Taugaverndandi áhrif Bu-Shen-Huo-Xue útdráttar gegn háum glúkósa-framkallaðri apoptosis í PC12 frumum

Fyrir meiri upplýsingar:ali.ma@wecistanche.com

Shao-Yang Zhao, Xin Dong, Peng-Fei Tu, Ke-Wu Zeng, Xue-Mei Wang

1Research Studio of Integration of Traditional and Western Medicine, First Hospital, Peking University, Peking, Kína.

2State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Peking, Kína.

Hápunktar

Taugaeiturverkanir af völdum hás glúkósa (HG) eru fólgnar í meinafræðisykursýkiheilakvilli (DE). Í rannsókn okkar sýnir Bu-Shen-Huo-Xue þykkni (BSHX), fjöljurtaformúla,taugaverndandivirkni á HG-völdum PC12 frumum og mögulegir aðferðir geta tengst bælingu á myndun hvarfgjarnra súrefnistegunda (ROS) sem og hvatbera-miðluðum caspasa og JNK/p38 MAPK boðleiðum. Þessi rannsókn veitir efnilegan lyf til að meðhöndla DE í klínískum notkun.

Smelltu til að cistanche útdráttur kostir og Cistanche fyrir nýru

Cistancheer vel þekkt tonic jurt sem getur nært og verndaðnýru. Í hefðbundinni kínverskri læknisfræði,Cistancheer besta jurtin fyrirnýru.Cistancheer ríkt af echinacoside, acteoside og flavonoids.Þessi áhrifaríku innihaldsefni íCistanchegetur dregið úrnýrufrumudauða og aukastnýrufrumufjölgun. Þess vegna,Cistancheernáttúrulegt nýrnauppbót.

Ágrip

Markmið: Að kanna taugaverndandi áhrif Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX) þykkni, fjöljurtaformúlu, gegn háum glúkósa (HG) völdum taugaeiturverkunum í PC12 frumum. Aðferðir: Frumulífvænleikapróf, Lactate Dehydrogenase (LDH) próf, Reactive Oxygen Species (ROS) uppgötvun, Hoechst 33258, Acridine Orange (AO)/Ethidium Bromide (EB) tvöfaldur litur og Mitochondrial Membrane Potential (MMP) próf voru framkvæmd. Að auki greindust Bax, Bcl-2, kaspasi-3, klofinn kaspasi-3, PARP, klofinn PARP, cýtókróm c og mítógenvirkjaður próteinkínasa (MAPK) með Western blot. Niðurstöður: BSHX þykkni jók lífvænleika frumna og minnkaði LDH leka á styrkleikaháðan hátt í HG-framkölluðum PC12 frumum. Þar að auki minnkaði BSHX þykkni magn innanfrumu ROS, jók möguleika hvatberahimnu, stjórnaði tjáningu Bax og Bcl-2 og hindraði losun cýtókróm c frá hvatberum. Ennfremur dró BSHX þykkni úr virkjun caspasa-3 og PARP og hamlaði fosfórýleringum c-Jun N-terminal kínasa (JNK) og p38 MAPKs. Ályktun: BSHX þykkni sýndi marktæk taugaverndandi áhrif á HG-framkallaða frumufrumu í PC12 frumum. Þessi áhrif geta tengst bælingu ROS-myndunar sem og hvatbera-miðluðum caspasa og JNK/p38 MAPK boðleiðum.

Leitarorð:sykursýkisheilakvilli, hefðbundin kínversk læknisfræði, Bu-Shen-Huo-Xue þykkni,taugaverndandi, hár glúkósa

Skammstöfun: AO: acridine appelsína; BSHX: Bu-Shen-Huo-Xue; DE: Sykursýkisheilakvilli; DM: Sykursýki; DMSO: dímetýl súlfoxíð; EB: Ethidium Brómíð; ERK: Extracellular Regulated Protein Kinases; HG: Hár glúkósa; JNK: c-Jun N-enda kínasi; LDH: Laktat dehýdrógenasi; MAPK: Mítógenvirkir próteinkínasar; MWP: Wu-Zi-Yan-Zong Prescription; MTT: 3-[4, 5-dímetýlþíasól-2-ýl] 2, 5-dífenýltetrasólíumbrómíð; PBS: Phosphate Buffer Saline; PBST: Fosfat-bufferuð saltvatn, 0,1 prósent Tween 20; ROS: Reactive Oxygen Species; T2DM: Sykursýki af tegund 2; TCM: Hefðbundin kínversk lyf

Bakgrunnur

Á undanförnum árum hefur sykursýkisheilakvilli (DE), fylgikvilli sykursýki (DM) sem kemur fram í miðtaugakerfinu (CNS), fengið mikla athygli. DE getur tengst nokkrum áhættuþáttum eins og aldri, lengd og blóðsykursstjórnun sykursýki [1, 2]. Klínískar birtingarmyndir DE eru formfræðilegar og lífeðlisfræðilegar breytingar í heila og afleidd vitsmunaleg vanstarfsemi. Blóðsykurshækkun, oxunarálag og langvarandi bólga geta verið mikilvægar sjúkdómsvaldandi orsakir DE [3]. Þrátt fyrir að sífellt fleiri tilraunir hafi sýnt að langvarandi viðvarandi blóðsykurshækkun getur flýtt fyrir öldrun heilans, er nákvæm meingerð DE ókönnuð.

