Hluti 1|Herba Cistanche þykkni eykur ATP myndun hvatbera í rottuhjörtum og H9c2 frumum

Tengiliður: emily.li@wecistanche.com

Hoi Yan Leung og Kam Ming Ko

Lífefnafræðideild, Hong Kong University of Science & Technology, Clear Water Bay, Hong Kong SAR, Kína

Lykilorð: ATP,Cistanche deserticola, H9c2 frumur, hjarta, hvatberar

Ágrip

Að kanna lyfjafræðilegan grundvöll "Yang- endurnærandi"verkun Herbal Cistanche [þurrkuðu heilu plönturnar afCistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae)], í kínverskri læknisfræði, voru áhrif metanólútdráttar Herba Cistanche á ATP-myndunargetu hvatbera skoðuð með því að nota ex vivo rottuhjartalíkan og in situ H9c2 frumupróf. Meðferð með Herba Cistanche þykkni jók ATP-myndunargetu hvatbera í hjartavöðva á skammtaháðan hátt hjá rottum, eins og metið var með in vitro mælingu. Örvun á ATP-myndunargetu var tengd samhliða aukningu á rafeindaflutningi hvatbera sem studd var af pýruvati en ekki súksínati. Herba Cistanche meðferð jók einnig starfsemi hvatbera hjartavöðva I og flókins III, þar sem umfang örvunar á flóknu I virkni var meira. Herba Cistanche meðferð olli skammta- og tímaháðri aukningu á ATP-myndunargetu hvatbera í H9c2 frumum. Niðurstöðurnar benda til þess að Herba Cistanche meðferð getiauka ATP myndun hvatberaí rottuhjörtum ex vivo og H9c2 frumum in situ, hugsanlega í gegnumeykur oxandi fosfórun.

Cistanche getur bætt hjartastarfsemi, lækkað blóðþrýsting og lækkað blóðfitu

Kynning

„Yang endurlífgun,“ sem felur í sér almenna aukningu á líkamsstarfsemi í kínverskum læknisfræði, felur í sér notkun orku til að knýja fram ýmis lífefnafræðileg ferli.

Í þessu sambandi er ATP, sem er alhliða gjaldmiðill orku til að ýta undir frumustarfsemi, aðallega framleitt með oxandi fosfórun í hvatberum. Við höfum haldið því fram að "Yang endurnærandi" jurtirhafa getu til að auka hvatbera ATP framleiðslugetu(Ko o.fl., 2004). Þetta er stutt af nýlegri niðurstöðu okkar um að „Yang-hrífandi“ en ekki „Yin-nærandi“ kínverskar hressandi jurtir gætu aukið ATP-myndunargetu hjartavöðva í músahjörtum ex vivo (Ko o.fl., 2006). Herba Cistanche, þurrkuð heil sníkjudýr planta (að undanskildum blómum) af Cistanche deserticola YC Ma (Orobanchaceae), er flokkuð sem'Yang-upplífgandi' hrífandi jurt í hefðbundinni kínverskri læknisfræði (Chen, 1998), og hún virðist vera vinsælasta innihaldsefnið í fjölda kínverskra einkaleyfasamsetninga sem notuð eru til að endurlífga Yang'. Í Kína og Japan er Herba Cistanche mikið notað til að meðhöndla fjölda Yang skortseinkenna. Lyfjafræðilegar rannsóknir bentu til þess að Herba Cistanche gætihreinsa sindurefna(Xiong o.fl., 1996),framleiða róandi lyf(Lu, 1998),gegn öldrun(Lee o.fl., 1990),verkjastillandi og bólgueyðandi áhrif(Lin o.fl., 2002), ogauka ónæmisvirkni(Wu o.fl., 2005). Helsta virka innihaldsefnið í Herba Cistanche erfenýletanóíð glýkósíð(Ouyang o.fl., 2003), sem hefur reynst hafabakteríudrepandi, streitudrepandi og andoxunarefnieiginleika (Xiong o.fl., 1998), sem og and-apoptotic áhrif á ræktaðar taugafrumur (Tian & Pu, 2005). Í núverandi rannsókn, til að kanna lyfjafræðilegan grundvöll Yang-uppörvandi verkunar Herba Cistanche, voru áhrif Herba Cistanche meðferðar á ATP-myndunargetu í hvatberum einangruðum úr rottuhjörtum ex vivo og ræktuðum H9c2 hjartavöðvafrumum á staðnum skoðuð. Til að kanna lífefnafræðilega aðferðina sem liggur að baki ATP-myndunar-auka verkun, voru áhrif Herba Cistanche meðferðar á rafeindaflutning hvatbera og flókna I-IV starfsemi einnig skoðuð í rottuhjörtum.

