Metformín verndar þekjufrumur linsu gegn öldrun í náttúrulega öldruðu múslíkani

Vinsamlegast hafðu sambandoscar.xiao@wecistanche.comfyrir meiri upplýsingar

KYNNING

Linsuþekjufrumur (LEC) mynda einlag af frumum sem klæðast framhlið linsunnar og ná til miðbaugs linsubogans [1, 2]. Eðlileg smíði og virkni LECs eru nauðsynleg til að viðhalda gagnsæi og efnaskiptajafnvægi allrar linsunnar[3]. Vaxandi vísbendingar benda til þess að öldrun LECs geti valdið breytingu, eðlisbreytingu og samsöfnun linsupróteina, þar með talið ensíma og kristalla, sem að lokum leitt til ógagnsæis linsu eða jafnvel drer [3-5]. Aldurstengdur drer (ARC) er enn helsta orsök sjónskerðingar og blindu, sem hefur alvarleg áhrif á lífsgæði eldri einstaklinga [6]. Eins og er eru engar árangursríkar aðferðir til að koma í veg fyrir framgang ARC. Þess vegna er nauðsynlegt að þróa lyfjafræðilega inngrip sem getur bætt gagnsæi linsunnar og seinkað framvindu ARC.

Undanfarna áratugi hafa vísindamenn náð ótrúlegum framförum í að bæta heilsu og lengja líftíma með því að nota nokkur erfðafræðileg, mataræði og lyfjafræðileg inngrip [7]. Metformin (MET) er eitt af þeim öldrunarlyfjum sem hafa verið rannsakað mikið. Umtalsverðar rannsóknir benda til þess að MET geti dregið úr öldrun og lengt heilbrigðan líftíma í ýmsum dýralíkönum. MET getur ekki aðeins lengt líftíma Caenorhabditis elegans heldur einnig aukið heilsu þess og lífsþrótt [8]. MET getur dregið úr aldurstengdri og oxunarálagstengdri uppsöfnun DNA skemmda í Drosophila midgut stofnfrumum til að lengja líftíma þeirra [9]. Fyrri rannsóknir benda einnig til þess að langvarandi lágskammta MET gjöf bætir heilsu og líftíma músa [10]. Þar að auki benda nýjar vísbendingar til þess að þegar sjúklingar með sykursýki eru meðhöndlaðir með MET, sýna þeir ávinning af lifun, jafnvel í samanburði við samanburðarhópa sem ekki eru með sykursýki [11].

Vinsamlegast smelltu hér til að vita meira

Til viðbótar við lífstímahvetjandi virkni MET í ýmsum líkanlífverum, miðar MET á margar frumumerkjaleiðir til að bæta aldurstengda sjúkdóma. Sýnt hefur verið fram á að MET stýrir sjálfsát aðallega með virkjun adenósínmónófosfats (AMPK) og kemur í veg fyrir taugahrörnun og taugabólgu til að gegna taugaverndandi hlutverki við Parkinsonsveiki [12]. Að sama skapi bætir MET aldurstengdar breytingar á sinusoidal æðaþelsfrumum lifrar með AMPK og æðaþels nituroxíðferlum [13].cistanche skammtur redditÞar að auki kemur langvarandi AMPK virkjun með MET í veg fyrir hjartavöðvakvilla með því að hækka sjálfsát í OVE26 músum með sykursýki [14]. Að auki dregur MET úr aldurstengdri skerðingu á hjarta- og æðakerfi með því að auka sjálfsát og kaloríutakmörkun [15]. Ennfremur getur MET-meðferð hamlað aldurstengdri æðakölkun í ApoE-7-músum og kanínum af völdum fituríkrar fæðu, komið verulega í veg fyrir kalkkölkun æðakölkun, dregið úr C-hvarfandi próteinmagni af mikilli næmni og bæla niður virkjun kjarnaþátt kappa B(NF-kB) ferill í æðum [16-18].