Apoptosis er forritaður frumudauði sem stjórnað er af genum til að viðhalda stöðugleika örumhverfisins. Próteinin sem taka þátt í frumudauða innihalda Bcl-2 fjölskylduna, kaspasa, p53, o.s.frv. Bcl-2 fjölskyldunni er skipt í tvo flokka, einn sem stuðlar að frumudauða, eins og Bax, og hinn þolir frumudauða, eins og Bcl-2. Þeir geta stjórnað frumudauða í gegnum kaspasa boðferilinn, sem er kaskada mögnunarviðbrögð óafturkræfs endanlegrar vatnsrofs hvarfefnis kaspasa [4-6]. Auk þess hafa rannsóknir sýnt fram á að frumudauði af völdum hás glúkósa (HG) tengist truflun á starfsemi hvatbera, DNA skemmdum og of mikilli framleiðslu á Reactive Oxygen Species (ROS) [7]. Rannsókn á sykursýkismúsum sýndi að Adenosine 5'-monophosphate (AMP)-virkjaður próteinkinasi (AMPK), innanfrumuorku- og streituviðtaki, gæti hindrað ROS-miðlaða frumudauða. Ennfremur hafa auknar vísbendingar sýnt fram á að hömlun á mítógenvirkum próteinkínasa (MAPK) gæti verið gagnleg fyrir hömlun á taugafrumum. Önnur skýrsla sýndi að c-Jun N-enda kínasa (JNK), utanfrumustjórnunar próteinkínasa (ERK), p38 MAPK merkjaleiðir gætu hugsanlega stjórnað taugafrumufrumufrumumyndun [8,9].

Byggt á hefðbundinni kínverskri læknisfræði,nýruKjarnaskortur og blóðstöðvun eru talin undirstöðu meingerð DE. Því stefna næringarnýruog virkjandi blóð er almennt notað í klínískum forritum fyrir DE. Fyrri rannsóknir gætu staðfest að breytt Wu-Zi-Yan-Zong lyfseðil (MWP), lyfseðill sem miðar að því að næranýru, getur bætt vitræna skerðingu og verndað taugafrumur með því að draga úr A-eitrun [10, 11]. Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX) lyfseðill, þar sem blóðsugur er bætt við byggt á MWP, er sérstaklega hannaður til aðnæranýruog virkja blóð. Nýlegar rannsóknir hafa sýnt að BSHX lyfseðilsskyld geta bætt minnisheilkenni sjúklinga með DM, sem bendir til öflugra taugavarnandi eiginleika [12]. Hins vegar er ítarlegt lyfjafræðilegt verklag fyrir BSHX enn óljóst. Í þessari rannsókn stefnum við að því að fylgjast með verndandi áhrifum BSHX útdráttar á HG-framkallaðar PC12 frumur og kanna hugsanlega sameindakerfi.

Aðferðir

Efni og hvarfefni

Allar jurtir voru keyptar frá Kang Ren Tang Chinese Medicine Co., Ltd. (Beijing, Kína) og staðfestar af Dr. PF Tu, lyfjafræðingi, samkvæmt kínverskri lyfjaskrá (The Pharmacopoeia Commission of PRC, 2010). 3- [4, 5-Dímetýlþíasól-2-ýl]2,5-dífenýltetrasólíumbrómíð (MTT) var frá Sigma Chemical Co. (Saint Louis, MO, Bandaríkjunum). Laktat dehýdrógenasa (LDH) prófunarsett var keypt frá Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute. (Nanjing, Jiangsu, Kína). Acridine Orange (AO)/Ethidium Bromide (EB) tvöfalt litunarsett og Hoechst 33258 voru fengin frá Solar Co., Ltd. (Beijing, Kína). Möguleg greiningarsett fyrir hvatberahimnu með JC-1, 2, 7-díklórfluorescein díasetati (DCFH-DA) var keypt frá Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, Kína). Aðalmótefni fyrir kaspasa-3, klofinn kaspasa-3, PARP, klofinn PARP, cýtókróm C, Bax, Bcl-2, p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, p -JNK, og -túbúlín voru fengin frá Cell signaling Technology (Boston, MA, Bandaríkjunum).

Undirbúningur BSHX útdráttar

BSHX samanstendur af sjö lyfjaþáttum (tafla 1). Fyrir undirbúning BSHX útdráttar, Tsizi (Cuscuta Chinensis Lam.), Gouqi (Lycium barbarum L.), Fupenzi (Rubus chingii Hu), Wuweizi (Schizandra Chinensis (Turcz.) Baill.), Cheqiancao (Plantago Asiatica L.), Shuizhi ( Hirudo nipponica Whitman.) og Yinyanghuo (Epimedium brevican Maxim.) var blandað í hlutfallinu 8:8:4:1:2:1:8 og sökkt í heildarrúmmál 10 sinnum (v/w) eimað vatn í 30 mín. , síðan soðið í 1 klst og aftur soðið í 1 klst í heildarrúmmáli 5 sinnum (v/w) eimuðu vatni. Flotvatnið var sameinað og þurrkað með frostþurrkun. Síðasti þurrkaði útdrátturinn var 25 prósent (w/w) af þyngd hráu jurtanna og skírteinissýni var afhent í Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, Peking University Health Science Center, Peking, Kína.

