Obacunone dregur úr lifrartrefjun með því að auka andoxunaráhrif GPx-4 og hömlun á EMT

Vinsamlegast hafðu sambandoscar.xiao@wecistanche.comfyrir meiri upplýsingar

Ágrip:Obacunone, limonin triterpenoid sem unnið er úr Phellodendronchinense Schneid eða Dic-tamnus dasycarpusb Turcz plöntunni, framkallar margvísleg lyfjafræðileg áhrif eins og bólgueyðandi, æxlishemjandi, andoxunar- og lungnatrefjun. Samt sem áður er óljóst hvað varðar trefjahamlandi áhrif oba-keilunnar og nákvæma undirliggjandi aðferð við lifrartrefjun. Lifrartrefjun er lamandi sjúkdómur sem ógnar heilsu manna. Umbreytandi vaxtarþáttur (TGF)- /P-Smad er meginleið bandvefsmyndunar sem einkennist af þekju-mesenchymal umbreytingum (EMT) og kollagenútfellingum, ásamt óhóflegum súrefnislausum stakeindum. Nrf-2 virkar sem lykil andoxunarstillir sem knýr tjáningu ýmissa andoxunartengdra gena. Glútaþíonperoxíðasi-4(GPx-4) er meðlimur glútaþíonperoxíðasafjölskyldunnar sem hindrar beint fosfólípíðoxun til að draga úr oxunarálagi. Í þessari rannsókn var stefnt að því að kanna hlutverk burðarásar í músalifrartrefjunarlíkani framkallað af koltetraklóríði (CCl4) og í lifrarstjörnufrumum (LX2 frumulínu) sem þjást af TGF-. Obacunone sýndi fram á kröftug bætandi áhrif á lifrartrefjun bæði í virkjaðri LX2 og í lifrarvef músa með minnkað magn af -SMA, kollageni1 og vimentíni. Obacunone bældi einnig TGF-/P-Smad merki og EMT ferli ótrúlega. Á sama tíma hafði obacunone öflug andoxunaráhrif með því að draga úr magni hvarfgjarnra súrefnistegunda (ROS) í báðum gerðum. Andoxunaráhrif hryggjarins voru rakin til virkjunar GPx-4 og Nrf-2. Að auki voru lækningaleg áhrif hryggjarins á LX2 frumur marktækt fjarlægð in vitro plús með GPx-4 mótlyfinu RSL3, samhliða endurhækkuðu gildi ROS.puritans c-vítamínÞannig sýnum við fram á að hryggjarlið er fær um að draga úr bandvefsmyndun í lifur með því að efla GPx-4 merki og hömlun á TGF-/P-Smad ferli og EMT ferli.

Leitarorð:hryggjarlið; lifrartrefjun; EMT;lifrarstjörnufrumur; GPx-4;TGF- ;oxunarálag

Vinsamlegast smelltu hér til að vita meira

1. Inngangur

Langvinn lifrarbólga stafar venjulega af veirulifrarbólgu, óalkóhólískri fituhrörnun, áfengislifrarbólgu og sjálfsofnæmislifrarbólgu. Viðvarandi lifrarskaðar geta endað í lifrartrefjun, eða jafnvel lifrarkrabbameini, sem hafði banvæn áhrif á heilsu manna [1]. Lifrartrefjun er tegund af viðbrögðum sem ekki gróa í sárum undir stöðugum skaðaþáttum sem einkennast af ýktri uppsöfnun utanfrumufylkis (ECM) og örmyndunar [2]. Lifrarstjörnufrumur (HSCs) eru venjulega í hvíldarástandi við venjulegar aðstæður, þær virkjuðust afbrigðilega við langvarandi lifrarskaða og sýndu mikla útbreiðslu og seytingu ECM [3], táknuð sem myofibroblasts [4]. Skilningur á fyrirkomulagi HSC virkjunar er mikils virði fyrir þróun nýrra meðferða til að meðhöndla lifrartrefjun.

