Metformín bætir stofnfrumum úr fitu úr mönnum með niðurmótun
Jul 14, 2022
Vinsamlegast hafðu sambandoscar.xiao@wecistanche.comfyrir meiri upplýsingar
Ágrip:Fituvefur gegnir mikilvægu hlutverki við að stjórna efnaskiptajafnvægi með því að geyma umfram fitu og vernda önnur líffæri gegn fitueitrun. Öldrun tengist miðlægri endurdreifingu fitu, sem nær hámarki í minnkun á insúlínviðkvæmum undirhúð og aukningu á insúlínþolnum fitu í innyflum. Fituafleiddar stofnfrumur (ASC) gegna mikilvægu hlutverki í endurnýjun fituvefs. Aldraðir ASC sýna minnkað stöng og endurnýjunarmöguleika vegna uppsöfnunar oxunarálags og truflunar á starfsemi hvatbera sem tengjast frumuskemmdum. Metformin er rótgróið sykursýkislyf sem hefur sýnt öldrunaráhrif í mismunandi lífverum og dýralíkönum. Í þessari rannsókn greindum við áhrif metformínmeðferðar á stofnhlutfall ASCs úr mönnum í frumuræktun og heilum fituvefsræktunarlíkönum. Niðurstöður okkar sýna að metformín bætir stífni ASCs, dregur úr útbreiðsluhraða þeirra og aðgreiningu fitufrumna. Við að rannsaka mögulegan undirliggjandi verkunarhátt sáum við lækkun á mTOR og ERK virkni í ASC sem fengu metformín. Að auki sáum við aukningu á sjálfsátvirkni við metformínmeðferð. Við komumst að þeirri niðurstöðu að metformínmeðferð bætir stöngleika ASCs með því að draga úr mTOR og ERK-merki og auka sjálfsát. Framtíðarmat í lífverum í dýralíkönum og mönnum mun greiða brautina fyrir klíníska aðlögun þessa rótgróna lyfs til að endurvekja stofnfrumur aldraðra stofnfrumna.
Vinsamlegast smelltu hér til að vita meira
Leitarorð:fitustofnfrumur; fituvef; stilkur; aðgreining; fjölgun; metformín;mTOR; ERK; sjálfsáfall
1. Inngangur
Fituvefur er kraftmikið líffæri sem stuðlar að mikilvægu jafnvægishlutverki við að stjórna næringarefnajafnvægi, insúlínnæmi og mótun ónæmis. Fituvefur gegnir þessu hlutverki með því að geyma og oxa umfram fitusýrur og koma þannig í veg fyrir fituhrörnun og fitueiturhrif í öðrum líffærum [1]. Aldurstengd insúlínviðnám er algengasti efnaskiptasjúkdómurinn. Um það bil 25 prósent bandarískra íbúa yfir 65 þjást af sykursýki, sem leiðir til hærri dánartíðni, skertrar virkni, aukinnar hættu á sjúkrahúsvist og óhóflegrar álags á heilsuhagkerfið [2]. Þrátt fyrir að tengslin milli sykursýki og offitu hafi lengi verið viðurkennd, eru tengslin milli öldrunar og sykursýki af tegund 2 enn óljós [3]. Fyrsta athugunin sem tengir minnkun á glúkósaþoli við öldrun var gerð árið 1921 [4]. Nokkrar rannsóknir hafa síðan bent á minnkað insúlínnæmi sem aðalorsök aldurstengdrar skerðingar á glúkósaefnaskiptum [5,6]. Byggt á líffærafræðilegri staðsetningu er hægt að skipta fituvef í stórum dráttum í tvær geymslur: fitugeymslur undir húð og innyflum. Staðsetning og virkni fituvefsgeymslunnar er mikilvæg með tilliti til insúlínnæmis; til dæmis er innyflum ónæmari en undir húð er næmari fyrir insúlíni [7]. Aldurstengt smám saman tap á rúmmáli fituvefs undir húð leiðir til minni upptöku glúkósa og lípíðs, sem leiðir til lípíðflæðis og utanlegsútfellingar lípíða í vöðva og lifur, sem stuðlar að þróun insúlínviðnáms [8].
Fituvefur er samsettur úr mismunandi frumugerðum. Ensímmelting fituvefs með kollagenasa framleiðir tvo meginhluta: fitufrumubrotið og æðaæðabrotið (SVF)[9]. SVF samanstendur af fitu-afleiddum stofnfrumum (ASC), eitilfrumum, æðaþelsfrumum, pericytes og fibroblasts [10]. ASC eru skilgreind ónæmissvipgerðar sem CD34 plús CD90 plús CD29 plús CD45-CD31 frumur af mesenchymal uppruna, sem sýna þríættar aðgreiningargetu í bein, brjósk eða fitu [11,12]. Í hvítum fituvef búa þessar frumur aðallega í æðum í kringum litlar æðar og geta fjölgað sér og aðgreint sig í fitufrumur[11]. Fituafleiddar stofnfrumur (ASC) gegna mikilvægu hlutverki í endurnýjun fituvefs með því að gangast undir fjölgun, sjálfsendurnýjun og aðgreiningu. Öldrun tengist tapi á þessum stofneiginleikum í ASCs [13,14]. Talið er að aldurstengd minnkun á stærð fitu undir húð sé vegna breyttrar afritunar og aðgreiningar á ASC[15-17]. Findeisen o.fl. benda til uppsöfnunar á oxunarálagi í fituvef við öldrun, sem hefur neikvæð áhrif á aðgreiningargetuna; [15] Hins vegar er nákvæmlega aðferðin(ir) sem liggja til grundvallar tapi á stöngli í ASCs ekki skilinn. Nýlegar rannsóknir hafa sýnt að minnkuð sjálfsát, hærra vélræn markmið rapamýsíns (mTOR) ferlavirkni og uppsöfnun hvarfgefna súrefnistegunda (ROS) eru tengd tapi á stöngli í ASC og ótímabærri öldrun í ASC [18-20].