Frumuræktun

Rottufrumufrumufrumulínur (PC12 frumur) voru fengnar frá Peking Union Medical College Cell Bank (Beijing, Kína) og ræktaðar í Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Macgene, Peking, Kína) bætt við 10% nautgripafóstursermi (Biowest, Frakklandi) ) og 1 prósent Penicillin-Streptomycin (100×, Macgene, Peking, Kína) í rakaðri hitakassa sem inniheldur 95 prósent loft og 5 prósent CO2 við 37 gráður.

Sýnameðferð

Í forprófuninni voru PC12 frumur meðhöndlaðar með BSHX útdrætti (20, 50, 100 mg/L) eingöngu í 48 klst til að meta frumueiturhrifin. Til greiningar á taugaverndandi áhrifum BSHX útdráttar gegn háum glúkósa (HG) völdum taugaeiturhrifum, voru PC12 frumur meðhöndlaðar með BSHX útdrætti (20, 50, 100 mg/L) og HG (75 mM) í 48 klst., fylgt eftir með MTT prófun fyrir lífvænleika frumna. Allar aðrar prófanir voru gerðar við sömu aðstæður með styrkleika BSHX útdráttar á bilinu 20 til 100 mg/L.

Frumulífvænleikapróf

PC12 frumum var sáð í 96-brunnsplötur með þéttleikanum 3,5 × 103 frumur í hverri brunn. Eftir ræktun með BSHX útdrætti (með eða án HG) í 48 klst, var flotið fjarlægt og MTT lausn (0,5 mg/ml) bætt við. Eftir ræktun við 37 gráður í 4 klst, var MTT lausn fjarlægð og frumurnar voru leystar upp í dímetýl súlfoxíði (DMSO) til að hrista 5 mín. Optical density (OD) var mældur við 570 nm með því að nota örplötulesara. Frumulífvænleiki ( prósent )=[OD (meðferð) – OD (eyðsla)]/ [OD (ómeðhöndluð viðmiðun) – OD (eyðsla)] × 100 prósent .

LDH próf

PC12 frumur voru ræktaðar og örvaðar til HG og BSHX útdráttarmeðferðar eins og áður hefur verið lýst. Síðan var LDH sem losað var úr frumunum greint með því að nota LDH sett í sölu samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Frásog var mæld við 450 nm. LDH (U/L)=[OD (meðferð) – OD (eyðsla)] / [OD (staðlað) – OD (eyðsla)] × 0,2 (mmól/L) × 1000.

Hoechst 33258 litun og AO/EB litun

Fyrir Hoechst 33258 litun voru frumurnar festar með 4 prósent paraformaldehýði í 30 mín. Síðan voru frumurnar þvegnar með fosfatbuffer saltvatni (PBS) 3 sinnum og ræktaðar með Hoechst 33258 vinnulausn (1 ug/mL) í myrkri í 30 mínútur við stofuhita. Myndir voru teknar með flúrljómunarsmásjá (IX73, Olympus, Japan) við örvunarbylgjulengd 352 nm/geislunarbylgjulengd 461 nm. Fyrir AO/EB litun, fjarlægðu miðilinn af 96-brunnplötum og bætið við AO/EB blöndu (100 ug/mL AO og 100 ug/mL EB blandað) í 5 mínútur í myrkri við stofuhita. Síðan voru frumurnar þvegnar með PBS þrisvar sinnum. Frumurnar voru sýndar með því að nota flúrljómunarsmásjá undir örvunarbylgjulengd 490 nm/losunarbylgjulengd 530 nm fyrir AO litun og örvunarbylgjulengd 520 nm/losunarbylgjulengd 590 nm fyrir EB litun.

Innanfrumu ROS uppgötvun

Fyrir innanfrumu ROS uppgötvun var PC12 frumum sáð í 6-brunnsplötur með þéttleika 5×105 og látnar fara í HG og BSHX útdráttarmeðferð í 24 klst. Eftir ræktun í 24 klst. voru PC12 frumur þvegnar með sermilausu Dulbecco's breyttu örnefni í 3 sinnum og bætt út í 10μΜ 2', 7'-díklórfluorescein díasetat (DCF-DA), sem er oxað í flúrljómandi 2', 7'-díklórflúorljós. (DCF) með vatnsperoxíðum, við 37 gráður í 30 mínútur í myrkri. Síðan voru frumurnar þvegnar með köldu PBS þrisvar sinnum og endursviflausnar í PBS. Innanfrumustig ROS var greint með því að mæla meðalflúrljómunarstyrk með frumuflæðismælingu (BD FACSCaliburTM, Bandaríkjunum). Örvun/losunarbylgjulengdirnar voru við 488 / 525 nm. Að minnsta kosti 10,000 atburðir voru taldir í hverju úrtaki. Gildin voru gefin upp sem meðalgleypni staðlað í prósentu af viðmiðunargildi.

Hvatbera himnumöguleikagreining

Hvatbera afskautun var metin með því að nota JC-1 greiningarsett í verslun. Eftir að hafa verið meðhöndluð með HG og BSHX útdrætti voru frumurnar ræktaðar með JC-1 vinnulausn (1 ×) við 37 gráður í 15 mínútur í myrkri. Fjarlægðu síðan flotið og þvoðu frumurnar 2 sinnum með JC-1 jafnalausn (1 ×). Frumurnar voru sýndar með því að nota flúrljómunarsmásjá undir örvunarbylgjulengd 460 nm/losunarbylgjulengd 530 nm fyrir JC-1 einliða (greind í frumum með afskautaða hvatbera), og örvunarbylgjulengd 520 nm/losunarbylgjulengd 3 JC{10} 19 }} fjölliða (til staðar í skautuðum hvatberum). Frumurnar með græna (einliða) flúrljómun voru taldar hafa afskautaða hvatbera; frumurnar með rauða (fjölliða) flúrljómun voru taldar hafa eðlilega hvatbera.

