Fásykrur bæta bráðan nýrnaskaða með því að draga úr flokki aðgreiningar 44-miðlað ónæmissvörun í nýrnapíplufrumum

Ágrip:Bráður nýrnaskaði (AKI)er skyndilegur þáttur afnýrnaskemmdirsem er algengt hjá sjúklingum sem leggjast inn á sjúkrahús. Hingað til hefur engin hugsjón meðferð verið þróuð til að draga úrAKI alvarleiki. Oligo-fucoidan(FC) truflar nýrnapípulaga frumuyfirborðs próteinþyrping aðgreiningar 44 (CD44) til að koma í veg fyrir millivefs bandvefsmyndun í nýrum; Hins vegar eru áhrif fásykra á AKI enn óþekkt. Í þessari rannsókn voru FC, galacto-oligosaccharide (GOS) og fructo-oligosaccharide (FOS) valin til að rannsaka áhrif fásykra á AKI. Sýnt hefur verið fram á að allar þrjár fásykrurnar frásogast að hluta til í þörmum. Við komumst að því að fásykrurnar minnkuðu skammtaháð mótefnavaka CD44 og bæla niður súrefnisskortsframkallaða tjáningu CD44, fosfó-JNK, MCP-1, IL-1 og TNF- í NRK-52E nýrnapíplufrumur. Á sama tíma drógu CD44 siRNA transfection og JNK hemill SP600125 úr súrefnisskorti af völdum tjáningu fosfó-JNK og cýtókína. Bindill CD44, hýalúrónan, vann gegn áhrifum fásykra á CD44 og fosfó-JNK. Tveimur dögum eftir aðgerð vegna blóðþurrðar-endurflæðisskaða drógu fásykrur úr nýrnabólgu, kreatíni í sermi, MCP-1, IL-1 og TNF- í AKI músum. 7 dögum eftir aðgerð var stuðlað að bata nýrna. Þessar niðurstöður benda til þess að FC, GOS og FOS hamli súrefnisskorti af völdum CD44/JNK fossa og cýtókína í nýrnapíplufrumum og bætir þar með AKI og nýrnabólgu í AKI músum. Þess vegna,viðbót við fásykruer hugsanleg heilbrigðisstefna fyrir sjúklinga með AKI.

Leitarorð: bráðum nýrnaskaða; þyrping aðgreiningar 44; frúktó-fjörsykra; galaktóligósakkaríð; oligo-fucoidan; bólga

1. Inngangur

Bráður nýrnaskaði(AKI) einkennist af skyndilegri lækkun á gaukulsíunarhraða og þar af leiðandi aukningu á kreatíníni í sermi. Þessi skaði er algengur hjá sjúklingum sem leggjast inn á sjúkrahús og gjörgæsludeildir, sérstaklega öldruðum. Blóðþurrð, blóðsýking og eiturverkanir á nýru eru helstu orsakir AKI sem eru oft samhliða og torvelda þar með greiningu og meðferð [1]. Alvarlegt AKI setur útskrifaða sjúklinga í hættu á aukaverkunum, svo sem langvinnum nýrnasjúkdómum, hjarta- og æðasjúkdómum, krabbameini og sýkingum [2]. AKI hefur hraða þróun og engin árangursrík meðferð er í boði til að forðast eða draga úr alvarleika hennar. Inntaka sérstakra næringarefna getur dregið úr nýrnapípluskaða í AKI [3]. Þess vegna mun rannsókn á áhrifum sértækrar næringar á AKI hjálpa til við að bæta AKI og meðfylgjandi áhættu sem útskrifaðir sjúklingar standa frammi fyrir.