Umbreytandi vaxtarþáttur (TGF- ) stuðlar að bólgusvörun með því að örva tjáningu Interleukin-1 (IL-1) og Interleukin-6(IL-6) í einfrumum [5]. Þar að auki veldur það meinvörpum í krabbameini með þekju-mesenchymal transformation (EMT) og æxlisónæmissleppi [6-8]. EMT vísar til kraftmikils lífeðlisfræðilegs ferlis þar sem þekjufrumur missa pólun sína og umbreytast í mesenchymal frumur eins og vefjafrumur og vöðvavefjafrumur, sem leiðir þannig til þróunar bandvefs [9]. Tilvik EMT er alltaf tengt niðurstýringu E-cadherins og uppstjórnun mesenchymal frumumerkja, eins og N-cadherin og snigill [10]. TGF- -Smad virkjun er ein helsta innanfrumuleiðin í EMT sem og myndun vöðvafíbroblasta [11].

Oxunarálag er talin ein helsta orsök bandvefsmyndunar með offramleiðslu hvarfgjarnra súrefnistegunda (ROS)[12]. Hátt magn ROS veldur byggingarskemmdum á lífsameindum, svo sem próteinum, lípíðum og DNA, sem leiðir að lokum til frumuskaða og eflingar bandvefsmyndunar [13]. Við oxunarálag sundrast dimer Nrf-2-Keep-1, kjarna öndunarþáttur-2(Nrf-2) er fluttur inn í kjarnann og framkallar tjáningu ýmissa andoxunarensím með því að bindast andoxunarefnaviðbragðsþáttunum (ARE) dregur úr magni ROS [14]. Glútaþíonperoxidasi-4 (GPx-4) ​​virkar sem andoxunarprótein með glútaþíonperoxidasavirkni, sem er aðallega ábyrgt fyrir hömlun á fosfólípíðoxun og ROS framleiðslu í ferroptosis ferlinu [15].sistancheRannsóknir á músum hafa sýnt að bandvefsmyndun versnar eftir að annaðhvort Nrf-2 eða GPx-4 tapast [16,17].

Cistanche getur gegn öldrun

Eins og er eru nokkur lyf fáanleg til meðferðar á lifrartrefjun, þar á meðal þau sem hafa eiginleika bólgueyðandi [18], andoxunarefnis [19] og peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR) örva [20]. Í nýlegri rannsókn komst prófessor Yu að því að sjúklingar með skorpulifur hafa hærra oxunarmagn blóðfitu í samanburði við heilbrigða viðmiðunarhópa í klínískum sýnum [21]. Nokkur andoxunarlyf eins og resveratrol[19] og ursolic acid |13] hafa sýnt fram á góð áhrif á bandvefsmyndun. Þessar vísbendingar benda til þess að andoxun sé vænleg aðferð til að meðhöndla bandvefsbólgu.

Pirfenidone (PFD) er pýridínlyf fyrir sjálfvakinn lungnatrefjun (IPF), á meðan það sýnir einnig góð meðferðaráhrif á lifrartrefjun í mörgum rannsóknum [22,23]. Þannig er PFD valið sem jákvætt viðmiðunarlyf í þessari rannsókn. Obacunone (Oba) er náttúrulegt limonoid efnasamband sem er unnið úr rótgrónum plöntum eins og Phellodendri og Dictamnus-dasycarpus [24], sem hafa ýmsa líffræðilega eiginleika eins og bólgueyðandi |25, andoxun [26] og æxlishemjandi [27]. Nýlegar skýrslur hafa leitt í ljós að Oba er sterkur Nrf-2 örvi, sem dregur í raun úr lungnatrefjun með CCL4 örvun og oxunarskemmdum á MDA-MB-231 frumum af völdum H, O2. Meira um vert, Oba er ekki eitrað fyrir músum [28]. Hins vegar er ekki greint frá neinum skýrslum um áhrif Oba á lifrartrefjun, sérstaklega á GPx-4 sem miðlar andfosfólípíðoxun, TGF- -Smad merki og EMT ferlið. Hér ætlum við að kanna áhrif Oba á lifrartrefjun og skilgreina undirliggjandi sameindakerfi.