Cistanche getur gegn öldrun
Metformín er sykursýkislyf sem almennt er notað til að lækka blóðsykur og bæta insúlínnæmi. Það er hægt að nota til að meðhöndla margs konar öldrunartengda efnaskiptasjúkdóma, eins og hjarta- og æðasjúkdóma, krabbamein og vitræna hnignun [21,22]. Sýnt hefur verið fram á langlífsbætandi áhrif metformíns hjá ormum, músum og rottum með takmörkun á mataræði, sem líkir eftir áhrifum örvunar adenósínmónófosfatvirkjaðar próteinkínasavirkni (AMPK) [23]. Ýmsar rannsóknir hafa sýnt að metformín hamlar spendýramarkmið rapamýsíns (mTOR) [24,25]. AMPK-mTOR boðleiðir stjórna sérstaklega einkennum frumuheimaostasa, svo sem sjálfsát, útbreiðslu, orkuefnaskipti og próteinmyndun [26]. Sýnt hefur verið fram á að metformín hamlar fjölgun, aðgreiningu og bólgu, dregur úr oxunarálagi og hvatberagetu og bætir heildarstofn í mismunandi gerðum fullorðinna stofnfrumna [27,28]. Áhrif metformíns á efnaskipti og stofnstig ASCs in vitro og in vivo eru ekki ljós.
Í þessari rannsókn notuðum við 2D ræktun á ASC úr mönnum og alls kyns fituvefsræktunaraðferðir manna til að líkja eftir frumuskipulagi in vivo og örumhverfi vefja. Með því að nota þessi tilraunalíkön, rannsökuðum við áhrif metformínmeðferðar á aðgreiningu, fjölgun og stofnstig ASCs og könnuðum sameindakerfin sem taka þátt í þessum frumuferlum.
2. Efni og aðferðir
2.1.Forskriftir gjafa
Fituvef var safnað frá fimm kvenkynsgjöfum sem ekki voru með sykursýki á aldrinum 39±13 og BMI bilinu 27 ± 4 sem gengust undir valbundnar lýtaaðgerðir við háskólann í Pittsburgh Medical Center (UPMC). Aðferðin við vefsöfnun var samþykkt af University of Pittsburgh Institutional Review Board (IRB nr.0511186).
2.2. Einangrun og ræktun ASC manna
Fituforefnisfrumurnar voru einangraðar sem hér segir [19,29]. Vefjasýni úr fituvef eftir skurðaðgerðir voru fluttar á rannsóknarstofuna í sæfðu lokuðu íláti. Vefur var skolaður með Dulbecco's fosfat-bufferðu saltvatni (PBS; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) og síðan var fjarlægt trefjaefni og æðar með krufningu. Vefurinn var skorinn í bita (1-2 mg) og meltur í meltingarbuffi (HBSS sem innihélt 200 U/mL kollagenasa (CLS Type II, Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NI) , USA) og 2 prósent án BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)) undir hræringu í 60 mínútur við 37 gráður; 1 mg fituvef/3 ml meltingarjafna. Dreifði vefurinn var skilinn í skilvindu í 10 mínútur við 200xg við stofuhita. Fljótandi fitufrumum var sogað út og kögglaðar frumur æðaæðahlutfallsins (SVF) voru sviflausnar í rauðkornalýsubuffi (0,155 M NH4CI, 5,7 mM K2HPO4, 0,1 mM EDTA, pH 7,3) og ræktaðar í 10 mínútur við stofuhita. Til að fjarlægja vefjarusl var frumusviflausnin síuð í gegnum nylon möskva (holustærð 100 um; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Bandaríkjunum). Eftir annað skilvinduþrep (10 mín við 200×g) var kögglaða SVF dreift í ASC miðli (Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)/F-12 medium (1:1) með HEPES og L-glútamíni (Thermo Fisher) Scientific, Waltham, MA, Bandaríkjunum), bætt við 33 μM bíótíni (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Bandaríkjunum), 17 μM pantóþenati (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, Bandaríkjunum), 10ng/mL EGF,1 ng/ml bFGF, 500 ng/ml insúlín, 2,5 prósent nautgripasermi og 12,5 μM/mL gentamicin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og sáð í þéttleika 50,000 frumur /cm2 í T175 flöskum.
Eftir að hafa náð 70 prósent samruna voru frumurnar þvegnar með PBS og trypsíngerðar með því að nota 0,05 prósent trypsin-EDTA 1x lausn (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA). Trypsín var óvirkt með því að bæta við ASC miðli auk 10 prósenta FBS og fjarlægt með skilvindu við 300×g í 5 mínútur áður en frumunum var sáð í þéttleikanum 5000 frumur/cm². ASC var aftur stækkað í 70 prósent samruna áður en þau skiptust. ASCs í leiðum 3-4 voru notuð í þessari rannsókn. Frumur voru meðhöndlaðar með mismunandi styrk af metformíni (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, Bandaríkjunum), rapamýsíni (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Bandaríkjunum), eða U0126 hemli samkvæmt tilraunaáætluninni.
