Hluti 1: Cistanche Tubulosa Phenylethanoid Glycosides framkalla apoptosis lifrarfrumukrabbameinsfrumna og auka æxlishemjandi áhrif
Mar 25, 2022
Tengiliður: ali.ma@wecistanche.com
Pengfei Yuan, BSc1, Changshuang Fu, MSc1, Yi Yang, PhD1, Aipire Adila, PhD1, Fangfang Zhou, MSc1, Xianxian Wei, MSc1, Weilan Wang, PhD1, Jie Lv, PhD1, Yijie Li, PhD1, Lijie Xia, PhD1 og Jinyao Li, PhD1
Ágrip
Cistanche tubulosa er tegund kínverskra jurtalyfja og sinnir ýmsum líffræðilegum aðgerðum. Það hafa fyrri rannsóknir sýnt fram áCistanche tubulosa phenylethanoid glýkósíð(CTPG) sýna æxlishemjandi áhrif á ýmsar æxlisfrumur. Hins vegar eru æxlishemjandi áhrif CTPG á HepG2 og BEL-7404 lifrarfrumukrabbameinsfrumur (HCC) enn ómöguleg. Rannsókn okkar sýndi að CTPG hamlaði marktækt vöxt HepG2 og BEL-7404 frumna með því að framkalla frumuhringsstopp og frumudauða, sem tengdist virkjun MAPK ferla sem einkenndust af uppstýrðri fosfórýleringu á p38, JNK, og ERK1/2 og hvatberaháð leið sem einkennist af minnkun hvatberahimnugetu. Losun cýtókróm c og klofning kaspasa-3, -7, -9 og PARP var síðan aukin með CTPG meðferð. Þar að auki bældi CTPG verulega flutning HepG2 með því að draga úr magni matrix metalloproteinasa-2 og æðaþelsvaxtarþáttum. Athyglisvert er að CTPG jók ekki aðeins útbreiðslu miltisfrumna heldur minnkaði einnig frumufrumu miltisfrumna framkallað af cisplatíni. Í H22 æxlismúsamódelinu hamlaði CTPG ásamt cisplatíni enn frekar vöxt H22 frumna og minnkaði aukaverkanir cisplatíns. Samanlagt hamlaði CTPG vöxt HCC með beinum æxlishemjandi áhrifum og óbeinum ónæmisbætandi áhrifum og bætti æxlishemjandi verkun cisplatíns.
LeitarorðCistanche tubulosa phenylethanoid glycosides, apoptosis, MAPK ferill, hvatberaháður ferill, cisplatín, ónæmisaukning
Cistanche hefur æxliseyðandi áhrif.
Smelltu til að Cistanche vörur og Cistanches
Kynning
Spáð var að lifrarkrabbamein væri sjötta algengasta krabbameinið og fjórða algengasta orsök krabbameinsdauða á heimsvísu árið 2018, með um 841 000 ný tilfelli og 782.000 dauðsföll árlega í Suðaustur-Asíu (Mongólíu, Kambódíu og Víetnam) .1 Í Kína var lifrarkrabbamein þriðja helsta orsök dauðsfalla af völdum krabbameins árið 2015.2 Meira en 90 prósent frumkrabbameina í lifur eru lifrarfrumukrabbamein (HCC) um allan heim. Eins og er, eru lifrarnám, lifrarígræðsla og húðhreinsun helstu aðferðirnar til að meðhöndla HCC. Því miður eru þessar meðferðir árangursríkar fyrir 30 prósent sjúklinga sem greinast með snemma lifrarkrabbamein, á meðan sjúklingar sem greinast með langt gengið lifrarkrabbamein (sem eru 40 prósent) þurfa að reiða sig á líknandi meðferð til að lengja lifunartímann.3,4 Sorafenib ásamt lifrarstarfsemi krabbameinssýki í slagæðum er mikilvæg og algeng líknandi meðferð fyrir flesta sjúklinga með langt genginn HCC á Asíu-Kyrrahafssvæðinu.5 Sorafenib, samþykkt af FDA árið 2006 til meðferðar á langt gengnu lifrarkrabbameini, er fjölkínasa hemill sem hamlar fjölgun æxlisfrumna og æða framleiðslu og stuðlar að æxlisfrumufrumumyndun. Sorafenib lengir lifunartíma sjúklingsins verulega um 3 til 5 mánuði en hefur alvarlegar aukaverkanir og er nátengt tilviki lyfjaónæmis.6 Því er brýnt að þróa ný lyf eða aðferðir við HCC.