2. Úrslit

2.1. Oba hindrað TGF- -Induced Lx-2 virkjun

Since the activated HSCs (aHSCs)played a critical role in liver fibrosis [3], we first observed the effects of Oba on liver fibrosis in aHSCs. In this experiment, we used the Cell Counting Kit-8(CCK8) to detect the toxicity of Oba on LX-2 cells, a type of human HSCs line. We found that LX-2 cells survival was not significantly affected by Oba at the concentration range of 10 to 160 uM during 24/48/72 h treatment (Figure 1A). Then, the LX-2 cells were stimulated with 10 ng/mL TGF-β for 24 h and then treated with Oba or not. the protein expression of α-Smooth muscle actin (α-SMA) was effectively inhibited at concentrations of >20 uM Oba. Athyglisvert er að með aukinni styrk Oba jukust a-SMA hömlunaráhrifin ekki marktækt (Mynd 1B).hvað er cistancheÞannig völdum við 20 μM styrk fyrir eftirfarandi tilraun, með PFD sem jákvætt viðmið. Oba hamlaði á áhrifaríkan hátt próteinmagn -SMA, kollagens-1, vímentíns og bandvefsvaxtarþáttar (CTGF) (Mynd 1C), í aHSCs[3,4]. Að auki minnkaði Oba mRNA tjáningarstig -SMA, kollagens-1 og vimentíns (mynd 1D). Niðurstöður ónæmisflúrljómunar staðfestu enn frekar að jákvæðu litunarmerki -SMA voru augljóslega minnkuð af Oba (miðað við það í TGF- hópnum, þar sem rauðkornafjöldi minnkaði eftir meðferð með Oba) í Lx-2(Mynd 1E). Þessar niðurstöður benda til þess að Oba hafi góð hamlandi áhrif á Lx-2 virkjunina.

2.2. Oba hindrað TGF-/Smad merki, EMT ferli og bólgueyðandi áhrif

Til að skilgreina sameindakerfin sem liggja að baki ofangreindum vefjagigtaráhrifum, sáust próteintjáningarmagn TGF-viðtaka, P-Smad og -SMA, sem var marktækt hamlað af Oba í aHSCs (Mynd 2A). tjáningarmagn N-cadherins og snigils minnkaði, en próteintjáningarstig E-cadherins var aukið (Mynd 2B), sem gefur til kynna að EMT leiðin hafi líka verið læst [3]. Að auki komumst við að því að Oba framkallaði minnkað magn IL-6(Mynd 2C).Anti öldrun cistancheTil að meta frekar áhrif Oba á bólgu, örvuðum við fyrst HepG-2 frumurnar (tegund af lifrarfrumukrabbameinsfrumulínu úr mönnum) með 20 nmól CCl4, fylgt eftir með meðferð með 20 uM Oba. Þessar niðurstöður sýndu að Oba gæti dregið úr mRNA og prótein tjáningu IL-6 í CCl4-örvuðum HepG-2(Mynd 2D). Á heildina litið sýndi oba margvísleg vefjagigtarverkun. með því að hindra TGF-/Smad merki, og EMT ferli, auk bólgueyðandi.

2.3. Bandvefsvarnaráhrif Oba voru háð aukinni andoxunargetu með því að virkja GPXx-4

In order to further define the underlying molecular mechanisms of Oba in aHSCs, we discovered that Oba activated the Nrf-2/Keap-1 pathway and reduced the protein expressions of Nox-2 (Figure 3A).In addition, we found that Oba increased the protein expression level of GPx-4(Figure 3B). To validate the importance of the GPx-4-mediated signal, RSL3, which is an inhibitor of GPx-4 [29], was selected to deal with Lx-2. Examination by using the CCK8 （Figure 3C）revealed that at concentrations of RSL3>{{0}}.75 μM, lífvænleiki frumna Lx-2 minnkaði marktækt; því var 0.75-μM RLS valið til að grípa inn í tjáningu GPx-4. Western blot niðurstöður sýndu að þegar RSL3 var bætt við í aHSCs, minnkaði GPx-4 prótein tjáning og profibrotic merkjunum, þar á meðal -SMA og vimentin, var öllum snúið verulega við, sem gefur til kynna mikilvægi GPx-4 við að miðla trefjalyfjaáhrifum Oba (mynd 3D). Á sama tíma minnkaði Oba augljóslega ROS-gildi aHSCs með ROS-flúrljómunarskynjurum og þessi áhrif voru greinilega lokuð af RSL3 (mynd). Þessi gögn gáfu til kynna að lægra fosfólípíð-ROS-magn sem miðlað var af GPx-4 væri helsta vefjagræðslan merki Oba.