Western blot greining

PC12 frumum var safnað og leyst í köldu RIPA jafnalausn með 1× kokteil próteasa hemli. Vökvanum var safnað með háhraða skilvindu við 12,000 snúninga á mínútu í 10 mín. við 4 gráður. Próteinstyrkur var ákvarðaður með Bradford prófinu. Cytosol og hvatberaauðgað brot voru einangruð með hvatbera einangrunarsettinu (Pierce, Rockford, Bandaríkjunum) fyrir cýtókróm c greiningu. Fyrir önnur prótein voru heildarfrumulýsin aðskilin með SDS-PAGE (10 prósent -15 prósent) og flutt yfir á pólývínýlídenflúoríð (PVDF) himnur. Pólývínýlídenflúoríðhimnurnar voru síðan lokaðar með 5 prósent fitulausri mjólk og ræktaðar með tilgreindum frummótefnum við 4 gráður yfir nótt. Himnurnar voru þvegnar með PBST (fosfat-bufferuðu saltvatni, 0,1 prósent Tween 20) þrisvar sinnum og ræktaðar með aukamótefnum við stofuhita í 2 klst. Síðan voru himnurnar þvegnar með PBST þrisvar sinnum í viðbót og sýndar með því að nota aukið efnaljómandi hvarfefni og skannaðar með Kodak Digital Imaging System (Gel Logic 2200Pro, Kodak, Bandaríkjunum).

tölfræðigreining

Öll gildi eru gefin upp sem meðaltal ± staðalfrávik (SD). Mikilvægi mismunar milli meðalgilda var ákvarðað með einhliða dreifigreiningu (ANOVA) með því að nota Statistical Package for Social Sciences (SPSS 16.0 hugbúnaður). P < 0.05="" samanborið="" við="" samanburðarhópinn="" var="" talið="" tölfræðilega="">

Niðurstöður

BSHX þykkni verndar PC12 frumur gegn HG af völdum frumuskaða

Til að kanna hvort BSHX þykkni gæti verndað PC12 frumur gegn HG móðgun, meðhöndluðum við PC12 frumur með svið af BSHX þykkni styrkleika (20, 50 og 100 mg/L) í 48 klst við HG (75 mM) aðstæður. Mat á lífvænleika frumna með því að nota MTT prófið sýndi að HG móðgun olli marktækri minnkun á lífvænleika PC12 frumna (lífvænleiki frumna var um það bil 56,9 ± 6,7 prósent) og að meðferð með BSHX útdrætti kom marktækt í veg fyrir frumudauða á þéttniháðan hátt. Lífvænleiki frumunnar jókst í 87,8 ± 9,2 prósent þegar frumurnar voru meðhöndlaðar með BSHX útdrætti (100 mg/L) (Mynd.1A). Laktat dehýdrógenasi (LDH) losnar úr skemmdum frumum og er því einnig hægt að nota sem vísbendingu um eiturhrif frumna. Í samræmi við niðurstöður MTT prófunarinnar komumst við að því að HG móðgun jók marktækt LDH losun frá PC12 frumum og að BSHX þykkni meðferð kom í veg fyrir losun LDH á styrkleikaháðan hátt (Mynd 1B), Þessar niðurstöður benda til þess að BSHX þykkni eykur lífvænleika frumna í PC12 frumum af völdum HG.

BSHX þykkni hindrar PC12 frumu frumudruflanir í gegnum caspasa-9/3-háða feril

Til að ákvarða áhrif BSHX útdráttar á frumudauða, notuðum við DNA litarefni Hoechst 33258 sem viðkvæmt próf fyrir frumudauða. Kjarnar eðlilegra frumna sem litaðar voru með Hoechst 33258 sýndu einsleita bláa flúrljómun, á meðan apoptótískar frumur sem kjarnakrómatínskýja pyknosis sýndu oflitrómatískar og þéttar flúrljómandi agnir. Hlutfall apoptosis var reiknað út í samræmi við fjölda apoptotic frumna á móti heildarfjölda frumna. Gögnin okkar leiddu í ljós að HG (75 mM) móðgun jók verulega hlutfall apoptótískra frumna (51,7 ± 4,3 prósent) og BSHX útdráttarmeðferð verndaði verulega gegn HG-völdum frumudauða í PC12 frumum (Mynd.2A). Þessar niðurstöður voru studdar frekar af AO/EB tvílitunargreiningu. AO fer inn í bæði eðlilegar og apoptotic frumur og gefur frá sér græna flúrljómun en EB fer aðeins inn í apoptotic frumur og gefur frá sér rauða flúrljómun [13]. AO/EB greiningin sýndi að hlutfall apoptótískra frumna jókst marktækt eftir HG (75 mM) móðgun (47,8,7 ± 2,6 prósent) og lækkaði við BSHX þykkni meðferð í PC12 frumum (Mynd.2B), sem bendir til þess að BSHX þykkni gæti á áhrifaríkan hátt hamla apoptosis PC12 frumna framkallað af HG.