Byggt á þessum athugunum reyndi þessi rannsókn að kanna hvort MET geti seinkað ARC öldrun og undirliggjandi sameindakerfi. Niðurstöður okkar eru sem hér segir: (i) langvarandi lágskammta MET meðferð seinkaði öldrun LECs í náttúrulega öldruðum músum og hindraði þar með ógagnsæi linsu; (i) AMPK ferillinn var óvirkur og sjálfsátflæði var skert í öldruðum LECs;(i ) langvarandi lágskammta MET-meðferð seinkaði öldrun LECs í náttúrulega öldruðum músum með því að virkja AMPK ferlið og auka sjálfsát. Niðurstöður okkar rökstyðja meint hlutverk MET gegn öldrun og gefa fullnægjandi vísbendingar um að MET gæti reynst mögulegur meðferðarkostur fyrir ARC.

NIÐURSTÖÐUR

Öldrunarstig LECs tengdist ARC í náttúrulega aldrinum músum

Margar hugsanlegar aðferðir ARC, þar á meðal áhrif öldrunar, hafa verið rannsakaðar ítarlega.cistanche þykkni kostir,Hins vegar eru tengslin milli öldrunar LECs og ARC in vivo óljós. Við gerðum þá tilgátu að öldrun LECs gæti leitt til ARC in vivo. Þess vegna smíðuðum við músarlíkan af ARC. Niðurstöður okkar leiddu í ljós að gagnsæi linsunnar í náttúrulega aldrinum músum (eldri músum) minnkaði verulega samanborið við samanburðarhópinn (ungar mýs) (Mynd 1a). Eins og sést á mynd 1b var tíðni drer í náttúrulega öldruðum hópnum 95,23 prósent. H&E litunarpróf benti til þess að LECs í samanburðarhópnum voru kringlótt í laginu og raðað reglulega, og þéttleiki venjulegra LECs var tiltölulega hár, en LECs náttúrulega aldraða músanna voru flatir í lögun og raðað ójafnt, og þéttleiki LECs á öldrunarstigi voru verulega lækkaðir (Mynd 1c). Að auki sýndi SA- -Gal litun að hlutfall aldraðra LECs var hækkað í náttúrulega aldrinum músum (mynd 1d). Ennfremur greindum við próteintjáningu öldrunartengdra merkja með IHC litun og Western blot greiningu. IHC litun leiddi í ljós að tjáning p21 og p53 var aukin í LECs á náttúrulega aldri músum samanborið við unga mús (mynd 1e, f). Á sama hátt uppgötvuðum við frekar að próteintjáning p21 og p53 var hærri í linsuhylkjum náttúrulega aldraða músa en í linsuhylkjum ungra músa (mynd 1g). Þessar niðurstöður bentu til þess að öldrun LECs tengdist ARC í náttúrulegum aldri músum.

Cistanche getur gegn öldrun

Langvarandi lágskammta MET gjöf bætti gegnsæi linsunnar og létti öldrun LECs Áður en við prófuðum áhrif metformíns á ARC, ákváðum við hvort langvarandi lágskammta MET gjöf væri örugg fyrir mús. Eftir MET-meðferð í 10 mánuði dóu 28 mýs (18 í náttúrulega aldraða hópnum og 10 í MET hópnum) af náttúrulegum orsökum. Við komumst að því að lifandi mýs í báðum hópum voru heilbrigðar og ekki var marktækur munur á líkamsþyngd og líffæraþyngd milli beggja hópa (tafla 1). Þess vegna bentu þessar niðurstöður til þess að skammturinn af metformíni sem notaður var í rannsókninni væri öruggur fyrir dýrin og gæti verið notaður í síðari tilraunir.