Bólga og nýliðun hvítkornaeru lykilmiðlarar AKI. Nýru, sérstaklega nýrnapíplufrumur, myndabólgueyðandi cýtókínmeðan á AKI stendur, eins og IL-1, IL-6, monocyte chemoattractant prótein-1 (MCP-1), og æxlisdrep- (TNF- ) [4,5] . Þessi cýtókín framkalla enn frekar almenna bólgu og nýliðun hvítkorna. Þrátt fyrir að nokkur hvítkorna undirhópur hafi verndandi áhrif á AKI (eins og T-stýrifrumur), eru flestar daufkyrninga, einfrumur og dendritic frumur skaðlegar fyrir AKI bata [6]. Altæk bólga er einnig skaðleg bata frá AKI vegna hás cýtókínmagns [7]. Meðal frumuefna sem nýrun seyta, er MCP-1 aðallega ábyrgt fyrir nýliðun hvítfrumna, bregst við ýmsum frumum, þar á meðal IL-1 og TNF- [8,9], og gegnir mikilvægu hlutverki í meinmyndun mismunandi nýrnaskaða [10]. Í nærliggjandi pípulaga frumum HK-2 úr mönnum er MCP-1 tjáning af völdum súrefnisskorts miðlað af c-Jun NH2- lokakínasa (JNK) ferli [11]. P38 ferillinn tekur einnig þátt í albúmínvöldum MCP-1 tjáningu í nýrnapíplum þekjufrumum [12]. Þess vegna getur stjórnun JNK og p38 ferla haft áhrif á bólgu og nýliðun hvítkorna í AKI.

Fásykrur eru sykrur fjölliður sem innihalda 3-10 einsykrur sem eru ómeltanlegar og eru stór hluti af heildar tiltækum prebiotics sem aukefni í fæðu [13]. Flestar frúktó-fjörsykrur (FOS) sem teknar eru inn í mannslíkamanum eru gerjaðar að fullu af ristilflóru og lítið brot er endurheimt í þvagi [14]. Galacto-oligosaccharides (GOS) geta frásogast í blóði og skilst síðan út í þvagi [15]. Sama staða á við um fucoidan í brúnum sjávarþörungum [16]. Frásogaðar fásykrur geta haft áhrif á lífefnafræðileg viðbrögð og frumuþekkingu [17]. Fyrri rannsókn okkar leiðir í ljós að oligo-fucoidan (FC) truflar víxlverkun milli nýrnapípulaga yfirborðspróteinsins CD44 og utanfrumu bindla þess og kemur þar með í veg fyrir millivefsvefjamyndun í nýrum [18]. Samspil CD44 og utanfrumu bindla þess stuðlar að JNK boðleiðinni [19]. Þess vegna gæti dagleg inntaka fásykra dregið úr nýrnabólgu hjá sjúklingum með AKI. Hins vegar eru áhrif þessara fjölliða á AKI enn óþekkt. Þessi rannsókn rannsakaði áhrif FC, FOS og GOS á nýrnapíplufrumur sem fengu súrefnisskort og AKI mýs með blóðþurrðar-endurflæðisskaða (IRI). Niðurstöður sýndu að fásykrurnar þrjár bældu CD44-miðlaða nýrnaónæmissvörun og minnkaði alvarleika eftir AKI. Þess vegna kynnir notkun þessara fjölliða sem fæðubótarefni nýja AKI meðferðarstefnu

2. Efni og aðferðir

2.1. Efni

FOS (meðalfjölliðunarstig < 10), GOS (meðalfjölliðunarstig < 8) og FC (meðalfjölliðunarstig < 5) voru fengin frá Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Bandaríkjunum, Cat. No. F8052), Carbosynth (Berkshire, UK, Cat. No. OG32134), og Hi-Q Marine Biotech International (Taipei, Taiwan), í sömu röð. Fásykrur voru leystar upp í tvíeimuðu H2O og síaðar með því að nota 0,22 µm dauðhreinsaðar síur (Merck Millipore, Darmstadt, Þýskalandi). Hýalúrónan (HA) og öll önnur efni af hvarfefnaflokki voru fengin frá Sigma. Mótefni gegn JNK (sc-7345), fosfó-JNK (sc-6254), MCP-1 (sc-52701), IL-1 (sc{{17 }}), og TNF- (sc-52746) voru keyptir frá Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, Bandaríkjunum). Mótefni gegn p38 (9212) og fosfó-p38 (9211) voru fengin frá Cell Signaling Technology (Danvers, MA, Bandaríkjunum). Mótefni gegn Ly6G (ab25377) og F4/80 (ab100790) voru keypt frá Abcam (Cambridge, Bretlandi). Mótefni gegn HIF-1 (NB100-105) voru keypt frá Novus Biologicals (Centennial, CO, Bandaríkjunum).