Hefðbundin kínversk læknisfræði (TCM) eitt sér eða í samsettri meðferð með öðrum aðferðum hefur verið notuð til að meðhöndla HCC og hefur sýnt klínískan ávinning þar á meðal lengri lifunartíma, bætt lífsgæði, minni aukaverkanir og svo framvegis.7,8Cistancheer TCM sem inniheldur fenýletanóíð glýkósíð (PhGs), iridoids, lignín og fjölsykrur sem hefur ýmsa líffræðilega virkni, svo sem andoxun, bólgueyðandi, öldrun, minnisauka og ónæmisbætandi virkni.9 PhGs hafa verið talin helstu virku efnisþættirnir í Cistanche og hafa margvíslega virkni, þar á meðal andoxun, bólgueyðandi, frumudauðavernd, lifrarvernd og taugavernd.10-12 Hópurinn okkar hafði greint frá því aðCistanchetubulosa phenylethanoid glýkósíð(CTPG) gæti hindrað vöxt sortuæxla B16-F10 frumna, vélindakrabbameins Eca-109 frumna og HCC H22 frumna með ytri eða innri boðleiðum in vitro eða in vivo; auk þess hafði CTPG ónæmisörvandi áhrif.13-15
Í þessari rannsókn könnuðum við æxlishemjandi áhrif og verkun CTPG á HepG2 og BEL-7404 frumum in vitro, greindum ónæmisbælandi virkni CTPG in vitro og in vivo og metum frekar meðferðaráhrif CTPG ásamt krabbameinslyfjameðferðinni. lyfið cisplatín á HCC H22 æxlamýs in vivo. Við komumst að því að CTPG gæti hindrað vöxt HepG2 og BEL-7404 frumna í gegnum hvatberaháða frumudauða og MAPK boðleiðina. CTPG hamlaði verulega flutning HepG2 frumna með því að draga úr magni matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) og æðaþelsvaxtarþáttar (VEGF). Að auki stuðlaði CTPG að útbreiðslu og virkjun ónæmisfrumna og jók ónæmi músa. Mikilvægt er að CTPG ásamt cisplatíni getur hindrað vöxt H22 frumna enn frekar in vivo og dregið úr aukaverkunum cisplatíns.
Cistanche eykur ónæmi.
Efni og aðferðir
Dýr
Um það bil 6 til 8 vikna gamlar karlkyns BALB/c, Kunming mýs og kvenkyns C57BL/6 mýs voru keyptar frá Animal Laboratory Center, Xinjiang Medical University (Urumqi, Xinjiang, Kína) og hýst í dýraaðstöðu Xinjiang háskólans með stofuhita. (RT) 25±3 gráður og 12/12 klst ljós-myrkur tímabil.
Frumulínur og frumurækt
Murine H22 frumurnar voru keyptar frá Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Kína) og HCC HepG2 og BEL-7404 frumur úr mönnum voru fengnar frá Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, Xinjiang háskóli (Urumqi, Xinjiang, Kína) og ræktað í RPMI 1640 miðli (Gibco, Bandaríkjunum) eða Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Gibco) sem inniheldur 10 prósent hitaóvirkjað nautgripasermi (MRC, Kína), 1 prósent L- glútamín (100mM), 100U/mL penicillín og 100ug/mL streptomycin við 37 gráður í rakaðri andrúmslofti með 5% CO2.