Í kjölfarið var langvarandi lágskammta MET gefinn til að meta hvort MET gæti hamlað ógagnsæi linsu og létta aldurstengda öldrun LECs í náttúrulega öldruðum músum. Eins og búist var við var gagnsæi linsunnar í MET hópnum verulega bætt samanborið við gagnsæi linsunnar í náttúrulega aldraða hópnum (Mynd 2a). Að auki staðfestu formfræðilegar athuganir að linsa MET hópsins sýndi minnkun á ógagnsæi. Tíðni drer í náttúrulega öldruðum hópnum var 95,23 prósent, en í MET hópnum var 19,00 prósent (Mynd 2b). H&E litunarpróf leiddi í ljós að þéttleiki LECs í MET hópnum var áberandi hærri en það í náttúrulega aldraða músunum (mynd 2c). Þar að auki voru LECs í MET hópnum tiltölulega kringlótt í lögun samanborið við hópinn sem var á náttúrulega aldrinum (Mynd 2c). SA- -Gal litun sýndi að hlutfall öldrunar LECs var marktækt lækkað í MET hópnum samanborið við það í náttúrulega aldrinum hópnum (Mynd 2d). IHC greining leiddi í ljós að tjáning p21 og p53 minnkaði meira í LECs í MET hópnum en í náttúrulega aldrinum hópnum (Mynd 2e, f). Að sama skapi leiddi Western blot greining í ljós að próteintjáning p21 og p53 var ótrúlega minnkuð í linsuhylkjum MET hópsins samanborið við þau sem voru á náttúrulega aldrinum (Mynd 2g). Þessar niðurstöður gáfu til kynna að langvarandi lágskammta MET gjöf gæti bætt gagnsæi linsunnar og dregið úr öldrun LECs.

Langvarandi lágskammta MET gjöf dregur úr öldrun LECs í náttúrulega öldruðum músum með AMPK virkjun. Yfirgnæfandi magn af gögnum styður þá niðurstöðu að virkjun AMPK sé nægjanlegt til að lengja líftíma líkana lífvera, og eykur aðdráttarafl þess sem langlífismarkmið [19,20] . Með hliðsjón af þessari kenningu, metum við tjáningu AMPK ferilsins í LECs músa. Hlutfallslegt FAS mRNA magn var lækkað í náttúrulega aldrinum hópnum og hækkað í MET hópnum (mynd 3a). Eins og sýnt er á mynd 3b,c minnkaði tjáning fosfórýleraðs AMPKa (Thr172) og fosfórýleraðs ACC (Ser79) í LECs náttúrulega aldraða músa samanborið við ungra músa. Hins vegar var tjáning fosfórýleraðs AMPKa (Thr172) og fosfórýleraðs ACC (Ser79) hækkuð í LECs í MET hópnum samanborið við þær hjá náttúrulega aldraða hópnum. Að auki leiddi Western blot greining í ljós að próteintjáning fosfórýleraðs AMPKa(Thr172) og fosfórýleraðs ACC (Ser79) var marktækt lækkað í linsuhylkjum náttúrulega aldraðra, og próteintjáning fosfórýleraðs AMPKa (Thr172) og ACC (fosfórýleraðs) Ser79) var aukið í linsuhylkjum MET hópsins (Mynd 3d). Þessar upplýsingar leiddu í ljós að AMPK leiðin var óvirkjuð í LECs á náttúrulega aldrinum músum. Ennfremur dró langvarandi lágskammta MET gjöf öldrun LECs í náttúrulega aldrinum músum með AMPK virkjun.

Langvarandi lágskammta MET gjöf endurheimti sjálfsátsflæðið til að draga úr öldrun LECs í náttúrulega öldruðum músum. Fyrri rannsóknir hafa gefið til kynna að sjálfsát gæti gegnt mikilvægu hlutverki í baráttunni gegn skaðlegum áhrifum öldrunar [21,22]. Til að greina frekar sameinda- og frumubreytingar í linsunni eftir MET meðferð, ákváðum við tjáningu LC3 og p62 vegna þess að þau eru almennt viðurkennd sem lífmerki um stig sjálfsáts. Eins og sýnt er á mynd 4a var hlutfallslegt p62 mRNA tjáningarstig aukið marktækt í náttúrulega aldraða hópnum samanborið við samanburðarhópinn; Hins vegar var hlutfallslegt mRNA tjáningarstig p62 verulega lækkað í MET hópnum samanborið við það í náttúrulega aldraða hópnum.cistanche Genghis KhanAð auki leiddi IHC litun í ljós að magn örpípla tengdra próteins 1 léttri keðju 3(LC3-II/l) og p62 var aukið í LECs náttúrulega aldraða músa. Ennfremur sýndu niðurstöður okkar að magn LC3-II/l og p62 var ótrúlega lækkað í LECs í MET hópnum (mynd 4b, c). Próteinmagn LC3-ll og p62 var verulega aukið í linsuhylkjum náttúrulega aldraða hópsins (Mynd 4d). Í heildina veltum við því fyrir okkur að sjálfsáfallsflæði væri skert í LECs náttúrulega aldraða músa og hægt væri að endurheimta það með langvarandi lágskammta MET gjöf til að draga úr öldrun LECs í náttúrulega öldruðum músum.