2.4. Oba dregur úr CCl4-Völdum músalifrartrefjun

CCl4-trefjun í lifur er ein algengasta músalíkanið til að rannsaka lifrartrefjun [3]. Á vefjafræðilegu stigi lét Oba verulega úr lifrarsjúkdómnum, sem sést af bættu kollagenútfellingum sem tilgreind eru með Masson litun og anti-SMA litun. (Mynd 4A-D). Síðan var styrkur alanín transamínasa (ALT)/aspartat transamínasa (AST) í sermi ákvarðaður til að prófa skaðastig lifrarinnar, samanborið við CCL4 mýsnar, lágskammta Oba hópurinn og PFD hópurinn minnkuðu marktækt ALT gildi (p<0.05)(figure 4e).="" expectedly,="" oba="" inhibited="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" collagen-1,="" ctgf,="" and="" α-sma="" in="" mouse="" fibrotic="" livers,="" which="" were="" consistent="" with="" the="" immunohistologic="" results="" (figure="" 4f).="" these="" in-vivo="" results="" illustrated="" that="" oba="" significantly="" improved="" the="" ccl4-induced="" mouse="" liver="">

2.5. Oba jók tjáningu GPx-4, minnkaði bólgu, EMT-tengd próteintjáning og minnkaði fituoxunarmagn í CCl4-framkallaðri lifrartrefjun

Eins og sýnt er á mynd 5A, hindraði Oba próteintjáningu IL-6 og tilvik EMT í músum í trefjalifrar lifur með minnkað magn snigils og N-cadherins en hærra magn af E-cadherin. Að auki var próteintjáning Nrf-2 og GPx-4 augljóslega aukin eftir meðferð með miðlungs og stórum skömmtum af Oba (Mynd 5B).cistanche benefíciosNiðurstöður ónæmisvefjaefnalitunar (IHC) sýndu fram á að samanborið við líkanahópinn var fjöldi GPx-4 jákvæðra frumna (brúnar) í Oba hópunum með háa og meðalskammta skammta verulega aukinn (mynd 5C, E). Næst prófuðum við magn oxunarálags í lifur músa og komumst að því að, samanborið við viðmiðunarhópinn, var ROS flúrljómunarstyrkur líkanhópsins greinilega hærri. Á hinn bóginn minnkaði magn ROS marktækt eftir meðferð með Oba (Mynd 5D, F).

3. Umræður

Fibrosis er ógnvekjandi sjúkdómur í heiminum. Hver sem orsökin er, þar á meðal veirusýking, alkóhólísk eða óáfeng lifrarbólga og sjálfsofnæmissvörun, enda allt með bandvefsmyndun vegna langvinnra lifrarskaða [1]. Virkjun HSCs er aðalatburðurinn sem liggur að baki lifrartrefjunar. HSCs eru virkjuð með afbrigðilegri framleiðslu á ýmsum trefjavaldandi þáttum og ECM útfellingum [2,3]. TGF- -tengd kanónísk Smad virkjunarmerki, EMT ferli sem og IL-6-tengd langvinn bólga er tilkynnt um að taka þátt í ofangreindum ferlum [3,4]. Til að meta bandvefsáhrif Oba á bandvefsmyndun í lifur, erum við fyrst að einbeita okkur að því að skilgreina áhrif þess á Lx-2 virkjun sem TGF- framkallar, og síðan sannreyna bandvefsáhrif þess in vivo með því að nota CCl4-framkallað lifrartrefjun músalíkan á endanum.

Oba er náttúrulegt limonoid efnasamband [24] og líffræðileg áhrif þess innihalda aðallega bólgueyðandi [25], andoxunarefni [26] og æxlishemjandi [27] aðgerðir. Nýlega hefur komið í ljós að Oba er sterkur og áhrifaríkur Nrf-2 örvi og hefur áhrif gegn lungnatrefjun í músum [28]. Hins vegar er enn skortur á sönnunargögnum í verkun þess gegn lifrartrefjun og tengdum sameindaaðferðum. Hér var oftjáning á -SMA, kollageni 1 og CTGF öll hindruð af Oba í Lx-2 gerðum örvuðum með TGF-. Aukin EMT merkjagjöf er einnig í raun bæld af Oba.

Það hefur verið staðfest að oxunarálag er mikilvægur þáttur í bandvefsmyndun [12]. Hvarfandi súrefnistegundir (ROS) er regnhlífarheiti fyrir oxaðar sameindir eða jónir með líffræðilega virkni og offramleiðsla á ýmsum ROS í lifrarfrumum getur leitt til dauða þess og framkallað lifrartrefjun [13]. Þvert á móti virkjast HSCs í hvíld eftir lifrarfrumuskaða og of mikið ROS magnar upp fleiri HSCs virkjun og endar með lifrartrefjun [12]. Þess vegna verður að draga úr ýktum oxunarálagi áhrifarík meðferð við bandvefsbólgu.