High-performance vökvaskiljun (HPLC)
Helstu efnasambönd CTPG (Upbio Tech Co., Ltd., Shanghai, Kína) voru hæfir og magngreind með HPLC eins og áður hefur verið greint frá.13 Notuð var ZORBAX SB-C18 súla (250×4,6 mm; 5μm) og hreyfanlegur fasinn samanstóð af 0,2 prósent maurasýrulausn og metanóli með halla frá 23 prósent til 31 prósent. Alls var 10μL sýni sprautað og greindist við 330 nm. Echinacoside og acteoside staðlar (Yuanye, Shanghai, Kína) voru notaðir til að greina íhluti CTPG.
echinacoside
Greining á lífvænleika frumna
Æxlishemjandi áhrif CTPG á HepG2 og BEL-7404 frumur voru metin með því að nota MTT (3-(4, 5-dímetýl-2-þíasólýl)-2, {{7 }}dífenýl-2-H-tetrasólíumbrómíð). HepG2 og BEL-7404 frumur voru plötuðar í 96-brunnsplötur (5 × 104 frumur/brunn) og meðhöndlaðar með 0, 200, 400 og 600 ug/mL CTPG í 24 og 48 klukkustundir, í sömu röð, eftir 24 klukkustunda ræktun við 37 gráður. Um það bil 35 ug/mL cisplatín (Yuanye) var notað sem jákvæður samanburður. Síðan var 100 μL MTT (0,5 mg/ml, þynnt með miðli án FBS miðils) bætt við hverja brunn og ræktað í 3 klukkustundir við 37 gráður og 5 prósent CO2. Eftir ræktun voru plöturnar settar í skilvindu við 1200 rpm í 7 mínútur, miðillinn fjarlægður og 200 ug/mL DMSO var bætt við hvern brunn til að leysa upp mynduðu formazan kristalla. OD490 gildin voru mæld með 96-brunnum örplötulesara (Bio-Rad Laboratories, CA, Bandaríkjunum). Til að meta áhrif CTPG á miltisfrumur voru frumurnar einangraðar úr C57BL/6 músum og þær settar í 96-brunnsplötur með þéttleikanum 1 × 105 frumur/brunn. Miltfrumur voru meðhöndlaðar með 0, 200, 400 og 600 ug/mL í 24, 48 og 72 klst. Lífvænleiki frumunnar var reiknaður út með eftirfarandi formúlu: Lífvænleiki frumna (prósent)=(ODmeðhöndluð/Ómeðhöndluð) × 100 prósent.
Greining á Ki-67
Greining á Ki{{0}} var gerð samkvæmt fyrri rannsókn okkar.16 Í stuttu máli voru BEL-7404 frumur meðhöndlaðar með mismunandi styrk (0, 200, 400 og 600 ug/mL) af CTPG eða cisplatín (35 ug/ml). Eftir 24 klukkustundir voru frumur teknar og þvegnar með PBS, síðan festar og gegndræpi með Foxp3 litunarbuffarsetti (eBioscience, USA) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Innanfrumu litun var gerð með því að nota FITC samtengd Ki-67 mótefni (BD Biosciences, San Jose, CA, Bandaríkjunum) í 15 mínútur við RT. Sýnin voru greind með frumuflæðismælingu (BD FACSCalibur, CA, Bandaríkjunum).
Greining á frumuapoptosis og frumuhringrás
HepG2 og BEL-7404 frumur voru sáð í þéttleikanum 2,5×105 frumur/skál og ræktaðar við 37 gráður yfir nótt. Frumur voru trypsíngerðar og teknar með skilvindu eftir meðferð með ýmsum styrkjum af CTPG eða formeðhöndlaðar með kaspasahemli (Z-VAD-FMK) eða kaspasa-3 hemli (Ac-DEVD-CHO) (Beyotime, Kína) í 2 klst. CTPG meðferð. Eftir 24 klukkustundir greindist frumudauði með frumuflæðismælingu. Í stuttu máli voru safnaðar frumur þvegnar með köldu PBS (Gibco) og endursviflausnar í annexínbindandi jafnalausn með 2,5μL Annexin V-FITC og 5μL PI-PE litunarlausn (Solarbio, Peking, Kína), og síðan voru frumur ræktaðar við RT í myrkri í 15 mínútur. Til greiningar á frumuhringsdreifingunni voru frumur safnað eftir CTPG meðferð og festar í köldu 70 prósent etanóli við 4 gráður í 30 mínútur. Frumur voru litaðar með PI (BD Biosciences) í myrkri í 30 mínútur. Sýni voru greind með frumuflæðismæli (BD FACSCalibur). Tjáningarmagn frumudauða og hringrásatengdra próteina greindist með Western blot.