UMRÆÐA

Ómeðhöndlað drer er leiðandi orsök blindu um allan heim sem einkennist af ógagnsæi á kristalla linsunni [23]. Faraldsfræðilegar rannsóknir hafa sýnt að aldur er ríkjandi áhættuþáttur fyrir drer, þekktur sem ARC, og eina meðferðin er skurðaðgerð [24]. Fyrri rannsóknir hafa sýnt að öldrun LECs er aðalorsök ARC [25]. Hingað til hafa engin áhrifarík meðferðarefni verið til til að hindra skýjun linsunnar og draga úr öldrun LECs án óæskilegra aukaverkana. Áhersla þessarar rannsóknar var að meta sameindalíffræðilegan grunn fyrir öldrun LECs og aðferð til að vernda eðlilega LECs gegn öldrun. Niðurstöður okkar leiddu í ljós að óvirkjun AMPK og skerðing á sjálfsáhrifum tengdist öldrun LECs og ARC. Ennfremur komumst við að því að MET gæti verndað LECs gegn öldrun og hamlað skýjun linsunnar með því að virkja AMPK og auka sjálfsát.

Öldrun er grundvallar líffræðilegt ferli sem fylgir almennri hnignun á starfsemi vefja. Þegar líftíminn eykst verða aldurstengdar truflanir eins og ARC alvarleg heilsu

mál [26]. Greint hefur verið frá því að öldrun LECs eigi þátt í tilkomu og þróun ARC [5]. Niðurstöður okkar leiddu í ljós að LECs náttúrulega aldraða músanna voru flatir í lögun og raðað ójafnt og þéttleiki LECs minnkaði verulega (mynd 1c, d). Að auki var tjáning öldrunartengdra gena (p21 og p53) uppstýrt í LECs á náttúrulega öldruðum músum (mynd 1e, f, g). Niðurstöður okkar gáfu til kynna að öldrun LECs tengdist tilkomu og þróun ARC. Þess vegna gæti verið þörf á nákvæmum skilningi á sameindaháttum sem liggja að baki öldrun LECs til að veita rökstuðning fyrir nýjum meðferðaraðferðum.

MET er mest ávísað blóðsykurslækkandi lyf til inntöku fyrir sykursýki af tegund 2 um allan heim. Nýjar vísbendingar benda til þess að MET hafi jákvæð áhrif á heilsu umfram þau sem tengjast bata á blóðsykri [27]. Það hefur verið staðfest að aðferðir MET eru mikilvægar til að miða á grundvallarleiðir í líffræðilegri öldrun, svo sem að virkja AMPK, auka sjálfsát, hamla bólgu og hafa andoxunaráhrif [28]. Hjá mönnum hefur MET verið notað í klínískri starfsemi í meira en 60 ár; það hefur mikla öryggissnið og er einstaklega í stakk búið til að grípa inn í nokkrar mikilvægar leiðir sem bera ábyrgð á öldrun og aldurstengdum sjúkdómum. Hins vegar hefur aldrei verið greint frá áhrifum MET á ARC og eftirlitskerfi þessara áhrifa. Þar af leiðandi, í rannsókn okkar, bætti langvarandi lágskammta MET gjöf í náttúrulega eldri músum gagnsæi linsunnar (mynd 2a) og dregur úr öldrun LECs in vivo (mynd 2).

Það er almennt viðurkennt að MET virkjar AMPK ferlið sem er hugsanlegur gangur MET til að hafa áhrif gegn öldrun [29]. AMPK, frumuorkuskynjari, gegnir mikilvægu hlutverki við að stjórna orkujafnvægi frumna [30]. Nokkrar rannsóknir hafa sýnt að AMPK þjónar sem samþætting og miðlari nokkurra leiða og ferla sem tengja orkufræði við langlífi. Í rannsókn okkar komumst við að því að óvirkjun AMPK var eiginleiki aldraðra LECs í náttúrulega aldrinum músum (Mynd 3). Í kjölfarið var sýnt fram á að MET örvaði AMPK leiðina til að koma í veg fyrir öldrun LECs (mynd 3). Sem rótgróinn AMPK virkjari er hlutverk MET í að koma í veg fyrir öldrun almennt rakið til áhrifa þess á mótun niðurstreymis boðleiða, svo sem endurheimt sjálfsáts, virkjun Sirt1 og Foxo1 og bælingu mTOR [31,32]. Rannsóknin okkar gaf nýja vísbendingarlínu sem lagði áherslu á mikilvægi AMPK virkninnar sem virkjað er af MET til að koma í veg fyrir tilvik ARC.