Áhrifarík innihaldsefni Cistanche geta hreinsað ýmsa virka súrefni sindurefna

Efni og aðferðir

Efni, frumurækt og jurtaefni

ATP, ADP og 3-[4,5-dímetýlþíósól-2-ýl]-2,5-dífenýltetrasólíumbrómíð (MTT) voru keypt frá Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, Bandaríkjunum). Luciferasa lausn (ATPlite) var fengin frá PerkinElmer (Boston, MA, Bandaríkjunum). Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) og fósturnautasermi (FBS) voru keypt frá GIBCO BRL Life Technologies (Grand Island, NY, Bandaríkjunum). H9c2 frumulína var keypt frá ATTC (Rockville, MD, Bandaríkjunum). Herba Cistanche var útvegað af staðbundnum jurtasala (Lee Hoong Kee). Jurtin var sannvottuð af birgirnum og sýnishorn af skírteini (HKUSTY00301) var afhent í lífefnafræðideild Hong Kong University of Science & Technology (HKUST).

Jurtaútdráttur

Herba Cistanche (100g) var skorið í litla bita og síðan dregið út með því að hita undir bakflæði í 300 ml metanóli við 65◦C í 2 klst. Aðferðin var endurtekin tvisvar. Samanlagði útdrátturinn var þurrkaður með því að gufa upp leysirinn við lækkaðan þrýsting og metanólútdrátturinn af Herba Cistanche fékkst með 39% afrakstur (w/w). Efnafræðileg greining benti til þess að metanólútdráttur Herba Cistanche innihélt heildarsafónín, heildarflavonoids, heildar lignans og fjölsykrur í styrkleikanum 1,62 prósent (w/w), 0,08 prósent, 0,15 prósent, og 75,6 prósent, í sömu röð.

Umönnun dýra

Fullorðnum Sprague-Dawley karlkyns rottum (8–10 vikur; 250–300 g) var haldið í 12- klst. myrkri/ljósri lotu í lofti/rakastýrðu herbergi við um 22◦C og leyft að borða og vatn eftir frjálsum vilja. í Dýragæslunni á HKUST. Tilraunareglur voru samþykktar af rannsóknarnefndinni á HKUST.

Lyfjameðferð

Dýrum var skipt af handahófi í hópa, með fimm til sex dýrum í hverjum. Í meðferðarhópunum var rottum gefið í maga með metanólútdrætti Herba Cistanche (uppleyst/sviflaus í vatni) í vaxandi dagskammtum ({{0}}.031–0,5 g/kg) í 3 daga. Viðmiðunardýr fengu eingöngu vatn. Tuttugu og fjórum tímum eftir síðustu skömmtun var hjartað fengið úr fenóbarbital svæfðum dýrum og gert lífefnafræðilega greiningu.

Undirbúningur hvatberabrota og mæling á ATP framleiðslugetu (ATP-GC) ex vivo

Vefsýni úr vinstri slegli hjartans voru klippt út og skoluð með ísköldum jafntónalausn (0,32 M súkrósa, 1 mM EDTA, 50 mM Tris/HCl, pH 7,4). Hjartahvatberabrot voru unnin með mismunandi skilvindu í jafnþrýstijafna við 4◦C. 10 prósent (w/v) hjartajafnvægi var útbúið með því að einsleita söxuð sleglavefinn með Teflon-gler einsleitara við 4000 snúninga á mínútu í 20–30 heila högg. Einsleitt efni var skilið í skilvindu við 600 x g í 10 mínútur til að fjarlægja kjarna og frumurusl. Fljótandi vökvinn var síðan skilinn í skilvindu við 8000 × g í 30 mínútur til að setja niður hvatberana (Evan, 1992). Kögglunum var blandað aftur í 1 ml af ísótónískum jafnalausn og endurblandað hvatberabrotin. Hvatbera ATP-GC ómeðhöndlaðra dýra var mældur með aðferð Leung o.fl. (2005)

Cistanche fjölsykrur geta seinkað lífeðlisfræðilegri hrörnun líffæra og hrörnun frumuforms