Western Blot
Western blot var gert samkvæmt fyrri rannsókn okkar.17HCC voru meðhöndluð með CTPG í 24 klst. Eftir þvott með ísköldu PBS tvisvar, var öllum viðloðandi og fljótandi frumum safnað saman og þær ljósaðar í RIPA Lysis Buffer (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) í 20mínútur á ís. Eftir skilvindu við 12000rpm 4 gráður í 10 mínútur, var próteinstyrkur ákvarðaður með Bicinchoninic Acid Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, USA) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Sami styrkur próteina var aðskilinn með 12 prósent SDS-PAGE og fluttur yfir á PVDF himnur. Eftir þvott með PBST jafnalausn (PBS með 0,05 prósent Tween-20), voru himnurnar stíflaðar með 5 prósent fitulausri mjólk við 37 gráður í 1 klukkustund og síðan ræktaðar með aðal mótefnum (Cell Signaling Technology, MA, USA) við rétta þynningu yfir nótt við 4 gráður. Eftir þvott 3 sinnum með PBST var himnan ræktuð með samsvarandi HRP-tengdum aukamótefnum (eBioscience) í 2 klukkustundir við 37 gráður. Markpróteinin voru greind með því að nota ECL prófunarbúnað (Beyotime). Grátónaskönnunargögn voru fengin með Image J.
Greining á möguleikum hvatberahimnu (Δψm)
Δψm var ákvarðað með himnugegndræpi JC-1 litarefni (Beyotime). Í stuttu máli voru HepG2 og BEL-7404 frumur meðhöndlaðar með mismunandi styrk af CTPG (0, 200, 400 og 600 ug/mL) í 24 klukkustundir. Öllum frumum var safnað og þvegin með JC-1 þvottabuffi. Frumur voru litaðar með JC-1 flúrljómunarnemanum samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda í 20 mínútur við RT. Eftir þvott með PBS tvisvar voru öll sýni greind með frumuflæðismælingu (BD FACSCalibur).
Hoechst 33342 litun
Hoechst 33342 litun var gerð samkvæmt fyrri rannsókn okkar.16 Formfræðilegar breytingar á kjarna voru skoðaðar með því að nota himnugegndræp DNA-bindandi litarefni Hoechst 33342 (Beyotime). Í stuttu máli voru frumurnar sáðar í 6-brunnsplötu í styrknum 1×105 frumur/brunn í 2mL miðli. Þegar 70 prósent til 80 prósent samruni var náð voru frumurnar meðhöndlaðar með 200, 400 og 600 ug/mL af CTPG eða cisplatíni í 24 klukkustundir. Frumurnar voru þvegnar með PBS og festar með 4 prósent ísköldu paraformaldehýði við 4 gráður í 10 mínútur. Eftir þvott með PBS voru frumur litaðar með Hoechst 33342 við 4 gráður í 10 mínútur. Sýni voru skoðuð með flúrljómunarsmásjá (Nikon Eclipse Ti-E, Japan).
cistanche þykkni
Flutningagreining
HCC frumuflutningur greindist í gegnum sárgræðsluprófið. Í stuttu máli var HepG2 frumum (2×104/brunn) sáð í 24-brunnsplötu. Eftir að hafa náð 80 prósenta samruna var miðju hverrar holu rispaður einu sinni með 20μL pípettuodda. Eftir þvott með PBS voru frumur meðhöndlaðar með cisplatíni (35 ug/ml) eða mismunandi styrkleika (0, 200, 400 og 600 ug/mL) af CTPG við 37 gráður. Eftir 24 klukkustundir voru myndir af hverju sýni teknar undir smásjá (Nikon Eclipse Ti-E). Meðalfjarlægðir frumuflutnings voru greindar með mynd J. Prósenta sáragræðslu var reiknað út með jöfnunni: sárgræðsla ( prósent )=(1−klórasvæði á tilgreindum tímapunkti/klórasvæði við 0klst.)×100 prósent. Tjáningarstig frumuflutningstengdra próteina MMP-2 og VEGF greindust með Western blot.