Eins og getið er hér að ofan hefur AMPK samskipti við fjölmargar leiðir og prótein til að hafa áhrif gegn öldrun, þar á meðal aukningu á sjálfsát. Autophagy, sem er að koma fram sem kjarnaferli til að tryggja langlífi, hefur vakið víðtækan áhuga sem hugsanlegt meðferðarmarkmið fyrir aldurstengda sjúkdóma. Autophagy er fljótandi, margra þrepa flókið líffræðilegt ferli. Heildarferlið sjálfsáfalls er kallað sjálfsátflæði, sem er mikið notað til að endurspegla stig sjálfsáfalls. Sem vísbending um sjálfsát, er LC3-Il þétt bundið við sjálfsáthimnuna sem er brotin niður af lysosomalensímum.cistanche líflengingÁ sama hátt er p62, sem er sjálfsátssértækt hvarfefni, venjulega niðurbrotið í sjálfsátsfrumum og tjáning þess endurspeglar óbeint magn sjálfsáts. Í þessari rannsókn gáfu niðurstöður okkar í skyn að magn sjálfsáts minnkaði greinilega hjá öldruðum LECs (mynd 4), en MET sneri við aldurstengdri skerðingu á sjálfsát (Mynd 4). Sameindakerfi gegn öldrun MET er rakið til aðalhlutverks AMPK í frumum vegna þess að það eykur almennt sjálfsát með AMPK virkjun [33]. Þar að auki er sýnt fram á að MET eykur sjálfsát beint og stuðlar þannig að því að koma í veg fyrir öldrun [34]. Hins vegar er þörf á ítarlegri rannsóknum til að skýra undirliggjandi kerfi, sem sannar að MET eykur sjálfsát í gegnum sjálfstæða eða háða AMPK leið.

Sýnt hefur verið fram á að algengi ARC hefur ekki verið tengt kynlífi í hópum af asískum uppruna [35, 36]. Þess vegna litum við ekki á kynlíf sem þátt sem gæti haft áhrif á ARC. Rannsókn okkar ætti að túlka með hliðsjón af ofangreindum takmörkunum.

NIÐURSTAÐA

Í stuttu máli sönnuðum við að óvirkjun AMPK ferilsins og aldurstengd skerðing á sjálfsát gæti stuðlað að öldrun LECs og tilvik ARC. Að auki leiddu gögn úr tilraunum okkar í ljós að MET tafði í raun öldrun LECs og myndun ARC með virkjun AMPK ferilsins og aukningu á sjálfsát. Niðurstöður okkar eru grunnlína fyrir frekari rannsóknir á sameindaháttum sem eru gagnlegar í hlutverki MET á öldrunarferli ARC og munu vera upplýsandi fyrir ítarlegri rannsóknir á þróun nýrra aðferða gegn tilvist og þróun ARC.

EFNI OG AÐFERÐIR Hvarfefni

MET var keypt frá Bristol-Myers Squibb Company (Kína). Mótefni gegn p21 (ab188224), p53 (ab131442), fosfórýleruðu AMPKa(p-AMPK)(Thr172)(ab133448), AMPKa1(ab32047), -aktíni (ab8226) og SQSTM1/p62 (3340-1) voru fengin frá Abcam (MA, Bandaríkjunum). Mótefni gegn LC3 (12741) og fosfó-asetýl CoA karboxýlasa (p-ACC)(Ser79)(3661) voru keypt frá Cell Signaling Technology ( MA, Bandaríkjunum).