2.3. Adipogenic aðgreining
Til að framkalla fitumyndun voru ASCs sáð í þéttleikanum 50,000 frumur/cm² í 6-brunn frumuræktunarplötum. Adipogenesis var framkallað með því að nota aðgreiningarmiðil, sem samanstendur af 0.2 uM insúlíni (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Bandaríkjunum),0.5 mM 1-metýl{{9 }}ísóbútýlxantín （IBMX） （Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Bandaríkjunum）, 0,25 μM dexametasón （Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Bandaríkjunum） og 10 ug/mL transferrin （Sigma, St. Louis, MO, Bandaríkjunum) í ASCmedium. Eftir 3 daga aðgreiningu var skipt um miðil og frumurnar ræktaðar í aðgreiningarmiðlinum án IBMX í 14 daga.
2.4.Fituvefjamenning
Fituvefsræktun var framkvæmd í 6-brunnfrumuræktunarplötum, með nokkrum breytingum, eins og birt var af Harms o.fl. [30]. Heilur fituvef var saxaður í smærri bita 3-5 mm að stærð og ræktaður í 5 ml frumuræktunarmiðlum. Frumusigtar með 70 μM holastærð voru hafðar yfir vefjabrotunum til að halda vefnum á kafi í miðli. Vefbrotin voru melt með kollagenasa, eins og útskýrt er hér að ofan fyrir ASCs einangrunaraðferðina, og SVF var greint með tilliti til tjáningar á ASC-tengdum stofngenum.
2.5. Olíurautt O litun
Til að sjá fyrir lípíðdropa voru frumur festar með 4 prósent paraformaldehýði í PBS í 1 klst og litaðar með 0,3 prósent Oil Red O (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) í ísóprópanóli/vatni ( 60:40) í 1 klst. Lokaþvottur var framkvæmdur tvisvar með eimuðu vatni. Til magngreiningar á frásoguðu Oil Red O var liturinn skolaður út með ísóprópanóli (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) og ljósþéttleiki var mældur við 518 nm.
2.6. Líkamslitun
Á degi 14 eftir örvun fituvökva, voru frumur litaðar með Bodipy (Invitrogen, Waltham, MA, Bandaríkjunum) og Hoechst (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Bandaríkjunum) í 30 mínútur við 37 gráður. Myndir voru teknar með flúrsmásjánni og greindar með ImageJ hugbúnaðinum.
2.7. FlouCytometry
ASCs í leið þrjú voru notuð fyrir frumuflæðisgreiningu fyrir yfirborðstjáningu CD29 (Biolegend, San Diego, CA, Bandaríkin), CD90 (Biolegend, San Diego, CA, Bandaríkjunum), CD45 (BD, Franklin Lakes, NJ, Bandaríkjunum) , CD24 (Biolegend, San Diego, CA, Bandaríkjunum), og CD31 (BD, NJ, Bandaríkjunum). Frumur voru trypsínaðar, þvegnar með PBS og litaðar með mótefnum í FACS litunarbuffi (1 prósent BSA í PBS). Ólituð ASC voru notuð sem viðmið. Fluorescent merki var mælt með því að nota frumuflæðismæli (Fortessa, BD, Franklin Lakes, NJ, Bandaríkin) og gögn voru greind með FlowJo hugbúnaði (BD, Franklin Lakes, NJ, USA).
2.8. Osteogenic aðgreining
ASCs voru ræktuð að samruna í {{0}}brunnsplötum og beinmyndandi aðgreining var framkölluð með því að nota beinmyndandi miðil (DMEM 10 prósent FBS, 0,1uM dexametasón, 10 mM -glýserólfosfat og 50 μM askorbínsýra）. Á degi 21 eftir aðgreiningu voru frumur festar í 4 prósent paraformaldehýði (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Bandaríkjunum) og litaðar með Alizarin Red Stain (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Bandaríkjunum). Magngreining litunar var framkvæmt með Image J hugbúnaði.
2.9.Efnufrumugreining með viðauka V-APC/PI litun
Apoptotic frumudauði var mældur með Annexin V-APC/PI setti (Biolegend, San Diego, CA, Bandaríkjunum). Alls 10,000(frumur/brunn) ASC var sáð á 6-brunnsplötur og ræktaðar við 37 gráður með 5 prósentum CO2. Frumurnar voru meðhöndlaðar með metformíni (0.25 mM, 0.5 mM, 1 mM, 2.5 mM og 5 mM) (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA). Eftir 72 klst. meðferð voru frumurnar safnað með trypsínvæðingu og litað með 2,5 μL AnnexinV-APC og 2,5 μL PIin bindibuffi, ræktað í myrkri við stofuhita í 15 til 20 mínútur og greint með frumuflæðisgreiningu (Fortessa, BD, NJ, USA).
2.10.Hvarfsgreining súrefnistegunda
ROS gildi voru ákvörðuð með því að nota flúrljómandi litarefni 2',7'-díklórfluorescein díasetat (DCFH2-DA) rannsaka (Invitrogen, Waltham, MA, Bandaríkjunum). ASCs(10,000 frumur/brunn) voru ræktaðar í 6-brunnsplötu og ræktaðar með metformíni (5 mM) við 37 gráður, 5 prósent CO, í 72 klst. Eftir ræktun voru ASCs trypsinized og lituð með 50μM DCFH 2-DA litarefni í 30 mínútur við 37 gráður og greind með flúrljómunarsmásjá.