Nrf-2 er mikilvægur eftirlitsaðili andoxunarálags, virkjaða fosfórýleraða Nrf-2 er flutt inn í kjarnann til að knýja upp stjórnun andoxunarpróteina, GST, HO1[15]. Sagt er að margir náttúrulegir efnavirkjar Nrf2 hafi trefjaeyðandi áhrif, svo sem tert-bútýlhýdrókínón og curcumin. Meðal allra andoxunarpróteina er glútaþíonperoxíðasi-4(GPx-4) meðlimur glútaþíonperoxídasafjölskyldunnar (GPx1-8) og það auðveldar redoxjafnvægið með því að draga úr glútaþíoninu [ 30-32]. Það er sannað að hærri tjáning glútaþíonperoxíðasa-7 hamlaði óáfengum fitulifursjúkdómi með því að minnka framleiðslu á ROS [33]. GPx-4 minnkaði fosfólípíðperoxíð á lípíðhimnunni til að vernda frumur gegn oxunaráverkumJ15]. Kazuya Tsubouchi o.fl. komist að því að tjáning GPx-4 minnkar í vefjum í lungnavef í músum af völdum bleomycins, og bandvefsmyndunin er alvarlegri þegar GPx-4 genið er slegið út. Að auki aukast lípíðperoxun og TGF-/P-Smad ferillinn verulega í trefjafrumum í lungum þegar GPx-4 genið er tæmt [17]. Nýlega studdu fleiri vísbendingar um að fosfólípíð-afleidd ROS eigi þátt í sérstökum frumudauða, sem kallast ferroptosis. GPx-4 hemill, RSL3, er einnig notaður sem ferroptosis hvati [21,34].

Í tilraunum okkar komumst við að því að Oba beitti andoxunargetu með því að hækka Nrf-2 og GPx-4 og niðurstilla Nox-2. Athyglisvert er að bandvefsvörn Oba veiktist verulega þegar GPx-4 genið var hamlað af RSL3, GPx-4 hemlinum. Stöðugt var minnkað ROS stig með Oba meðferð líka upplýst. Þessar in vitro athuganir studdu mjög að GPx-4-miðlað and-fosfólípíð ROS væri mikilvægt fyrir verndandi áhrif Oba.

Til að sannreyna ofangreindar niðurstöður meðferðar gegn bandvefsmeðferð Oba í LX2 frumum, var CCl4-afleidd lifrartrefjun í músum líka skoðuð. CCl4 er tegund lifrareiturs, niðurbrot sem miðlað er af örveruensími P450 framleiddi mjög hvarfgjarna sindurefna til að eyðileggja heilleika frumuhimnunnar, aftur á móti, kveikja á röð truflunar á lifrarstarfsemi og skaða, sem þróast að lokum í lifrartrefjun [35]. Í tilraun okkar sýndi Oba góð læknandi áhrif á CCl-framkallaða lifrartrefjun. Það létti á lifrarskemmdum með lægra magni AST, flatarmál kollagentrefjaknippa minnkaði og próteintjáning a-SMA, CTGF, kollagens-1, snigils, N-cadherins og IL{{10 }} var öllum fækkað. Þó að andoxunarboðin, próteintjáning Nrf-2 og GPx-4 hafi öll verið hækkuð líka, lækkaði hærra gildi ROS. Þessar niðurstöður staðfestu enn frekar in vitro and-fibrosis áhrif Oba og tengdra boðefna, sérstaklega hömlun á EMT og andoxunaráhrifum með Nrf-2 og GPx-4.

Í stuttu máli komumst við að þeirri niðurstöðu að Oba létti á TGF- -örvaði HSCs virkjun og CCl4-örvaði lifrartrefjun með ýmsum aðferðum. Í fyrsta lagi hindraði Oba klassíska TGF- /Smad ferilinn, EMT og IL-6 framleiðslu. Í öðru lagi sýndi það framúrskarandi andoxunargetu með því að auka tjáningu Nrf-2 og GPx-4. GPx-4miðluð and-fosfólípíð ROS áttu aðallega þátt í bindieyðandi áhrifum þess. Þess vegna gæti Oba þjónað sem efnafræðilegur umboðsmaður til að koma í veg fyrir bandvef og meðferð.