2.2. Frumumenning

Nærliggjandi nýrnapíplufrumur (NRK-52E) og átfrumna úr músum RAW264.7 voru keyptar frá Food Industry Research and Development Institute (Hsinchu, Taívan); ræktað í DMEM ásamt sýklalyfja/sveppalyfjalausn og 10% fósturkálfasermi; og haldið við 37 ◦C og 95% raka í CO2 útungunarvél. Eftir að hafa náð 70% samruna voru frumurnar ræktaðar í sermilausum miðli og ræktaðar yfir nótt fyrir tilraunina. Fyrir súrefnisskortstilraunina voru NRK-52E frumur og Anaero Pack (Mitsubishi Gas Chemical America, New York, NY, USA) settar í rétthyrndar krukkur (Mitsubishi Gas Chemical America), og allt uppsetningin var sett í 37 ◦C útungunarvél í 4 klst. Frumurnar voru síðan ræktaðar yfir nótt við venjulegar aðstæður.

2.3. Western Blot greining

Í stuttu máli var 15 µg af NRK-52E próteinlýsi borið á hverja braut og niðurstöðurnar greindar með Western blot. Hlutfallslegt magn próteinbanda var magnmælt úr fimm sjálfstæðum tilraunum með Quantiscan hugbúnaði frá Biosoft (Cambridge, Bretlandi).

2.4. Stutt truflandi (si)RNA flutningur á CD44

Rotta CD44 siRNA (4390771) var keypt frá Thermo Scientific (Waltham, MA, Bandaríkjunum). Eftir að hafa vaxið upp í 70% samruna voru frumurnar transsýktar með siRNA með því að nota Lipofectamine 2000 transfection hvarfefni (Thermo Scientific) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.

2.5. Frumufjölgunargreining

Eftir að NRK-52E frumur með súrefnisskorti voru ræktaðar í 24 klst., var sami miðill notaður til að rækta RAW264.7 frumur í 96-brunnsplötu (2000 frumur/brunn). Eftir 24 klst ræktun var fjölgun RAW264.7 frumna greind með því að nota SRB prófunarsett (Abcam, Cat. No. ab235935) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.

2.6. CD44 mótefnavakapróf

Raðbrigða rotta CD44 var fengin frá R&D Systems (Minneapolis, MN, USA, Cat. No. 6577-CD) og notað til að framleiða bindihvarf við HA samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Í stuttu máli var 20 ng/ml raðbrigða CD44 rottu blandað saman við mismunandi styrk af FC, FOS eða GOS í 10 mínútur til að kanna áhrif fásykra á CD44 mótefnavaka. Blöndurnar voru greindar með því að nota CD44 ELISA kit (Abcam, Cat. No. ab213928) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.

2.7. Tilraunadýr og IRI í nýrum

Átta vikna gamlar karlkyns 129S1/SvImJ mýs voru keyptar frá Lasco Technology (Taipei, Taívan). Allar dýratilraunir voru samþykktar af Taipei Medical University Committee of Experimental Animal Care and Use (samþykkisnr. LAC-2019-0511) og mótaðar af NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Fyrir IRI örvun voru mýs (sem vega 21-23 g) settar í tvíhliða nýrnabotnklemma í 30 mínútur með því að gera hliðarskurð [20]. Mýsnar voru svæfðar með innöndunardeyfingu með isoflurani fyrir aðgerð. Sýndaraðgerðar mýs gengust undir svipaða aðgerð, að undanskildum klemmum á nýrnapípum. Allar mýs voru gefnar með fásykrum í gegnum munngjöf frá 1 degi fyrir til 2 dögum eftir IRI aðgerð. Tilraunamúsunum var skipt í eftirfarandi fimm hópa með n=8 fyrir niðurstöðurnar á degi 3 og degi 7: (1) sýndarhópur; (2) AKI hópur; (3) AKI hópur fóðraður með FC (10 mg/kg/dag); (4) AKI hópur fóðraður með FOS (10 mg/kg/dag); og (5) AKI hópur fóðraður með GOS (10 mg/kg/dag). Músum var fórnað 3 eða 7 dögum eftir aðgerðina og blóði var safnað og greind með lífefnagreiningartæki og ELISA settum. Kreatínínmagn í sermi í hverri mús var greint til að meta þróun AKI. Formgerð nýrna var skoðuð með periodic acid-Schiff (PAS) litun og ónæmisvefjaefnalitun (IHC) í formalínföstum 2 µm paraffínsköflum.

