HLUTI 1: Cistanche útdrættir bætir taugaeiturhrif af völdum vetnisperoxíðs í nýjum stökkbreyttum DJ-1-transfected Neuroblasoma frumulíkönum

Tengiliður:joanna.jia@wecistanche.com

1. INNGANGUR

Helstu taugahrörnunarsjúkdómar eru maAlzheimersjúkdómur, Parkinsonsveiki (PD), Huntingtonsveiki og fleiri. Meðal þessara sjúkdóma er tíðni PD(Parkinsons veiki) er í öðru sæti í heiminum og nær 1 prósent –2 prósentum hjá fólki eldri en 60 ára (Burke & O'Malley, 2013; Mullard, 2017; Shen & Ji, 2013). Sem aðal taugafræðileg einkenni PD eru dópamínvirku taugafrumurnar í substantia nigra pars compacta framsæknar hrörnunarhættir (Glizer & MacDonald, 2016), sem fylgir útliti ‐synuclein innifalinna sem kallast Lewy bodies (Zhang, An, Zhang og Pu) , 2010). Í meingerð PS eru hvíldarskjálftar, stífni, hægsláttur og líkamsstöðufrávik að greina sem helstu einkenni PS á heilsugæslustöðinni. Þrátt fyrir að nákvæm framsækin hrörnunarferill dópamínvirkra taugafrumna sé ekki skiljanlegur, eru annaðhvort umhverfislegar orsakir, þar á meðal útsetning fyrir skordýraeitri, taugaeiturefnum og þungmálmum, eða erfðafræðilegar orsakir eins og stökkbreytingar á Parkin (Kitada o.fl., 1998), -synuclein (Polymeropoulos et al. al., 1997), og DJ‐1 (Biosa o.fl., 2017; Bonifati o.fl., 2003), er talið leiða til þess að PD komi fram. Hingað til er fjöldi missense stökkbreytinga, rammabreytinga og stórra brotabrota af völdum DJ-1 gena stökkbreytinga yfir 10 (Andres-Mateos o.fl., 2007; Bonifati o.fl., 2003; Hague o.fl., 2003). Innan DJ-1 prótein er skipting Leucine166Proline (L166P) upp úr eins mikilvæg. Að auki hefur einnig verið sýnt fram á að oxunarálag á sér stað í PD (Dexter o.fl., 1989, 1994; Nikam, Nikam, Ahaley og Sontakke, 2009) og tekur þátt í meingerð þess (Hague o.fl., 2003).

DJ-1 gen sem inniheldur átta exon sem dreift er yfir 24 kb, staðsetur á litningi 1p36 í mönnum (Bonifati o.fl., 2003) og kóðar mjög varðveitt prótein sem inniheldur 189 amínósýrur. Próteinið tilheyrði ThiJ/PfpI fjölskyldunni, er til í homodimerformi. Glial frumur í heilaberki og substantia nigra og striatum eru þær helstu sem finnast á svæðum DJ-1 próteins (Olzmann o.fl., 2007). Í þessum frumum gegnir DJ-1 eftirfarandi hlutverkum, svo sem krabbameinsgeni (Nagakubo o.fl., 1997), umritunarstjórnun (Kim o.fl., 2005; Niki, Takahashi- Niki, Taira, Iguchi-Ariga og Agria, 2003 ), andoxunarálag (Taira o.fl., 2004; Zhou & Freed, 2005), aðstoðarmaður (Shendelman, Jonason, Marlinat, Leete og Abeliovich, 2004; Zhou, Zhu, Wioson, Petsko og Fink, 2006) og próteasa (Abou-Sleiman, Healy, Quinn, Lees og Wood, 2003).

Meðferð við taugahrörnunarsjúkdómum: cistanche þykkni

Cistancheer hefðbundin kínversk læknisfræði og hefur aðallega verið notuð til að meðhöndla andrology sjúkdóma í gegnum tíðina. Helstu virku innihaldsefnin íCistancheeru fenýlglýkósíð þar á meðal 34 efnasambönd, eins og akteósíð, echinakósíð, osfrv. Lyfjafræðileg áhrifCistanche útdrættirfela í sér bætta kynstarfsemi, öldrun gegn öldrun, aukinni náms- og minnisgetu, taugavörn, ónæmisstýringu, þreytu, blóðþurrðarvörn og lifrarvernd (Tu o.fl., 2011). Koffínsýra er eitt af helstu umbrotsefnum Cistanche (Yan, 2018).