Útbreiðsla og apoptosis miltafruma
Til útbreiðslugreiningar voru miltisfrumur einangraðar úr 3 C57BL/6 músum og litaðar með CFSE (eBioscience). CFSE merktar frumur voru sáðar inn í 24-brunnsplötur með þéttleikanum 2 × 106 frumur í 1 ml miðli í hverri brunn og meðhöndlaðar með mismunandi styrk af CTPG (200, 400 og 600 ug/mL) eða blandaðar með 35 ug. /ml cisplatín í 72 klst. Flæðifrumugreining var gerð eftir litun með CD3-APC og CD19-PE (BD Biosciences). Til frumufrumugreiningar voru miltisfrumur sáð í 24-brunnsplötur með þéttleikanum 2 × 106 frumur í 1 ml miðli í hverri brunn og meðhöndluð með mismunandi styrk af CTPG (200, 400 og 600 ug/mL) eða sameinuð með cisplatín í 24 klst. Flæðifrumugreining var gerð eftir litun með 2,5 μL Annexin V-FITC og 5 μL PI-PE lausn.
Öryggismat og ónæmisörvandi virkni CTPG In Vivo
Til að meta in vivo ónæmisörvandi virkni CTPG var 6 til 8 vikna karlkyns Kunming músum skipt af handahófi í 7 hópa (5 mýs/hóp). Inndæling undir húð (sc, 200, 400 mg/kg), inndæling í kviðarhol (ip, 200, 400 mg/kg) og gjöf í maga (ig, 200, 400 mg/kg) voru beitt á 2 daga fresti í samtals 7 sinnum , en samanburðarhópurinn fékk enga meðferð. Mýsnar hafa vigtað annan hvern dag og fylgst var með stöðu músanna á hverjum degi. Eftir CTPG meðferð voru líffæri músanna aðskilin og vigtuð. Líffæravísitölurnar voru reiknaðar út samkvæmt formúlunni: líffærastuðull=líffæraþyngd (mg)/líkamsþyngd (g). Miltfrumunum var safnað, talið og litað með and-CD3-APC, and-CD19-PE, and-CD49b FITC eða and-CD4-APC, and-CD{{ 22}}PE, andstæðingur-CD8-FITC (BD Biosciences). Sýni voru greind með frumuflæðismælingu (BD FACSCalibur).
Æxlishemjandi virkni CTPG ásamt cisplatíni í H22 æxlisberandi músum. Um 6 til 8 vikna gamlar karlkyns BALB/c mýs voru sprautaðar undir húð með H22 frumum (1,0 × 106 á mús í 100 μL PBS). Þegar æxlismagnið náði um það bil 60 mm3, var æxlisberandi músum skipt af handahófi í 4 hópa (6 mýs/hóp) og meðhöndlaðar með cisplatíni (4mg/kg), CTPG (400mg/kg), cisplatíni (4mg/kg) auk CTPG ( 400mg/kg), eða án meðferðar (viðmiðunarhópur), í sömu röð. Æxlumýs voru sprautaðar í kviðarhol með CTPG á 5., 7., 9., 11. og 13. degi, í sömu röð. Cisplatín var sprautað í bláæð á 7. og 11. degi. Æxlisrúmmál og líkamsþyngd voru mæld annan hvern dag. Rúmmál æxlis var reiknað sem eftirfarandi: Æxlisrúmmál (V)=a × b2/2, þar sem a og b tákna lengsta og stysta þvermál æxlis mælt með þykkni þykkni, í sömu röð. Á 20. degi voru líffæri og æxli einangruð og vegin. Miltafrumunum var safnað, talið og litað með and-CD3-APC og and-CD19-PE eða and-CD4-FITC og and-CD8-APC eða and-CD11b-PE og and-Gr-1-APC eða and-CD4-FITC, and-CD25-APC og and-Foxp3-PE (BD Biosciences) . Í kjölfarið voru tíðni og númer frumna greind með frumuflæðismælingu (BD FACSCalibur).
Cistanche eykur æxliseyðandi áhrif og bætir ónæmi.
Fyrir frekari upplýsingar, vinsamlegast smelltu á myndina.
Tölfræðigreining
Öll gögn voru gefin upp sem meðaltal±staðalvilla meðaltals (SEM). Tölfræðileg greining var gerð með ein-/tvíhliða dreifigreiningu (ANOVA) með Prism5.0 hugbúnaði. P<.05 was="" considered="" statistically="">