2.8. Ónæmisvefjaefnalitun

Nýrnavefur var festur með 4% jafnaðri paraformaldehýði, felld inn í paraffín og skorinn í 2 µm hluta til litunar með UltraVision Quanto Detection System HRP DAB settum (Thermo Scientific, Fremont, CA, Bandaríkjunum) og blandað saman við frummótefnið samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda .

2.9. PAS litun

Nýrnahlutar voru litaðir með PAS blettasetti (Abcam, Cat. No. ab150680) í samræmi við leiðbeiningar framleiðanda.

2.10. ELISA próf

Ræktunarmiðill NRK-52E frumna og sermisýnum tilraunamúsanna var safnað og greind með MCP-1 ELISA settinu (Abcam, Cat. No. ab208979) og IL-1 ELISA sett (Abcam, vörunúmer ab197742). Sermissýnin voru einnig greind með TNF-ELISA setti (R&D Systems, Cat. No. MTA00B) og daufkyrninga gelatínasa-tengd lipocalin (NGAL) ELISA Kit (R&D Systems, Cat. No. MLCN20) af leiðbeiningum framleiðanda.

2.11. Tölfræðipróf

Marktækur munur á milli hópanna tveggja var ákvarðaður með t-prófi nemenda. Mismunur var talinn marktækur fyrir p gildi<0.05

3. Úrslit

3.1. Fásykrur hamla aukningu á CD44 og cýtókínum í súrefnissýknum NRK-52E frumum

CD44 tjáning í NRK-52E frumum sem fengu FC, FOS og GOS var fyrst fylgst með til að meta áhrif fásykra á nýrnapíplufrumur. CD44 tjáning af völdum súrefnisskorts var hindruð af öllum þremur fásykrunum á bilinu 0.05–0,5 mg/ml (Mynd 1A). Þess vegna var fásykruskammturinn 0,1 mg/ml notaður í eftirfarandi frumutilraunum. Í undirbúnu kerfinu olli súrefnisskortsmeðferð ótrúlega tjáningu súrefnisskorts HIF-1 í NRK-52E frumum, sem gefur til kynna að frumurnar hafi verið í súrefnisskorti (Mynd 1B). Súrefnisskortur hækkaði magn fosfórýleraðs JNK, MCP-1, IL-1 og TNF- en ekki í frumunum sem voru meðhöndlaðar með fásykrum (Mynd 1B, C). JNK tjáning jókst í súrefnisfrumum en ekki í FC-meðhöndluðum eða FOS-meðhöndluðum frumum. GOS hafði ekki áhrif á tjáningu JNK í súrefnisfrumum en bældi uppstýringu fosfórýleraðs JNK. Þess vegna geta fásykrur hamlað súrefnisskorti af völdum JNK-boðaflutnings og cýtókínatjáningu í nýrnapíplufrumum. Þrátt fyrir að FC og GOS hækkuðu fosfórýlerað p38 í súrefnisfrumum, jókst tjáning þessa próteins ekki í súrefnisfrumum. Þessi niðurstaða gefur til kynna að p38 gegni ekki lykilhlutverki í svörun af völdum súrefnisskorts í NRK-52E frumum.