Mæling á rafeindaflutningi hvatbera

Mæling á rafeindaflutningi í einangruðum hvatberum, sem byggist á lækkun MTT, eins og framkvæmt [1]myndað eins og lýst er af Cohen o.fl. (1997). Hvatberar voru útbúnir í próteinstyrk 1 mg/ml með ræktunarbuffi (250 mM súkrósa, 50 mM HEPES, 10 mM KH2PO4, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 7,4) . Deilur (40 µL) af hvatberum var blandaður saman við 100 µL hvor af 15 mM pýruvati eða 0,5 mM súksínati og 0,42 mg/ml MTT. Hvarfblandan var ræktuð við 37◦C í 10 mínútur með varlega hristingu. Eftir ræktunina var hvarfblöndunni hætt með því að bæta við 100 µL lysisbuffi (10 prósent, w/v, natríumdódesýlsúlfat og 45 prósent dímetýlformamíð, stillt á pH 4,7 með ísediki). Eftir að hafa staðið í 5 mínútur voru gleypnimælingar á hvarfblöndunni teknar með örtítraplötulesara (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) og greint frá sem muninum á milli 570 nm og 630 nm. Gögnin voru gefin upp sem hundraðshluti af meðalgildi samanburðarhópsins (þ.e. Herba Cistanche-ómeðhöndluð).

Frumuræktun

H9c2 frumur, varanleg frumulína unnin úr hjartavöðvafrumur (Hescheler o.fl., 1991), voru ræktaðar sem einlög í DMEM bætt við 10 prósent (v/v) FBS. Miðillinn innihélt glúkósa (4,5 g/l) og glútamín (4,5 mM), ásamt NaHCO3 (17 mM), pensilíni (100 ae/ml) og streptómýsíni (100 µg/mL). Allar frumur voru ræktaðar undir andrúmslofti 5% (v/v) CO2 í lofti við 37◦C. Miðillinn var skipt út fyrir ferskan miðil á 2 eða 3 daga fresti. Stofn af frumum var ræktaður í 75 cm2 ræktunarflösku og skipt fyrir samruna í undirræktunarhlutfallinu 1:10. Fyrir ATP-GC greiningu var H9c2 frumum sáð með þéttleikanum 2,5 × 104 frumur/brunn í 24-brunnsplötu. Eftir frumufestingu var Herba Cistanche þykkni (leyst upp í fosfat-bufferuðu saltvatni; PBS) sett í miðilinn og frumurnar ræktaðar í lengri tíma (2-16 klst.). Viðmiðunarfrumur (ómeðhöndlaðar) fengu eingöngu PBS.

Mæling á ATP-GC á staðnum

Eftir tilgreinda ræktunartíma með HerbaCistanche útdrætti í vaxandi styrk (5{{10}}–300µg/mL), var ATP-GC prófið framkvæmt. Miðillinn var sogaður út og frumur voru meðhöndlaðar með digitóníni (50 µg/ml) í ræktunarbuffi (120 mM KCl, 5 mMKH2PO4, 2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 0,1 mM MgCl2, 0,5 prósent BSA, pH 7,4) í 373 mínútur ◦C. Eftir uppsog dígítónínsins var glútamati (5 mM), malati (5 mM) og ADP (60 µM) bætt við frumurnar til að mynda hvatbera ATP, sem var fylgst með með vaxandi tímabili á bilinu 0 til 15 mín. Hvarfinu var hætt með því að bæta við 60 µL af perklórsýru (30 prósent, w/v), og hvarfblöndurnar voru síðan skildar í skilvindu við 600 × g í 10 mínútur við 4◦C. Deiliskammti (120 µL) af flotinu var blandað saman við 90 µL af 1,4 M KHCO3 til hlutleysingar. Blöndurnar voru skilgreindar aftur við 600 × g við 4◦C, og flotið var mæld með tilliti til ATP innihalds eins og áður var lýst. ATP-GC ómeðhöndlaðra frumna var metið með því að reikna flatarmálið undir feril línuritsins (AUC1) með því að teikna ATP myndað (nmól/mg prótein) á móti tíma (0-15 mín) og gefið upp í handahófskenndum einingum. Fyrir HerbaCistanche-meðhöndlaðar frumur voru AUC1 gildi fyrir vaxandi ræktunartíma (3, 5, 7, 10 og 15 mín) staðlað í viðkomandi meðalviðmiðunargildi úr ómeðhöndluðum sýnum og gefið upp sem prósentu samanburðar. Síðan var flatarmálið undir kúrfunni (AUC2) á línuritinu sem teiknaði prósentuviðmiðunargildi á móti ræktunartíma (3-15 mín) reiknað og gefið upp í handahófskenndum einingum. Gögn um hópa sem fengu Herba Cistanche voru gefin upp sem hundraðshluti af samanburði úr jöfnunni:

[AUC2(HerbaCistanche - meðhöndlað)/AUC2(ómeðhöndlað)]×100 prósent

Mælingar á flóknum I–IV og sítratmyndunarvirkni

Virkni hvatbera rafeindaflutningakeðju (ETC) flókin I–III var mæld með litrófsmælingum með því að nota flókin sértæk hvarfefni (NADH fyrir flókið I, súksínat fyrir flókið II og desýlúbíkínól fyrir flókið III) eins og lýst er (Grad & Lemire, 2004; Hsu o.fl. , 2005; Mark o.fl., 2001). Complex IV virkni var mæld með cýtókróm c oxidasa prófunarbúnaði frá Sigma. Virkni hvatbera sítratsyntasa var mæld með aðferð Srere (1969).

Próteinprófun

Próteinstyrkur hvatberahluta og frumuþátta var ákvarðaður með því að nota BioRad próteingreiningu með því að nota albúmín í sermi úr nautgripum sem staðal ({{0}}.038–0,600mg/ml).

tölfræðigreining

Öll gögn voru gefin upp sem meðaltal ± staðalvillu þema (SEM). Þær voru greindar með einstefnugreiningu á dreifni (ANOVA). Post hoc margfaldur samanburður var gerður með LSD. P gildi<0.05 were="" regarded="" as="" statistically="">

Niðurstöður

Áhrif Herba Cistanche meðferðar á ATP-GC hjartavöðva hjá rottum

Eins og sýnt er á mynd 1, jók meðferð með Herba Cistanche þykkni í skömmtum allt að 0,5 g/kg ATP-GC í hvatbera hjartavöðva á skammtaháðan hátt hjá rottum, þar sem örvunarstigið var 89 prósent við skammt. af 0,5 g/kg.

Áhrif Herba Cistanche meðferðar á hvatbera rafeindaflutningi í rottuhjörtum

Umfang rafeindaflutnings í einangruðum hvatberum var mælt með því að fylgjast með lækkun MTT. Hvarfefnið sem notað var við prófunina var annað hvort pýruvat eða súksínat.

Mynd 1. Áhrif Herba Cistanche meðferðar á hvatbera ATP myndunargetu í rottuhjörtum ex vivo

Hver súla táknar þema ± SEM, með n {{0}}. Dýr voru meðhöndluð til inntöku með HerbaCistanche í tilgreindum dagskammtum í 3 daga. ATP framleiðslugeta var mæld eins og lýst er í "Efni og aðferðir." Gögnin voru gefin upp í prósentum samanburðar með tilliti til gilda (AUC2) fyrir viðkomandi ómeðhöndlaða samanburðarhóp. ∗Verulega frábrugðin viðkomandi ómeðhöndluðum samanburðarhópi; verulega frábrugðinn hópnum sem fékk Herba Cistanche með 0,5 g/kg.

Mynd 2. Áhrif Herba Cistanche meðferðar á rafeindaflutning hvatbera í rottuhjörtum

Hver súla táknar meðaltal ± SEM, með n {{0}}. (a) Pyruvate-studd (b) súksínat-studd hvatbera rafeindaflutningur var mældur með MTT minnkun, eins og lýst er í "Efni og aðferðir." Gögnin voru gefin upp í hlutfalli ómeðhöndlaðra viðmiðunargilda [pýrúvatstudd: OD570nm− OD630nm =0.0206 ± 0,0001 (SEM), n {{ 10}}; súksínat-studd: karlkyns, 0,255 ±0,015, n=5]. ∗Verulega frábrugðin viðkomandi ómeðhöndluðum samanburðarhópi; verulega frábrugðin 0,5 g/kg hópnum.

Eins og sést á mynd 2a, jók meðferð með Herba Cistanche skammtaháð umfang rafeindaflutnings hvatbera studd af pýruvati í rottuhjörtum, með bestu örvun sem sést við skammta upp á 0,5 g/kg. Hins vegar fundust engar marktækar breytingar á umfangi hvatbera rafeindaflutnings sem studd var af súksínati í rottuhjörtum sem fengu Herba Cistanche (mynd 2b).

Fyrir hluta 2,vinsamlegast smelltu hér.