2.11. TMRM litun
ASC (10,000 frumur/brunn) voru ræktaðar í 6-brunnsplötu, meðhöndlaðar með mismunandi skömmtum af metformíni (5 mM) í 72 klst. og ræktaðar við 37 gráður með 100 nM TMRM (Sigma-Aldrich) , St. Louis, MO, Bandaríkjunum) í 30 mínútur við 37C. Eftir ræktun sáust frumur undir flúrljómunarsmásjá. Mynd] var notað til að mæla flúrljómun smásjármynda.
2.12. Magnbundin RT-PCR genatjáning
Heildar-RNA var einangrað með RNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Þýskalandi) og cDNA nýmyndun var framkvæmd með RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Bandaríkjunum). Gensértækir primers voru keyptir frá Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Bandaríkjunum. Megindleg tjáningargreining var framkvæmd með Quantstudio 3 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Bandaríkjunum). MRNA magngreiningin var framkvæmd með því að nota -aktín til að staðla. Gögn fyrir hvert genarit voru staðlað með því að reikna út mismuninn (ACt) á Ct-housekeeping og Ct-Target genunum. Hlutfallsleg aukning eða minnkun á tjáningu var reiknuð út með því að bera saman viðmiðunargenið við markgenið (AACT) með því að nota formúluna fyrir hlutfallslega tjáningu (=24ACt).
2.13. Western Blot
Western blot greining var framkvæmd í meginatriðum eins og lýst er [19]. Aðferðin sem notuð var til að staðla próteinmagnið var „Pierce BCA Protein Assay Kit“ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Bandaríkjunum). Frumulýsöt (15 ugs heildarprótein á hverja braut) voru útbúin í natríumdódecýlsúlfat (SDS) sýnislausn, aðskilin með SDS-PAGE, og þeytt á pólývínýlídendíflúoríð himnum. Eftirfarandi mótefni voru notuð: músa and-manna-aktín (Proteintech, IL, USA), perilipin (Cell Signaling, MA, USA), fosfór-P70S6K (Cell Signaling, MA, USA), heildar P70S6K (Cell Signaling, MA, USA), pERK1/2 (Cell Signaling, MA, USA), samtals ERK1/2 (Cell Signaling, MA, USA), and-mús IgG HRP samtengd (Proteintech, IL, USA), og kanínur and-rotta IgG HRP( Proteintech, Illinois, Bandaríkjunum). Image J hugbúnaður var notaður við þéttleikagreiningar. 2.14.Tölfræðigreining
Tölfræðilegar greiningar voru gerðar í GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). FlowJo var notað fyrir FACS greiningu. Mikilvægi munarins á meðaltölum var metið með t-prófi nemandans eða dreifnigreiningu. Villa ber er táknuð sem meðaltal ± SEM. Gildi voru marktæk við p gildi af<><0.01 and=""><>
3. Úrslit
Metformín er rótgróið sykursýkislyf sem hefur verið sýnt fram á að gegna mikilvægu hlutverki við að lengja langlífi [31]. Til að rannsaka áhrif metformínmeðferðar á stofnfrumur fituafleiddra stofnfrumna, einangruðum við ASC úr fituvef mannagjafa með kollagenasa meltingu. Einangruðu ASCs voru plastviðloðandi og sýndu trefja- eða spindullaga formgerð. Flæðifrumumælingar sýndu að ASCs voru jákvæðir fyrir mesenchymal stofnfrumumerki, svo sem CD29, CD90 og CD24, en neikvæð fyrir blóðmyndandi ættarmerkið CD45 og æðaþels ættarmerkið CD31 (Mynd 1A). Auk þess að sýna dæmigerða ASC svipgerð, ASCs sýndu sterkan fituvæðandi og beinmyndandi aðgreiningarmöguleika, auðkennd með Bodipy og Alizarin Red S litun, í sömu röð (Mynd 1B).cistanche แอ ม เว ย์Einkenndu ASC voru notuð til frekari tilrauna í rannsókn okkar.
Greint hefur verið frá því í fræðiritum að metformín dragi úr fituvaldandi aðgreiningu stofnfrumna. Við stefnum að því að kanna stjórnun fitufrumnaaðgreiningar ASCs við metformín meðferð. ASCs voru meðhöndluð með 1,2,5 og 5 metformíni sem hófst 2 dögum fyrir örvun fituefna og í gegnum aðgreiningarferlið. Bodipy og Oil Red Ostains voru notuð til að sjá olíudropana á 14. degi eftir framköllun aðgreiningar. Niðurstöður Oil Red O (Mynd 1C) og Bodipy litun (Mynd 1D) sýna að metformínmeðferð hamlar marktækt aðgreining á fituvökva á skammtaháðan hátt samanborið við samanburðarfrumur. Hömlun á fitufrumnaaðgreiningu var staðfest enn frekar með því að nota Western blot greiningu á fitufrumnaaðgreiningarmerki próteini perilipin. Til þess var frumulýsum safnað úr sérhæfðum frumum á 14. degi fitufrumnaaðgreiningar og tjáning perilipin var greind. Western blot niðurstöður okkar sýna marktæka niðurstýringu á tjáningu perilipin við metformínmeðferð meðan á fitufræðilegri aðgreiningu stendur (Mynd 1E), sem hafði fylgni við minnkun á Bodipy og Oil Red O blettum. Við komumst að þeirri niðurstöðu að metformínmeðferð hamli fitugrænni aðgreiningu ASCs úr mönnum, þar sem umfang hömlunar tengist jákvætt samhengi við metformín meðferðarskammtinn.