Síðan rannsökuðum við áhrif BSHX útdráttar á caspasa-3/PARP ferlið, mikilvægan feril fyrir hvatberatengda apoptosis [14]. Western blot leiddi í ljós að HG (75 mM) móðgun jók marktækt tjáningu virkra forma kaspasa-3 og PARP og minnkaði tjáningu heildarkaspasa-3 og PARP í PC12 frumum, og þessi áhrif gengu verulega til baka. með BSHX þykkni meðferð (Mynd.2C), sem bendir til þess að BSHX þykkni hafi á áhrifaríkan hátt verndað PC12 frumur gegn apoptosis með stjórnun á hvatberaháðum caspasa-3/PARP ferli.

BSHX þykkni hamlar innanfrumu ROS framleiðslu í HG-framkölluðum PC12 frumum

Þar sem HG gæti aukið myndun innanfrumu ROS [15], prófuðum við magn innanfrumu ROS til að ákvarða hvort BSHX þykkni gæti hamlað myndun ROS. Það var 3.23-föld aukning á meðalflúrljómunarstyrk sem sást í PC12 frumum sem voru útsettar fyrir 75 mM HG í 48 klst. samanborið við samanburðarhóp. Aftur á móti minnkaði samhliða meðferð með BSHX útdrætti marktækt meðalflúrljómunarstyrk í um það bil 0.76-, 0.{{10}} og 0.{ {12}}falt af líkanahópnum, í sömu röð, sem gefur til kynna að BSHX þykkni gæti hamlað framleiðslu á ROS framkallað af HG (myndir.3A, B).

BSHX þykkni viðheldur jafnvægi í hvatbera í PC12 frumum af völdum HG með því að stjórna tjáningu Bax og Bcl-2

Hvatberahimnugeta er mikilvægur mælikvarði á starfsemi hvatbera sem notuð er sem vísbending um heilsu frumna. JC-1 er fitusækið, katjónískt litarefni sem getur valið inn í hvatbera og breytt lit til baka úr grænu í rautt eftir því sem himnugetan eykst. Í heilbrigðum frumum með mikla hvatberahimnugetu myndar JC-1 sjálfkrafa fléttur þekktar sem J-samstæður með sterkri rauðri flúrljómun. Á hinn bóginn, í apoptótískum frumum með litla hvatberahimnugetu, er JC-1 áfram á einliða formi, sem sýnir aðeins græna flúrljómun [16, 17]. Hlutfall græns flúrljómunar og rauðs flúrljómunar getur því endurspeglað hvatbera afskautun. Í rannsókn okkar jókst fjöldi frumna með afskautaða hvatbera (grænt flúrljómun) marktækt í kjölfar HG (75 mM) í 48 klst. og þessari aukningu var snúið við með BSHX þykkni meðferð á styrkleikaháðan hátt (Mynd.4A).

Næst fundum við hvatbera og umfrymisdreifingu cýtókróm c, sem er lykilmaður í virkjun kaspasaháðu frumudreifingarferlinu. Við komumst að því að HG (75 mM) móðgun í 48 klst. olli stórkostlegri flutning cýtókróms c frá hvatberum yfir í umfrymið og var verulega komið í veg fyrir þessa flutning með BSHX þykkni meðferð (Mynd.4B), sem gefur til kynna að BSHX þykkni gæti hamlað losun á cýtókróm c frá hvatberum.

Ennfremur eru Bcl-2 fjölskylduprótein mikilvægir eftirlitsaðilar ýmissa apoptotic ferla. Bcl-2 getur hamlað frumudauða af völdum margs konar frumudrepandi þátta og er hemill á losun cýtókróm c frá hvatberum í umfrymið. Hins vegar er Bax, sem meðlimur Bcl-2 fjölskyldunnar, frumkvöðull. Þegar frumudauði er framkallað, flytur Bax frá umfrymi til hvatbera og eyðileggur heilleika hvatbera [5, 18]. Í rannsókninni okkar var próteinmagni Bcl-2 lækkað og Bax var stýrt upp með HG (75 mM) móðgun í 48 klst., þessi áhrif snerust styrktarháð til baka með BSHX útdrætti (Mynd.4C). Allar þessar niðurstöður hér að ofan bentu til þess að BSHX útdráttur verndaði PC12 frumur gegn HG-framkölluðu hvatberaafskautun með því að stjórna tjáningu Bax og Bcl-2.

Áhrif BSHX útdráttar á frumudreifingu í gegnum JNK/p38 MAPK merkjaleiðir

Sumar rannsóknir hafa sýnt að aukin ROS framleiðsla hefur tengst virkjun MAPK ferla, til að koma frumudreifingu9 [19, 20]. Þannig að við rannsökuðum áhrif BSHX útdráttar á mítógen-virkjaðan próteinkinasa (MAPK) merkjaleiðina til að ákvarða hvort BSHX útdráttur gæti dregið úr frumudauða af völdum HG. Eins og sýnt er á mynd 5 jók HG (75 mM) móðgun í 48 klst fosfórýleringar c-Jun NH 2-enda kínasa (JNK) og p38 í PC12 frumum, sem voru marktækt hindrað af BSHX útdrætti í styrk- háð hátt. Hins vegar sást ekki svipuð niðurstaða með extracellular Regulated Protein Kinase (ERK) MAPK. Niðurstöðurnar benda til þess að BSHX útdráttur gæti hamlað frumufrumumyndun af völdum HG með JNK/p38 MAPK boðleiðum.