Algengustu frumulíkönin af PD innihalda 1-metýl-4- fenýl pýridíníum jón-framkallaða PC12 frumur (Abou-Sleiman o.fl., 2003) og vetnisperoxíð (H2O2)-framkallaða taugafrumur (SH-SY5Y) frumur (Zhang o.fl. ., 2009). Hins vegar eru dæmigerð meinafræðileg einkenni PD ekki til staðar í þessum líkönum. Til að þróa lífeðlisfræðilega viðeigandi frumulíkan af PD, í þessari rannsókn komum við á H2O2 framkallaðar L166P og C106S DJ-1-transfected SH-SY5Y frumur, og rannsökuðum áhrifCistanche útdrættirog lykil lífvirk efnasambönd, þar á meðal akteósíð, echinacoside, koffínsýra ogCistanche heildarglýkósíðá þessum tveimur gerðum, í fyrsta sinn.

Cistanche þykkni gegn taugahrörnunarsjúkdómum

2. EFNI OG AÐFERÐIR

2.1|Plasmíð, lyf, efni og frumur

FLAG-L166P DJ-1, FLAG-C106S DJ-1 plasmíð og and-DJ-1 fjölklóna mótefni voru vinsamlega útveguð af Dr. Hiroyoshi Ariga, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido háskólanum. Afvötnuð lágmarks nauðsynleg miðill (MEM) og F-12 miðill var keyptur frá Gibco. Lipofectin var frá Invitrogen. FastDigest Xho I og FastDigest EcoR I voru frá Fermentas. Endotoxínlausa plasmíð undirbúningssettið var frá líftækni. SH-SY5Y frumulínan var frá frumubanka kínversku læknaakademíunnar. BCA próteinprófunarhvarfefnissett var frá Pierce. PVDF himnur voru frá Millipore. Anti-FLAG fjölstofna mótefni var frá GeneTex.Cistanche útdrættir, þar á meðal akteósíð, echinakósíð, koffínsýra og Cistanche heildarglýkósíð, voru útveguð af náttúrulækningadeild, lyfjafræðideild Peking háskólans.

2.2|Plasmíð mögnun, útdráttur og hreinsun

Eftir að hafa ræktað Escherichia coli JM109 frumur í LB fljótandi miðli þar til OD 600=0.5, voru hæfar frumur útbúnar með kalsíumklóríðaðferðinni. Hæfni E. coli var síðan umbreytt með plasmíði DNA með því að nota hitasjokkaðferðina, eftir það voru ummyndirnar ræktaðar á LB plötum sem innihéldu ampicillín í 16–24 klst við 37 gráður. Einstofna nýlenda sem umbreytt var með góðum árangri var síðan valin og ræktuð í LB fljótandi miðli sem innihélt 50 ug/mL ampicillín í 12 klst til viðbótar við 37 gráður. Plasmíðin voru dregin út og hreinsuð með endotoxínfríu plasmíð undirbúningssetti samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.

2.3|Plasmíð auðkenning

Útdregin plasmíð voru gefin í ensímmeltingu, eftir það voru plasmíðin og niðurbrotsbrotin skoðuð með 1 prósenta agarósa gel rafdrætti. Gelið sem fékkst var litað í EB lausn í 20–25 mínútur við stofuhita og myndað.

2.4|Plasmíðflutningur í SH-SY5Y frumur

Hreinsað plasmíð DNA var umbreytt í SH-SY5Y frumur sem ræktaðar voru í MEM/F-12 miðli sem innihélt 10 prósent nautgripafóstursermi. Smitaðar frumur voru síðan valdar í miðli sem innihélt 400 ug/mL G418, eftir það voru 200 ug/mL G418 notaðar til að viðhalda stöðugri transsýktu frumulínu.

2,5|Greining á transsýktum frumum með Western blot

Smitaðar SH-SY5Y frumur voru ljósaðar í RIPA jafnalausn. Eftir skilvindu lýsissins var heildarpróteinstyrkur í flotinu ákvarðaður með því að nota BCA próteinprófunarhvarfbúnaðarsett. Jafnt magn af próteinþykkni var síðan sett í 12,5 prósent SDS-pólýakrýlamíð gel rafdrætti og flutt yfir á PVDF himnu. PVDF himnan var læst með 5 prósent fitulausri þurrmjólk í TBST lausn og unnin til ónæmisgreiningar. And-FLAG og and-DJ-1 voru notuð sem aðal mótefni og HRP-tengd IgG var auka mótefnið. Aukið efnaljómunargreiningarkerfi var notað til að greina markpróteinin.