Hærri aðgreiningar- og fjölgunartíðni leiðir til taps á stöngli. Þar sem við sáum að metformín dregur úr aðgreiningu á fitufrumum höfðum við áhuga á að kanna áhrif metformínmeðferðar á útbreiðslu ASCs in vitro. ASCs voru meðhöndluð með metformíni og frumurnar voru taldar á degi 4 eftir ræktun í nærveru eða fjarveru metformíns. Frá niðurstöðum okkar sáum við að metformín dregur verulega úr frumufjölgunarhraða samanborið við samanburðar-ASC (Mynd 2A). Stofnfrumur gegna mikilvægu hlutverki við endurnýjun og viðhald vefja.hversu mikið cistanche á að takaTil að gegna endurnýjunarhlutverki sínu á skilvirkan hátt þurfa stofnfrumur að viðhalda stofneiginleikum sínum. Við greindum áhrif metformínmeðferðar á tjáningu stofngena í ASC. Í þessu skyni notuðum við megindlega rauntíma PCR til að greina gen sem tengjast viðhaldi stofns í ASC. Við sáum að metformín hækkaði marktækt tjáningu á fitustofnfrumumerkjum, eins og BMP7, DPP4, Sox2, Oct3/4, Wnt2, ICAM1, CD90 og DLK1, samanborið við samanburðar-ASC (Mynd 2B). Niðurstöður okkar sýna fram á að metformín meðferð hægir á áhrifaríkan hátt á útbreiðslu ASCs og kemur þannig í veg fyrir að frumurnar þreytist af útbreiðslu með því að efla tjáningu á stofngenum.
Mynd 1. Meðferð með metformíni hindrar fitufræðilega aðgreiningu ASCs á skammtaháðan hátt. (A) ASCs voru prófuð fyrir tjáningu CD29, CD90, CD24, CD31 og CD45 með frumuflæðismælingu. Bæði prósentu jákvæðni sýnd í súluritunum og meðalflúrljómun styrkleiki (MFI) sýnd í töflunni yfir samanburð (ólituð ASCs) og lituð (ASCs meðhöndluð með viðkomandi mótefnum) eru sýndar. (B) ASCs voru látnir sæta fituvökva eða beinmyndandi aðgreiningu með því að nota ættarsértæka aðgreiningarkokteila. Aðgreining á fitufrumnaætt var staðfest með Bodipy litun og beinmyndun var staðfest með Alizarin Red litun. Hlutfall Alizarin Red litaðs svæðis var reiknað út með mynd J. (C) ASCs voru meðhöndlaðir með fitufrumnaaðgreiningarkokteil í viðurvist eða fjarveru mismunandi skammta af metformíni í 14 daga. Þróun fitufrumna á degi 14 eftir örvun var metin með því að lita fitudropa með Oil Red O lit. Frásogaður Oil Red O blettur var dreginn út og ljósþéttleiki mældur. Sjónþéttleiki frá samanburðar-ASC var tekinn sem 100 prósent og hlutfallsleg breyting við metformínmeðferð var teiknuð (n =3). (D) Lípíðinnihald á degi 14 var ákvarðað með því að nota Bodipy lit (grænt). Hoechst (blátt) var notað til að lita kjarna.hvað er cistanche(E) Western blot greining á tjáningu perilipin próteina. -Actin var notað sem hleðslueftirlit. Magngreining á þéttleika perilipin próteinbanda staðlað í -Actin notað Mynd J. Myndir og línurit eru fulltrúar þriggja sjálfstæðra endurtekna (n=3). *bls<0.05,**><0.01,***p><0.001 and="" ***=""><0.0001 as="" compared="" with="">
Til að útiloka að minnkun á aðgreiningu og fjölgun sé ekki vegna frumudrepandi áhrifa metformíns á ASCs, greindum við lífvænleika metformínmeðhöndlaðra frumna. Greining á AnnexinV/PI litun með frumuflæðismælingu sýndi enga marktæka aukningu á apoptótískum eða drepandi frumum við meðferð með vaxandi styrk metformíns allt að 5 samanborið við frumuræktunarmiðilinn (Mynd 3A). Hvatberavirkni og myndun hvarfgjarnra súrefnistegunda (ROS) eru mikilvæg fyrir frumuaðgreiningu og aukið magn hvatberaefnaskipta og ROS-myndunar hefur sést við aðgreining á fitufrumum [32]. Út frá niðurstöðum okkar sáum við að metformínmeðferð dregur úr fitufræðilegri aðgreiningu ASCs. Næst könnuðum við áhrifin á hvatberavirkni og ROS framleiðslu. ASC voru meðhöndluð með metformíni og lituð með TMRM til að meta virkni hvatberahimnu og með DCF2DA til að meta styrk ROS. Flúrljómandi smásjámyndir og magngreining á flúrljómandi merkinu leiddi í ljós að metformínmeðferð dregur verulega úr hvatberavirkni (Mynd 3B, C) og ROS framleiðslu (Mynd 3D, E). Við komumst að þeirri niðurstöðu að metformín-miðluð lækkun á hvatberavirkni og ROS framleiðslu stuðli að aukningu á stöngli ASCs.
