sem eykur styrki er virkt ferli semminnimyndun, þar sem nýlega var greint frá því að Yy1 auðveldar myndun þessara langdrægu samskipta25. Samanlagt benda þessi gögn til þess að upphafsáfangiminnimyndun breytir aðgengislandslagi krómatíns í virkum taugafrumum, með langvarandi stöðugum breytingum sem eiga sér stað aðallega innan aukasvæða.

Dýnamískar breytingar á staðbundnum kjarnaarkitektúr og aðgengi að litningi við upphafminnimyndun samsvarar aukinni tíðni milliverkana sem stuðla að auknum virkni á meðanminnimuna

Nuclear 3D arkitektúr er að koma fram sem lykilþáttur í kraftmikilli stjórnun á tjáningu gena, í mörgum taugafrumum26–28. Þess vegna höfðum við áhuga á að afmarka nákvæmar breytingar sem eiga sér stað í staðbundinni litningaskipan á meðanminnimyndun og samþjöppun. Við framleiddum Hi-C gögn frá grunnástandi og eYFP ásamt merktum taugafrumum (snemma og seint, viðbótartafla 5). Krómatín er aðskilið í tvö staðbundið aðskilin undirkjarnahólf, 'A' og 'B', sem samsvara umritunarvirka og óvirka litningnum, í sömu röð15, 16,26. Snemma vísbendingar benda til þess að taugafrumuvirkni og ytri merkjasendingar gætu valdið endurskipulagningu á 3D-chromatin arkitektúr14,27,28. Hólfástandsgreining okkar15, 16,26 (mynd 3a–c) leiddi í ljós endurstaðsetningu stórra litningahluta úr óvirku (B) yfir í leyfilegt umhverfi (A) (og öfugt) á upphafs- og seinstigiminnimyndun (212 hlutar skipt úr A í B, 127 úr B í A, meðalstærð ~436Kbp). Athyglisvert er að 52 prósent svæðanna í upphafi áfanga sem skiptu úr B í A héldu því ástandi í seint áfanga (þ.e. voru áfram í ástandi A, mynd 3b, c; viðbótartafla 6). Þar að auki, næstum öll þessi svæði skarast við áunnið DAR frá ATAC-seq greiningu okkar, sem staðfestir umskipti á undirhólfinu frá óvirku umhverfi í leyfilegt umhverfi (mynd 3d). Þessi gögn gefa til kynna að sum staðsetning gangist undir hólfsskipti yfir mismunandi minnisstig og gætu því stuðlað að langtíma breytingum á eiginleikum og virkni taugafrumna eftir upphaflega virkjun.

Þó að Hi-C gögn okkar bentu til umfangsmikillar endurskipulagningar, var enn óljóst hvort þessi endurstilling gerði víxlverkun nýrra efnisskrár sem stuðla að auknu efni og fínstilla mismunandi umritunaráætlanir (mynd 3e). Með því að nota promoter-capture Hi-C (pc-HiC) tæknina, rannsökuðum við nákvæmar breytingar sem eiga sér stað í víxlverkunum promoter-enhancers meðan á ferlinu stendurminnimyndun og innköllun. Fyrir þessa rannsókn notuðum við sérhönnuð „beita“ sem miðuðu á ~5000 verkefnisstjóra29. Í samræmi við fyrri útgáfur29, fundum við ~19.000 (á hvern hóp) marktæka hvata-aukandi (67,5 prósent) og hvata-hvata (46,2 prósent) samskipti (útvíkkuð gögn mynd 3a,b).