Umræða

Sykursýkisheilakvilli (DE) er algengur fylgikvilli sykursýki af tegund 2 (T2DM). Það getur valdið vitrænni skerðingu á heilanum og er mikilvægur áhættuþáttur dánartíðni og fötlunar hjá sjúklingum með sykursýki af tegund 2 um allan heim [3]. Þess vegna er mikilvægt að rannsaka gangverk DE sem og forvarnir og meðferðaraðferðir þess.

Í Kína hafa hefðbundin kínversk lyf (TCM) verið notuð til að meðhöndla DM í mörg ár og hafa sýnt læknandi áhrif. Sumar klínískar rannsóknir benda til þess að TCM sem byggist á nærandi nýrum og virkjunaraðferðum blóðs geti lækkað blóðsykur, stuðlað að blóðrásinni og bætt vitræna truflun á heila. BSHX lyfseðil er fulltrúi þessara TCM. Klínísk bráðabirgðarannsókn okkar sýndi að BSHX lyfseðilsskyld gæti á áhrifaríkan hátt bætt blóðsykur, homocystein (HCY) og C-reactive prótein (hs-CPR) í sermi og bætt vitræna virkni sykursýkissjúklinga með væga vitræna skerðingu (MCI) [12]. Hins vegar er skortur á sönnunargögnum til að sanna skilvirkni og lyfjafræðilega aðferð hingað til.

Í þessari rannsókn komumst við að því að BSHX þykkni gæti dregið úr lækkun á lífvænleika frumna af völdum HG, eins og mælt er með MTT, LDH prófi. Til að kanna frekar verndandi áhrif BSHX útdráttar á lífvænleika frumna, rannsökuðum við frumudauða með Hoechst 33258 og AO/EB litunargreiningu. Niðurstöðurnar sýndu að BSHX þykkni gæti dregið verulega úr frumudauða af völdum HG. Sem merki um apoptosis, jókst caspase-3 og PARP marktækt eftir meðferð með HG en virkjun þessara pro-apoptotic þátta var hamlað með BSHX útdrætti á styrkleikaháðan hátt. Ofangreindar niðurstöður bentu til þess að BSHX þykkni hefði verndandi áhrif á PC12 frumuskemmdir af völdum HG.

ROS myndast við oxandi fosfórun frumna og aukning þess í framleiðslu eða skemmdir á andoxunarkerfum getur leitt til oxunarálags í frumum [21]. Rannsóknir hafa sýnt að hár glúkósa gæti leitt til uppsöfnunar á innanfrumu ROS og að lokum virks apoptotic boðleið. Og algengi aðferðin við fylgikvilla sykursýki er oxunarálag [22, 23]. Niðurstöður okkar sýndu að hár glúkósa gæti leitt til aukningar á ROS í PC12 frumum, sem var í samræmi við fyrri rannsóknir [24]. Talið er að eituráhrif hás glúkósa á frumur geti náðst með ROS-framkallaðri frumufrumu. Hvatberar eru helstu staðir fyrir framleiðslu á ROS innanfrumu og einnig aðal marklíffærið fyrir ROS árás [25]. Við meinafræðilegar aðstæður getur hröð aukning á ROS leitt til truflunar á starfsemi hvatbera, möguleiki á hvatberahimnu hrynja og að lokum leitt til frumudauða [26]. Þannig að við fundum heilleika hvatberanna. Niðurstöður okkar sýndu að hár glúkósa minnkaði marktækt hvatberahimnugetu, jók hlutfall Bax/Bcl-2 sem stjórnaði skiptingu á hvatbera permeability transition pore (MPTP), og stuðlaði að leka cýtókróm c, á meðan BSHX þykkni gæti snúa þessum breytingum við. Þetta bendir til þess að taugaverndandi BSHX þykkni gegn HG-framkölluðum PC12 frumum geti stafað af því að viðhalda heilleika hvatbera.

MAPK boðferill gegnir einnig mikilvægu hlutverki í frumudreifingu. JNK, ERK og p38 MAPK eru mest rannsakaðir meðlimir MAPK fjölskyldunnar. Helsta verkunaraðferð þeirra er að fosfóra tiltekna staði þeirra og stjórna þar með frumudreifingu [8, 27, 28]. Þar að auki hafa rannsóknir sýnt fram á að of mikil framleiðsla á ROS getur kallað fram p38MAPK fosfórun [29-31], og ROS getur framkallað eða miðlað virkjun MAPK ferla [32]. Nokkrir frumuáreiti sem örva ROS framleiðslu líka samhliða geta virkjað MAPK ferla í mörgum frumugerðum [32, 33]. Mögulegir aðferðir fyrir MAPK virkjun með ROS geta falið í sér óvirkjun og niðurbrot MAPK fosfatasa sem viðhalda ferlinu í óvirku ástandi [19]. Á hinn bóginn, til að staðfesta enn frekar hvort MAPK ferlar hafi verið virkjaðir með ROS myndun, voru frumur formeðhöndlaðar með andoxunarefnum (td NAC, ROS hreinsiefni) til að koma í veg fyrir ROS uppsöfnun. Og niðurstöðurnar sýndu að MAPK virkjun var næstum hindruð eftir frumuörvun með frumu áreiti [32, 33], sem gefur til kynna þátttöku ROS óvirkjun MAPK ferla. Þar að auki sýndu rannsóknir að þegar frumur voru meðhöndlaðar með sértæka JNK hemlinum SP600125, gæti frumuddrunin af völdum hjartaeiturs III verið læst [34]. Fyrri rannsókn okkar leiddi í ljós að breytt Wu-Zi-Yan-Zong lyfseðilsskyld (MWP) gæti hamlað virkjun ERK/p38 MAPK í A-virkjaðri BV2 microglia [10]. Hins vegar, í þessari rannsókn, komumst við að því að BSHX þykkni gæti hamlað fosfórun á JNK og p38 MAPK og við náðum ekki sömu niðurstöðu með p-ERK. Við veltum því fyrir okkur að blóðsugur gegni öðru hlutverki í BSHX þykkni. Niðurstöðurnar benda til þess að annar verndarbúnaður BSHX útdráttar gegn frumudauði í HG-framkölluðum PC12 frumum gæti verið í gegnum stjórnun á JNK/p38 MAPK merkjaleiðum.