Til að skilja hugsanlegt merkjafall sem ber ábyrgð á minnkaðri aðgreiningu fitufrumna, fjölgun og uppstýringu stofngena í ASC við metformín meðferð, lögðum við áherslu á mTOR, sjálfsát og utanfrumumerkjastýrða kínasa (ERK) merkjakaskada. Fyrri rannsóknir hafa sýnt fram á mikilvægu hlutverki þessara leiða við að viðhalda stönginni í ASCs [19,33]. Bæði ERK og mTOR merki gegna mikilvægu hlutverki við að stuðla að frumufjölgun og aðgreiningu. Eftir að ASCs voru meðhöndluð með mismunandi skömmtum af metformíni, var frumulýsum safnað og Western blotuð fyrir LC3, fosfórýleruðum p70S6 kínasa, heildar p70S6 kínasa, fosfórýleruðum-ERK42/44 og heildar ERKp42/44 mótefnum. Beta-aktín var notað sem heimilisgen. Western blot greining sýndi að samanborið við viðmiðunar-ASC, stjórnaði metformínmeðferð tjáningu á fosfórýleruðum p70S6K og fosfórýleruðum-ERK42/44 kínasa (Mynd 4A, B, D). Bæði ERK og mTOR merki gegna mikilvægu hlutverki í stjórnun sjálfsátsferilsins.lífflavonoidsWestern blot niðurstöður leiddu í ljós að metformín meðferð eykur sjálfsát virkni í ASCs (Mynd 4A, C). Við greindum frekar tjáningu gena í sjálfsáfallsferli við metformínmeðferð á mRNA stigi með því að nota magnbundið rauntíma PCR. Með qPCR greiningu sáum við marktæka aukningu á genum sjálfsátsferils VMP1, P62, ATG5 og ATG7 við metformínmeðferð (Mynd 4E), sem er í samræmi við aukningu á sjálfsátsvirkni sem sýnd er í Western blot niðurstöðum okkar. Óveruleg aukning á tjáningu ATG 9 kom einnig fram í greiningum okkar. Við komumst að þeirri niðurstöðu að metformín meðferð dragi úr ERK og mTOR virkni og eykur sjálfsát í ASC sem mögulegur undirliggjandi aðferð fyrir minni útbreiðslu og aðgreiningu og aukið stöng.
Til að undirstrika beinan þátt ERK og mTOR boðefna í metformínmeðferð miðlaðri hömlun á aðgreiningu og aukningu á stöngli í ASC, hindruðum við sérstaklega ERK boð og mTOR ferilinn með því að nota ERK hemil U0126 og rapamýsín, í sömu röð, og greindum áhrif á ASC. aðgreining og stofnleiki [19,33]. Viðbót á ERK hemli U0126 við aðgreining fitufrumna á ASC leiddi til marktækt minni aðgreiningar, eins og kom í ljós með Bodipy lituðum myndum og flúrljómunarmagngreiningu (Mynd 5A, B). Magnbundnar rauntíma PCR niðurstöður sem sýna uppstjórnun stofngena við sértæka hömlun sem miðlað er af hemlum. af ERK merkjasendingum (Mynd 5C) studdu enn frekar niðurstöðu okkar að niðurstýring ERK leiðar með metformínmeðferð stuðlar að því að auka stöng.
Við notuðum síðan rapamýsín, vel þekktan mTOR ferilhemil sem getur virkjað sjálfsát, og metum áhrifin á fitumyndun og genatjáningu stofns [19]. Frumulýsum af ASC sem meðhöndlaðir voru með rapamýsíni var safnað og rannsakað með fosfórýleruðum p70S6 kínasa, heildar p70S6 kínasa og -aktín mótefnum. Við sáum að rapamýsín minnkaði tjáningu fosfórýleraðs p70S6 kínasa (Mynd 6A). Til að ákvarða virknihlutverkið í aðgreiningu á fituvökva, voru ASCs meðhöndlaðir með rapamýsíni og framkallaðir með fituefninu. Eftir 14 daga voru frumurnar litaðar með Bodipy litun til að meta fitumyndun. Við sáum að meðferð með rapamýsíni dró marktækt úr fituvökva aðgreiningu (Mynd 6B, C). Næst greindum við áhrif þess að hindra mTOR merkjaflutning á stofnstyrk ASCs. Í þessu skyni voru ASCs meðhöndluð með rapamýsíni og rauntíma PCR var notað til að mæla tjáningu afrita sem tengdust stöngli. Við sáum að rapamýsín hækkaði marktækt tjáningu stofntengdra merkja (Mynd 6D). Við komumst að þeirri niðurstöðu að hömlun á bæði ERK og mTOR ferlum stuðli að minnkun á aðgreiningu fitufrumna og aukningu á stöngli í ASCs úr mönnum.
Næst prófuðum við hvort við gætum endurskapað stofnstyrksaukandi áhrif metformínmeðferðar á 2D-ræktaðar ASCs í flóknara og in vivo þýðanlegu heilum fituvefsræktunarlíkani. Til þess breyttum við siðareglum um ræktun fituvefs sem birt var af Harms o.fl.30] með því að nota frumusíur í staðinn fyrir innskot í gegnum hol til að halda fituvefsbrotunum á kafi í miðlum (Mynd 7A). Eftir að hafa ræktað 3-5 mm búta af fituvef úr mönnum með eða án metformíns í 5 daga, einangruðum við straumæðahlutfallið (SVF) með kollagenasa meltingu fituvefsbrota og greindum tjáningu gena sem tengjast stöngli. Rauntíma PCR gögn sýndu að SVF úr fituvef meðhöndluðum með metformíni sýndi marktæka uppstjórnun á tjáningu stofnmerkja eins og BMP7, DLK1, MYC1, DPP4, OCT3/4, Sox2, Nanog, KLF4, PDGFR og Wnt2 (Mynd 7B ).