Þar sem verkefnisstjórar í spendýraheilanum gætu verið undir stjórn margra eftirlitsþátta14,30,31, greindum við skörun milli allra víxlverkandi aukaefna og viðkomandi hvata. Við höfum komist að því á hverjum tímaminnifasa, sama hvatarar hafa oftar samskipti við sérstakt undirmengi aukaefna (þ.e. einstakt, Basal – 3243, Early - 7602, Late - 7028, Endurvirkjað – 7244; Mynd. 4a,b; Extended Data Fig. 3c; Viðbótartafla 7). Þessi niðurstaða er í samræmi við fyrri útgáfur sem sýna að margvísleg aukaefni sem umlykja nokkur gen (c-Fos og Arc) skipta sköpum fyrir virkjun þeirra og víxlverkunartíðni þeirra við viðkomandi verkefnisstjóra breytist til að bregðast við ýmsum afskautunarefnum í ræktuðum taugafrumum31. Við greindum einnig minna undirmengi víxlverkana þar sem hvatararnir voru í samskiptum við sömu aukaefnin á mismunandiminniáföngum (þ.e. algengt, ~31 prósent allra milliverkana; viðbótartafla 7). Ennfremur sýndu endurvirkjaðar taugafrumur marktækt sterkari víxlverkunarskor (eins og reiknað er út af Chicago, mynd 4b; útvíkkuð gögn mynd 3d). Þess vegna, þrátt fyrir að fjöldi einstakra milliverkana hafi verið svipaður í snemma, seint og endurvirkjuð ástand, benda sterkari mælikvarðar á milliverkanir til þess að sértækar milliverkanir sem stuðla að auknu efni eiga sér stað oftar meðan á minni stendur.

muna. Þessi hugmynd var staðfest enn frekar með 3C tilraunum, með frumurum sem hannaðir voru til að mæla tíðni víxlverkunar milli valinna eykur (E) og genahvata (P) sem kóða fyrir heilkjörnunga þýðingu upphafsstuðli 3 undireiningu D (Eif3d) eða glútamatviðtaka, jónótrópískum, kainati 3 (Grik3) (Mynd. 4c). Gögnin okkar sýndu að endurvirkjaðar taugafrumur höfðu marktæka aukningu á tíðni milliverkana á milli Eif3d verkefnisins og valda aukabúnaðarins, samanborið við aðra íbúa (mynd 4c). Samanlagt benda þessi gögn til þess að milliverkanir sem stuðla að auknu efni eiga sér stað oftar á meðanminnimuna.

Næst spurðum við hvort hinar kraftmiklu langdrægu samskipti sem auðkennd eru með pc-HiC samsvari litningasvæðum sem verða aðgengilegri, eins og ákvarðað er með ATAC-seq. Þetta myndi staðfesta að aukið aðgengi hefur hagnýtar afleiðingar í því að koma af stað nýrri víxlverkun sem stuðlar að auknum efnum. Til að ná þessu bárum við saman skörun milli víxlverkandi aukaefna í hverri frumuþýði við DAR (séð) eða handahófskennt mengi aðgengilegra erfðafræðilegra staðla (væntanlegt). Greining okkar leiddi í ljós marktæka skörun á milli bæði áunninna DARs í virkjuðum-snemma taugafrumum og stöðugt áunninna DARs með víxlverkandi aukaefnum, í öllum frumuhópum (All Ps < 0.0001,="" extended="" data="" fig.="" 3e).="" aftur="" á="" móti,="" breytingar="" á="" aðgengi="" að="" krómatíni="" sem="" áttu="" sér="" stað="" á="" seinni="">minniþétting og endurvirkjun skarast ekki marktækt við víxlverkandi aukaefni (Extended Data Fig. 3e). Saman benda þessar niðurstöður til þess að ávinningur af aðgengi við minniskóðun sé frumunaratburður og þessir frumstilltu staðsetningar taka þátt í de-novo hagnýtum samskiptaverkefnum á síðari stigumminnimyndun. Þetta kraftmikla landslag er sýnt með því að sjá fyrir erfðafræðilegu svæðin í kringum heilkjörnungaþýðingar upphafsþátt 5 undireiningu A (Eif5a) genið (mynd 4d). Þessi tímabundna sameindakrufning á engram líftíma varpar ljósi á hvernig samræmd frumun á erfðafræðilegu ástandi frumu á meðanminnikóðun og samþjöppun auðveldar langdræg samskipti við endurvirkjun.