Niðurstaða

BSHX þykkni, fjöljurtaformúla, sýnir taugaverndandi áhrif á PC12 frumur gegn HG móðgun. BSHX þykkni hamlaði á áhrifaríkan hátt HG-framkallaða PC12 frumu frumudauða með því að minnka innanfrumu ROS myndun, viðhalda heilleika hvatberahimnunnar og hindra caspasa-3 og JNK/p38 MAPK boðleiðir (Mynd.6). Samanlagt benda niðurstöður okkar til þess að BSHX þykkni sé efnilegur lyf til að meðhöndla DE í klínískum notkun.

Framlög höfunda

Hugsaði og hannaði tilraunirnar: Zeng KW, Wang XM. Framkvæmdi tilraunina: Zhao SY. Greindu gögnin: Zhao SY, Zeng KW og Wang XM. Hvarfefni/efni/greiningartæki: Zhao SY, Dong X, Tu PF, Zeng KW og Wang XM. Faðirinn skrifaði: Zhao SY.

Heimildir

1 Riederer P, Korczyn AD, Ali SS, o.fl. Sykursýkisheilinn og skynsemi. J Neural Transm 2017, 124: 1-24.

2. Hamed SA. Heilaskaði með sykursýki: vísbendingar, aðferðir og meðferðaráhrif. Sérfræðingur Rev Clin Phar 2017, 10: 409-428.

3. Testa R, Bonfigli AR, Prattichizzo F, o.fl. Kenningin um „efnaskiptaminni“ og snemmtæk meðferð á blóðsykri til að koma í veg fyrir fylgikvilla sykursýki. Nútr 2017, 9: 437-445.

4. Ly JD, Grubb DR, Lawen A. Hvatberahimnugeta (Δψm) í frumudauða; uppfærslu. Apoptosis 2003, 8: 115-128.

5. Aouacheria A, Baghdiguian S, Lamb HM, Huska JD, Pineda FJ, Harwick J M. Að tengja hvatbera gangverki og líf-eða-dauða atburði með Bcl-2 fjölskyldupróteinum. Neurochem Int 2017, 109: 141-161.

6. Bernardi P, Scorrano L, Colonna R, o.fl. Hvatberar og frumudauði. Vélrænir þættir og aðferðafræðileg atriði. J. febrúar 1999, 264: 687-701.

7. Yang L, Wu L, Du S, o.fl. 1,25-(OH)2D3 hindrar háa glúkósa-framkallaða frumufrumu og ROS framleiðslu í kviðhimnufrumum manna í gegnum MAPK/P38 ferli. Mol Med Rep 2016, 14: 839-844.

8. Tabakman R, Jiang H, Schaefer E, o.fl. Formeðferð taugavaxtarþáttar dregur úr súrefnis- og glúkósaskortsörvun c-Jun amínóendakínasa 1 og streituvirkjaða kínasa p38 og p38 virkjun og veitir taugavörn í pheochromocytoma PC12 líkaninu. J Mol Neurosci 2004, 22: 237-250.

9. Zou W, Zeng J, Zhuo M, Xu W, Sun L, Wang J, o.fl. Þátttaka kaspasa-3 og p38 mítógenvirkjaðs próteinkínasa í kóbaltklóríð völdum frumudauða í PC12 frumum. J Neurosci Res 2002, 67: 837-843.

10. Yu Q, Song FJ, Chen JF, o.fl. Taugabólgueyðandi áhrif breytts Wu-Zi-Yan-Zong lyfseðils í -Amyloid-örvuðum BV2 Microglia í gegnum NF-KB og ERK/p38 MAPK merkjaleiðina. Evid-Based Compl Alt 2017, 2017: 1-10.

11. Zeng KW, Zhang T, Fu H, o.fl. Breytt Wu-Zi-Yan-Zong lyfseðils, hefðbundin kínversk fjöljurtaformúla, bælir taugabólgu af völdum lípópólýsykru í stjörnufrumum rotta með NF-KB og JNK/p38 MAPK merkjaleiðum. Phytomed 2012, 19: 122-129.

12. Fu H, Lin WW, Wang H, o.fl. Áhrif Bushen Huoxue lyfseðils á meðhöndlun vægrar vitsmunaskerðingar á sykursýki af tegund 2. Chin J Integr Trad West Med 2017, 37: 661-665.

13. Baskić D, Popović S, Ristić P, o.fl. Greining á sýklóhexímíði af völdum frumudauða í hvítfrumum úr mönnum: Flúrljómunarsmásjárskoðun með annexíni V/própidíumjoðíði á móti acridín appelsínu/etídíumbrómíði. Cell Biol. Int 2006, 30: 924–932.