4. Umræður
Fitustofnfrumur (ASC) endurnýja fituvef með sjálfsendurnýjun og sérhæfingu og viðhalda þannig stofnfrumusafni vefsins. Hins vegar er öldrun og offita tengd tapi á stofneiginleikum í ASCs. Metformin er sykursýkislyf og hefur sýnt vænlegan árangur sem öldrunarlyf. Við lögðum áherslu á að greina áhrif metformíns á stafni ASCs og skilja undirliggjandi kerfi, með það að markmiði að koma metformíni á framfæri sem hugsanlegan miðil til að viðhalda stöngli í ASCs með aldrinum. Til að auðvelda þýðingu á niðurstöðum okkar yfir á menn, notuðum við 2D frumuræktunarlíkan af ASC úr mönnum og notuðum fituvefsræktunaraðferð manna til að líkja eftir flóknari vefjaumhverfi. Við notuðum fituvef undir húð sem vefjauppsprettu fyrir rannsóknir okkar. Með því að nota þessar fjölbreyttu frumur og vefjaræktunaraðferðir rannsökuðum við áhrif metformínmeðferðar á stofnhlutfall ASCs.
Offita veldur breytingu á hreyfihvörfum ASC aðgreiningar, sem minnkar stofnfrumusafnið. Niðurstöður okkar gáfu til kynna að, samanborið við ómeðhöndlaða ASC, dró metformínmeðferð úr fitumyndun á skammtaháðan hátt. Þessi athugun er í samræmi við fyrri skýrslur sem sýndu að metformín hamlar fitufrumum í fitustofnfrumum, beinmergsstómfrumum, tannholdsbandsstofnfrumum og 3T3 frumulínum [34-37]. Útbreiðsluhraði stofnfrumna gegnir mikilvægu hlutverki við að viðhalda stofnfrumusafni, stofnfrumu og sjálfsendurnýjunargetu. Við sáum að metformín hamlaði útbreiðslu ASCs án þess að framkalla frumudrepandi áhrif á ASCs, sem er í samræmi við aðrar rannsóknir sem birtar voru á músum fituafleiddum stofnfrumum [28], stromal frumum og fibroblasts [38,39].kaupa cistancheNýleg rannsókn þar sem notaðar voru stofnfrumur úr fitu úr hestum sýndu fram á fjölgunaráhrif metformíns [27]. Líklegasta skýringin á þessum misvísandi athugunum er munurinn á gjafategundum og líffærafræðilegum stað frumuuppskeru, þar sem ASC hross voru safnað úr halanum. Agnieszka Smieszek o.fl. kom fram að metformín hamlar frumufjölgun og stuðlar að frumudauða með auknum skömmtum (5 og 10 mM) í beinmergsfrumum úr músum og Balb/3T3 fósturtrefjafrumulínunni [40]. Að auki hamlar metformín fjölgun gervihnattafrumna sem eru einangruð úr músavöðvum |41. Til stuðnings athugun okkar, Min-lung Park o.fl. greint frá því að metformín bætir bólgueyðandi eiginleika ASCs úr mönnum með því að lækka tjáningarstig IL-1, IL-6 og TGF-; metformín eykur einnig lifun ígræddra ASCs og verndar gegn apoptotic frumudauða [42]. Þessar niðurstöður benda til mismunandi áhrifa metformínmeðferðar á lífvænleika frumna úr mismunandi tegundum og að ASC úr mönnum séu ónæm fyrir hugsanlegum frumudrepandi áhrifum metformínmeðferðar.
Aðgreining ASCs í fitufrumur tengist meiri orkuþörf og efnaskiptahraða, sem leiðir til meiri hvatberavirkni og ROS framleiðslu. ROS gegnir mikilvægu hlutverki við að viðhalda kyrrð og stofnfrumum í fullorðnum stofnfrumum, þar sem hærra magn af ROS ýtir frumunum í átt að sérhæfingu og að lokum stofnfrumuöldrun og frumudauða [43]. Við sáum að metformín minnkar marktækt hvatberahimnugetu og myndun hvarfgjarnra súrefnistegunda. Í samræmi við gögn okkar, greindu fyrri rannsóknir einnig frá því að metformín dregur úr oxunarálagi og bætir andoxunartjáningu í músafósturtrefjum [44], músa-ASCs [38] og ósæðaræðaþelsfrumum manna [45]. Þar að auki, í samræmi við rannsókn okkar, greindu Chien-Hung Lin o.fl. frá því að metformín virkar sem taugavarnarefni með því að draga úr oxunarálagi í taugastofnfrumum manna [46]. Nokkrar aðrar rannsóknir staðfesta að metformín virkar sem andoxunarefni með því að draga úr oxunarálagi og auka andoxunarensímtjáningu, svo sem superoxíð dismutasa í músa-ASC, músa C2C12 vöðvafrumum og æðaþelsforfrumum í blóðrás manna [38,47,48]. Ennfremur, rannsókn Alejandro Martin-Montalvo o.fl. styður athugun okkar, sem sýnir fram á að metformín hamlar marktækt hvatbera flókið, hamlar hvatberaöndun í músum [49] Áhrif metformíns á minnkaða myndun hvarfgjarnra súrefnistegunda eru hugsanlega miðluð af aukningu á skertu glútaþíoni [50] í kerfi sem felur í sér redox- næmur umritunarþáttur Nrf2 [51].