Dýr og meðferð

Karlkyns C57BL6J mýs sem voru 3 og 8 mánaða gamlar voru keyptar frá Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd. (Beijing, Kína). Mýsnar voru geymdar við hitastýrðar (hitastig, 20-25 gráður og hlutfallslegur raki, 55±15 prósent) aðstæður með 12 klst ljós/myrkri hringrás, með frjálsan aðgang að mat og vatni. Allar aðferðir og samskiptareglur sem gerðar voru á dýrum voru samþykktar af siðanefnd Harbin Medical University.

Músunum var skipt í eftirfarandi þrjá hópa: (i) samanburðarhópur með unga mús (3 mánaða gamlar, líkamsþyngd =29,72± 1,66 g, n =40) fengu staðlað hreinsað músafæði og vatn ad libitum; Þegar mýsnar voru 10 mánaða gamlar var 120 músum skipt af handahófi í tvo hópa: náttúrulega aldurshóp og MET hóp. (i) hópur sem er á náttúrulega aldri (eldri mýs, 20 mánaða, líkamsþyngd=32.98±1.93g, n=60) fékk staðlað hreinsað músafæði og vatn að vild;(ii)MET hópur ( 20 mánaða gömul, líkamsþyngd=31.21±2,81 g,n=60) var haldið á venjulegu hreinsuðu músafæði og vatni þar til mýsnar náðu 10 mánaða aldri; að því loknu hófust meðferðir. Mýs í MET hópnum fengu fæði sem bætt var við 0,1 prósent MET (Bristol Myers Squibb, Kína) og vatni að vild í 10 mánuði.

einangrun á linsum og linsuhylki

Mýsnar voru aflífaðar með leghálsi. Allt augað var strax skorið úr öllum tilraunadýrum og sett í dauðhreinsað saltvatn. Sjóntaugin var sett upp á við og fest með pincet. Þá var skurður gerður á sjóntauginni sem fer inn í augað og herðablaðið dregið til baka til að afhjúpa linsuna.cistanche nzÍ framhaldi af því notuðum við pincet til að fjarlægja varlega brot úr brjóstholinu sem fest var við miðbaugsplan linsunnar. Myndir af fersku linsunni voru strax teknar og linsan var fljótt fest með 4 prósent paraformaldehýði við stofuhita. Öll linsuhylkin voru fljótt afhýdd af linsunni sem eftir var, snöggfryst í fljótandi köfnunarefni og geymd við 80 gráður C fyrir síðari tilraunir.

Hematoxýlín og eósín (H&E)

Ferska linsan var strax fest með 4 prósent paraformaldehýði við stofuhita og felld inn í paraffín. Til vefjafræðilegrar skoðunar voru vefirnir skornir í 4-μm sneiðar. Eftir afparaffínvæðingu og endurvötnun voru tilbúnir paraffínhlutar litaðir með hematoxýlín (H) lausn í 8 mínútur, fylgt eftir með 5 dýfum í 1 prósent súrt etanól (1 prósent HCI í 70 prósent etanóli)

og skola með eimuðu vatni. Í kjölfarið voru sneiðarnar litaðar með eósín (E) lausn í 3 mínútur, fylgt eftir með þurrkun með flokkuðu alkóhóli og hreinsun með xýleni. Formfræðilegar breytingar sáust í smásjá (Nikon, Eclipse, Japan).

Öldrunartengd -galaktósíðasa (SA- -Gal) greining Æðrunartengd -galaktósíðasa (SA- -Gal)virkni var mæld með því að nota SA- -Gal litunarsett (Sigma, CS{ {12}}030). Samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda voru vefjasneiðarnar, eftir röð meðferða, þvegnar með fosfat-bufferðu saltvatni (PBS) í 5 mínútur (þrisvar) og síðan ræktaðir í SA- -gal litunarlausn (pH 6,0) við 37 gráður án CO2 í 24 klst. Myndirnar voru teknar undir ljóssmásjá (Nikon, Eclipse, Japan). Hlutfall SA- -gal-jákvæðra frumna var metið sem meðalfjöldi jákvæðra frumna/meðalfjöldi heildarfrumna.