Oba sýndi einhver læknandi áhrif á CCl4-framkallaða lifrartrefjun í C57 músum. Oba gæti dregið úr tjáningu á lífmerkjum fibrosis próteina, svo sem: -SMA, CTGF, o.s.frv. Á meðan minnkaði Oba próteintjáningu I-6, E-cadherin o.s.frv. Það var áhugavert að Mid-Oba sýnir merki um betri útkomu yfir í lág-Oba og hátt-Oba hvað varðar hlutfallslega tjáningu þessara próteina, þó það sé ekki tölfræðilega marktækt. Hins vegar gaf það til kynna að ákjósanlegur skammtur gæti verið mikilvægur þáttur í þessu ferli og við munum kanna þetta fyrirbæri í næstu tilraun. Ennfremur komumst við að því að lægri ROS og stigi lifrartrefjunar með uppstýrandi tjáningu Nrf-2 og GPx-4. Þannig að við teljum að Oba gæti létta lifrartrefjun með því að stjórna Nrf-2 og GPx-4. Hins vegar gæti PFD haft betri meðferðaráhrif en Oba bæði in vivo og vitro. Hins vegar var Oba betri en PFD á andoxunaráhrifum, það er til þess fallið að auka möguleika á að finna nýtt lyf fyrir lifrar-fibrogenic áhrif frá andoxunarefni hliðinni, og leggja smá framlag til heilsu manna.

4. Efni og aðferðir

4.1. Efni og hvarfefni

Oba (nr.B20553, hreinleiki meira en eða jafnt og 98 prósent) og RSL3 (nr. S81241, hreinleiki meiri en eða jafnt og 98 prósent) voru keyptir frá YUANYE Bio-Technology Co., Ltd. (Shanghai, Kína) og leyst upp í dímetýlsúlfoxíði (DMSO) (nr.R21950; YUANYE) í styrkleikann 72,64 mg/ml og 6mmól, í sömu röð. Eftir dauðhreinsun á síu var lausnin sem myndaðist geymd við -20 gráðu C. Lausninni var bætt við ræktunarmiðilinn til að ná endanlega DMSO styrk upp á<1%. tgf-β="" was="" purchased="" from="" peprotech="" china="" (suzhou,="" china).="" ccl4="" was="" purchased="" from="" jiangsu="" qiangsheng="" chemical="" (jiangsu,="" china).="" a="" ros="" fluorescence="" probe="" kit="" was="" purchased="" from="" applygen(beijing,="" china).="" trizol,="" sybr="" premix="" ex="" taq="" reagents,="" revertaid="" first="" strand="" cdna="" synthesis="" kit,="" ripa,="" bca="" protein="" assay="" kit,="" and="" sds-page="" kit="" were="" purchased="" from="" thermo="" fisher="" scientific(waltham,="" ma,="" usa).="" the="" cell="" counting="" kit-8="" (cck8)was="" purchased="" from="" saint-bio="" (shanghai="" china).="" the="" primers="" were="" designed="" and="" synthesized="" by="" tsingke="" (xi'an,="" china).dapi,="" goat="" anti-mouse="" igg="" h&l(alexa="" fluor="" 594)(ab150120),="" anti-alpha="" smooth="" muscle="" actin="" antibody(ab7817),="" anti-vimentin="" antibody="" (ab20346),="" anti-il-6="" antibody="" (ab233706),anti-collagen-1="" antibody="" (ab34710),anti-smad3="" (phospho)="" antibody="" (ab52903),="" and="" anti-nox2/gp91phox="" antibody(ab80508)="" were="" purchased="" from="" abcam(cambridge,="" ma,="" usa).="" e-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (20874-1-ap),="" n-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (22018-1-ap),="" gpx4="" antibody="" (14432-1-ap),β-actin="" polyclonal="" antibody(20536-1-ap),="" nrf2="" polyclonal="" antibody="" (16396-1-ap),="" and="" keap1="" polyclonal="" antibody="" (10503-2-ap)="" were="" purchased="" from="" proteintech="" (rosemount,="" min,="" usa).ctgf="" polyclonal="" antibody(wl02602)="" and="" snail="" polyclonal="" antibody="" (wlo1863)were="" purchased="" from="" wanleibio="" (shenyang,="">