Sýnt hefur verið fram á að metformín stuðlar að kyrrstöðu gervihnattafrumna með því að lækka efnaskipti sem þarf til útbreiðslu og aðgreiningar. Ýmsar rannsóknir staðfesta einnig að metformín stuðlar mjög að stofnstyrk og endurnýjun stofnfrumna [23,39,41,49,52,53]. Það er einnig þekkt fyrir að bæta verulega og hækka tjáningarstig stofnfrumumerkja. Þar sem við tókum eftir því að metformín hamlar útbreiðslu og fitumyndun með því að hindra oxunarálag og hvatberavirkni, leituðum við að staðfesta hvort metformín bætir stofninn í ASCs eða í in vitro fituvefsræktunarlíkani. Í samræmi við það sáum við að metformín bætti marktækt stöngstengda merkjatjáningu DPP4, Wnt2, THP1, DLK1, PDGFR, ICAM1 og Annexin3, Oct3/4, Nanog, BMP4, SOX2 og Mycl í 2D ASCculture og fituvefsræktunarlíkönum . Notkun heils fituvefjaræktunar býður upp á einstakt tækifæri til að líkja eftir in vivo örumhverfi mannavefs, þar sem frumurnar eru stilltar eins og í náttúrulegum arkitektúr þeirra og hafa gagnvirkan stuðning frá mismunandi frumugerðum sem eru ofnar í vefjagrunninu. Eftir því sem við best vitum, sýnir rannsókn okkar í fyrsta skipti fram á stöngvabætandi áhrif metformínmeðferðar á ASCs í mönnum, bæði í 2D og heilum fituvefjaræktun. Við lítum svo á að niðurstöður okkar sem sýna uppstýringu á undirskrift stofngena í ASC sem eru einangruð úr fituvefsbrotum sem hafa verið meðhöndluð með metformíni mæli fyrir frekari rannsókn á notkun metformíns sem meðferð til að hægja á öldrunarferlinu og yngja upp aldraðan fituvef.
Vélræn markmið rapamýsíns (mTOR) gegnir lykilhlutverki í fjölgun og sérhæfingu stofnfrumna. Lækkun á mTOR virkni með erfðafræðilegri meðferð, meðferðaríhlutun eða lífsstílstengdum breytingum eykur stöng og langlífi [19,20]. Þar sem við sáum að metformín hamlar fitumyndun, prófuðum við áhrif metformíns á mTOR boð. Athyglisvert er að niðurstöður sýndu að metformín minnkar fosfórýleringarmagn PS70S6 kínasa verulega, sem er lykilboðsameind niðurstreymis mTOR og skýrir frá virkni mTOR ferla. Fyrri rannsóknir benda einnig til þess að metformín bæli fitumyndun með því að hamla mTOR-boðaleiðinni í músfósturtrefjum (MEFs), C3H10T1/2 músa mesenchymal stofnfrumum og 3T3-L1 forfitufrumum [34]. Vélræn markmið rapamýsíns er samsett úr tveimur fléttum, mTORCl og mTORC2, og boðin gegna mikilvægu hlutverki í fitumyndun. Sýnt hefur verið fram á að hömlun á mTORC1 merkjum með rapamýcíni skerði fitumyndun með því að minnka fosfórun PS6kinasa í 3T3-L1 forfitufrumum. Þessar rannsóknir sýndu einnig fram á að hömlun á mTOR merkjum hamlar fitumyndun með því að lækka tjáningarstig fitufrumnaættarmerkja eins og PPARgamma, CEBPI , CEBP1 og adiponectin [54-56]. Þar að auki er mTOR merking miðlað af fosfórun S6 kínasa. Sýnt var fram á að niðurfelling S6 kínasa væri ónæm fyrir offitu og þyngdaraukningu við fituríkt mataræði vegna skerðingar á fitumyndun [57]. Við staðfestum athugun okkar á metformínmiðluðu lækkun á mTOR virkni sem mögulegan miðla aukningar á stöngli og minni aðgreiningu ASCs með því að nota rapamycin, sem hindrar sérstaklega m TOR ferilvirkni.
Auk mTOR gegnir ERK merkjaleiðin mikilvægu hlutverki í útbreiðslu og fitumyndun. Xiaomin Ning o.fl., Í riti sínu, halda því fram að fitumyndun sé virkjuð með ERK merkjum [58]. Þar sem við sáum að metformín hamlaði fitumyndun og fjölgun, ákváðum við að kanna áhrif metformíns á ERK boð. Í samræmi við fyrri skýrslur bentu niðurstöður okkar einnig til þess að metformín gæti hamlað fitumyndun með bælingu á ERK-boðum með aukningu á stofnstengdri genatjáningu. }}]. Hins vegar er tap á sjálfsát tengt tapi á stöngli, þó metformínmeðferð hafi bætt genatjáningu sem tengist stöngli með því að virkja tjáningu sjálfsátatengdra merkja eins og LC3Il. Þannig benda niðurstöður okkar til þess að metformín skerði fitumyndun með því að bæta stofninn í ASC manna eða fituvefsræktunarlíkönum úr mönnum með því að virkja sjálfsát og hindra mTOR merkjaleiðir. Framtíðarrannsóknir á dýrum og mönnum í lífinu, sem beinast að því að meta áhrif metformíns á líffræði ASCs, munu leiðbeina við aðlögun metformínsnotkunar sem stofnfrumueyðandi efnis.
Þessi grein er unnin úr Biomedicines 2021, 9, 1782. https://doi.org/10.3390/biomedicines9121782 https://www.mdpi.com/journal/biomedicines