Magntíma pólýmerasa keðjuverkun (gRT-PCR) Heildar-RNA úr linsuhylkjum músa var dregið út með því að nota TRlzol hvarfefnið. Öfug umritun var framkvæmd með ExScript RT Reagent Kit (Invitrogen). Magnbundin öfug umritun-pólýmerasa keðjuverkun (qRT-PCR) greining var framkvæmd með því að nota SYBR Green Supermix

sett (Takara, Tókýó, Japan), með -aktíni sem innræna stjórn. Umritunin var rannsökuð fyrir nokkrum markgenum, þar á meðal FAS (áfram, 5'-TTGCTGGCACTACAGAATGC-3'og afturábak,5'-AACAGCC TCAGAGCGACAAT-3'), p62 (áfram,5'-GGCGCACTACCGCGATGAGGA{{ 10}} og afturábak,5'-TGTTCCCGCCGGCACTCCTT-3') og -aktín (áfram, 5 '-TCGTGGGCCGCCCTAGGCAC-3'og afturábak,5'-TGGCCTTAGGGTTC AGGGGGG-3'. stig hverrar genatjáningar voru

aðferð. staðlað í -aktín og reiknað með 2-△△ct r ónæmisvefjaefnafræðilegri (IHC) litun. Alls voru 5 dæmigerðir hlutar úr hverri af 10 völdum linsum í hverjum hópi notaðir fyrir ónæmisvefjaefnafræðilega (IHC) greiningu til að meta tjáningu p21, p53, p-AMPK, p-ACC, LC3 og p62. Eftir að tilbúnu sýnin voru ræktuð við 60 gráður í 2 klst, voru þau látin fara í gegnum xýlen og flokkaða alkóhólsröð til afparaffínhreinsunar. Í kjölfarið voru sýnin soðin í 0,1 M af sítrónusýru (pH 6,1) í 30 mínútur og kæld niður í stofuhita. Eftir þvott þrisvar með PBS voru sýnin bleytt með 0,3 prósent HO, til að hindra innræna peroxidasavirkni. Í kjölfarið var aðal mótefnum bætt við og kælt við 4 gráður C, yfir nótt. Samsvarandi aukamótefni voru ræktuð í 1 klst við 37 gráður C. Eftir þvott með PBS voru sýnin ræktuð í díamínóbensídíni (DAB) þar til æskilegur litastyrkur þróaðist. Myndir af ónæmislituðu frumunum voru teknar með Nikon Eclipse smásjá (Nikon, Eclipse, Japan).

Western blot greining

Heildarprótein úr linsuhylkjum músa var dregin út með því að nota radio-immunoprecipitation assay (RIPA) buffer með próteasahemla kokteil (Pierce, Bandaríkjunum), og bicinchoninic acid (BCA) sett (Thermo Fisher Scientific, USA) var notað til að mæla próteinstyrkinn . Heildarpróteinið (40 ug) var greint með því að nota natríumdódecýlsúlfat-pólýakrýlamíð hlaup rafdrætti (SDS-PAGE) og flutt með rafhleðslu á pólývínýlíden tvíflúoríð síu (PVDF) himnur (Millipore, Þýskalandi). Himnurnar voru ræktaðar yfir nótt með frummótefni við 4 gráður C. Daginn eftir voru himnurnar ræktaðar með samsvarandi aukamótefnum í 1 klst við 37 gráður C. Ónæmisvirku böndin voru sýnd með því að nota efnaljómandi hvarfefnisaðferðina með Super Signal West Pico sett (Pierce Biotechnology, Bandaríkjunum). Gerðar voru þrjár sjálfstæðar tilraunir.

tölfræðigreining

Gögnin voru gefin upp sem meðaltal±staðalfrávik (SD). Tölfræðilegar greiningar voru gerðar með því að nota GraphPad Prism 7.0 hugbúnaðinn og Microsoft Excel. Prótein var magnmælt með Image J hugbúnaðinum. T-próf ​​nemandans og dreifnigreining (ANOVA) voru notuð til að reikna út tölfræðilega marktekt tilraunagagnanna. Mismunur með P-gildi<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" experiments="" were="" repeated="" independently="" at="" least="" three="">

FÁLÆGT gagna

Gagnasöfnin sem notuð voru og greind í yfirstandandi rannsókn eru innifalin í þessari birtu grein.

Þessi grein er dregin út af www.nature.com/cddiscovery