3.2. CD44 og JNK gegna mikilvægu hlutverki í aukningu frumna í blóðoxuðum NRK-52E frumum

Tjáning CD44, fosfórýleraðs JNK og cýtókína í nýrnapíplufrumum var öll fyrir áhrifum af fásykrum, en tengsl þeirra á eftir að skýra. Til að rannsaka hlutverk CD44 í JNK merkjaflutningi og frumuboðun í súrefnisfrumum, voru NRK-52E frumur umbreyttar með mismunandi skömmtum af CD44 siRNA. CD44 siRNA við 50 og 100 PM hindraði á skilvirkan hátt súrefnisaukna CD44 tjáningu og hamlaði verulega aukningu á magni fosfórýleraðs JNK, MCP- 1, IL-1 og TNF- af völdum súrefnisskorts (Mynd 2A). Áhrif CD44 blokkunar á JNK tjáningu tengdust siRNA skömmtum. JNK tjáning í súrefnisfrumum var framkölluð af CD44 siRNA við 50 pM en hindrað við 100 pM. Báðir skammtar bældu upp stjórnun fosfórýleraðs JNK. Sértæki hemillinn fyrir JNK, SP600125, dró verulega úr tjáningu MCP-1, IL-1 og TNF- í súrefnisskorti NRK-52E frumum (Mynd 2B). Þessar niðurstöður benda til þess að hamlandi áhrif CD44 siRNA flutnings á súrefnisskortsframkallaða cýtókín séu rakin til lækkunar á fosfórýleruðu JNK.

Mynd 1. Hindrandi áhrif fásykra á CD44 merkjaflutning í súrefnislausum NRK-52E frumum. Frumurnar voru formeðhöndlaðar með FC, FOS eða GOS í 30 mín og síðan settar í súrefnisræktun. Próteintjáning var greind með Western blotting. (A) Skammtaháð áhrif fásykra á CD44 tjáningu. (B) Áhrif fásykra á CD44-tengd merki. Styrkur fásykra var stilltur sem 0,1 mg/ml. Hlutfallsleg aukning á próteinböndum er einnig sýnd á súluritsformi (C). Niðurstöður eru gefnar upp sem meðaltal ± SD (n=4).

Mynd 2. Hlutverk CD44 og JNK í súrefnisskorti af völdum bólguviðbragða í NRK-52E frumum. Próteintjáning var greind með Western blot. (A) Hindrandi áhrif CD44 siRNA transfection á fosfórýleruðu JNK og frumuefni. (B) Hindrandi áhrif SP600125 á cýtókín. Frumurnar voru formeðhöndlaðar með 20 µM SP600125 í 30 mínútur fyrir meðferð með blóðsykursfalli. Hlutfallsleg aukning á próteinböndum er einnig sýnd á súluritsformi. Niðurstöður eru gefnar upp sem meðaltal ± SD (n=4).

3.3. Cýtókínseyting af völdum blóðsykursfalls í nýrnapíplufrumum stuðlar að fjölgun átfrumna

Bólga er miðill nýrnaskaða í AKI. Þess vegna voru áhrif oligosaccha ríða á hvítfrumur skoðuð. Mynd 3A sýnir að FC, FOS og GOS höfðu ekki áhrif á fjölgun átfrumna RAW264.7 frumna. Fjölgun RAW264.7 frumna var ýtt undir með 24-klukkutíma ræktunarmiðli fyrir súrefnissýkingar NRK-52E frumur (Mynd 3B) en ekki af miðlinum fyrir súrefnissýknar NRK-52E frumur sem voru meðhöndlaðar með fásykrur. Hið fyrra hafði hærra MCP-1 og IL-1 stig en hið síðarnefnda (Mynd 3C, D). Allar þrjár fásykrurnar drógu verulega úr MCP-1 og IL-1 í ræktunarmiðli súrefnislausra NRK-52E frumna. Þess vegna geta FC, FOS og GOS dregið úr tjáningu og seytingu cýtókína í súrefnislausum nýrnapíplufrumum og þar af leiðandi dregið úr bólgu af völdum slasaðra nýrnapíplufrumna.