4.2. Frumumenning og tilraunahönnun

Lifrarstjörnufrumulínan Lx-2 og lifrarkrabbameinsfrumulínan Hepg-2 (allt fengin frá lyfjafræðideild, The Fourth Military Medical University, Kína) voru ræktuð í Dulbecco's Modified Eagle Medium ( DMEM) bætt við 10 prósent nautgripasermi og 1 prósent penicillín (Thermo Fisher Scientific) og streptómýsín (Thermo Fisher Scientific), og síðan haldið við 37C í rakaðri andrúmslofti með 5 prósent CO2 og 95 prósent lofti. Til að meta áhrif Oba á lífvænleika Lx-2 frumna var Lx-2 klætt með 1×10* frumum/holu í 96-brunnsplötu og ræktað í 24 klst. af Oba. Síðan voru Lx-2 meðhöndluð með mismunandi styrk af Oba (10,20, 40,80 og 160 wM og ræktuð í 24,48 eða 72 klst. Lífvænleiki frumunnar var prófaður af CCK8. Til að meta áhrif Oba á Lx-2 virkjun, Lx-2 var forræktað með sermifríu miðli í 12 klst., fylgt eftir með örvun með TGF- (10ng/ml,24 klst.) og meðferð með Oba eða PFD. Til að meta áhrif Oba á bólgu var Hepg-2 örvað með CCl4(20 nm,8 klst.) og meðhöndlað með 20 μM Oba. Í lok ræktunar var frumunum safnað saman og þær settar í Western blotting og rauntíma qPCR greining.

4.3. Dýr og tilraunahönnun

Karlkyns C57 mýs sem vógu 20± 0,5 g (The Laboratory Animal Center of the Fourth Military Medical University) voru geymdar við viðeigandi aðstæður, 25 gráður ± 2 gráður hitastig og 12-klst ljós/myrkur hringrás með ókeypis aðgangur að vatni og mat. Sérhver tilraun í þessari rannsókn var gerð í samræmi við samskiptareglur sem samþykktar voru af fjórðu herlæknisháskólanefndinni um dýravernd. C57 músunum var dreift af handahófi í 6 hópa (n=6 í hverjum hópi) sem hér segir: i) sýndarviðmiðunarhópur, i) módelhópur, ii) hópur með háan oba (CCl4 plús 6mg/kg Oba),io )miðlungs-Oba hópur (CCl4 plús 3 mg/kg Oba), ø) lág-Oba hópur (CCl4 plús 1,5 mg/kg Oba) og vi) PFD hópur (CCl4＋ PFD). Líkanhópurinn var meðhöndlaður með CCl4 (30 prósent CCl4/ólífuolía,5 ml/kg inndæling í kviðarhol) þrisvar í viku í 6-vikutímabil til að framkalla lifrartrefjun. Hinir hóparnir fengu mismunandi skammta af Oba eða PFD og jöfnu magni af CCil4 í kviðarholssýkingu fyrir 6-vikutímabil. Jafnt magn af ólífuolíu í stað CCl4 var gefið í C57 af ipas a sham control. Sérhver tilraun í þessari grein var gerð í samræmi við samskiptareglur sem samþykktar voru af fjórðu herlæknisháskólanefndinni um dýr Umhyggja.

4.4.Western Blotting

C57 lifur eða ræktaðar frumur voru einsleitar eða ljósaðar í RIPA jafnalausn með því að nota vefjaskífunarbúnað eða frumuskrap (Service, KZ-2). Próteinstyrkur var mældur með BCA próteingreiningarsettinu. Lysatið var skilið í skilvindu (4 gráður, 12, 000 rpm, 5 mín), og flotinu var safnað. Rekstrarskrefunum var fylgt eins og áður hefur verið greint frá [14]. Sýnin voru skönnuð undir Chemiluminescent Imaging and Analysis kerfi (Beijing Sage Creation Science Co, MiniChemi 610).

4.5. Rauntíma qPCR greining

C57 lifur eða ræktaðar frumur voru einsleitar eða leystar í Trizol hvarfefni með hjálp vefjaskífunarbúnaðarins til að draga út heildar-RNA. Heildar-RNA var öfugt umritað í cDNA með því að nota RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit. -aktín var notað til innri viðmiðunar. RT-qPCR var framkvæmt á 7500 rauntíma qPCR kerfinu (Applied Biosystems) með SYBR Premix Ex Taq hvarfefnum. Grunnefnin fyrir gena manna sem notuð voru voru skráð í töflu 1.

Þessi grein er dregin út úr Molecules 2021, 26, 318. https://doi.org/10.3390/molecules26020318 https://www.mdpi.com/journal/molecules