14. Galluzzi L, Lópezsoto A, Kumar S, o.fl. Kaspasar tengja frumudauðaboð við lífverujafnvægi. Ónæmi 2016, 44: 221-231.

15. Hamed S, Brenner B, Roguin A. Nituroxíð: lykilþáttur á bak við óvirkni æðaþelsforfrumna í tegund sykursýki-2. Cardiovasc Res 2011, 91: 9-15.

16. Perelman A, Wachtel C, Cohen M, o.fl. JC-1: Aðrar örvunarbylgjulengdir auðvelda frumugreiningu hvatberahimnunnar. Cell Death Dis 2012, 3: e430.

17. Perry SW, Norman JP, Barbieri J, o.fl. Hvatberahimnumöguleikarannsóknir og róteindahalli: hagnýt notkunarleiðbeiningar. Líftækni 2011, 50: 98-115.

18. Chipuk JE, Green D R. Hvernig framkalla BCL-2 prótein gegndræpi ytri himnu hvatbera? Trends Cell Biol 2008, 18:157-164.

19. Son Y, Cheong YK, Kim NH, o.fl. Mítógenvirkjaðir próteinkínasar og hvarfgjarnar súrefnistegundir: hvernig getur ROS virkjað MAPK ferla? J Signal Transduct 2011: 792639.

20. Zhang L, Zhang Z, Chen F, o.fl. Arómatískir heteróhringlaga esterar af podophyllotoxin hafa and-MDR virkni í hvítblæði K562/ADR frumum úr mönnum með ROS/MAPK boðleið. Eur J Med Chem 2016, 123:226-235.

21. Kanninen K, White AR, Koistinaho J, o.fl. Að miða á glýkógensyntasa kínasa-3 fyrir meðferðarávinning gegn oxunarálagi við Alzheimerssjúkdóm: þátttaka Nrf2-ARE leiðarinnar. Int J Alzheimers Dis 2011, 2011:985085.

22. Babizhayev MA, Strokov IA, Novikov VV, o.fl. Hlutverk oxunarálags í taugakvilla með sykursýki: Myndun sindurefna í sykursýkiviðbrögðum og fjölbreytni gena sem kóða andoxunarefnaensím fyrir erfðafræðilegt næmi fyrir taugakvilla með sykursýki í hópi sykursýkisjúklinga af tegund I. Cell Biochem Biophys 2015, 71: 1425-1443.

23. Volpe C, Villardelfino PH, Dos PA, o.fl. Frumudauði, hvarfefni súrefnistegunda (ROS) og fylgikvillar sykursýki. Cell Death Dis 2018, 9: 119-127.

24. Chen K, Zhang M, Chen BD, o.fl. Ginkgolide B hindrar frumudauða í æðaþelsfrumum í mönnum með háum glúkósaörvuðum naflabláæðum. Chinese Pharmacological Bulletin 2017, 33: 378-383.

25. Goldsteins G, Keksa-Goldstein V, Ahtoniemi T, et al. Skaðlegt hlutverk ofuroxíð dismutasa í hvatbera millihimnurýminu. J Biol Chem 2008, 283: 8446-8452.

26. Cowan KJ, hæð KB. Mítógenvirkjaðir próteinkínasar: nýjar boðleiðir sem virka í frumuviðbrögðum við umhverfisálagi. J Exp Bio 2003, 206: 1107.

27. Wu N, Lin X, Zhao X, o.fl. MiR-125b virkar sem krabbameinsgen í glioblastoma frumum og hindrar frumudapósu í gegnum p53 og p38MAPK óháða ferla. Brit J Cancer 2013, 109: 2853.

28. Shi L, Yu X, Yang H, o.fl. Háþróaðar lokaafurðir glýkunar örva frumudauða hornhimnuþekjufrumna manna með myndun hvarfgjarnra súrefnistegunda og virkjun JNK og p38 MAPK ferla. Plus One 2013, 8: e66781.

29. Chung H, Kim E, Lee DH, o.fl. Ghrelin hindrar frumudauða í taugafrumur undirstúku við súrefnis-glúkósaskort. Endocrinology 2007, 148: 148.

30. Palanivel K, Kanimozhi V, Kadalmani B. Verrucarin A breytir frumuhringsstjórnunarpróteinum og veldur frumudauða með hvarfgjarnri súrefnistegundaháðri p38MAPK virkjun í brjóstakrabbameinsfrumulínu MCF-7. Æxlislíffræði 2014, 35: 10159.

31. Hua X, Chi W, Su L, o.fl. Oxunaráverka af völdum ROS sem tekur þátt í meingerð sveppasýkingar með p38 MAPK virkjun. Sci Rep 2017, 7: 10421.

32. Mccubrey JA, Lahair MM, Franklin RA. Virkjun súrefnistegunda af völdum MAP kínasa boðleiða. Antioxid Redox Signal 2006, 8: 1775-1789.

33. Torres M, Forman H J. Redox merki og MAP kínasa ferlar. Biofactors 2003, 17: 287-296.

34. Chien CM, Yang SH, Yang CC, Chang LS, Lin SR. Hjartaeitur III framkallar c-jun N-enda kínasaháða frumudauða í HL-60 hvítblæðisfrumum úr mönnum. Cell Biochem Funct 2008, 26: 111-118.