2.6|Ónæmisfrumuefnafræðileg auðkenning á transsýktum frumum

Smitaðar SH-SY5Y frumur voru festar með 4 prósenta paraformaldehýðlausn, gegndræpnar með 0.3 prósent Triton X‐100 lausn og stíflaðar með 10 prósenta geitasermi. Stífluðu frumurnar voru síðan ræktaðar fyrst með and-FLAG og anti-DJ-1 fjölstofna mótefni, og síðan með FITC-conjugated geita andkanínu auka mótefni. Frumukjarnar voru litaðir með Hoechst 33342 og frumurnar voru sýndar undir öfugum flúrljómunarsmásjá (IX-71, Olympus).

2.7| Frumulífvænleikapróf

Ósmitaðar og umsmitaðar SH-SY5Y frumur voru plötuðar í 96- útdrætti, þar á meðal acteoside, echinacoside, koffeinsýru og Cistanche heildarglýkósíð (öll 10, 20 og 40 ug/mL, í sömu röð), var bætt við og frumur voru ræktaðar í 6 klst fyrir meðferð með 0,2 mM H2O2 í 1 klst til viðbótar. Miðlinum var hent og frumulífvænni var mæld með því að nota MTT eins og lýst er hér að ofan.

2.8|Áhrif Cistanche útdráttar á lífvænleika frumna

útdrætti, þar með talið akteósíð, echinacoside, koffínsýra og Cistanche heildarglýkósíð (allt 10, 20 og 40 ug/mL, í sömu röð), var bætt við og frumurnar ræktaðar í 6 klst fyrir meðferð með 0,2 mM H2O2 í 1 klst til viðbótar. Miðlinum var hent og frumulífvænni var mæld með því að nota MTT eins og lýst er hér að ofan.

2.9|tölfræðigreining

Gögn eru gefin upp sem meðaltal ± SD af þremur óháðum tilraunum. Munur á milli hópa var greindur með einhliða ANOVA og LSD aðferð með SPSS 22.0 hugbúnaði. Gildin p < 0.05="" voru="" talin="">

Cistanchejurt

3|NIÐURSTÖÐUR

3.1|Plasmíðum var umbreytt og hreinsað með góðum árangri. Eftir aðskilda tjáningu í E. coli JM109 voru plasmíð dregin út og skoðuð með því að nota 1 prósent agarósa gel rafdrætti eftir meltingu með skerðingarensími (Mynd 1). 6,2-kb plasmíðin voru klofnuð í 5,4- og 0,8-kb línuleg DNA-brot, sem staðfesti að L166P og C106S DJ-1 plasmíðin voru bæði tjáð og hreinsuð með góðum árangri.

3.2|Greining á transsýktum frumum með Western blotting. Eins og sýnt er á mynd 2, fundum við FLAG-L166P DJ-1 og FLAG-C106S DJ-1 hljómsveitir við um 70 kDa. Hátt magn FLAG-merkts próteins í transsýktum SH-SY5Y frumum bendir til þess að L166P og C106S DJ-1 stökkbrigðin hafi verið sterklega tjáð í viðkomandi transfectantum.

3.3|Ónæmisfrumuefnafræðileg auðkenning á transsýktum frumum. Það sýnir sterk flúrljómandi merki frá transsýktum SH-SY5Y frumum eftir ræktun með and-DJ-1 eða and-FLAG mótefnum. Þetta staðfestir hið háa magn af L166P og C106S DJ-1 sem er tjáð í smitefnum.

3.4|Umsmitaðar frumur voru næmari fyrir H2O2 en ósmitaðar frumur. Eftir ræktun í 1 klst. í viðurvist flokkaðs styrks H2O2 (0.1, 0.2, 0.3, 0.4, {{15} }.5, og 1 mM, í sömu röð) minnkaði lífhæfi SH-SY5Y frumna sem voru transsmitaðar með L166P eða C106S DJ-1 skammtaháð samanborið við ósmitaðar frumur

3,5|Cistanche útdrættir hindruðu H2O2-framkallaða lækkun.Cistanche útdrættir, þar á meðal akteósíð, echinakósíð, koffínsýra og Cistanche heildarglýkósíð (allt 10, 20 og 40 ug/mL, í sömu röð).

Cistanche